Ocena wartości dowodu z badania DNA
Ekspertyza genetyczna
Oględziny dowodów, zabezpieczanie śladów
Pomiar stężenia Amplifikacja (PCR) loci
Izolacja DNA
DNA polimorficznych
Sekwencjonowanie DNA
(mtDNA)
Interpretacja wyników
Elektroforeza fragmentów DNA
Analiza porównawcza  próbka Przygotowanie opinii
dowodowa - próbka referencyjna
Ocena wartości dowodu z badania
DNA (statystyka)
Wybór markerów genetycznych nie jest przypadkowy
TPOX
D3S1358
TH01
D8S1179
D5S818 VWA
FGA
D2S1338 D7S820
CSF1PO
AMEL
Płeć
Penta E
D19S433
D13S317
AMEL
D16S539 D18S51 D21S11
Penta D
Badania populacyjne
" Ich wyniki stanowią podstawę do wyboru locus jako markera identyfikacyjnego
 Locus powinna charakteryzować wysoka heterozygotyczność
 Zgodność z regułą Hardy ego-Weinberga (allele niezależne statystycznie w obrębie
locus)
 Brak sprzężenia genetycznego z innymi markerami wykorzystywanymi w procesie
identyfikacji genetycznej (allele niezależne statystycznie dla różnych loci)
" Znajomość częstości alleli niezbędna jest do oceny wartości dowodu z badania DNA
Reguła Hardy ego  Weinberga
Podstawowa zasada w genetyce populacyjnej, zgodnie z którą
częstości genotypów i alleli w dużych, losowo krzyżujących się
populacjach pozostają niezmienne we wszystkich pokoleniach, przy
założeniu braku mutacji, migracji i doboru naturalnego.
Przykład  reguła Hardy ego-Weinberga
" Częstości alleli i genotypów są powiązane za pomocą prostego równania
p2 +2pq+q2 = 1
" Częstości genotypów
 AA = 81%
 Aa = 18%
 aa = 1%
" Częstości alleli (populacja 100 osób = 200 alleli)
 A = 162 allele + 18 alleli = 190 alleli = 90% = 0,9 (p)
 a = 2 allele + 18 alleli = 20 alleli = 10% = 0,1 (q)
" p + q = 100% = 1
" Oczekiwana częstość osobników homozygotycznych: AA = 0,9 x 0,9 = 0,81 =
p2 oraz aa = 0,1 x 0,1 = 0,01 = q2
" Oczekiwana częstość osobników heterozygotycznych: 2 x 0,9 x 0,1 = 0,18 =
2pq
" Reguła HW to przybliżenie stanu rzeczywistego  nie uwzględnia ewolucji
" Zmiany częstości genów w populacjach zachodzą na skutek: 1)mutacji, 2)
działania doboru naturalnego, 3) dryfu genetycznego, 4) migracji
Obliczenia zgodności z regułą Hardy ego-Weinberga
" W praktyce porównuje się heterozygotyczność obserwowaną z
heterozygotycznością oczekiwaną (zgodnie z równaniem HW)
" Badania populacyjne pozwalają na określenie heterozygotyczności
obserwowanej (O)
" Za pomocą prostego testu Chi kwadrat możemy ocenić, czy nasze
wyniki są bliskie wartości oczekiwanych (E)
" �2 = " (OAa  E Aa)2/EAa
" Test dokładny Fishera można zastosować w tym samym celu
" Oprogramowanie komputerowe umożliwia przeprowadzenie
stosownych obliczeń
Stan równowagi Hardy ego-Weinberg a
Marker genetyczny jest w stanie równowagi Hardy ego-Weinberga, gdy oczekiwane częstości
genotypów są zgodne z obserwowanymi częstościami genotypów.
�� Stan równowagi HW dowodzi, że marker jest stabilny genetycznie nie obserwujemy
działania presji ewolucyjnej lub nieprzypadkowego kojarzenia.
�� W praktyce testy mogą wykazać potencjalny nadmiar homozygot, który często tłumaczony
jest poprzez  wypadanie alleli , a więc niedoskonałość testu powodującą uzyskiwanie
fałszywych oznaczeń jednego allela z dwóch różnych istniejących faktycznie  np. mutacja
w miejscu wiązania startera PCR (allele zerowe).
Stan równowagi Hardy ego-Weinberga może być zakłócony, gdy:
A. ma miejsce pokrewieństwo wśród rodziców podwyższona liczba homozygot.
B. istnieje silna istotna substruktura populacji
C. ma miejsce selekcja  osobnicy o pewnych genotypach przekazują je wydajniej niż
osobnicy o innych genotypach
1. Zależności pomiędzy allelami w różnych loci
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
1 2 3 4 5 6 7 8
Allele Number
Rozkład skorelowany
0.4
0.4
0.35
0.35
0.3
0.3
0.25
0.25
0.2
0.2
0.15
0.15
0.1
0.1
0.05
0.05
0
1 2 3 4 5
0
Allele Number
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Allele Number
2. Pula alleli jest próbą losową, a każdy allel jest niezależnym
 losem z jego rozkładu częstości
Allele Frequency
Allele Frequency
Allele Frequency
Trzy prawa prawdopodobieństwa
1. Wartości prawdopodobieństw leżą w zakresie od 0 do 1 (0%-100%)
2. Zdarzenia mogą się wzajemnie wykluczać. W tym przypadku
prawdopodobieństwa poszczególnych zdarzeń możemy sumować.
- Prawdopodobieństwo, że zajdzie jedno z dwóch zdarzeń wzajemnie wykluczających się
jest równe 1 czyli 100 %
- Prawdopodobieństwo zdarzenia H = 1  prawdopodobieństwo zdarzenia G.
3. Jeśli dwa zdarzenia są niezależne od siebie, to ich prawdopodobieństwa
możemy przemnażać. Wtedy prawdopodobieństwo, że jednocześnie zajdą
niezależne zdarzenia H i G = iloczynowi prawdopodobieństw dla tych
dwóch zdarzeń
Nierównowaga sprzężeń (linkage disequilibrium, LD)
O markerach genetycznych, które są od siebie niezależne (są od siebie odpowiednio oddalone
fizycznie przez co dziedziczą się niezależnie) mówimy, że są w stanie równowagi
sprzężeń (linkage equilibrium), są więc statystycznie niezależne.
Markery zależne są w stanie nierównowagi sprzężeń (linkage disequilibrium)  w tym
przypadku nie możemy stosować reguły mnożenia (zdarzenia nie są niezależne od siebie, a
więc trzecie prawo prawdopodobieństwa nie jest spełnione).
Testowanie możemy prowadzić również w oparciu o prosty test Chi kwadrat
Program Arlequin
Analiza porównawcza ślad - próbka referencyjna
Układ
A B C Dowód 1 Dowód 2 Dowód 3
polimorficzny
D3S1358 16, 17 14, 17 14, 15 16, 17 14, 15 14
VWA
14, 19 15, 17 16, 19 14, 19 16, 19
D16S539
11, 12 11 12, 13 11, 12 9, 13
D2S1338
19, 24 19, 23 17 19, 24 17, 20
Amelogenina X, Y X, Y X X, Y X, Y X, Y
D8S1179 14 10, 15 13 14 13, 14 10
D21S11 28 28, 30 28, 30 28 28, 30
18, 19
D18S51 14, 15 14, 17 14, 18 14, 15
D19S433 12, 13 12, 18.2 13, 13.2 12, 13 14, 15 12
TH01 6, 9.3 6, 8 9, 9.3 6, 9.3 8, 9.3
FGA 23, 24 19 22, 23 23, 24 22
Brak zgodności profili DNA
Układ
B Dowód 2
polimorficzny
D3S1358 14, 17 14, 15
VWA
15, 17 16, 19
D16S539
11 9, 13
D2S1338
19, 23 17, 20
Amelogenina X, Y X, Y
D8S1179 10, 15 13, 14
D21S11 28, 30 28, 30
18, 19
D18S51 14, 17
D19S433 12, 18.2 14, 15
TH01 6, 8 8, 9.3
FGA 19 22
Porównanie wykazało brak zgodności oznaczonego w próbce dowodowej profilu
DNA z profilem genetycznym oznaczonym w nadesłanym materiale porównawczym.
Należy wykluczyć możliwość pochodzenia próbki dowodowej od podejrzanego.
Niepełny profil DNA
Układ
B Dowód 3
polimorficzny
D3S1358 14, 17 14
VWA
15, 17
D16S539
11
D2S1338
19, 23
Amelogenina X, Y X, Y
D8S1179 10, 15 10
D21S11 28, 30
D18S51 14, 17
D19S433 12, 18.2 12
TH01 6, 8
FGA 19
Częściowy profil genetyczny, który oznaczono w próbce dowodowej nie pozwala na
przeprowadzenie wnioskowania odnośnie zgodności profili DNA.
Zgodność profili DNA
Układ
A Dowód 1
polimorficzny
D3S1358 16, 17 16, 17
VWA
14, 19 14, 19
D16S539
11, 12 11, 12
D2S1338
19, 24 19, 24
Amelogenina X, Y X, Y
D8S1179 14 14
D21S11 28 28
D18S51 14, 15 14, 15
D19S433 12, 13 12, 13
TH01 6, 9.3 6, 9.3
FGA 23, 24 23, 24
Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla podejrzanego A. Co dalej ?
Powody uzyskania zgodności profili
1. Sprawca pozostawił swój materiał
biologiczny na miejscu zdarzenia
2. Podejrzany w wyniku działania
przypadku ma taki sam profil DNA jak
materiał pozostawiony na miejscu
zdarzenia (może też być blisko
spokrewniony ze sprawcą ...)
3. Błąd laboratorium
Hipoteza oskarżenia i hipoteza obrony
Oskarżenie: Obrona: ślad pochodzi
ślad pochodzi od od nieznanego sprawcy,
podejrzanego podejrzany w wyniku
przypadku ma profil
zgodny z profilem śladu
Jak ocenić wartość uzyskanego dowodu
" Naszym zadaniem jest udzielenie odpowiedzi na pytanie, czy jest
prawdopodobne, że do zgodności profili DNA w analizowanych próbkach
doszło na skutek przypadku ?
" Odpowiedz
uzyskamy poprzez obliczenie częstości danego genotypu (profilu
DNA) w populacji.
" Jeśli profil DNA jest częsty (np. ma go 1 na 10 osób) prawdopodobieństwo
przypadkowej zgodności jest wysokie.
" Jeśli jednak okaże się, że profil jest rzadki (np. ma go 1 na 1 miliard osób)
prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności jest bardzo niskie.
" Dowód w tym drugim przypadku jest bardzo mocny.
Szansa a priori na rzecz winy = Pr(G)/Pr(nieG)
G - podejrzany jest winny
nieG - podejrzany jest niewinny
E - dowód z badania DNA
Szansa a priori na
rzecz winy
podejrzanego - wynika
z wszelkich informacji
wynikających
z dochodzenia, poza
dowodem
z laboratorium
Szansa a posteriori na rzecz winy
podejrzanego - ustalona przez sąd -
wynika z wszelkich dopuszczonych
dowodów w sprawie (w tym dow. z DNA!)
Prawo Bayesa w postaci szansy
P(G E) P(E G)
P(G)
P(nieG E) P(nieG) P(E nieG)
Szansa Szansa
Iloraz
a posteriori a priori
wiarygodności
Miara wartości dowodu
Dowód z badania DNA modyfikuje prawdopodobieństwo
winy a priori
dowód z badania DNA
prawdopodobieństwo prawdopodobieństwo
winy a priori winy a posteriori
Prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności
(match probability)
Prawdopodobieństwo, że inna niespokrewniona osoba wybrana losowo z populacji
ma identyczny profil DNA może być oszacowane poprzez obliczenie częstości z
jaką ten profil DNA (genotyp) występuje w populacji.
��Częstości alleli poznajemy dzięki badaniom populacyjnym.
��Populacyjne bazy danych powinny gromadzić dane dla osób
niespokrewnionych o ustalonym pochodzeniu etnicznym.
��Jaką bazę danych wybrać w celu przeprowadzenia obliczeń?
- dla różnych grup etnicznych
- dla jednej grupy etnicznej
- dla regionu np. Małopolski.
Prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności
P(E|nieG) = prawdopodobieństwo
przypadkowej zgodności dwóch profili
(match probability, MP)
= prawdopodobieństwo posiadania przez
przypadkową osobę
z populacji profilu DNA zgodnego z profilem
DNA podejrzanego = częstość profilu DNA
w populacji
Kontradyktoryjność procesu sądowego
LR (likelihood ratio) - iloraz wiarygodności służy do
porównania prawdopodobieństw dowodu przy założeniu
dwóch alternatywnych twierdzeń (hipoteza zerowa i
hipoteza alternatywna).
zgodność profili DNA
Iloraz wiarygodności LR  stosunek dwóch prawdopodobieństw tego samego
zdarzenia (zgodności profili DNA) przy założeniu różnych hipotez.
Iloraz dwóch prawdopodobieństw warunkowych:
H0  ustalono dowód, bo podejrzany jest winny
H1  ustalono dowód, ale doszło do tego przez przypadek, a
podejrzany w rzeczywistości jest niewinny
Iloraz wiarygodności
P(dowód z DNA podejrzany jest winny)
LR
P(dowód z DNA podejrzany jest niewinny)
P(G E) P(E G)
P(G)
=
P(nieG E) P(nieG) P(E nieG)
Jak bardzo dowód (ustalona zgodność profili
DNA) zwiększa prawdopodobieństwo, że to
oskarżony pozostawił dany ślad?
Sposób wyrażania wyniku analizy LR
 uzyskanie zgodności profilu DNA podejrzanego
z profilem DNA z miejsca zdarzenia jest milion
razy bardziej prawdopodobne,
przy założeniu, że jest on sprawcą (z
ródłem
śladu),
niż uzyskanie takiej zgodności, jeżeli ślad
pozostawiła inna, niespokrewniona
z podejrzanym osoba, a zgodność podejrzanego
jest dziełem przypadku
Wartość LR przekłada się liczbowo na
szansę powtórzenia się danego zgodnego
profilu DNA w populacji
np. LR = 100 bilionów
szansa powtórzenia się powyższego profilu DNA
w populacji ... wynosi jak 1 na 100 bilionów
niespokrewnionych osób.
Która hipoteza jest bardziej prawdopodobna
hipoteza prokuratury  to podejrzany popełnił przestępstwo.
Prawdopodobieństwo zgodności profili DNA jest wtedy równe
100%; Hp = 1
hipoteza obrony  to inna losowa osoba z populacji popełniła
przestępstwo, a zgodność profili jest dziełem przypadku
Która hipoteza jest bardziej prawdopodobna
1
Częstość genotypu w populacji
Marker Częstość
Allel 1 Allel 2 p q Wzór
genetyczny genotypu
15 16 0.26159 0.25331 2pq 0.1325
D3S1358
Reguła mnożenia (product rule)
Częstość profilu DNA obliczana jest poprzez oszacowanie
częstości genotypu dla każdego locus, a następnie
przemnożenie wartości dla wszystkich loci genetycznych.
Reguła mnożenia może być zastosowana dzięki niezależności
analizowanych markerów genetycznych.
Która hipoteza jest bardziej prawdopodobna
1
Częstość genotypu w populacji
Marker Częstość
Allel 1 Allel 2 p q Wzór
genetyczny genotypu
15 16 0.26159 0.25331 2pq 0.1325
D3S1358
17 18 0.28146 0.20033 2pq 0.1128
VWA
12 11 0.32616 0.32119 2pq 0.2095
D16S539
Analiza wielu niezależnych markerów DNA
Marker Częstość
Allel 1 Allel 2 p q Wzór
genetyczny genotypu
15 16 0.26159 0.25331 2pq 0.1325
D3S1358
17 18 0.28146 0.20033 2pq 0.1128
VWA
12 11 0.32616 0.32119 2pq 0.2095
D16S539
19 24 0.26124 0.22132 2pq 0.1156
D2S1338
13 12 0.30464 0.18543 2pq 0.1130
D8S1179
30 29 0.27815 0.19536 2pq 0.1087
D21S11
15 16 0.15894 0.13907 2pq 0.0442
D18S51
12 13 0.16124 0.15426 2pq 0.0497
D19S433
9.3 6 0.36755 0.23179 2pq 0.1704
TH01
22 21 0.21854 0.18543 2pq 0.0810
FGA
1.35 x 10-10
Częstość profilu DNA
Brak zgodności profili DNA
Układ
A Dowód 1
polimorficzny
D3S1358 16, 17 16, 17
VWA
14, 19 14, 19
D16S539
11, 12 11, 12
D2S1338
19, 24 19, 24
Amelogenina X, Y X, Y
D8S1179 14 14
D21S11 28 28
D18S51 14, 15 14, 15
D19S433 12, 13 12, 13
TH01 6, 9.3 6, 9.3
FGA 23, 24 23, 24
Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla podejrzanego A.
Brak zgodności profili DNA
Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla podejrzanego A.
Prawdopodobieństwo, że ujawniona zgodność jest dziełem przypadku wynosi
1 x 10-12, innymi słowy teoretyczna szansa powtórzenia się danego zgodnego profilu
DNA w populacji niespokrewnionych mieszkańców Polski wynosi jak 1: 1 biliona osób.
Zgodność profili DNA jest 1 bilion razy bardziej prawdopodobna jeśli, to podejrzany jest
z
ródłem próbki dowodowej, niż jeśli jakaś inna przypadkowa osoba z populacji stanowi
jej z
ródło.
Skala obrazująca wartość dowodu
Wartości ilorazu wiarygodności (LR) wspomagające
hipotezę oskarżenia:
1 - 10 dowód słaby
10 - 100 średni umiarkowany
100 - 1000 umiarkowanie mocny
1000 - 10 000 mocny
10 000 - 100 000 bardzo mocny
wyjątkowo mocny > 1 milion
Konserwatywny sposób wypowiadania się co do
z
ródła pochodzenia śladu przez FBI
N=260 mln mieszkańców USA (System CODIS - 13
loci typu STR)  US FBI paz
dziernik 1997
Jeżeli z dużą statystyczną precyzją określi się, że ślad
pochodzi od podejrzanego, to znaczy, że naprawdę od
niego pochodzi, a jeżeli inne dowody przemawiają na
korzyść podejrzanego, należy znalez
ć inne
wytłumaczenie ustalonej zgodności:
- naniesienie w innym czasie, niezależnym od
zdarzenia
- ślad mógł być celowo podrzucony
Problem częstości rzadkich alleli
Dla alleli bardzo rzadkich przyjmuje się wartość częstości = 5/2N
(zalecane przez NRC II), gdzie N = liczba zbadanych osób
Podobieństwo profili DNA
Układ polimorficzny Siostra NN? NN
D3S1358 15, 18 15, 18
VWA 17, 18 17, 18
D16S539 12 12
D2S1338 16, 25 16, 25
Amelogenina X X, Y
D8S1179 10, 15 10, 15
D21S11 29, 30.2 29, 30.2
D18S51 16, 17 16, 17
D19S433 15, 16 13, 15
TH01 7, 9 7, 9.3
FGA 21, 22 21, 22
Problem pokrewieństwa podejrzanych
" Współczynnik pokrewieństwa F (Theta)  miara poziomu
pokrewieństwa pomiędzy dwiema osobami
" Prawdopodobieństwo, że dana osoba posiada kopię allela przodka
(identical by descent, ibd)
" Dla rodzica i dziecka oraz rodzeństwa F=1/4
" Dla wuja i siostrzenicy F=1/4
" Dla kuzynów pierwszej linii F=1/16
" Przy kojarzeniu w pokrewieństwie oczekiwana częstość heterozygot
jest zredukowana właśnie o współczynnik F
" Przy obliczaniu wartości dowodowej w sprawach dot. spornego
ojcostwa w pokrewieństwie należy zastosować odpowiednią korektę
Problem pokrewieństwa podejrzanych
Związek z podejrzanym Prawdopodobieństwo zgodności
Niespokrewniony 1 na miliard
Pierwszy kuzyn 1 na 100 milionów
Pół-rodzeństwo 1 na 10 milionów
Rodzic/dziecko 1 na 1 milion
Rodzeństwo 1 na 10 tysięcy
Analiza pokrewieństwa (podstawowa)
" Dochodzenie spornego ojcostwa (czy ten mężczyzna
jest biologicznym ojcem dziecka?)
" Dochodzenie spornego pokrewieństwa (czy ten
mężczyzna jest wujkiem dziecka?)
" NN  identyfikacja szczątków ludzkich (czy ten fragment
ludzkiego ciała pochodzi od zaginionego krewnego?)
Analiza pokrewieństwa (zaawansowana)
" Więcej niż jeden analizowany scenariusz
" Masowe groby, katastrofy
" Sprawy imigracyjne
" Jednocześnie można porównywać pomiędzy
sobą tylko dwie alternatywne hipotezy.
" Zaawansowane programy komputerowe do
rozwiązywania tego rodzaju problemów, np.
DNA_VIEW.
Dochodzenie spornego ojcostwa
Współczynnik ojcostwa (paternity index, PI = LR)
Iloraz wiarygodności: Hp/Hd
Hp = szansa, że to pozwany przekazał allel
Hd = szansa, że inny przypadkowy mężczyzna przekazał allel
Hp = 1 jeśli ojciec jest homozygotą
Hp = 0.5 jeśli ojciec jest heterozygotą
D3 :
Matka: 15, 17
Dziecko: 15
Ojciec: 15
15 to allel pochodzący od ojca, częstość = 0.2335
PI = 1/0.2335 = 4.28
A
ączny współczynnik ojcostwa (combined paternity
index, CPI)
Układ
matka dziecko ojciec? PI PI
�=0 �=0,25
polimorficzny
D3S1358 15,17 15 15 4.28 1.89
VWA 16,19 16,19 16,19 3.82 1.46
D16S539 11,13 13 11,13 2.69 1.37
D2S1338 17,24 24 17,24 5.0 1.50
Amelogenina X X X,Y - -
D8S1179 12,13 12,13 12,14 1.00 2.29
D21S11 29,31 29,31 29,31 4.30 1.50
D18S51 17 17 12,17 4.20 1.04
D19S433 13,15 14,15 14,15 1.40 1.70
TH01 9.3 9.3 7,9.3 1.73 0.90
FGA 22 22,24 22,24 3.60 2.46
D5S818 11,13 11,12 12,13 1.25 1.59
D13S317 9,13 12,13 12,13 2.19 2.07
D7S820 11 11 8,11 2.90 1.00
współczynnik ojcostwa CPI (LR) 274 900,75 250,95
Wynik w postaci współczynnika ojcostwa (LR)
Współczynnik ojcostwa CPI = sumaryczna wartość LR -
Uzyskanie wyników analizy (brak wykluczenia pozwanego)
jest 100 000 razy bardziej prawdopodobne, przy założeniu,
że pozwany jest biologicznym ojcem dziecka ...,
niż uzyskanie powyższych wyników analizy DNA, przy
założeniu, że biologicznym ojcem jest inny niespokrewniony
z nim mężczyzna, a pozwany nie wyklucza się w wyniku
działania przypadku.
Prawdopodobieństwo ojcostwa (W)
" Inny (bardziej przejrzysty dla sądu sposób wyrażenia
prawdopodobieństwa
" Prawdopodobieństwo ojcostwa W = pL /(pL + 1-p)
" W = Wahrscheinlichkeit (prawdopodobieństwo)
" p = prawdopodobieństwo a priori
" L = PI
PI = L = 100 000
a priori p = 0,5 wówczas [W = L /(L + 1)]
prawdopodobieństwo ojcostwa (a posteriori)
W = 99,999%
Prawdopodobieństwo ojcostwa (W)
" Wiarygodny mężczyzna twierdzi, że oskarżenie kobiety
jest fałszywe
" Statystyka mówi, że np. w podobnych przypadkach tylko 1 raz
na 5 mężczyzna jest winny
" p zamiast 0,5 może zostać ustalone na 1/5 tj. 0.2
PI = L = 100 000
a priori p = 0.2 wówczas [W = pL /(pL + 1-p)]
prawdopodobieństwo ojcostwa (a posteriori)
W = 99,996%
Problem mutacji w komórkach płciowych
14,18 15,17
14,18 15,17
13,17
15,18
Typowa transmisja alleli Mutacja ojcowska
(brak mutacji)
Sprawa dotycząca kazirodztwa