METODY BADAC
W BIOLOGII
TECHNIKI FRAKCJONOWANIA ORGANELLI
HOMOGENIZACJA  rozbicie tkanek i komórek za pomocą dz
więku (sonikacja),
detergentu (permeabilizacja) lub wysokiego ciśnienia. W wyniku tego procesu
otrzymuje siÄ™ zawiesinÄ™ (homogenat = ekstrakt) zawierajÄ…cÄ… enzymy, rybosomy,
metabolity i wszystkie organelle otoczone błonami.
Rozbicie komórek Podziurawienie błony
dz
więkiem o wysokiej łagodnym detergentem
częstotliwości (permeabilizacja)
(sonikacja)
Zawiesina komórek
lub tkanka
Prawidłowo przeprowadzona
homogenizacja pozwala zachować
większość organelli otoczonych
błonami w stanie nienaruszonym
Przeciskanie komórek Ściskanie komórek
przez mały otwór pod między tłokiem a
wysokim ciśnieniem ścianami naczynia
TECHNIKI FRAKCJONOWANIA ORGANELLI
CzÄ…steczki zawieszone w roztworze:
Øð opadajÄ… (SEDYMENTACJA), jeżeli ich gÄ™stość jest wiÄ™ksza od gÄ™stoÅ›ci rozpuszczalnika;
Øð pÅ‚ywajÄ… (wolnym ruchem), jeżeli ich gÄ™stość jest mniejsza od gÄ™stoÅ›ci rozpuszczalnika;
Øð tworzÄ… zawiesinÄ™, kiedy nie ma różnic w gÄ™stoÅ›ci miÄ™dzy czÄ…steczkami a roztworem.
W rotorze wirówki wytwarzana jest siła kilkaset tysięcy razy
przewyższająca ziemską grawitację.
Prędkość osadzania się cząsteczek podczas
wirowania zależy od rotora (jego prędkości
kątowej i promienia) oraz właściwości
sedymentacyjnych czÄ…steczek.
Właściwości sedymentacyjne określa się
współczynnikiem sedymentacji (jednostką
jest swedberg S; 1 swedberg = 10-13 s).
TECHNIKI FRAKCJONOWANIA ORGANELLI
WIROWANIE RÓŻNICOWE
WIROWANIE RÓŻNICOWE  metoda rozdziału homogenatu komórkowego na jego
składniki. Rozdział składników komórki zależy od ich wielkości i gęstości (większe i
gęstsze sedymentują w postaci osadu, a mniejsze i mniej gęste pozostają w roztworze
zwanym supernatantem).
SUPERNATANT 1 SUPERNATANT 2 SUPERNATANT 3
WIROWANIE Z
MAA

SZYBKOÅšCI

WIROWANIE ZE
WIROWANIE Z
WIROWANIE Z
ÅšREDNI

DUÅ»

BARDZO DUÅ»

SZYBKOÅšCI

SZYBKOÅšCI

SZYBKOÅšCI

HOMOGENAT
OSAD 1 OSAD 2 OSAD 4
OSAD 3
całe komórki mitochondria rybosomy
mikrosomy
jÄ…dra lizosomy wirusy
inne małe pęcherzyki
cytoszkielet peroksysomy wielkie czÄ…steczki
TECHNIKI FRAKCJONOWANIA ORGANELLI
WIROWANIE W GRADIENCIE G
STOÅšCI
WIROWANIE W GRADIENCIE G
STOŚCI (ULTRAWIROWANIE)  służy do oddzielenia od
siebie makrocząsteczek, które tylko nieznacznie różnią się między sobą gęstością i wielkością.
Podczas wirowania cząsteczki migrują w gradiencie, a gdy ich gęstość zrównoważy się z
gęstością separującego roztworu, dana grupa molekuł zajmuje zwarte określone miejsce.
Wykorzystuje siÄ™ dwie techniki wirowania w gradiencie.
1) Wirowanie zonalne (warstwowe)  gradient gęstości przygotowuje się przed wirowaniem.
Gradient preparuje się mieszając stężony roztwór z rozcieńczonym nanosząc stopniowo od
dołu i zwiększając ilość stężonego w miarę napełniania wirówkowej probówki. Preparat
nanosi siÄ™ na powierzchniÄ™ roztworu wirowanego. Stosowane substancje to np. sacharoza,
glikol.
2) Wirowanie izopikniczne  do preparatu dodaje się roztwór np. CsCl; gradient ustala się
samoczynnie podczas wirowania.
TECHNIKI FRAKCJONOWANIA ORGANELLI
WIROWANIE W GRADIENCIE G
STOÅšCI
Wirowanie zonalne Wirowanie izopikniczne
Próbka
Próbka
Gradient
Roztwór
sacharozy
WIROWANIE sacharozy
Składnik wolno
opadajÄ…cy
Składnik szybko
opadajÄ…cy
FRAKCJONOWANIE
Składnik o małej
gęstości
Składnik o dużej
gęstości
AUTORADIOGRAFIA
Technika badawcza pozwalająca na wykrywanie i lokalizację substancji, śledzenie
przebiegu i dynamiki procesów metabolicznych dzięki wykorzystaniu znakowanych
radioaktywnie prekursorów reakcji.
Wbudowane do komórki pierwiastki radioaktywne emitują promieniowanie jonizujące,
które może być rejestrowane przez detektor lub uwidocznione na kliszy fotograficznej
(obecnie stosuje się metodę mikroautoradiografii , tzn. że miejsca ulokowania się
izotopów radioaktywnych wykrywa się w mikroskopie).
Autoradiogram sekwencji DNA
Asymilacja zanieczyszczeń
Autoradiogram ukazujący metalami ciężkimi w młodym
receptory acetylocholinowe pomidorze
HODOWLE in vitro
Przetrzymywanie komórek, tkanek lub narządów poza organizmem
przez okres dłuższy niż 24 godziny
Przetrzymywanie komórek, tkanek lub narządów poza
organizmem przez okres krótszy niż 24 godziny określane jest
jako inkubacja.
In vitro  poza ustrojem
qð PrawidÅ‚owe komórki zwierzÄ™ce w hodowli in vitro wykazujÄ… tzw. zahamowanie
kontaktowe, tzn. przestają się dzielić po utworzeniu pojedynczej warstwy, gęsto ułożonych
komórek.
Aby kontynuować hodowlę konieczne jest pasażowanie komórek do innego naczynia (czyli
przeniesienie komórek z jednego naczynia do innego).
Nie transformowane komórki zwierzęce wykazują w hodowli trzy fazy wzrostu.
1) Pierwotna hodowla.
2) Okres intensywnego rozmnażania się komórek (przy odpowiednim pasażowaniu).
3) Podziały komórkowe ustają, hodowla starzeje się i zamiera.
qð Komórki nowotworowe nie wykazujÄ… zahamowania kontaktowego i mogÄ… siÄ™ dzielić w
nieskończoność.
HODOWLE in vitro
ZASTOSOWANIA
Øð Namnażanie wirusów do produkcji szczepionek.
Øð Diagnostyka wirusów.
Øð Badania prenatalne (hodowle komórek owodni lub trofoblastu pobrane w I trymestrze
ciąży).
Øð Diagnostyka cytogenetyczna (ustalanie aberracji chromosomowych); hodowle
limfocytów.
Øð Badanie toksycznoÅ›ci różnych substancji.
Øð Poszukiwanie leków przeciwnowotworowych (cytostatyków).
Øð SporzÄ…dzanie onkobiogramu (indywidualnej wrażliwoÅ›ci nowotworu na cytostatyki).
Øð Produkcja przeciwciaÅ‚ monoklonalnych.
Øð Namnażanie skóry do przeszczepów po rozlegÅ‚ych oparzeniach.
Øð Próby hodowania narzÄ…dów do przeszczepów, np. z komórek macierzystych.
CHROMATOGRAFIA
Metoda rozdziału i analizy związków chemicznych w mieszaninie
Rozdział składników mieszaniny następuje w wyniku ich różnego podziału
między fazę ruchomą i nieruchomą (stacjonarną).
PODZIAA
CHROMATOGRAFII
1) Kolumnowa
2) Cienkowarstwowa
3) Bibułowa
Faza
stacjonarna
czas
frakcje
CHROMATOGRAFIA
Chromatografia
barwników roślinnych
na kolumnie
Chromatogram na bibule
Współczesna aparatura
chromatograficzna
ELEKTROFOREZA
Metoda rozdziału i analizy związków chemicznych w mieszaninie
Rozdział składników mieszaniny następuje w wyniku wymuszonej
wędrówki cząsteczek w polu elektrycznym.
próbka
kaseta z
katoda
PODZIAA
ELEKTROFOREZY
tworzywa
1) Żelowa
2) Kapilarna
3) Bibułowa (współcześnie nie używana)
bufor
anoda
żel
bufor
ZASTOSOWANIE
Najczęściej stosowana do rozdzielania
Elektroforeogram DNA
białek i fragmentów DNA i RNA
MIKROMANIPULACJE
Techniki manipulacji na pojedynczych komórkach i ich elementach w polu
powiększenia uzyskiwanego w mikroskopie
Zapłodnienia in vitro
CYTOCHEMIA (HISTOCHEMIA)
Badania nad rozmieszczeniem i przemianami związków chemicznych in situ
(w miejscu) w nienaruszonej, spreparowanej metodami cytologicznymi
komórce (cytochemia) lub tkance (histochemia)
BARWNIKI
Wakuole wewnÄ…trz
komórek
(zabarwione)
DIACHROMY (mikroskop świetlny):
- czerwień obojętna (wakuole)
- błękit metylenowy (cytoplazma, włókna nerwowe)
- zieleń Janusa (mitochondria)
- błękit trypanu (martwe komórki)
- dwuoctan fluoresceiny (żywe komórki)
- sudan czarny (lipidy)
FLUOROCHROMY (mikroskop fluorescencyjny):
- oranż akrydyny (strukturay o niskim pH: jądra, lizosomy)
- fluoresceina
- rodamina
Ściana zewnętrzna skórki (epidermy) liścia
- DAPI (jądra komórkowe)
Gasteria verrucosa zawierajÄ…ca lipidy
(wybarwione Sudanem III na pomarańczowo)
Ziarna skrobi wybarwine
płynem Lugola w komórce
banana
Rozmaz krwi
Wybarwione fibroblasty
widziane w mikroskopie
fluorescencyjnym
Skórka (epiderma) ściągnięta z mięsistej łuski cebuli -
Allium cepa. Obraz oglÄ…dany w ultrafiolecie: jÄ…dra
komórkowe świecą białoniebiesko po DAPI, ściany
komórkowe wykazują białą autofluorescencję
1 cm
MIKROSKOPIA
1 mm
100 źm
komórki
roślinne
komórki
10 źm
zwierzęce
bakterie
1 źm
100 nm
wirusy
rybosomy
10 nm
białka
1 nm
małe
czÄ…steczki
atom
0,1 nm
OKO
MIKROSKOP ÅšWIETLNY
MIKROSKOP ELEKTRONOWY
MIKROSKOPIA
CZ
ÅšCI OPTYCZNE CZ
ÅšCI MECHANICZNE
" okular " statyw z podstawÄ…
BUDOWA MIKROSKOPU
" obiektyw " stolik
" kondensor " tubus
" z
ródło światła " rewolwer
TUBUS " śruba makrometryczna
" śruba mikrometryczna
OKULAR
REWOLWER
Odnajdywanie
obiektów
STATYW
STOLIK
ÅšRUBA MAKROMETRYCZNA
KONDENSOR
ÅšRUBA MIKROMETRYCZNA
y
RÓDA
O ÅšWIATA
A
Ustawianie
PRZESA
ONA
ostrości obrazu
PODSTAWA
SUCHE  oglÄ…damy preparaty w powietrzu (pow. 5,10, 20, 40x
IMMERSYJNE
Øð immersja wodna
Øð immersja glicerolowa
Øð immersja olejowa
OBIEKTYWY
MIKROSKOPIA
BIEG PROMIENI W MIKROSKOPIE
z
ódło
kondensor szkiełko obiektyw tubus okular oko
światła
POWI
KSZENIE MIKROSKOPU = pow. soczewki obiektywu x pow. soczewki okularu
ZDOLNOŚĆ ROZDZIELCZA
Najmniejsza odległość między dwoma punktami,
CECHY OBRAZU W:
które widzimy jeszcze jako oddzielne
OBIEKTYWIE OKULARZE
" powiększony " powiększony
" odwrócony " prosty
" rzeczywisty " pozorny
NAZWA ZDOLNOŚĆ
PRZYRZ
DU ROZDZIELCZA
a) b)
Ludzkie oko 0,1 mm
Mikroskop świetlny 0,2 źm
TEM 0,2 nm
a)- ograniczona możliwość odróżnienia dwóch punktów
b)- brak możliwości odróżnienia dwóch punktów
MIKROSKOPIA
Obrazy tej samej niebarwionej komórki zwierzęcej z
kulktury in vitro w mikroskopach świetlnych różnego typu
(A) MIKROSKOP JASNEGO POLA (B) MIKROSKOP KONTRASTOWO-FAZOWY
Do obiektywu mikroskopu wpadają promienie Obiekty  fazowe , niewidoczne w zwykłym
przechodzące przez obiekt. mikroskopie (widoczny ruch organelli w żywej
komórce).
(C) MIKROSKOP INTERFERENCYJNO-RÓŻNICUJ
CY (D) MIKROSKOP CIEMNEGO POLA
Obserwacja żywych obiektów (wykorzystanie zdolności do Do obiektywu mikroskopu wpadają wyłącznie
niewielkiego załamania światła przez obiekty, możliwość promienie ugięte na strukturach obiektu. Promienie
intensyfikowania tych zmian, wyciszenia tzw. szumów tła). przechodzące przez obiekt , a nie ugięte są
eliminowane. Struktury rozpraszajÄ…ce sÄ… widoczne
jako jasno świecące twory na ciemnym tle.
MIKROSKOPIA
MIKROSKOP FLUORESCENCYJNY
Umożliwia obserwację obiektów mających zdolność
do samoistnej fluorescencji pod wpływem światła UV
lub wybarwionych tzw. Fluorochromem.
fluoresceina
1. AUTOFLUORESCENCJA  zdolność niektórych substancji
występujących w komórkach (np. hemoglobina, chlorofil)
do świecenia pod wpływem światła UV.
2. FLUORESCENCJA WTÓRNA  wykorzystanie
fluorochromów, które po wprowadzeniu do komórki wiążą
się z określonymi organellami i świecą pod wpływem UV
uwidaczniając w ten sposób określone struktury.
wczesna póz
na
póz
na
rodamina
metafaza anafaza telofaza cytokineza
anafaza
Stadia mitozy widziane w
mikroskopie fluorescencyjnym
dla dwóch różnych linii
komórkowych
POPULARNE FLUOROCHROMY
MIKROSKOPIA
SKANINGOWY MIKROSKOP ELEKTRONOWY
(SEM)
Preparat, który pokryto bardzo cienką warstwą metalu
ciężkiego, jest skanowany wiązką elektronów zogniskowaną
na preparacie przez cewki elektromagnetyczne, które w
mikroskopach elektronowych działają jako soczewki. W
miarę bombardowania przez wiązkę każdego kolejnego
punktu powierzchni preparatu detektor mirzy liczbÄ™
elektronów ugiętych (rozproszonych) lub odbitych, którą
traktuje się jako kontrolę intensywności kolejnych punktów
na obrazie powstajÄ…cym na ekranie kontrolnym. Mikroskop
tworzy wyraziste obrazy trójwymiarowe przedmiotów o
dużej głębi ostrości i rozdzielczości od 3 nm do 20nm,
zależnie od typu preparatu.
Skaningowa mikrografia elektronowa stereociliów
wystających z rzęsatej komórki zmysłowej w uchu
wewnętrzym
MIKROSKOPIA
TRANSMISYJNY MIKROSKOP ELEKTRONOWY
(TEM)
Jest podobny do odwróconego mikroskopu świetlnego, ale
zamiast wiązki światła używa wiązki elektronów, a do
skupienia wiÄ…zki - zamiast soczewek szklanych - cewek
magnetycznych. Preparat, który umieszcza się w próżni, musi
być niezwykle cienki. Kontrast uzyskuje się zazwyczaj przez
nałożenie barwników zawierających elektronowo gęsty
metal ciężki, który lokalnie albo pochłania, albo rozprasza
elektrony, usuwajÄ…c je z wiÄ…zki w czasie jej przechodzenia
przez preparat. TEM umożliwia użytkowe powiększanie aż do
miliona razy.
Mikrografia elektronowa
pokazuje mały obszar komórki
w skrawku jÄ…dra.