Ćwiczenie 3

Metody oznaczania stężenia białka

Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych

• Kwas ortofosforowy – C

• Wodorotlenek sodu – C

• Miedzi (II) siarczan kryst. 5 hydrat – Xn, N

• Etanol 96% - F

SPEKTROFOTOMETRIA ABSORPCYJNA

W metodach spektrofotometrycznych wykorzystuje się zjawisko pochłaniania (selektywnej absorpcji)

promieniowania przez badane substancje w celu ich wykrycia, identyfikacji lub ilościowego oznaczenia, gdyż

cechą charakterystyczną każdej substancji chemicznej jest zdolność do absorpcji ściśle określonych kwantów

promieniowania z zakresu widma elektromagnetycznego. Ze względu na wykorzystywany zakres widma (Tab. 1)

dokonuje się podziału na spektrofotometrię absorpcyjną w świetle widzialnym, zwaną kolorymetrią

i absorpcjometrię w nadfiolecie i podczerwieni. W badaniach analitycznych zastosowanie znalazła

absorpcjometria w zakresie światła widzialnego (VIS) oraz bliskiego ultrafioletu (UV). Absorpcja promieniowania

z tych przedziałów długości fal zależy głównie od ilości i rozmieszczenia elektronów w badanej cząsteczce, oraz

powoduje wzbudzenie cząsteczki danego związku polegające na przeniesieniu elektronów na wyższy poziom

energetyczny.

Rodzaj promieniowania

Długość fali

promienie γ

poniżej 10 pm

promienie X

10 pm-10 nm

ultrafiolet daleki

10-200 nm

ultrafiolet bliski

200-390 nm

światło widzialne

390-800 nm

podczerwień

800 nm-1 mm

Mikrofale

1 mm-30 cm

Tabela 1 Widmo promieniowania elektromagnetycznego.

Ilościową miarą charakteryzującą zdolność pochłaniania promieniowania przez dany związek jest absorbancja

oznaczana literą A (Uwaga: absorbancja zwana jest też ekstynkcją i oznaczana literą E). Pomiar absorbancji

oparty jest na prawie Lamberta-Beera, które określa zależność pomiędzy natężeniem promieniowania

padającego na roztwór danego związku (Io) a natężeniem promieniowania przechodzącego (I) przez warstwę

badanej próbki zgodnie z poniższym wzorem:

A = log (Io / I) = kcl

1

A – absorbancja (ekstynkcja)

Io – natężenie światła monochromatycznego o określonej długości fali padającego na roztwór

I – natężenie światła po przejściu przez roztwór

k – współczynnik absorbancji właściwej dla danej długości fali, wielkość charakterystyczna dla danej

substancji (niezależna od jej stężenia) i rozpuszczalnika dla danej długości fali, liczbowo równa

absorbancji roztworu o stężeniu 1 mol/l i grubości warstwy l = 1 cm

c – stężenie danego związku (mol/l)

l – grubość warstwy absorbującej, standardowo l = 1 cm, gdyż w badaniach biochemicznych grubość

stosowanych kuwet wynosi zwykle 1 cm

Badanie selektywnego pochłaniania promieniowania przez dany związek w zależności od długości fali λ pozwala

na wyznaczenie jego widma absorpcyjnego. Rozkład maksimów i minimów w widmie zależy od właściwości

barwnych związku (maksimum absorbancji określa barwę). Gdy zakres długości fal promieniowania

absorbowanego przez dany związek jest dostatecznie wąski, to związek ten ma barwę dopełniającą do barwy

absorbowanego promieniowania. Jeśli dany związek absorbuje promieniowanie o kilku barwach, to jego

ostateczna barwa jest kombinacją barw dopełniających do tych absorbowanych. Związki bezbarwne nie

pochłaniają fal w widzialnym obszarze widma, a z kolei związki czarne pochłaniają wszystkie długości fal. Dzięki

znajomości widma absorpcyjnego badanego związku możliwe jest oznaczenie jego stężenia (ilości) w roztworze,

gdyż można wybrać światło monochromatyczne o takiej długości fali, która jest maksymalnie absorbowana przez

dany związek. Do oznaczania stężenia bezbarwnych związków stosuje się specjalne odczynniki, z którymi tworzą

one barwne pochodne.

A

Rys. 1 Widmo absorpcyjne

Stężenie badanej substancji w roztworze można obliczyć:

1. korzystając bezpośrednio z prawa Lamberta-Beera dokonując pomiaru absorbancji próby badanej (Ab)

i absorbancji próby wzorcowej o znanym stężeniu (Aw):

Ab/Aw = kcbl/kcwl = cb/cw ⇒ cb = (Ab/Aw)cw

Uwaga: Powyższą zależność można stosować tylko wtedy, gdy obserwuje się prostoliniową zależność

między stężeniem danego związku a mierzoną absorbancją.

2. stosując krzywą kalibracyjną (wzorcową, standardową)

Dokonuje się pomiaru absorbancji próby badanej (Ab) i absorbancji kilku prób wzorcowych o znanym

stężeniu (Aw1...Awn), a po wykreśleniu zależności absorbancji próbek wzorcowych (Aw) od ich stężenia

(cw) otrzymuje się prostą przechodząca przez początek układu współrzędnych. Znając absorbancję badanej

próby z krzywej wzorcowej odczytuje się stężenie zawartego w niej związku, ale jedynie w jej prostoliniowym

zakresie.

Uwaga 1: Na osi odciętych odkłada się wartości stężeń, a na osi rzędnych – uzyskane wartości absorbancji.

Uwaga 2: Przyjmuje się, że absorbancja czystego rozpuszczalnika (w którym rozpuszczony się dany

związek) i względem, którego wykonuje się pomiary spektrofotometryczne wynosi zero. Ślepa odczynnikowa

2

(ślepa, próbka kontrolna) składa się ze wszystkich odczynników dodawanych w takiej samej ilości oraz takiej

samej kolejności jak miało to miejsce w przypadku próbki właściwej.

a

Absorbancja

b

Stężenie [mg/ml]

Rys. 2 Krzywe wzorcowe dla: a – roztworu stosującego się do prawa Lamberta-Beera, b – roztworu

wykazującego przy dużych stężeniach odchylania od praw absorpcji.

1. Oznaczanie zawartości białka metodą pomiaru w nadfiolecie

Aminokwasy nie absorbują światła widzialnego (tj. są one bezbarwne) i z wyjątkiem aminokwasów

aromatycznych (Trp, Tyr, Phe, His) nie absorbują również światła nadfioletowego o długości powyżej 240 nm.

Białka natomiast absorbują światło nadfioletowe w paśmie 260-290 nm, ze względu na obecność w ich

łańcuchach aminokwasów aromatycznych (głównie reszt Trp i Tyr odpowiedzialnych za pochłanianie większości

światła ultrafioletowego). Zwykle odczytu absorbancji białek dokonuje się przy długości fali 280 nm, gdyż Trp i Tyr

wykazują maksimum absorbancji właśnie przy tej długości fali. Przyjmuje się, że ilość zaabsorbowanego światła

jest proporcjonalna do ilości białka, ale różne ilości Trp i Tyr w poszczególnych białkach powodują utrudnienie

w ilościowej ocenie stężenia białka w roztworze tą metodą. Dodatkowo w tym samym zakresie światła UV

absorbują również kwasy nukleinowe i nukleotydy, których maksimum pochłaniania jest przy długości fali 260 nm.

W zmodyfikowanej metodzie spektrofotometrycznej stężenie białka w próbce określa się na podstawie

różnicy absorbancji mierzonych przy długościach fal 260 i 280 nm stosując kuwetę kwarcową o grubości 1 cm,

a stężenie białka wyrażone w mg/ml oblicza się wg wzoru podanego przez Layne’a:

Cbiałka = 1,55 * A280 – 0,76 * A260

Zaletą zmodyfikowanej metody spektrofotometrycznej jest możliwość szybkiego określenia stężenia białka w

dużej ilości próbek bez konieczności korzystania z odnośnika białkowego i krzywej kalibracyjnej, również przy

dokonywaniu pomiarów w małej ilości materiału w obecności dużych stężeń NaCl czy (NH4)2SO4. Jest to metoda

wykorzystywana na przykład przy oznaczaniu stężenia białka we frakcjach uzyskiwanych podczas rozdziału

chromatograficznego na kolumnach. Ponadto metoda ta eliminuje wkład kwasów nukleinowych

w wartość mierzonej absorbancji, o ile ich zawartość w mieszaninie nie jest większa niż 20%. Niemniej jednak

metoda ta jest obarczona dużym błędem i daje tylko przybliżone wyniki, gdyż zarówno białka, jak i kwasy

nukleinowe, nie dają identycznych wartości absorbancji maksymalnych przy jednakowych stężeniach. Ponadto,

również inne związki małocząsteczkowe (puryny, pirymidyny, fenole) cechują się duża absorbancją przy 260 nm

i 280 nm.

Wykonanie

Zmierzyć wartość absorbancji próbki badanej przy długościach fal 260 i 280 nm wobec ślepej odczynnikowej tj.

roztworu/rozpuszczalnika, w którym jest rozpuszczone białko; w kuwecie kwarcowej o grubości 1 cm. Obliczyć

orientacyjną zawartość białka korzystając z podanego powyżej wzoru. Do kuwety odpipetować po 0,5 ml

roztworów próbek badanych P1, P2, P3 i P4.

2. Oznaczanie zawartości białka metodą mikrobiuretową

Zasada oznaczania – patrz metoda biuretowa Piotrowskiego (Ćwiczenie 2).

3

Dzięki zastosowaniu spektrofotometrycznego pomiaru absorbancji fiołkowego kompleksu powstającego na

skutek reakcji jonów miedzi w środowisku zasadowym z wiązaniami peptydowymi, przy długości fali 310 nm

uzyskuje się 50-krotny wzrost czułości oryginalnej metody biuretowej opracowanej przez Itzhaki i Gil ( Itzhaki RF,

Gil DM (1964) Anal Biochem 9: 401-10). Dodatkowo, opcjonalne traktowanie oznaczanej próby 0,5 M roztworem

NaOH zamiast wody, umożliwia oznaczenie zawartości białka w płynach biologicznych, homogenatach

komórkowych czy frakcjach subkomórkowych. Rodzaj oznaczanego białka nie ma wpływu na wartość mierzonej

absorbancji.

Wykonanie

Przygotować próbki seri A i B wg Tabeli 1. Do każdej probówki seri A dodać po 0,25 ml 0,21% roztworu

CuSO4*5H2O w 30% roztworze NaOH, a do probówek seri B – po 0,25 ml 30% roztworu NaOH. Zawartość

eppendorfów wymieszać i po upływie 5 minut zmierzyć w spektrofotometrze UV-VIS absorbancję wszystkich

próbek przy długości fali 310 nm. Absorbancję próbek seri A odczytać wobec ślepej odczynnikowej Ao (parametr

A dla każdej próbki seri A), natomiast absorbancję próbek seri B wobec ślepej odczynnikowej Bo (parametr B).

Absorbancję właściwą wszystkich oznaczanych prób obliczyć z różnicy A-B. Na podstawie otrzymanych wartości

absorbancji właściwej dla wzorcowych roztworów BSA uzupełnić Tabelę 1 i wykreślić krzywą kalibracyjną

zależności zmierzonych absorbancji od stężenia białka. Z krzywej kalibracyjnej odczytać zawartość białka

w badanych próbkach P1, P2, P3 i P4.

Uwaga: wszystkie oznaczenia wykonywać w trzech równoległych powtórzeniach.

3. Oznaczanie zawartości białka metodą Bradforda

Bradford MM (1976) Anal Biochem 72: 248-54.

W metodzie Bradforda wykorzystywana jest zdolność wiązania się barwnika zwanego błekitem

kumazyny (ang. Coomassie Bril iant Blue G-250) z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych.

Z barwnikiem reagują głównie reszty argininy, a w minimalnym stopniu reszty histydyny, lizyny, proliny, tryptofanu

i tyrozyny. W środowisku kwaśnym (w roztworze kwasu H3PO4) błękit kumazyny przyjmuje zabarwienie brunatne.

Dodanie błękitu kumazyny do roztworu białka powoduje powstawanie kompleksu o intensywnie niebieskim

zabarwieniu i przesunięcie maksimum absorbancji barwnika z 465 nm do 595 nm. Efekt ten jest konsekwencją

występowania barwnika w dwóch różnych formach – brunatnej i niebieskiej. Forma brunatna ulega konwersji do

niebieskiej po związaniu się barwnika z białkiem. Wiązanie to jest procesem bardzo szybkim (poniżej 2 minut), a

kompleks barwnik-białko pozostaje trwały i nie agreguje w roztworze przez stosunkowo długi czas (do 60 minut).

Natężenie barwy niebieskiej jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze. Optymalny czas pomiaru

wynosi od 5 do 20 minut od dodania odczynnika Bradforda do próbki. Zaletami metody są prostota

i szybkość wykonania, oraz jej czułość (białko może być wykryte przy jego stężeniu w granicach 2-8 µg/ml).

Oznaczenie można wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, wersenianu sodu (EDTA),

jonów magnezu, sacharozy, glikolu i związków tiolowych. Wadą metody jest różne wiązanie barwnika przez różne

białka, a ponadto fakt, że aceton, siarczan dodecylu sodu (SDS) i Triton X-100 dają w połączeniu

z barwnikiem dodatkowy interferujący kolor, co zwiększa natężenie barwy niebieskiej i przeszkadza w uzyskaniu

wiarygodnych wyników.

Wykonanie

Przygotować ślepą odczynnikową, wzorce oraz próbki badane wg Tabeli 2. Do każdej próbki dodać po 250 µl 5-

krotnie rozcieńczonego odczynnika Bradforda. Po upływie minimum 5 minut (a przed upływem 20 minut) od

momentu dodania odczynnika Bradforda, zmierzyć w czytniku do płytek titracyjnych wartości OD wszystkich

próbek przy długości fali 595 nm. Na podstawie otrzymanych wartości OD595 uzupełnić Tabelę 2. Od wartości

OD595 dla wzorców i próbek badanych odjąć wartość OD595 ślepej odczynnikowej. Wykreślić krzywą kalibracyjną

zależności zmierzonych OD595 od stężenia białka. Z krzywej kalibracyjnej odczytać zawartość białka w badanych

próbkach P1, P2, P3 i P4.

Uwaga: wszystkie oznaczenia wykonywać w trzech równoległych powtórzeniach.

Odczynniki

wzorcowe roztwory BSA o stężeniu 1mg/ml i 0,5 mg/ml; roztwory badanych próbek P1, P2, P3 i P4;

30% roztwór NaOH ; 0,21% roztwór CuSO4*5H2O w 30% NaOH; odczynnik Bradforda: 0,01% (w/v) błękit

kumazyny, 4,7% (w/v) etanol, 8,5% (w/v) kwas ortofosforowy

4