2012-02-21
Regulamin (zasady BHP)
Mikrobiologia
ćwiczenie 1
" ObowiÄ…zkowy fartuch;
" Zakaz jedzenia, picia, palenia papierosów;
Podstawowe techniki badań mikrobiologicznych
" Dbanie o porządek i czystość przy w swoim miejscu pracy;
Spięte włosy;
"
" Uwaga na palniki gazowe  nie nachylać nad nimi, nie wolno chodzić po
pracowni trzymając w ręce zakażone lub rozżarzone ezy, pipety itp.;
" Regularne uczęszczanie na ćwiczenia;
" Obowiązek sporządzania opracowań z każdego tematu ćwiczeń (temat, cel
i zakres ćwiczenia, sposób wykonania, zestawienie wyników, wnioski);
" po zakończonych ćwiczeniach koniecznie należy umyć ręce;
" wymagane wyposażenie:
mgr Nina Chrzanowska długopis, ołówek, marker do pisania po szkle, zeszyt czysty lub w kratkę,
pokój 628
zapałki lub zapalniczka ;
" O wszelkich wypadkach należy bezzwłocznie powiadomić prowadzącego!!!
"
Warunki zaliczenia
Co to jest mikrobiologia?
" Regularne uczestnictwo w ćwiczeniach (1 nieobecność usprawiedliwiona
dozwolona);
" Mikrobiologia- wyraz pochodzenia greckiego (mikros
" Zaliczenie dwóch kolokwiów  ¾ Å›redniej arytmetycznej
- "mały", bios - "życie", logos - "słowo", "nauka")
" Aktywność na ćwiczeniach;
oznaczający naukę o najmniejszych istotach żywych,
" Przygotowanie do ćwiczeń ( wejściówki); ź średniej arytmetycznej
niedostrzegalnych gołym okiem drobnoustrojach 
" Zdane i zaliczone sprawozdania;
mikroorganizmach;
Mniej niż 3.00  ocena dwa (2.0)
" Do organizmów, którymi zajmuje się mikrobiologia,
Od 3.00 do 3.24  ocena trzy (3.0)
należą następujące drobnoustroje: bakterie, wirusy,
Od 3.25 do 3.74  ocena trzy i pół (3.5)
grzyby oraz niektóre organizmy z królestwa Protista;
Od 3.75 do 4.24  ocena cztery (4.0)
Od 4.25 do 4.74  ocena cztery i pół (4.5)
Od 4.75 do 5.00  ocena pięć (5.0)
Badania mikrobiologiczne
Szkło mikrobiologiczne
1. Metody bezpośrednie
" Brak substancji bakteriobójczych;
" Brak substancji wchodzących w reakcje ze składnikami podłoża;
a) Bakterioskopia;
" Odporność na nagłe zmiany temperatury;
b) Hodowla;
" Sterylność;
c) Wykrywanie antygenów metodami serologicznymi;
" Wyróżniamy:
d) Wykrywanie DNA lub RNA metodami biologii molekularnej;
2. Metody pośrednie
a) Określenie poziomu przeciwciał w surowicy i płynach
ustrojowych;
b) Próby biologiczne na zwierzętach;
Szalki Petriego Kolby Probówki Pipety szklane
Płytki Periego (szalki) Kolby, zlewki Próbówki Pipety szklane
1
2012-02-21
Sprzęt mikrobiologiczny
Podłoża mikrobiologiczne
" Podłoże ( pożywka) jest to mieszanina związków chemicznych,
Oczka bakteriologiczne- ezy, głaszczki; Pipety automatyczne;
na których lub w których rosną mikroorganizmy;
Cechy podłoża:
" Odpowiednia ilość składników odżywczych: z
ródło węgla;
tlenu; wodoru; azotu- azotany, azot atmosferyczny, sole
amonowe, aminokwasy ; soli mineralnych, niekiedy witamin i
czynników wzrostowych;
" Odpowiednie pH;
" Jałowość;
" Klarowność;
" Odpowiedni stan skupienia;
" Odpowiednia temp. inkubacji;
" Odpowiednia atmosfera;
Podział podłoży we względu na stan skupienia
Odpowiedni ciśnienie Odpowiednia Odpowiednio dobrana
osmotyczne i PH temperatura inkubacji atmosfera
" Podłoża płynne- wprowadzone przez Ludwika Pasteura np.
Acidofile ( phd"5,4) Psychrofile temp. 15-22 °C BezwzglÄ™dne beztlenowce
bulion, mleko, brzeczka;
np. Lactobacillus spp. np. Flavibacetrium spp. np. Clostridium
" Podłoża stałe- wprowadzone przez Roberta Kocha, powstają
poprzez dodanie do podłóż płynnych substancji zestalających
Neutrofile (pH 5,4-8,5) Mezofile temp. 30-37°C WzglÄ™dne beztlenowce
np. większość np. Escherichia coli np. Escherichia coli jak np. agaru (1,5-3%), żelatyny (12-15%) czy żelu
drobnoustrojów ma
krzemionkowego;
optimum pH 7
" Podłoża półpłynne- poprzez dodanie do podłoża płynnego
Alkalifile ( pH 7-11) Termofile 51°C Mikroaerofile 0,1-0,8% agarozy;
np. Vibrio cholerae np. Thermococcus spp. np. Helicobacter pylori
Bezwględne tlenowce
np. Pseudomonas
" Podłoża specjalne- z dodatkiem węglowodanów lub innych specyficznych
Podział ze względu na ilość i jakość związków
substratów np. agar czekoladowy, pożywka Sabouranda;
odżywczych
" Proste np. agar zwykły, woda peptonowa;
" Wzbogacone - z dodatkiem krwi, surowicy lub innych dodatkowych
czynników wzrostowych np. agar z krwią dla Staphylococcus;
" Wybiórcze (wybiórczo - namnażające) zawierają składniki hamujące wzrost
nie których bakterii, a stwarzające warunki rozwoju innym gatunkom
" Podłoża transportowe- stosowane przy przesyłaniu materiału klinicznego
bakterii, np. bulion z żółcią dla Salmonella; podłoże SF dla Shigella i
do laboratorium, zawiera sole mineralne i bufory, zabezpieczajÄ…ce
Salmonella;
żywotność drobnoustrojów obecnych w materiale;
" Różnicujące (wybiorczo - różnicujące) służą do badania procesów
biochemicznych przeprowadzanych przez bakterie, zawierajÄ… substrat dla
bakterii tzw. wskaz
nik, który powoduje zmianę zabarwienia podłoża w
wyniku jego rozkładu np. podłoże z purpurą bromokrezolową i laktozą;
podłoże Chapmana, podłoże MacConkeya;
" Podłoże dla bakterii beztlenowych- Pożywka z tioglikolanem sodu,
cysteiną, heminą i witaminą K, niezbędna zwłaszcza dla
przetrwalnikujÄ…cych z grupy Clostridium
2
2012-02-21
Ze względu na skład podłoża dzielimy: Metody i warunki hodowli drobnoustrojów
" Podłoża naturalne - uzyskiwane bezpośrednio z tkanek " Metody
zwierzęcych bądz
roślinnych (skład znany w przybliżeniu) np.
" Hodowla (kultura)- pożywka płynna lub stała wraz z
mleko, ziemniaki, owoce;
rozwijajÄ…cymi siÄ™ w niej mikroorganizmami;
" Podłoża syntetyczne - skład ilościowy i jakościowy
" Czysta kultura (monokultura)- hodowla zawierajÄ…ca
dokładnie znany;
drobnoustroje jednego gatunku!
" Podłoża półsyntetyczne - znany tylko skład zw.
" Mieszana kultura- zawiera drobnoustroje z licznych
nieorganicznych, często są to podłoża syntetyczne z
gatunków
dodatkiem wyciągu z tkanek zwierzęcych i roślinnych;
" Warunki
" Tlenowe (w cieplarkach)
" Mikroareofilne (cieplarki z Co2)
" beztlenowe (anaerostaty z pompa próżniową)
Wzrost drobnoustrojów na podłożu stałym
Wzrost drobnoustrojów w podłożu płynnym
" wykonuje się zanurzając oczko ezy lub końcówkę pipety z pobranym " Płytkach;
Metoda powierzchniowa
" Skosach;
materiałem w podłożu;
Równomiernie rozprowadzić materiał
" SÅ‚upkach;
badany na powierzchni zestalonej
Metoda głębinowa pożywki na płytce bądz
w probówce
(agar skośny);
Na dno jałowych płytek Petriego
" Materiał badany na płytki nanosi się
wylać 1 ml (1000µl) materiaÅ‚u
pipetami automatycznymi i równomiernie
badanego i zalać ostudzoną
rozprowadza opalonymi głaszczkami;
pożywką stałą- zawartość płytki
" dyfuzyjny (zmętnienie)- równomierny w całej objętości podłoża, w postaci
równomiernie wymieszać;
zmętnienia, charakterystyczny dla drobnoustrojów względnie beztlenowych.
Dodatkowo przy wzroście dyfuzyjnym na powierzchni podłoża może wystąpić
" Posiewy na agarze skośnym wykonuje się
membrana, pierścień lub osad na dnie probówki;
igłą lub ezą;
" w postaci kożuszka na powierzchni - typowy dla drobnoustrojów ściśle
(bezwzględnie) tlenowych;
" w postaci pierścienia tuż pod powierzchnia podłoża - typowy dla
mikroaerofilnych mikroorganizmów, tj. rosnących przy obniżonej zawartości tlenu
(5%);
" w postaci osadu na dnie - typowy dla drobnoustrojów preferujących warunki
beztlenowe. Osad może mieć formę kłaczków lub grudek;
Kolonia- CFU (ang. colony forming unit )
" Przykład:
Pobrano wodÄ™ do analizy mikrobiologicznej. Po 1000-krotnym jej
" Na podłożach stałych (na płytkach) drobnoustroje tworzą kolonie;
rozcieńczeniu i wylaniu 0,1 ml na płytkę z pożywką stwierdzono,
" Kolonią nazywamy widocznym gołym okiem skupisko komórek
że w wyniku hodowli na płytce powstało 15 kolonii. Jakie było
rozwijające się z pojedynczej komórki bakterii;
stężenie bakterii w badanej wodzie?
" CFU (ang. colony forming unit  jednostka tworząca kolonię)  skrót
oznaczający pojedyncze (wyjściowe) komórki, z których w wyniku
podziałów powstaną pojedyncze kolonie komórek;
x=a*b*10, gdzie:
x= jtk/ml; Odpowiedz
: 15 kolonii odpowiada 15 komórkom w rozcieńczonym 1000-krotnie roztworze
(wynika to z definicji CFU). Ponieważ na płytkę wylano 0,1 ml takiego roztworu, w 1 ml
a= liczba wyrosłych kolonii;
znajdowało się 150 komórek bakteryjnych. Uwzględniając rozcieńczenie, można stwierdzić, że
b= odwrotność rozcieńczenia;
stężenie bakterii w analizowanej wodzie wynosiło 150 000 komórek/ml.
10= przeliczenie na 1 ml;
3
2012-02-21
Posiew
Cechy hodowli bakteryjnej
redukcyjny
" Wymiary ;
" Kształt;
" Badania mikrobiologiczne
" Barwa; prowadzi siÄ™ zazwyczaj
kolisty nieregularny soczewkowaty nitkowaty rozgałęziony
posługując się czystymi
" Wyniosłość;
kulturami;
" Powierzchna;
" JednÄ… z technik
" Struktura;
płaski wyniosły soczewkowaty pępkowaty
prowadzÄ…cÄ… do izolacji
" Brzegi;
czystych kultur jest posiew
" Przezroczystość;
redukcyjny;
" Zawieszalność w płynach;
" Metoda ta polega na
gładki falisty płatowaty nitkowaty z obwódką
" Zapach; zaszczepieniu materiału na
płytkę Petriego według
" Inne cechy np.: typ hemolizy Ä… (Streptococcus pneumoniae),² (Staphylococcus
schematu
aureus) ,c (Staphylococcus epidermidis);
przedstawionego obok;
Rozcieńczenia próbek
Metody bezpośredniego liczenia drobnoustrojów:
Metody te polegają na bezpośrednim liczeniu drobnoustrojów pod
mikroskopem.
" Mikroskopia fluorescencyjna (DEFT)
Wykonanie oznaczenia obejmuje filtrowanie odpowiednio przygotowanej
próby a następnie barwienie osiadłych na filtrze drobnoustrojów
fluorescencyjnym barwnikiem np. oranżem akrydyny i policzenie liczby
bakterii przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Technika ta pozwala na
oznaczenie komórek martwych i żywych;
" Liczenie drobnoustrojów przy użyciu komór
Komory do liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem to najczęściej
szklane płytki z wyciętym wgłębieniem, podzielonym na kwadraty lub
prostokąty o znanej powierzchni. Po naniesieniu rozcieńczenia do komory
dokonuje się liczenia komórek widocznych w obrazie mikroskopowym, a
następnie przelicza się ich liczbę na 1 cm3 badanego materiału. Najczęściej
stosuje siÄ™ komory: Thoma, Howarda, Börkera, Fuch Rosenthala;
Metody pośredniego liczenia bakterii Część praktyczna:
Wykonanie posiewu
" Przygotowanie rozcieńczeń- 10-1, 10-2, 10-3, 10- 4 i 10-5;
" na podstawÄ™ z wybranym podÅ‚ożem nanosi siÄ™ 100 µ (0,1 ml)
" Posiew powierzchniowy- 100 µl odpowiedniego rozcieÅ„czenia
produktu lub jego rozcieńczenia; Warunki inkubacji:
na szalkę, wygłaskać zawiesinę wypaloną głaszczką;
odpowiednie dla oznaczanej grupy drobnoustrojów;
" Posiew głębinowy- 1 ml odpowiedniego rozcieńczenia na dno
Inne: petrifilmy, system płytki spiralnej, metoda sączenia przez
szalki; zalać (rozpuszczonym) podłożem stałym;
filtr membranowy;
" Posiew na agar skośny- ezą, bądz
igłą bakteriologiczną zrobić
rysÄ™ na agarze;
" Posiew na podłoże płynne- ezą, bądz
pipetą zaszczepić
podłoże;
4
2012-02-21
Pamiętać o zachowaniu jałowych warunków!!!
" WÅ‚Ä…czony palnik;
" Opalanie brzegu kolbek, probówek;
Metody sterylizacji
" Wyżarzanie ez, igieł bakteriologicznych, głaszczek w płomieniu
palnika;
Mikroskopowanie
" Delikatne uchylanie wieczek szalek Petriego i pokrywek do
końcówek do pipet;
" Przed i po pracy przetrzeć powierzchnię na której pracujemy
denaturatem bÄ…dz
etanolem!
Skuteczność dezynfekcji zależy od :
" Sterylizacja- proces niszczenia i usuwania
drobnoustrojów wraz z zarodnikami i
przetrwalnikami, usuwanie wirusów obecnych w
" Właściwości środka dezynfekcyjnego ;
produkcie przy użyciu czynników fizycznych i
" Rodzaju, wrażliwości i liczby drobnoustrojów ;
chemicznych;
" Warunków środowiska takich jak: pH , temperatura, które
mogą oddziaływać zarówno na przeżywalność drobnoustrojów
jak i właściwości środka dezynfekcyjnego, większość środków
" Dezynfekcja (odkażanie)- niszczy formy
lepiej działa w podwyższonej temperaturze i inne parametry
wegetatywne drobnoustrojów (nie musi niszczyć
procesu dezynfekcji takie jak czas trwania procesu , stężenie
form przetrwalników) przy użyciu czynników
środka dezynfekcyjnego ;
fizycznych i chemicznych np. potarcie
" Obecności substancji organicznych i innych zanieczyszczeń,
powierzchni etanolem;
mogą one reagować ze środkiem dezynfekcyjnym i zmniejszać
jego stężenie, a także tworzyć warstwę ochronną ;
ð Pasteryzacja- proces niszczenia form wegetatywnych
" UHT (ang. Ultra high temperature)- zmodyfikowana
drobnoustrojów poprzez krótkie ogrzewanie cieczy (do 100ºC
metoda pasteryzacji (inaczej upperyzacja), polegajÄ…ca
przez kilka sekund) i następnie szybkie schłodzenie;
na błyskawicznym, 1-2 sekundowym podgrzaniu do
ð Tyndalizacja- polega na trzykrotnej pasteryzacji
temp. ponad 100°C (135-150°C dla mleka) i równie
przeprowadzanej co 24 godziny- zmierza do eliminacji form
błyskawicznym ochłodzeniu do temperatury pokojowej.
przetrwalnych drobnoustrojów;
Cały proces trwa 4-5 sek;
Mechanizm działania:
" Proces stosowany był początkowo w mleczarstwie,
obecnie stosuje się go w pełnej gamie produktów
* pierwsza pasteryzacja zabija głównie formy wegetatywne,
pakowanych aseptycznie;
nie jest w stanie zabić niektórych form przetrwalnych;
* po upływie doby, pod wpływem impulsu termicznego z
przetrwalników rozwijają się kolejne formy wegetatywne
bakterii, które giną po drugiej pasteryzacji;
* trzecia pasteryzacja działa podobnie jak druga, zabijając
ewentualne opóz
nione bakterie.
5
2012-02-21
Promieniowanie UV
Sterylizacja metodami fizycznymi
" Naświetlanie materiału promieniowaniem ultrafioletowym;
" W gorÄ…cym suchym powietrzu inaczej na  sucho -
" Promieniowanie zmienia strukturę kwasów nukleinowych;
opalanie i wyżarzanie- ezy, głaszczki; wyjaławianie w
" Używa się fal o długości 210-328 nm (najbardziej aktywne jest
suszarkach- w temperaturze 160-180ºC przez 3-4h
promieniowanie o długości fali 254 nm), emitowanych np.
wyjaławia się szkło mikrobiologiczne;
przez lampy rtęciowe;
" Sterylizacja w parze wodnej bieżącej inaczej na
" Promieniowanie ultrafioletowe jest szkodliwe dla ludzi - może
 mokro - pasteryzacja, tyndalizacja, autoklawowanie;
powodować między innymi stany zapalne skóry i zapalenie
" Sterylizacja za pomocÄ… promieniowania (przy =240-
spojówek;
280nm przez 2-3h); promieniowanie UV, ultradz
więki
" Metoda pomocnicza;
(0,2-20Mhz), promieniowanie jonizujÄ…ce (X i Å‚);
Promieniowanie jonizujÄ…ce Sterylizacja ultradz
więkami
" Metoda sterylizacji za pomocÄ… fal ultradz
więkowych o
" Przebiega w sposób bezpośredni, jak i pośredni, przez
częstotliwości powyżej 20 kHz;
produkty radiolizy wody;
" Fale są wytwarzane w generatorach, bardzo silnie oddziałują
" y
ródłem tego promieniowania mogą być na przykład izotopy -
na żywe bakterie;
zwykle używa się izotopu kobaltu 60Co lub wiązka elektronów i
" Bardziej podatne na działania ultradz
więków są bakterie Gram
promieniowanie X, wytworzone w akceleratorze;
ujemne niż Gram dodatnie;
" Wyjaławianie materiałów termolabilnych - wyrobów
" Mechanizm działania ultradz
więków zasadza się na zjawisku
medycznych jednorazowego użytku, produktów leczniczych,
kawitacji, tj. rozrywaniu komórki od wewnątrz na skutek
kosmetyków oraz materiałów transplantacyjnych;
wytworzenia w niej pęcherzyków gazu;
Aparat Kocha -tyndalizacja
Autoklawowanie
" Autoklaw  hermetycznie zamknięty, metalowy kocioł o
" Grubościenny kocioł o podwójnym dnie
podwójnych ścianach stosując nadciśnienie 1 atm,
zamykany pokrywÄ…;
uzyskuje siÄ™ atmosferÄ™ nasyconej pary wodnej o temp.
" Służy do przeprowadzania procesu tyndalizacji
121°C;
lub dezynfekcji za pomocÄ… pary wodnej przy
" W tej temperaturze wszystkie mikroorganizmy i ich
normalnym ciÅ›nieniu w temperaturze 100°C; przetrwalniki zostajÄ… zabite w ciÄ…gu okoÅ‚o 30 min;
" Czas trwania sterylizacji zależy od rodzaju jałowionego
" y
ródłem pary jest woda znajdująca się na dnie
materiału i jego objętości;
kotła, podgrzewana przez system grzewczy;
" Jałowi się podłoża, sól fizjologiczną, bufory, wodę
" Do sterylizacji substancji ze składnikami
destylowaną, narzędzia chirurgiczne, opatrunki, końcówki
odżywczymi (inaczej przetrwalniki nie
do pipet. Nie sterylizuje się stężonych roztworów cukrów
wykiełkują), np. stężone roztwory cukrów,
oraz substancji Å‚atwo hydrolizujÄ…cych;
aminokwasów;
6
2012-02-21
Aparat Kocha
Autoklaw
Komory (boksy)
laminarne do posiewów " Do pracy laboratoryjnej w warunkach
sterylnych;
" Zachodzi w niej przepływ laminarny
(warstwowy, niezaburzony) jałowego
powietrza, które wcześniej zostało poddane
filtracji;
" Komora wyposażona jest w lampę
ultrafioletową, którą włącza się przed pracą
aby dodatkowo wyjałowić wnętrze
(przestrzeń roboczą) komory;
" Jałowe powietrze wydostające się z komory
ciągłym, równomiernym strumieniem, tworzy
barierę utrudniającą wniknięcie do komory
przetrwalnikom bakterii czy zarodnikom
grzybów, które stale unoszą się w powietrzu
poza komorÄ…;
" Często do komory laminarnej na stałe
podłączony jest palnik gazowy (np. do
wyżarzania ez), pomimo że zaburza on
nieco laminarny ruch powietrza;
Do środków chemicznych o
Sterylizacja metodami
Sterylizacja metodami
mechanicznymi (filtracja)
chemicznymi
działaniu odkażającym należy:
" Zasady i kwasy;
" Filtry porcelanowe;
" środek utleniający  chloramina, woda utleniona, jodyna
" Åšrodki utleniajÄ…ce;
" Mikrofiltry membranowe;
" sól metali ciężkich  rtęć, srebro;
" Sole metali ciężkich;
" Filtry z ziemi
" alkohol  działa bakteryjnie, niszczy przetrwalniki;
" Alkohole; okrzemkowej;
" fenol i krezol  oba zwiÄ…zki niszczÄ… bakterie, twory
" Fenol i jego pochodne;
wegetatywne i grzyby (lizol);
" formaldehyd  w roztworze 40% jest stosowany w
laboratoriach i prosektoriach;
" barwnik  fiolet krystaliczny, błękit metalowy;
" detergent  syntetyczny a zarazem organiczny środek
chemiczny o wysokiej aktywności powierzchniowej i wysokiej
sile oczyszczajÄ…cej;
Cechy idealnego środka odkażającego Mikroskop
" Szerokie spektrum działania;
" Nieszkodliwy dla ludzi i zwierzÄ…t;
" Działanie w niskiej temperaturze;
" Trwały i tani;
" Dobrze rozpuszczalny;
" Bezwonny;
" A
atwo dostępny;
7
2012-02-21
Części optyczne Części mechaniczne
Obiektyw suchy i immersyjny
" Statyw, korpus
" Obiektywy;
mikroskopu;
" Okulary;
" Stolik przedmiotowy;
" Kondensor;
" Åšruba ogniskowania
" y
ródło światła;
makro- i mikrometryczna;
" Przesłona;
" Rewolwer;
" Tubus;
Powiększenie mikroskopu równe
" Układ mechaniczny
jest iloczynowi powiększenia
kondensora;
obiektywu i powiększenia
okularu.
8