Politechnika Wrocławska Strona 1 z 4
Sprawozdanie 2.
Wydział Chemiczny Data zajęć: 2008/10/24
Enzymologia (BTC4033l) Grupa IV
Ćwiczenie 2.
laboratorium Anna Dawiec
SporzÄ…dzenie nasyconego roztworu
mgr inż. Dominika Bystranowska Mateusz Jędrzejewski
siarczanu amonu.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ›
Ćwiczenie 2. Wstęp
Siarczan amonu NH SO to bezbarwne ciało stałe; substancja krystaliczna i higroskopijna.
Masa molowa 132,14[1] g/mol; gÄ™stość 1,77[1] g/cm3 (20°C), rozpuszczalność w wodzie 760[1] g/l (20°C),
pH 5-6[1] (50 g/l H2O, 20°C). Rozpuszczalność znacznie zależy od temperatury. Sól hydrolizuje,
zgodnie z reakcją 1., a przez to pH jest lekko kwaśne (sól mocnego kwasu i słabej zasady).
NH 2H O NH OH H O (Reakcja 1.)
Rozpuszczalność białek zależy w szczególności od: temperatury, pH, siły jonowej roztworu oraz zdolności
białka do hydratacji. Wysalanie białek jest procesem wytrącania białka z roztworu. Polega na uszkodzeniu
otoczki hydratacyjnej, białko staje się mniej rozpuszczalne. Rozpuszczalność większości białek zmniejsza
się w roztworach stężonych soli (zmiana siły jonowej roztworu). Często stosowaną solą do wysalania
białek jest siarczan amonu. Białko najłatwiej wysolić w pH równym jego punktowi izoelektrycznemu
(wówczas rozpuszczalność białka jest najmniejsza). Jest to proces odwracalny. Rozpuszczalności różnych
białek są różne. Wysalanie stosuje się do frakcjonowania białek, wstępnego oczyszczania, a w szczególności
do zagęszczania rozcieńczonych roztworów białek. Sól można usunąć z roztworu stosując dializę.
[1] Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej CHEMPUR  siarczan amonu (http://alchem.eu/_upload/pliki/amonu_siarczan.pdf).
Ćwiczenie 2. Cel
Przygotowanie 100 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu potrzebnego do Ćwiczenia 3.
Ćwiczenie 2. Wykonanie
Przygotowano zlewkÄ™ 300 ml. PodgrzewajÄ…c i mieszajÄ…c rozpuszczono 90 g siarczanu amonu
w 100 ml 1 mM EDTA. Pod wyciągiem miareczkowano roztwór 5% roztworem amoniaku do pH 7,5.
CiepÅ‚y roztwór przesÄ…czono przez lejek Büchnera, użyto pompki wodnej. PrzesÄ…czony roztwór
przelano do zlewki 300 ml. ZlewkÄ™ podpisano i przykryto foliÄ… aluminiowÄ….
Ćwiczenie 2. Wyniki
Używając wagi analitycznej odważono 90 g siarczanu amonu.
90 g 130,6 g ważona NH SO zlewki 220,6 g
NH SO zlewki
Używając cylindra miarowego zmierzono 100 ml 1 mM EDTA. Używając uniwersalnych papierków
wskaz
nikowych określano pH roztworu (żółty pH 6,0; zielony pH 7,0; ciemnozielony pH 7,5).
Ćwiczenie 2. Wnioski
Otrzymano ok. 100 ml nasyconego roztwór siarczanu amonu o pH 7,5. Podczas ogrzewania
nieznaczna ilość roztworu mogła wyparować. Intensywnie mieszano, dzięki temu rozpuszczono cały
dodany siarczan amonu. Rozpuszczalność siarczanu amonu rośnie wraz z temperaturą. Przy sączeniu
roztwór ostygał. Niewielkie ilości nadmiaru siarczanu amonu wykrystalizowały na sączku.
Politechnika Wrocławska Strona 2 z 4
Sprawozdanie 2.
Wydział Chemiczny Data zajęć: 2008/10/24
Enzymologia (BTC4033l) Grupa IV
Ćwiczenie 1.
laboratorium Anna Dawiec
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
mgr inż. Dominika Bystranowska Mateusz Jędrzejewski
aldolazowej wykorzystujÄ…cej test hydrazynowy.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ›
W ramach dodatkowego zadania powtórzono Ćwiczenie 1. z dnia 2008/10/17.
Ćwiczenie 1. Wstęp
Aldolazy to enzymy należące do klasy liaz. Występują w różnych izoformach. Izolowane
są z tkanki mięśniowej, wątroby i mózgu. Biorą udział w jeden z reakcji glikolizy oraz
glikoneogenezy. KatalizujÄ… reakcjÄ™ rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 2.)
2- 2-
CH2OPO3 CH2OPO3
C O C O
H O
aldolaza
C
HO C H H C OH
+
H C OH
H C OH H
2-
CH2OPO3
C OH
CH2OPO2-
3
fruktozo-1,6-disfosforan
fosfodihydroksyaceton
aldehyd
3-fosfoglicerynowy
Reakcja 2.  Reakcja katalizowana przez aldolazÄ™
Stężenia enzymu można próbować wyznaczyć poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm
oraz stosując prawo Lamberta-Beera (1), gdzie to współczynnik ekstynkcji, a to długość
drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń.
· · (1)
Aktywność enzymu wyznacza się poprzez zmianę stężenia (poprzez zmianę absorbancji)
w czasie  szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności U definiuje się zgodnie ze wzorem (2).
µmol substratu
U (2)
min
Test hydrazynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym
oznaczaniu zmiany stężenia hydrazonu aldehydu 3-fosfoglicerynowego (H) przy 240 nm.
W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny
w stosunku 1:1.
Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (3).
(3)
Ćwiczenie 1. Cel
Wyznaczenie stężenia aldolazy z mięśni oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym.
Porównanie otrzymanych wyników z Ćwiczeniem 1. z dnia 2008/10/17.
Politechnika Wrocławska Strona 3 z 4
Sprawozdanie 2.
Wydział Chemiczny Data zajęć: 2008/10/24
Enzymologia (BTC4033l) Grupa IV
Ćwiczenie 1.
laboratorium Anna Dawiec
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
mgr inż. Dominika Bystranowska Mateusz Jędrzejewski
aldolazowej wykorzystujÄ…cej test hydrazynowy.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ›
Ćwiczenie 1. Wykonanie
W części I wyznaczono stężenie aldolazy. Odmierzono 3 ml buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA).
Zmieszano z 60 źl stężonego roztworu aldolazy (o nieznanym stężeniu). Odnośnik sporządzono
używając samego buforu. Zmierzono absorbancję względem odnośnika przy 280 nm.
W części II wyznaczono aktywność aldolazy. Odmierzono 1,5 ml 2,6 mM siarczanu hydrazyny zawartym
w roztworze (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). Zmieszano z 200 źl 30 mM fruktozodifosforanu. Odnośnik
sporządzono analogicznie. Wyzerowano spektrofotometr względem odnośnika. Dodano 25 źl roztworu
aldolazy z części I, natomiast do odnośnika dodano taką samą objętość buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM
EDTA). Zmierzono absorbancję względem odnośnika przy 240 nm przez 3 minuty. Część II powtórzono.
Ćwiczenie 1. Wyniki
Tabela 1.  Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych
pomiar 1° pomiar 2° Å›rednia* uwagi
60 -
µl
odczyt
0,1842
ze spektrofotometru
ald
ald
, %
0,2024
·
mg/ml
ald
25
ald
µl
odczyt z wykresu 1.
0,13 0,09 0,11
odczyt z wykresu 1.
0,32 0,30 0,31
" "
0,19 0,21 0,20
ald
ald
2,933 " 10 3
ald
mg/ml
"t
3 3 3 -
min
Akt ald
Akt ald · 10
0,0232 0,0256 0,0244
· ·"
U/ml
Akt tot Akt tot Akt ald ·
0,0400 0,0442 0,0421
U
Akt ald
Akt spec
Akt spec
7,91 8,73 8,32
ald
U/mg
* Å›rednia arytmetyczna z pomiarów 1° i 2°.
gdzie: masa aldolazy: 5 µg
ald
długość drogi optycznej (szerokość kuwety): 1 cm
, % ml
masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm): 0,91 mg·cm
1
molowy współczynnik ekstynkcji dla hydranazonu GAP (przy 240 nm): 2730 M·cm
objÄ™tość: 1,5 ml 200 µl 25 µl 1725 µl 1,725 ml
µl
rozcieńczenie: 69
µl
Politechnika Wrocławska Strona 4 z 4
Sprawozdanie 2.
Wydział Chemiczny Data zajęć: 2008/10/24
Enzymologia (BTC4033l) Grupa IV
Ćwiczenie 1.
laboratorium Anna Dawiec
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
mgr inż. Dominika Bystranowska Mateusz Jędrzejewski
aldolazowej wykorzystujÄ…cej test hydrazynowy.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ›
Tabela 2.  Obliczenia dla wyjściowego roztworu aldolazy
wykonane na podstawie wartoÅ›ci Å›rednich pomiarów 1° i 2°
uwagi
· · ·
ald ald ald ald
10,3
mg/ml
Akt ald Akt ald · · Akt ald
85,9
U/ml
Akt tot* Akt tot Akt ald ·
85,9
U
Akt ald · ·Akt ald
Akt spec
Akt spec Akt spec
8,32
· · ald
ald
U/mg
* objętość wyjściowego preparatu aldolazy 1 ml.
gdzie:
µl µl
rozcieńczenie: 51
µl
Ćwiczenie 1. Wnioski
Dobrano odpowiednie rozcieńczenia roztworu aldolazy do badania jej aktywności metodami
spektrofotometrycznymi. Stężenie aldolazy w roztworze wyjściowym wynosi 10,3 mg/ml.
Zgodnie z wykresem 1. absorbancja, więc także stężenie (1), H rośnie, z dobrym
przybliżeniem, liniowo w czasie. Aktywność aldolazowa zależy od stężenia enzymu,
im roztwór bardziej rozcieńczony tym aktywność aldolazowa mniejsza. Aktywność całkowita
(totalna) zależy od objętości roztworu. Aktywność specyficzna aldolazy nie zależy od stężenia
enzymu i wynosi średnio 8,32 U/mg. Średnią arytmetyczną wyznaczono z dwóch niezależnych
od siebie pomiarów dających zbliżone wyniki (ich odchylenie standardowe wynosi 0,58).
Ćwiczenie 1. wykonano mniej dokładnie niż dnia 2008/10/17 (wtedy odchylenie standardowe
wyników wynosiło 0,15). Aktywność specyficzną wyznaczono wówczas na 7,58 U/mg.
Pomiary wykonywano korzystajÄ…c z tego samego spektrofotometru.
Test hydrazynowy pozwolił na wyznaczenie aktywności aldolazy. Jest to szybka i prosta
metoda. Jej zastosowanie było możliwe, ponieważ w reakcji powstawał produkt H, który
posiadał maksimum absorbancji przy 240 nm. Inne substraty reakcji w roztworze praktycznie
nie absorbowały przy 240 nm.
Załączniki
1. Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch pomiarów (Wykres 1.).
2. Instrukcja  Ćwiczenie 1. wraz z bieżącymi obliczeniami.
3. Instrukcja  Ćwiczenie 2. wraz z bieżącymi obliczeniami.