Procesy dynamiczne w NMR
Procesy dynamiczne w NMR
rotacja wokół wiązań formalnie pojedynczych
Studia NMR nad zmianą pozycji jąder można m. in.
zastosować:
" do badań rotacji wokół wiązań formalnie pojedynczych
40 °C
H3C O
" studia nad inwersją pierścienia
N C
" badań nad inwersją na atomie azotu
H3C H
H3C O
160 °C
N C
H3C H
88 kJmol-1
Procesy dynamiczne w NMR
Procesy dynamiczne w NMR
rotacja wokół wiązań formalnie pojedynczych
rotacja wokół wiązań formalnie pojedynczych
"½
kA
temperatura koalescencji  temperatura, w której
A B
zanika minimum między sygnałami
½Ä™ ½Å‚
kB
Ä0 [s]
h 1 Ä„"½
Ä0 H"
= kc =
= 2.22"½
2Ä„"E 2Ä„"½
" 2
Gdzie: kc  stała szybkości przekształcenia w temp. koalescencji
KOALESCENCJA
Równanie Eyring a
TC
"G`" = 4.58 TC(10.32 + log )
kC
"G`" = "H`" - T"S`"
Procesy dynamiczne w NMR
Procesy dynamiczne w NMR
Inwersja pierścienia
rotacja wokół wiązań formalnie pojedynczych
AX3
CH3OH
H
H
H
H
H
H
Widmo 1H NMR metanolu zarejestrowane przy różnych temperaturach
1.60 1.36 1.12
1
wolna wymiana
szybka wymiana
Procesy dynamiczne w NMR Procesy dynamiczne w NMR
Inwersja pierścienia Inwersja pierścienia
H H
H
H
H
H H
H H
H H
H H
H
H H
H H
Ä„ Ä„
( )
x ( )
x
2 2
t1 t2
przygotowanie rejestracja FID
Technika wieloimpulsowa w
sekwencji 90°-t1-90°
t1
D
1D NMR
t2
D
t1
2D NMR
2D NMR
I
I
Ä„ t1
( )
x
2
IMPULS
t1
½2= const
½2
Ä„
( ) I
x
2
Oscylujące amplitudy sygnałów protonu
dla serii widm zarejestrowanych przy
IMPULS
zwiększającym się cyklicznie czasie
ewolucji t1
Punkty przecięcia serii widm płaszczyzną
½2=const
½L
½1
Zachowanie siÄ™ wektora magnetyzacji w sekwencji 90°-t1-90° (A) PoÅ‚ożenie poczÄ…tkowe (B) Wynik TF przeksztaÅ‚cony z domeny czasu
PoÅ‚ożenie po impulsie 90° (C) PoÅ‚ożenie po czasie ewolucji t1 (D) PoÅ‚ożenie po drugim w domenÄ™ czÄ™stoÅ›ci ½1
impulsie 90°
2
ewolucja
2D NMR
2D NMR
Obserwowane sygnały:
" diagonalne  leżą na przekątnej; reprezentują wszystkie protony
obecne w czÄ…steczce;
" korelacyjne (pozadiagonalne, krzyżowe) występują na
skrzyżowaniu linii rzutujących sygnały na osie;
Seria FID dla CHCl3 przedstawiona w postaci
widma w domenie częstotliwości jako pik oraz
kontur
protony odpowiadające sygnałom diagonalnemu i krzyżowemu
sprzęgają się ze sobą  występuje pomiędzy nimi sprzężenie skalarne
1
2D NMR  H,1H COSY
ustalenie sygnałów należących
1
1 2 3 4 5
2D NMR  H,1H COSY
ang. COrelatione SpectroscopY
HOOC-CH-CH2-CH2-COOH do sąsiadujących protonów
ang. COrelatione SpectroscopY
500MHz
NH2
a b c d e f
CH3CH2COCH2CH2CH2CH3
a f
b c d e
b c
C7H14O
d
e
a
f
13
100.6 MHz
2D NMR  C,1H COSY (HETCOR)
13
D2O 2D NMR  Hetero J-resolved C-1H (HET2DJ)
ang. HETeronuclear CORelations
H H
OH OH
HO 8 HO 8
9 9
H H
7 7
6 6
H OCH3 H OCH3
H H
HO HO
CH3COHN O AcHN O
5 5
4 4
CO2CH3 CO2CH3
HO Hex HO Hex
H 3 H 3
Hax Hax
ustalenie sygnałów
należących do
protonów związanych
bezpośrednio z
atomami węgla
100.6 MHz
D2O
3
H
OH
HO 8 13
Hetero J-resolved C-1H (HET2DJ)
9
H
7
6
H OCH3
H
100.6 MHz
HO
CH3COHN O
5
4
CO2CH3
HO Hex
H 3
Hax
2D NMR
2D NMR
COSY TOCSY
W eksperymencie COSY magnetyzacja jest przenoszona poprzez sprzężenie skalarne. Protony, które są rozdzielone
więcej niż trzema wiązaniami chemicznymi nie dają sygnałów krzyżowych, bowiem stałe sprzężenia 4J są bliskie 0.
Tylko sygnały pochodzące od protonów rozdzielonych dwoma lub trzema wiązaniami występują w widmie
COSY (czerwone). Szczególne znaczenie mają sygnały krzyżowe pochodzące od protonów HN i Hą, ponieważ na
3
podstawie stałych sprzężenia J między nimi można określić kąty torsyjne Ć szkieletu łańcucha polipeptydowego
białka. W eksperymencie TOCSY, magnetyzacja jest rozproszona na cały układ spinowy reszty amiokwasowej w
wyniku kolejnych sprzężeń skalarnych. W widmie TOSCY występują zatem nie tylko sygnały czerwone (to te same
co w widmie COSY), lecz także dodatkowe sygnały (zielone), które są wynikiem oddziaływań wszystkich protonów
układu spinowego.
2D heterojÄ…drowy NMR
Oprócz protonów białka zawierają także inne aktywne magnetycznie jądra. Dla celów spektroskopii NMR
wyjątkowe znaczenie mają jądra 15N i 13C, szczególnie dla określania struktury większych białek (> 100 AA).
Ponieważ jednak naturalna częstotliwość występowania jąder 15N i 13C jest bardzo niska, a właściwości
magnetyczne dużo mniej korzystne niż jąder 1H, stosuje się dwa podejścia: wzbogacenie udziału
izotopowego jąder 15N i 13C w cząsteczkach badanego białka oraz wzmocnienie stosunku sygnału do
szumów poprzez wykorzystanie techniki inwersyjnego 2D NMR, w której magnetyzacja przenoszona jest
od 1H do 15N lub 13C.
Najważniejszą wersją inwersyjnego NMR jest HSQC (heteronuclear single quantum correlation). Zasada
metody na schemacie powyżej. W metodzie tej następuje korelacja atomu azotu grupy NHx z protonem
połączonym z tym atomem. Każdy sygnał w widmie HSQC odpowiada protonowi połączonemu
z atomem azotu.
4