2010/2011
Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych
Serologia transfuzjologiczna
Immunohematologia
Serologia grup krwi
Podstawowe techniki badań
Podstawowe techniki badań
Zajmuje się między innymi:
immunohematologicznych
immunohematologicznych
określaniem budowy antygenowej składników krwi
(zwłaszcza erytrocytów)
badaniem odpowiedzi immunologicznej na antygeny
Joanna Urbaniak
znajdujące się na komórkach i białkach krwi
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
Układ grupowy
Wiadomości ogólne
Tworzą antygeny zdeterminowane bezpośrednio
1. Prawie 300 różnych antygenów
lub pośrednio przez allele zajmujące to samo locus
2. Co najmniej 30 układów grupowych
w chromosomie lub miejsca położone tak blisko siebie,
3. Za istotne klinicznie uważa się te antygeny, które mogą
że zjawisko crossing-over zdarza się między nimi
indukować powstawanie przeciwciał nieregularnych
bardzo rzadko.
odpowiedzialnych za:
- wczesne lub póz
ne reakcje poprzetoczeniowe
- rozwój choroby hemolitycznej płodu i noworodka
- hemolizÄ™ po przeszczepieniu szpiku lub KKM
Układy grupowe erytrocytów
Układ grupowy
Antygen zalicza się do układu grupowego, jeśli: 001 ABO 011 YT 021 Cromer
002 MNSs 012 Xg 022 Knops
Antygen indukuje powstawanie swoistych przeciwciał
003 P 013 Scianna 023 Indian
Wykryto i zlokalizowano gen i ustalono jego
004 Rh 014 Dombrock 024 Ok
sekwencjÄ™ nukleotydowÄ…
005 Lutheran 015 Colton 025 Raph
Wykazano, że gen jest różny od innych dotychczas
006 Kell 016 Landsteiner-Wiener 026 John Milton Hagen
poznanych
007 Lewis 017 Chido/Rodgers 027 I
Wykazano dziedziczenie antygenu
008 Duffy 018 H 028 Globside
Antygeny nie spełniające wszystkich kryteriów zalicza
009 Kidd 019 Kx 029 Gill
siÄ™ do kolekcji lub serii
010 Diego 020 Gerbich 030 RhAG
Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej Strona 1 z 6
2010/2011
Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych
Składowe reakcji aglutynacji
Natura łączenia antygenu z przeciwciałem
wiÄ…zania jonowe
Poszukiwany Poszukiwane
wiÄ…zania wodorowe
antygen na krwinkach przeciwciała w surowicy
siły Van der Waalsa
krwinki badane surowica badana
interakcje hydrofilowe i hydrofobowe
+ +
przeciwciała o znanej krwinki o znanej
swoistości budowie antygenowej
Dwie fazy reakcji aglutynacji
(wzorcowe) (wzorcowe)
I. Uczulanie, opłaszczanie
II. Sieciowanie, aglutynacja
Warunki reakcji uzależnione są od właściwości przeciwciał
I. Uczulanie
W środowisku  solnym (0.15 M NaCl)
wiązanie przeciwciał z antygenem na powierzchni
erytrocytów
+ potencjał zeta
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
25 nm
+
+ odległość pomiędzy krwinkami
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+
Odległość pomiędzy miejscami wiążącymi antygen:
dla przeciwciał klasy IgM 30 nm; klasy IgG 14 nm
II. Sieciowanie
Czynniki odgrywajÄ…ce rolÄ™ w fazie uczulenia
Temperatura; optymalna dla IgM 4-27oC, IgG 37oC
Przeciwciała  kompletne Przeciwciała  niekompletne
pH; stosuje się roztwory o pH około 7.0
IgM IgG
Czas inkubacji; zależny od:
- klasy przeciwciał
Temperatura pokojowa Temperatura 37oC
- powinowactwa przeciwciała do antygenu
0.15 M NaCl Środowisko o obniżonej
- środowiska reakcji
sile jonowej (0.03 M NaCl)
Siła jonowa; reakcja przebiega szybciej przy niższej sile
Enzym proteolityczny
jonowej
Surowica antyglobulinowa
Stosunek ilościowy antygenu i przeciwciała; zwiększanie
Polibren
ilości przeciwciał w stosunku do antygenu na krwinkach
PEG
zwiększa czułość reakcji
Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej Strona 2 z 6
2010/2011
Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych
Aglutynacja krwinek przy udziale przeciwciał  niekompletnych
wymaga zmniejszenia odległości pomiędzy krwinkami poprzez
Przeciwciała  kompletne umożliwiają
zmniejszenie Å‚adunku ujemnego lub/i otoczki wodnej
powstawanie aglutynatów
w środowisku soli fizjologicznej
w temperaturze pokojowej
papaina i bromelina
usuwajÄ… reszty kwasu sjalowego
i/lub modyfikują cząsteczki wiążące wodę
i/lub zmniejszajÄ… przeszkody steryczne
polibren, polimer o Å‚adunku dodatnim,
neutralizuje Å‚adunek powierzchniowy
Test LEN
Aglutynację krwinek przy udziale przeciwciał
 niekompletnych umożliwia zastosowanie surowicy
antyglobulinowej pośredni test antyglobulinowy, PTA)
Krwinki
Poliwalentna
wzorcowe
anty-IgG i C3b i C3d
Monowalentna
anty-IgG lub
anty-C3b lub
anty-C3d lub
IgA lub ...
Inkubacja z LEN Surowica
LISS + papaina badana
Bezpośredni test antyglobulinowy, BTA
Pośredni test antyglobulinowy, PTA
Surowica Krwinki Surowica
badana wzorcowe antyglobulinowa
Do przemytych erytrocytów dodaje się surowicę antyglobulinową
Inkubacja
Erytrocyty in vivo opłaszczone przeciwciałami są aglutynowane
Przemywanie
Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej Strona 3 z 6
2010/2011
Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych
Test hamowania aglutynacji
Test hamowania aglutynacji
Do badanego roztworu dodaje się znane przeciwciała
a następnie krwinki czerwone zawierające poszukiwany
antygen. Jeśli w badanym roztworze był obecny
rozpuszczalny antygen połączy się z przeciwciałami,
a krwinki wzorcowe pozostanÄ… wolne.
Brak aglutynacji, obecny rozpuszczalny antygen A
{osocze + anty-A} + krwinki grupy A
aglutynacja brak rozpuszczalnego antygenu A
brak aglutynacji obecny antygen A
Aglutynacja, brak rozpuszczalnego antygenu A
Testy szkiełkowe
Techniki reakcji serologicznych
Reakcje antygen przeciwciało przeprowadza się:
na płytach szklanych, porcelanowych,
1. Testy szkiełkowe Metody manualne
polistyrenowych, szkiełkach podstawowych
2. Testy probówkowe Metody automatyczne
Najczęściej wykorzystywana, jeśli jednym ze
3. Testy mikropłytkowe
składników reakcji są przeciwciała  kompletne
4. Testy kolumnowe
W Polsce głównie: AB0 i Rh
Całkowita aglutynacja, jeden duży zlep ++++ score 12
Testy probówkowe
Reakcje antygen przeciwciało przeprowadza się
CaÅ‚kowita aglutynacja, duże zlepy +++ score 10 w  probówkach serologicznych Ø 7 mm
Częściowa aglutynacja, średnie zlepy, ++ score 8
w tle niezaglutynowane krwinki
Częściowa aglutynacja, drobne zlepy, + score 5
w tle niezaglutynowane krwinki
Bardzo słaba aglutynacja, wątpliwa, +/- score 2
Brak aglutynacji, reakcja ujemna, - score 0
jednorodna zawiesina krwinek
Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej Strona 4 z 6
2010/2011
Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych
Testy mikropłytkowe
Testy probówkowe
Płytki mikrotitracyjne z dnem U lub V kształtnym.
Testy enzymatyczne (LEN)
Modyfikacje pośredniego testu antyglobulinowego
(PTA-NaCl, PTA-LISS, PTA-PEG)
Bezpośredni test antyglobulinowy (BTA)
Reakcje zwykle przeprowadzane techniką szkiełkową,
jeśli konieczne jest zwiększenie czułości reakcji
Przy zastosowaniu płytek o specjalnej budowie dołka
technika została zautomatyzowana.
Testy kolumnowe
Testy kolumnowe
Mikrokolumienki wypełnione żelem lub kulkami szklanymi,
Odczyt wyniku reakcji: wzrokowy lub automatyczny
pełnią funkcje sita molekularnego
4 3 2 1 0
Testy kolumnowe są metodą zalecaną ze względu na:
Reakcje nietypowe
możliwość standaryzacji badania
Rulonizacja
eliminacjÄ™ reakcji nieswoistych, np. rulonizacji
krwinek
Hemoliza
wysoką czułość badania
bardziej obiektywny odczyt wyniku
Aglutynacja mieszana
skrócenie czasu badania
Poliaglutynacja
mniejsze zużycie krwinek i odczynników wzorcowych
możliwość automatyzacji
Panaglutynacja
Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej Strona 5 z 6
2010/2011
Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych
Rulonizacja Rulonizacja
Rulonizacja makroskopowo przypomina słabą Rulonizacja makroskopowo przypomina słabą
aglutynacjÄ™, aglutynacjÄ™,
Surowica badana  aglutynuje krwinki każdej grupy Surowica badana  aglutynuje krwinki każdej grupy
może pojawić się u osób z zaburzeniami składu może pojawić się u osób z zaburzeniami składu
białek osocza (makroglobulinemie, choroby białek osocza (makroglobulinemie, choroby
nowotworowe, oparzenia) nowotworowe, oparzenia),
po podaniu dekstranu lub środka kontrastowego po podaniu dekstranu lub środka kontrastowego
do badań radiologicznych do badań radiologicznych.
Różnicowanie: Różnicowanie:
ocena mikroskopowa ocena mikroskopowa
Hemoliza
Aglutynacja mieszana
Hemoliza krwinek występuje, gdy przeciwciała
Pod wpływem odczynnika wzorcowego część krwinek ulega
(allohemolizyny) po zwiÄ…zaniu z antygenem krwinek
aktywują dopełniacz aglutynacji, część pozostaje w zawiesinie
hemolizy nie wolno przeoczyć, oznacza reakcję dodatnią
Obecność słabej odmiany antygenu (A3, B3)
trzeba powtórnie przeprowadzić reakcję
Przetoczenie krwinek innej grupy (np. krwi
po rozcieńczeniu surowicy NaCl 1:9 lub
uniwersalnej)
po zniszczeniu dopełniacza, np. przez ogrzewanie Po przeszczepieniu allogenicznych komórek
surowicy przez 30 minut w temperaturze 56oC
macierzystych od dawcy o innej grupie krwi AB0
(chimera transplantacyjna)
hemoliza może być spowodowana błędami
technicznymi, tj. domieszkÄ… wody
Poliaglutynacja/Panaglutynacja
zjawisko aglutynowania w testach serologicznych
wszystkich krwinek badanych pod wpływem każdej
surowicy pochodzenia ludzkiego na skutek odsłonięcia
determinant T, Tn i/lub innych na krwinkach pod wpływem
enzymów bakteryjnych (m.in. neuraminidazy)
Poliaglutynacja - odsłonięcie determinant zachodzi in vivo,
zwykle w przebiegu zakażenia
Panaglutynacja - odsłonięcie determinant zachodzi in vitro,
z powodu zakażenia samej próbki
Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej Strona 6 z 6