PCR http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
PCR - Z MAA
EJ ILOŚCI DUŻA ILOŚĆ W KRÓTKIM CZASIE.
PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction) polega na
przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankujących
określony odcinek DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów. Jest to
metoda alternatywna do klonowania i może być używana w celu amplifikacji nawet
bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie ale warunkiem jest znajomość sekwencji
otaczającej powielany fragment. W praktyce wystarczy tylko jedna cząsteczka
matrycy.
Typowa reakcja PCR polega na powtarzających się cyklach :
1. DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze około 90�C. Syntetyczne
oligonukleotydy długości mniej więcej 20 nukleotydów komplementarne do 3`
końców kawałka DNA , którego powieleniem jesteśmy zainteresowani , dodane są w
dużym nadmiarze molowym do zdenaturowanego DNA.
2. Temperatura zostaje obniżona do 40-60�C. DNA pozostaje zdenaturowany
ponieważ komplementarne łańcuchy są w zbyt niskiej koncentracji , w porównaniu z
ilością starterów , aby zrenaturować. Specyficzne oligonukleotydy hybrydyzują z
komplementarnymi sekwencjami w DNA (tzw. annealing) i służą jako startery do
syntezy DNA , którą prowadzi termostabilna DNA polimeraza tzw. Taq polimeraza
izolowana z bakterii Thermus aqaticus.
3. Synteza odbywa się w temperaturze 72�C.
1 z 5 2010-04-04 13:25
PCR http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
Następnie cała mieszanina jest podgrzewana znowu do 95�C aby rozdysocjować
nowo powstałe dupleksy DNA. Póz
niej temperatura jest obniżana i zachodzi następna
runda syntezy. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane są odcinki DNA o różnej
długości. Stopniowo zaczynają przeważać fragmenty ograniczone straterami a
końcowy produkt jest praktycznie jednorodny. W każdym cyklu liczba kopii
sekwencji pomiędzy primerami rośnie wykładniczo jak 2n gdzie n jest liczbą cykli.
Amplifikacja fragmentu DNA metodą PCR.
Numer Liczba dwuniciowych ,
cyklu zamplifikowanych cząsteczek DNA
1 0
2 0
2 z 5 2010-04-04 13:25
PCR http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
3 2
4 4
5 8
6 16
7 32
8 64
9 128
10 256
11 512
12 1024
13 2048
14 4096
15 8192
16 16 384
17 32 768
18 65 536
19 131 072
3 z 5 2010-04-04 13:25
PCR http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
20 262 144
21 524 288
22 1 048 576
23 2 097 152
24 4 194 304
25 8 388 608
26 16 777 216
27 33 544 432
28 67 108 864
29 134 217 728
30 268 435 456
31 536 870 912
32 1 073 741 824
Po powieleniu DNA może być poddany analizie restrykcyjnej , hybrydyzacyjnej czy
sekwencjonowaniu.
ZASTOSOWANIE :
PCR może być używany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA
izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy :
- analizowaniu mutacji związanych z szeregiem chorób genetycznych
- diagnostyce chorób dziedzicznych
- ustalaniu ojcostwa w sądownictwie
- ustalaniu pochodzenia śladów krwi , włosów itp. w kryminalistyce
4 z 5 2010-04-04 13:25
PCR http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html
- namnażaniu DNA z mumii egipskich czy szczątków wymarłych organizmów
- wykrywania we krwi obecności wirusów takich jak np. HIV.
RODZAJE PCR :
RAPD-PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragmentów genomu
dzięki zastosowaniu krótkich starterów (około 10 nukleotydów) o losowo dobranej
sekwencji.
Na pewno zwiążą się one z DNA w jakimś miejscu a ponieważ jednorazowo do
każdej reakcji dodawany jest jeden rodzaj startera zakłada się występowanie
sekwencji typu odwróconych powtórzeń w takiej odległości od siebie w genomie ,
która pozwoli na wydajną amplifikację czyli 300 do 1500 par zasad.
Elektroforetyczny obraz prążków jest charakterystyczny dla osobnika. Ten rodzaj
PCR znalazł zastosowanie w określaniu stopnia pokrewieństwa między organizmami
a także m.in. w kryminalistyce w celach identyfikacji.
RT-PCR - PCR połączona z odwrotną transkrypcją czyli materiałem wyjściowym do
namnażania jest mRNA a nie jak zazwyczaj DNA.
ZAZ
BIONA PCR - umożliwia zamplifikowanie odcinka DNA zawartego w
większym uprzednio namnożonym fragmencie.
PCR in situ - nowa technika pozwalająca na przeprowadzenie reakcji w tkance bez
naruszania jej struktury np. na preparacie mikroskopowym.
PCR ILOŚCIOWA - za pomocą pomiaru intensywności reakcji barwnych jesteśmy
w stanie zmierzyć po określonej liczbie cykli ilość powstałego produktu. Jest to
szczególnie istotne dla substancji występujących w bardzo niewielkich ilościach.
Można w ten sposób szacować poziom ekspresji genu kodującego konkretne białko
mierząc ilość mRNA.
SEKWENCJONOWANIE - S
JUŻ DO TEGO MASZYNY
WSZYSTKO CO BIOTECHNOLOG MUSI MIEĆ W LABORATORIUM I NIE TYLKO
(c) 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster
5 z 5 2010-04-04 13:25