2011-12-02
Co to jest mikrobiologia?
" Mikrobiologia- wyraz pochodzenia greckiego (mikros
- "mały", bios - "życie", logos - "słowo", "nauka")
Podstawowe techniki badao mikrobiologicznych
oznaczający naukę o najmniejszych istotach żywych,
niedostrzegalnych gołym okiem drobnoustrojach 
mikroorganizmach;
" Do organizmów, którymi zajmuje się mikrobiologia,
należą następujące drobnoustroje: bakterie, wirusy,
grzyby oraz niektóre organizmy z królestwa Protista;
mgr Nina Chrzanowska
pokój 628
Badania mikrobiologiczne
Szkło mikrobiologiczne
1. Metody bezpośrednie
" Brak substancji bakteriobójczych;
" Brak substancji wchodzących w reakcje ze składnikami podłoża;
a) Bakterioskopia;
" Odpornośd na nagłe zmiany temperatury;
b) Hodowla;
" Sterylnośd;
c) Wykrywanie antygenów metodami serologicznymi;
" Wyróżniamy:
d) Wykrywanie DNA lub RNA metodami biologii molekularnej;
2. Metody pośrednie
a) Określenie poziomu przeciwciał w surowicy i płynach
ustrojowych;
b) Próby biologiczne na zwierzętach;
Szalki Petriego Kolby Probówki Pipety szklane
Płytki Periego (szalki) Kolby, zlewki Próbówki Pipety szklane
Sprzęt mikrobiologiczny
Podłoża mikrobiologiczne
" Podłoże ( pożywka) jest to mieszanina związków chemicznych,
Pipety automatyczne, pipety
Oczka bakteriologiczne- ezy, głaszczki;
na których lub w których rosną mikroorganizmy;
pasteurowskie;
Cechy podłoża:
" Odpowiednia ilośd składników odżywczych: z
ródło węgla;
tlenu; wodoru; azotu- azotany, azot atmosferyczny, sole
amonowe, aminokwasy ; soli mineralnych, niekiedy witamin i
czynników wzrostowych;
" Odpowiednie pH;
" Jałowośd;
" Klarownośd;
" Odpowiedni stan skupienia;
" Odpowiednia temp. inkubacji;
" Odpowiednia atmosfera;
1
2011-12-02
Typu pokarmowe mikrobów
Odpowiedni ciśnienie Odpowiednia Odpowiednio dobrana
osmotyczne i PH temperatura inkubacji atmosfera
" Autotrofy (organizmy samożywne)  pobierające C w formie
Acidofile ( phd"5,4) Psychrofile temp. 15-22 °C BezwzglÄ™dne beztlenowce
utlenionych zw. mineralnych (nieorganicznych)  CO2, H2CO3.
np. Lactobacillus spp. np. Flavibacetrium spp. np. Clostridium
Zalicza się do nich niektóre bakterie i wszystkie glony;
" Heterotrofy (organizmy cudzożywne)  wymagające
Neutrofile (pH 5,4-8,5) Mezofile temp. 30-37°C WzglÄ™dne beztlenowce
obecności w środowisku zredukowanych związków
np. większośd np. Escherichia coli np. Escherichia coli
organicznych zawierających C (np. węglowodanów). Są to w
drobnoustrojów ma
optimum pH 7
większości bakterie i wszystkie grzyby;
" Organizmy tej grupy dzielimy na:
Alkalifile ( pH 7-11) Termofile 51°C Mikroaerofile
 saprotrofy  wykorzystujÄ…ce martwÄ… materiÄ™ organicznÄ…, np. Vibrio cholerae np. Thermococcus spp. np. Helicobacter pylori
 biotrofy  pobierajÄ…ce zwiÄ…zki wytwarzane przez organizmy
żywe. W obrębie tych ostatnich wyróżnia się organizmy Bezwględne tlenowce
np. Pseudomonas
pasożytnicze będące sprawcami chorób roślin, zwierząt i
człowieka oraz symbiotyczne, których współżycie przynosi
obu partnerom korzyści;
Podział ze względu na ilośd i jakośd związków
Podział podłoży we względu na stan skupienia
odżywczych
" Podłoża płynne- wprowadzone przez Ludwika Pasteura np.
" Proste np. agar zwykły, woda peptonowa;
bulion, mleko, brzeczka;
" Wzbogacone- z dodatkiem krwi, surowicy lub innych dodatkowych
czynników wzrostowych np. agar z krwią dla Staphylococcus;
" Podłoża stałe- wprowadzone przez Roberta Kocha, powstają
" Wybiórcze (wybiórczo- namnażające) zawierają składniki hamujące wzrost
poprzez dodanie do podłóż płynnych substancji zestalających
nie których bakterii, a stwarzające warunki rozwoju innym gatunkom
jak np. agaru (1,5-3%), żelatyny (12-15%) czy żelu
bakterii, np. bulion z żółcią dla Salmonella; podłoże SF dla Shigella i
krzemionkowego; Salmonella;
" Różnicujące (wybiorczo- różnicujące) służą do badania procesów
" Podłoża półpłynne- poprzez dodanie do podłoża płynnego
biochemicznych przeprowadzanych przez bakterie, zawierajÄ… substrat dla
0,1-0,8% agarozy;
bakterii tzw. wskaz
nik, który powoduje zmianę zabarwienia podłoża w
wyniku jego rozkładu np. podłoże z purpurą bromokrezolową i laktozą;
podłoże Chapmana, podłoże MacConkeya;
" Podłoża specjalne- z dodatkiem węglowodanów lub innych specyficznych Ze względu na skład podłoża dzielimy:
substratów np. agar czekoladowy, pożywka Sabouranda;
" Podłoża naturalne- uzyskiwane bezpośrednio z tkanek
zwierzęcych bądz
roślinnych (skład znany w przybliżeniu) np.
mleko, ziemniaki, owoce;
" Podłoża syntetyczne- skład ilościowy i jakościowy
dokładnie znany;
" Podłoża transportowe- stosowane przy przesyłaniu materiału klinicznego
do laboratorium, zawiera sole mineralne i bufory, zabezpieczajÄ…ce
" Podłoża półsyntetyczne- znany tylko skład zw.
żywotnośd drobnoustrojów obecnych w materiale;
nieorganicznych, często są to podłoża syntetyczne z
dodatkiem wyciągu z tkanek zwierzęcych i roślinnych;
" Podłoże dla bakterii beztlenowych- Pożywka z tioglikolanem sodu,
cysteiną, heminą i witaminą K, niezbędna zwłaszcza dla
przetrwalnikujÄ…cych z grupy Clostridium
2
2011-12-02
Metody i warunki hodowli drobnoustrojów
Wzrost drobnoustrojów w podłożu płynnym
" wykonuje się zanurzając oczko ezy lub koocówkę pipety z pobranym
" Metody
materiałem w podłożu;
" Hodowla (kultura)- pożywka płynna lub stała wraz z
rozwijajÄ…cymi siÄ™ w niej mikroorganizmami;
" Czysta kultura (monokultura)- hodowla zawierajÄ…ca
drobnoustroje jednego gatunku!
" Mieszana kultura- zawiera drobnoustroje z licznych " dyfuzyjny (zmętnienie)- równomierny w całej objętości podłoża, w postaci
zmętnienia, charakterystyczny dla drobnoustrojów względnie beztlenowych.
gatunków
Dodatkowo przy wzroście dyfuzyjnym na powierzchni podłoża może wystąpid
membrana, pierścieo lub osad na dnie probówki;
" Warunki
" w postaci kożuszka na powierzchni - typowy dla drobnoustrojów ściśle
" Tlenowe ( w cieplarkach)
(bezwzględnie) tlenowych;
" w postaci pierścienia tuż pod powierzchnia podłoża - typowy dla
" Mikroareofilne ( cieplarki z Co2)
mikroaerofilnych mikroorganizmów, tj. rosnących przy obniżonej zawartości tlenu
" beztlenowe ( anaerostaty z pompa próżniową)
(5%);
" w postaci osadu na dnie - typowy dla drobnoustrojów preferujących warunki
beztlenowe. Osad może mied formę kłaczków lub grudek;
Wzrost drobnoustrojów na podłożu stałym
Kolonia- CFU (ang. colony forming unit )
" PÅ‚ytkach;
Metoda powierzchniowa
" Na podłożach stałych (na płytkach) drobnoustroje tworzą kolonie;
" Skosach;
Równomiernie rozprowadzid materiał
" SÅ‚upkach;
" Kolonią nazywamy widocznym gołym okiem skupisko komórek
badany na powierzchni zestalonej
rozwijające się z pojedynczej komórki bakterii;
Metoda głębinowa pożywki na płytce bądz
w probówce
" CFU (ang. colony forming unit  jednostka tworząca kolonię)  skrót
(agar skośny);
Na dno jałowych płytek Petriego
oznaczający pojedyncze (wyjściowe) komórki, z których w wyniku
" Materiał badany na płytki nanosi się
wylad 1 ml (1000µl) materiaÅ‚u
pipetami automatycznymi i równomiernie
podziałów powstaną pojedyncze kolonie komórek;
badanego i zalad ostudzonÄ…
rozprowadza opalonymi głaszczkami;
pożywką stałą- zawartośd płytki
równomiernie wymieszad;
x=a*b*10, gdzie:
" Posiewy na agarze skośnym wykonuje się
igłą lub ezą;
x= jtk/ml;
a= liczba wyrosłych kolonii;
b= odwrotnośd rozcieoczenia;
10= przeliczenie na 1 ml;
Cechy hodowli bakteryjnej
" Przykład:
" Wymiary ;
Pobrano wodÄ™ do analizy mikrobiologicznej. Po 1000-krotnym jej
" Kształt;
rozcieoczeniu i wylaniu 0,1 ml na płytkę z pożywką stwierdzono,
" Barwa;
kolisty nieregularny soczewkowaty nitkowaty rozgałęziony
że w wyniku hodowli na płytce powstało 15 kolonii. Jakie było
" Wyniosłośd;
" Powierzchna;
stężenie bakterii w badanej wodzie?
" Struktura;
płaski wyniosły soczewkowaty pępkowaty
" Brzegi;
" Przezroczystośd;
" Zawieszalnośd w płynach;
gładki falisty płatowaty nitkowaty z obwódką
" Zapach;
" Inne cechy np.: typ hemolizy Ä… (Streptococcus pneumoniae),² (Staphylococcus
aureus) ,c (Staphylococcus epidermidis);
Odpowiedz
: 15 kolonii odpowiada 15 komórkom w rozcieoczonym 1000-
krotnie roztworze (wynika to z definicji CFU). Ponieważ na płytkę wylano 0,1
ml takiego roztworu, w 1 ml znajdowało się 150 komórek bakteryjnych.
Uwzględniając rozcieoczenie, można stwierdzid, że stężenie bakterii w
analizowanej wodzie wynosiło 150 000 komórek/ml
3
2011-12-02
Posiew
Rozcieoczenia próbek
redukcyjny
" Badania mikrobiologiczne
prowadzi siÄ™ zazwyczaj
posługując się czystymi
kulturami;
" JednÄ… z technik
prowadzÄ…cÄ… do izolacji
czystych kultur jest posiew
redukcyjny;
" Metoda ta polega na
zaszczepieniu materiału na
płytkę Petriego według
schematu
przedstawionego obok;
Metody bezpośredniego liczenia drobnoustrojów: Metody pośredniego liczenia bakterii
Wykonanie posiewu
Metody te polegają na bezpośrednim liczeniu drobnoustrojów pod
mikroskopem.
" Na podstawÄ™ z wybranym podÅ‚ożem nanosi siÄ™ 100 µl (0,1 ml)
" Mikroskopia fluorescencyjna (DEFT)
produktu lub jego rozcieoczenia; Warunki inkubacji:
Wykonanie oznaczenia obejmuje filtrowanie odpowiednio przygotowanej
odpowiednie dla oznaczanej grupy drobnoustrojów;
próby a następnie barwienie osiadłych na filtrze drobnoustrojów
fluorescencyjnym barwnikiem np. oranżem akrydyny i policzenie liczby Inne: Petrifilmy, system płytki spiralnej, metoda sączenia przez
bakterii przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Technika ta pozwala na
filtr membranowy;
oznaczenie komórek martwych i żywych;
" Liczenie drobnoustrojów przy użyciu komór
Komory do liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem to najczęściej
szklane płytki z wyciętym wgłębieniem, podzielonym na kwadraty lub
prostokÄ…ty o znanej powierzchni. Po naniesieniu rozcieoczenia do komory
dokonuje się liczenia komórek widocznych w obrazie mikroskopowym, a
następnie przelicza się ich liczbę na 1 cm3 badanego materiału. Najczęściej
stosuje siÄ™ komory: Thoma, Howarda, Börkera, Fuch Rosenthala;
Częśd praktyczna:
Pamiętad o zachowaniu jałowych warunków!!!
" Przygotowanie rozcieoczeo- 10-1, 10-2, 10-3, 10- 4 i 10-5;
" WÅ‚Ä…czony palnik;
" Posiew powierzchniowy- 100 µl odpowiedniego rozcieoczenia
" Opalanie brzegu kolbek, probówek;
na szalkę, wygłaskad zawiesinę wypaloną głaszczką;
" Wyżarzanie ez, igieł bakteriologicznych, głaszczek w płomieniu
" Posiew głębinowy- 1 ml odpowiedniego rozcieoczenia na dno
palnika;
szalki; zalad (rozpuszczonym) podłożem stałym;
" Delikatne uchylanie wieczek szalek Petriego i pokrywek do
" Posiew na agar skośny- ezą, bądz
igłą bakteriologiczną zrobid
koocówek do pipet;
rysÄ™ na agarze;
" Przed i po pracy przetrzed powierzchnię na której pracujemy
" Posiew na podłoże płynne- ezą, bądz
pipetÄ… zaszczepid
denaturatem bÄ…dz
etanolem!
podłoże;
4