organiczna analiza jakosciowa

Fragmenty książki "organiczna analiza jakościowa" autorstwa J. Wolińskiego i J. Terpińskiego Fragmenty książki "organiczna analiza jakościowa" autorstwa J. Wolińskiego i J. Terpińskiego 1.2. Krystalizacja Krystalizacja jest procesem najczęściej stosowanym do oczyszczania substancji stałych. Polega ona na wyzyskaniu różnej rozpuszczalności związku właściwego i zanieczyszczeń w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku na zimno i na gorąco. 1.2.1. Rozpuszczalniki Sprawą bardzo istotną dla prawidłowo przeprowadzonej krystalizacji jest dobór odpowiedniego rozpuszczalnika. Powinien to być związek obojętny zarówno w stosunku do substancji właściwej jak i w stosunku do towarzyszących jej zanieczyszczeń. Nie należy na przykład krystalizować estrów z alkoholi, może bowiem wtedy zachodzić reakcja transestryfikacji, a również nadmiar kwasu, występujący jako zanieczyszczenie estru, może reagować z użytym do krystalizacji alkoholem. Podobnie nie należy używać kwasu octowego jako rozpuszczalnika do krystalizacji amin lub ich pochodnych acylowych. Dobierając rozpuszczalnik należy uwzględnić prawidłowości wynikające z budowy związków organicznych; pewne ogólne wytyczne podano w tabl. 1.1. Dobrze dobrany rozpuszczalnik powinien rozpuszczać oczyszczaną substancję dobrze na gorąco, a źle na zimno. Tablica 1.1: Rozpuszczalniki stosowane do krystalizacji Rodzaj związku krystalizowanegoNajczęściej stosowany rozpuszczalnik Węglowodoryeter naftowy, benzen, toluen, metanol, etanol Chlorowco- i nitrozwiązkiaceton, metanol, etanol, kwas octowy Estrymetanol + woda, etanol + woda, czterochlorek węgla, dioksan, octan etylu Pikrynianyeter etylowy, benzen, octan etylu, etanol Aminymetanol, etanol, dioksan Aldehydy, ketonybenzen, czterochlorek węgla, metanol + woda, etanol + woda Amidy, anilidy, oksymy, itp.woda, benzen, etanol + woda, dioksan + woda Chlorki kwasowe, bezwodnikichloroform, czterochlorek węgla, benzen Fenolewoda, etanol + woda Kwasy karboksylowewoda, kwas octowy, metanol + woda, kwas octowy + woda Kwasy sulfonowewoda, metanol + woda, kwas octowy + woda Czwartorzędowe sole amoniowewoda, etanol, izopropanol, octan etylu Cukrywoda, metanol, etanol + woda W wielu przypadkach do krystalizacji stosuje się mieszaniny rozpuszczalników. W jednym z nich substancja oczyszczana rozpuszcza się bardzo dobrze, w drugim powinna wykazywać tylko nieznaczną rozpuszczalność. Ciecze te muszą mieszać się ze sobą. Ich stosunek ilościowy wynika z metodyki postępowania i jest najczęściej przypadkowy. W bardzo rzadkich przypadkach używamy mieszaniny o składzie podanym z góry, na przykład 50%-owego roztworu wodnego etanolu lub 10%-owego kwasu octowego. 1.2.2. Aparatura i przebieg krystalizacji Krystalizację niewielkich ilości substancji przeprowadza się zwykle w prostych zestawach, przedstawionych na rys. 1.1. i 1.2. Najczęściej używanymi naczyniami są małe kolby stożkowe (Erlenmeyera) zaopatrzone w krótką chłodniczkę powietrzną, która jest owinięta dwiema lub trzema warstwami wilgotnej bibuły, lub też probówki, w których rolę chłodnicy spełnia rurka szklana o średnicy 6-8 mm i o długości ok. 30cm. Przed przystąpieniem do krystalizacji dobieramy odpowiedni rozpuszczalnik, przeprowadzając w małych probówkach próby rozpuszczalności substancji na zimno i w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Jeśli substancja dobrze krystalizuje po ochłodzeniu, to oczyszczaną próbkę umieszczamy w kolbce stożkowej Rys. 1.1 Ogrzewanie pod chłodnicą zwrotną Rys. 1.2. Krystalizacja w probówce lub w probówce, dodajemy równą objętościowo ilość rozpuszczalnika, wrzucamy kawałek niepolewanej porcelany lub teflonu i ogrzewamy do wrzenia w ciągu kilkudziesięciu sekund. Jeśli substancja nie ulegnie całkowitemu rozpuszczeniu to - utrzymując nieprzerwane wrzenie - dodajemy przez chłodniczkę niewielkimi porcjami rozpuszczalnik, aż do uzyskania klarownego roztworu. W przypadku substancji łatwo rozkładających się podczas ogrzewania lub odznaczających się niską temperaturą topnienia stosuje się często metodę krystalizacji, polegającą na rozpuszczeniu związku w odpowiednim rozpuszczalniku w temperaturze pokojowej (ok. 20°) i ochłodzeniu roztworu do temp. ok. -70° (stały CO2 w acetonie lub metanolu). Jest rzeczą oczywistą, ze do tego celu nie mogą być używane rozpuszczalniki o stosunkowo wysokiej temperaturze krzepnięcia, jak woda, benzen, kwas octowy, dioksan. Krystalizując substancję z mieszaniny rozpuszczalników, na przykład metanol + woda, kwas octowy + woda, rozpuszczamy ją najpierw w rozpuszczalniku w którym jest lepiej rozpuszczalna, następnie podczas wrzenia dodajemy niewielkimi porcjami drugi rozpuszczalnik aż do uzyskania trwałego, nieznacznego zmętnienia. W przypadku krystalizacji estrów z rozcieńczonych alkoholi lub rozcieńczonego kwasu octowego wskazane jest jednak - w celu uniknięcia transestryfikacji - dodanie od razu 0,1-0,5g wody a następnie alkoholu lub kwasu. Następna faza krystalizacji polega na szybkim ochłodzeniu otrzymanego na gorąco roztworu nasyconego. Po wyjęciu z naczynia porcelanki lub teflonu roztwór chłodzimy bieżącą wodą, jednocześnie intensywnie mieszając w celu otrzymania drobnych kryształów; zanieczyszczenia okludowane są wtedy tylko na powierzchni i łatwo je wtedy wymyć. Duże kryształy, powoli wypadające z roztworu, zawierają zwykle zanieczyszczenia i ług macierzysty wbudowane w fazę stałą; zanieczyszczeń tych nie można usunąć przez przemywanie osadu. Szybkość krystalizacji substancji organicznych jest bardzo różna. Przy powolnej krystalizacji występuje często zjawisko tworzenia się roztworów przechłodzonych. W celu spowodowania możliwie szybkiej krystalizacji i uniknięcia tworzenia się roztworu przechłodzonego należy podczas chłodzenia roztworu pocierać ścianki naczynia bagietką szklaną lub metalową łopatką albo zaszczepić roztwór paroma kryształkami czystej substancji lub kryształami, otrzymanymi przez odparowanie kilku kropel roztworu macierzystego na szkiełku zegarkowym. Podczas krystalizacji związków o niskiej temperaturze topnienia spotykamy się czesto podczas chłodzenia z wypadaniem substancji w postaci oleju, który dopiero następnie krzepnie w całej masie. Czasem intensywne chłodzenie, mieszanie i zaszczepienie roztworu pozwala uniknąć tego niepożądanego zjawiska. Zwykle jednak jedynym wyjściem jest krystalizacja z bardziej rozcieńczonych roztworów. Pojawienie się fazy stałej podczas chłodzenia rozpoczyna się wtedy w temperaturze niższej niż to jest w przypadku roztworów nasyconych w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Gdy temperatura początku krystalizacji jest niższa niż temperatura topnienia oczyszczanej substancji, związek wypada z roztworu w postaci stałej, a nie stopnionej. 1.2.3. Odbarwianie roztworów i sączenie Zanieczyszczenia barwne, zesmolenia, usuwamy przez parominutowe ogrzewanie nasyconego roztworu substancji z niewielką ilością (1-5%, licząc na masę oczyszczanego związku) sorbentów: węgla aktywnego, ziemi okrzemkowej (ziemia Fullera, Florydyna, Cellit) lub tlenku glinu (do chromatografii). Węgiel aktywny wykazuje silne właściwości odbarwiające w rozpuszczalnikach polarnych (woda, kwas octowy, alkohole), działa natomiast słabo w rozpuszczalnikach niepolarnych. Ziemie okrzemkowe oraz tlenek glinu są bardziej uniwersalne w działaniu. Należy pamiętać, aby przed dodaniem sorbenta wrzący nasycony roztwór lekko ochłodzić, unikając w ten sposób gwałtownego wrzenia, mogącego spowodować wykipienie mieszaniny. Gorący roztwór sączymy przez karbowany sączek bibułowy, stosując w razie potrzeby płaszcz grzejny do lejka. Otrzymany w sposób opisany w p. 1.2.2 krystaliczny osad substancji sączymy na małych lejkach z denkami ze spieku szklanego o gęstości G2 lub G3 albo na tzw. igle Willst�ttera (cienka bagietka spłaszczona na końcu, na który kładzie się krążek bibułowy i całość wstawia do zwykłego lejka; rys. 1.3). Prosty zestaw przedstawiony na rys. 1.4 nadaje się doskonale zarówno do oddzielania niewielkich ilości osadów, jak i do sączenia roztworów na gorąco. W koreczku polietylenowym z "uszczelnieniem labiryntowym", który jest bardzo często stosowany do zamykania buteleczek z drażetkami, wycinamy w denku kilka małych otworków. Na dno koreczka wkładamy krążek bibuły i dociskamy go rurką szklaną, dopasowaną do średnicy wewnętrznej korka polietylenowego. Korek wraz z rurką wciskamy od spodu w miękki korek gumowy, zatykając tubus pokrywy eksykatorka. Do eksykatorka wstawiamy kolbkę stożkową ze zwykłym lejkiem tak, Rys. 1.3 Sączenie na igle Willst�ttera Rys. 1.4. Sączenie na sitku polietylenowym by lejek był umieszczony tuż pod kołnierzem korka polietylenowego. Za pomocą tego zestawu można doskonale sączyć roztwory i odsączać osady pod niewielkim ciśnieniem; nadaje się on szczególnie dobrze do szybkiego odsączania węgla i innych sorbentów. Należy jednak pamiętać, że polietylen mięknie w temp. ok. 110° i nie jest odporny na działanie wrzących węglowodorów aromatycznych. 1.2.4. Suszenie osadów Rys. 1.5. Suszenie małych ilości substancji Po przemyciu osadu na sączku niewielką ilością rozpuszczalnika użytego do krystalizacji należy otrzymaną substancję wysuszyć. Najczęściej suszymy osad na powietrzu, rozkładając go płasko na płytce Petriego lub sączku bibułowym. W przypadku stosowania do krystalizacji trudno lotnych rozpuszczalników wskazane jest suszenie w małych naczyniach próżniowych, wypełnionych środkiem suszącym (chlorkiem wapniowym, żelem krzemionkowym, pięciotlenkiem fosforu, strużkami parafinowymi). Proces suszenia można przyspieszyć ogrzewając dolną część naczynia w odpowiedniej łaźni. 1.7. Ekstrakcja Ekstrakcję stosuje się najczęściej w celu wydzielenia substancji rozpuszczonej lub zemuglowanej w wodzie. W tym celu używa się rozpuszczalników nie mieszających się z wodą, w których izolowana substancja rozpuszcza się dobrze lub stosunkowo dobrze. Jako cieczy służących do ekstrakcji używamy najczęściej eteru etylowego, octanu etylu, benzenu, chloroformu, czterochlorku węgla. Prócz właściwości dobrego rozpuszczania związków organicznych odznaczają się one niskimi temperaturami wrzenia; można je więc łatwo oddestylować od substancji wydzielonej przez ekstrakcję. Prócz tego są to związki obojętne chemicznie, można więc nie obawiać się ich reakcji ze związkiem izolowanym metodą ekstrakcji. Ekstrakcja ma również zastosowanie do rozdzielania niektórych mieszanin. Na przykład przez wytrząsanie z rozcieńczonym ługiem sodowym benzenowego roztworu fenolu i benzoesanu fenylu można wydzielić fenol pod postacią soli sodowej, dobrze rozpuszczalnej w wodzie. Ester pozostaje przy tym w warstwie organicznej. Fenol wydzielamy przez zakwaszenie roztworu wodnego i powtórną ekstrakcję benzenem. Dobór odpowiedniego rozpuszczalnika do ekstrakcji pozwala w wielu przypadkach na oddzielenie zanieczyszczeń od substancji stałej. Tą metodą oddziela się na przykład wiele barwników od nieorganicznych zanieczyszczeń. 1.7.1. Ekstrakcja periodyczna Do ekstrakcji periodycznej używa się najczęściej małych rozdzielaczy. Jeśli chodzi o samą technikę ekstrakcji, należy pamiętać o tym, aby używać możliwie małych ilości rozpuszczalnika, natomiast samo wytrząsanie i oddzielenie warstw należy przeprowadzić możliwie wielokrotnie. Jeśli współczynnik podziały rozpuszczalnik-woda jest dla danej substancji dość duży, wystarcza w zasadzie trzykrotna ekstrakcja. Jednym z lepszych rozpuszczalników jest chloroform; ekstrahuje on łatwo szereg związków, a prócz tego tworzy wiązania wodorowe z alkoholami, estrami, aldehydami, ketonami. Małe ilości substancji ekstrahuje się zwykle w probówkach; górną warstwę cieczy oddziela się wtedy za pomocą pipety. Bardzo wygodnym urządzeniem do ekstrakcji niewielkich ilości substancji są małe buteleczki polietylenowe od perfum lub farmaceutyków. Wyjmuje się z nich dyszę rozpylacza i wciska na jej miejsce rurkę szklaną wyciągniętą w kapilarę. Na zimno polietylen jest odporny wobec wszystkich rozpuszczalników, można go myć nawet mieszaniną chromową. Przez zwolnienie nacisku na ścianki buteleczki zasysamy do środka ciecz ekstrahowaną a następnie rozpuszczalnik. Zakończenie rurki zatykamy palcem i całość wytrząsamy. Po oddzieleniu się warstw, które widać dobrze poprzez cienki polietylen, przez naciśnięcie ścianek buteleczki wytłaczamy dolną warstwę. Do tego typu ekstrakcji nadają się najlepiej rozpuszczalniki cięższe od wody, ciecz ekstrahowana pozostaje bowiem w buteleczce i nie musimy jej za każdym razem przelewać. 1.7.2. Ekstrakcja ciągła Jeżeli związek, który mamy wydzielić z roztworu, rozpuszcza się w wodzie w prawie tym samym stopniu co w rozpuszczalnikach organicznych lub gdy jego rozpuszczalność w wodzie jest lepsza niż w eterze lub benzenie, a więc jego tzw. współczynnik podziału (Współczynnikiem podziału nazywamy stosunek stężeń danej substancji w dwu nie mieszających się fazach, jaki ustalił się po osiągnięciu stanu równowagi. Dla danej substancji i układu konkretnych rozpuszczalników jest to oczywiście wielkość stała) jest równy lub nawet mniejszy od 1 (do tego rodzaju związków należą na przykład niższe alifatyczne kwasy dwukarboksylowe, glikole, hydroksykwasy itp.), to można zmniejszyć jego rozpuszczalność w wodzie przez tzw. wysolenie, tj. dodanie do roztworu wodnego związku dobrze rozpuszczalnych soli nieorganicznych, takich jak chlorek sodowy, chlorek potasowy, siarczan sodowy, siarczan magnezowy. Zmieni to jednak tylko nieznacznie efektywność ekstrakcji. W takim przypadku korzystniej jest stosować bardziej skuteczną metodę ekstrakcji ciągłej. Metoda ta jest przy tym znacznie wygodniejsza, ponieważ ekstrakcja ciągła przebiega samoczynnie, z dużą oszczędnością czasu i materiału, unikamy bowiem wytrząsania, rozdzielania i przelewania roztworów. Na rysunku 1.12a i b przedstawiono schematy ekstraktorów do ekstrakcji ciągłej rozpuszczalnikami lżejszymi i cięższymi od wody. Rys. 1.12. a - ekstrakcja ciągła rozpuszczalnikiem lżejszym od wody; b - ekstrakcja ciągła rozpuszczalnikiem cięższym od wody; c - perkolator do ekstrakcji cieczami cięższymi od wody Rysunek 1.12c wyjaśnia zasadę działania bardzo wygodnego i efektywnego perkolatora, do rozpuszczalników cięższych od wody. Główną jego zaletą jest działanie w temperaturach niskich, wadą - konieczność periodycznego odlewarowywania przez rurkę powietrzną cieczy ekstrahującej i - po oddestylowaniu w innym zestawie - napełniania perkolatora czystym rozpuszczalnikiem. 1.7.3. Ekstrakcja ciągła substancji stałych Do ekstrakcji ciągłej substancji stałych stosuje się najczęściej aparaty przedstawione na rys. 1.13. W przypadku zestawu pierwszego związek jest umieszczony na tyglu z dnem ze spieku szklanego. Krople rozpuszczalnika spływające z chłodnicy wymywają na gorąco substancję i jej roztwór spływa do naczynia z cieczą ekstrahującą. W zestawie drugim (rys. 1.13b) substancja jest umieszczona na sączku karbowanym w szerokim lejku. Lejek jest przykryty kolbą okrągłodenną, chłodzoną wodą. Zasada działania tego prostego aparatu jest identyczna jak w przypadku opisanego poprzednio ekstraktora. Należy pamiętać jednak o tym, by naczynie z rozpuszczalnikiem ogrzewać na krytej płytce elektrycznej tylko do słabego wrzenia. Rys. 1.13. a - ekstrakcja substancji stałych; b - prosty ekstraktor do substancji stałych 1.7.4. Suszenie i zagęszczanie ekstraktów Oddzielony po ekstrakcji wyciąg substancji jest nasycony wodą, należy więc przed destylacją dokładnie go osuszyć, ewentualnie usunąć barwne zanieczyszczenia. Przy operowaniu małymi ilościami wskazane jest połączyć te czynności w jedną, dodając do roztworu od razu środek suszący i sorbent, na przykład węgiel aktywny. Po parominutowym wytrząsaniu odstawiamy roztwór i po przesączeniu zagęszczamy. Istotną rolę odgrywa rodzaj środka suszącego. W tablicy 1.3 zestawiono najczęściej stosowane środki suszące i ich działanie oraz stosowalność. Wyciągi po ekstrakcji zagęszcza się metodami podanymi w podrozdziałach 1.3 i 1.4. W przypadku gdy produkt ekstrahowany jest stały, należy rozpuszczalnik oddestylować nie z kolby okrągłodennej, lecz wprost z kolby stożkowej, której można następnie od razu do krystalizacji. Niewielkie ilości rozpuszczalników usuwamy bez destylacji, wprowadzając ponad powierzchnię cieczy (czasem lekko ogrzanej) strumień suchego powietrza. Aparaturę służącą do tego celu przedstawiono na rys. 1.14. Rys. 1.14. Odparowywanie małych ilości rozpuszczalników Tablica 1.3: Najczęściej stosowane środki suszące Środek suszącyMożna suszyćNie używać do suszeniaSzybkość suszeniaEfekt suszenia Chlorek wapniowywszystkie związkizwiązków hydroksylowych i aminowychduża powyżej 30°średni Siarczan wapniowywszystkie związki-maładobry Siarczan magnezowywszystkie związki-dużadobry Siarczan sodowywszystkie związki-średniadobry Węglan potasowyaminy, alkohole, ketonykwasówśredniaśredni Pięciotlenek fosforuchlorowcopochodne, nitryle, węglowodoryinnych poza wymienionymidużab.dobry Wodorotlenek sodowyaminy, hydrazyny, węglowodory nasyconeinnych poza wymienionymidużab.dobry Sódetery, węglowodory nasyconeinnych poza wymienionymidużab.dobry Tlenek glinu (do chromatografii, obojętny, I st. akt.)wszystkie związki-dużab.dobry Sita molekularnewszystkie związki-dużab.dobry 1.8. Chromatografia Chromatografia stanowi współcześnie jedną z podstawowych, i to nie tylko laboratoryjnych, ale i przemysłowych metod rozdzielania substancji. Jej istota polega na różny rozdzielaniu się składników mieszaniny między dwie fazy - fazę nieruchomą i fazę ruchomą. Po raz pierwszy chromatografia została zastosowana przez Cwieta w 1906 r. do rozdzielania pigmentów roślinnych; przez dłuższy czas była stosowana jedynie do rodzielania substancji barwnych (stąd jej nazwa: z greckiego chroma - barwa, grapho - piszę). Cwiet wprowadzał mieszaninę pigmentów na kolumnę zawierającą szereg adsorbentów, a następnie przepuszczał przez kolumnę rozpuszczalniki i obserwował rozdzielanie się składników mieszaniny wzdłuż kolumny na odrębne barwne pasma. Od tego czasu opracowano szereg metod chromatograficznych pozwalających rozdzielać mieszaniny gazów, cieczy i ciał stałych, i to nawet takie mieszaniny, które znacznie trudniej, a nawet nie sposób rozdzielić metodą destylacji lub krystalizacji. Przydatność chromatografii w analizie polega jednak nie tylko na możliwości wydzielania czystych substancji: metodami chromatograficznymi można bezpośrednio identyfikować substancje, nawet w mikroskopijnych ilościach (rzędu 5 µg). Zależnie od procesów fizykochemicznych zachodzących podczas rozdzielania substancji rozróżniamy trzy rodzaje chromatografii: chromatografię adsorpcyjną, rozdzielczą (podziałową) i jonowymienną. Podział ten jest oczywiście czysto formalny, ponieważ w praktyce może zachodzić jednocześnie kilka procesów. 1. Chromatografia adsorpcyjna polega na przepuszczaniu przez warstwę stałego adsorbenta (zwykle o bardzo silnie rozwiniętej powierzchni) mieszaniny, której składniki są adsorbowane z różną siłą. Może to być mieszanina gazów (węglowodory do C4), i wówczas fazę ruchomą stanowi gaz (np. CO2), albo też ciał stałych lub cieczy, i wówczas fazę ruchomą stanowi ciecz. W wyniku wielokrotnie powtarzającego się procesu adsorpcji i desorpcji składniki mieszaniny wędrują przez warstwę adsorbenta z różną prędkością, co w efekcie prowadzi do ich rozdzielenia. 2. Chromatografia rozdzielcza wykorzystuje fakt różnicy we współczynnikach podziału składników mieszaniny między dwie nie mieszające się fazy ciekłe lub fazę ciekłą i fazę gazową. Ciecz stanowiąca fazę stacjonarną jest osadzona na nośniku stałym o słabych właściwościach adsorpcyjnych. Podczas przemieszczania się fazy ruchomej mamy do czynienia z wielokrotnie powtarzającym się procesem ekstrakcji; istotę chromatografii rozdzielczej stanowi więc ekstrakcja przeciwprądowa. 3. Chromatografia jonowymienna wykorzystuje do rozdziału substancji reakcje między jonami znajdującymi się w roztworze i jonami związanymi z nośnikiem stanowiącym fazę nieruchomą, tzw. jonitem. Rozdzielenie mieszaniny jonów znajdujących się w roztworze wynika z różnej szybkości ich wymiany na jony jonitu. Zależnie od ładunku wymienianych jonów rozróżniamy żywice kwasowe - kationity (wymieniające kationy) i żywice zasadowe - anionity (wymieniające aniony). Ze względu na technikę prowadzenia procesu rozróżniamy cztery różne metody chromatograficzne: kolumnową, cienkowarstwową, bibułową i gazową. 1.8.1. Chromatografia kolumnowa Chromatografia kolumnowa służy przede wszystkim do rozdzielania i oczyszczania ciał stałych i wyżej wrzących cieczy (ilość rozdzielanych substancji rzędu od miligramów do kilogramów). Obecnie stosuje się ją najczęściej w powiązaniu z metodą cienkowarstwową, za pomocą której dobiera się najodpowiedniejszy układ adsorbentów i rozpuszczalników oraz kontroluje proces rozdziału mieszaniny na kolumnie. Większość substancji rozdziela się na kolumnach metodą adsorpcyjną i tę metodę omówimy bardziej szczegółowo. Metodę rozdzielczą stosuje się w przypadku wyższych alkoholi, kwasów i estrów. Metodą jonowymienną rozdziela się przede wszystkim aminokwasy i węglowodany oraz oddziela się silnie polarne związki organiczne od soli nieorganicznych. Proces chromatografowania metodą adsorpcyjną obejmuje: 1) wybór adsorbenta, 2) wybór rozpuszczalnika, 3) dobranie odpowiednich rozmiarów kolumny, 4) wypełnienie kolumny, 5) wprowadzenie roztworu na kolumnę i 6) rozwinięcie chromatogramu. 1.8.1.1. Adsorbenty Mały rozmiar oraz jednorodność ziaren adsorbenta zapewniają szybkie ustalanie się równowagi adsorpcyjnej. Gruba warstwa zbyt rozdrobnionej substancji stawiałaby jednak zbyt duży opór przepływającemu rozpuszczalnikowi (eluentowi). W praktyce stosuje się ziarna o rozmiarze od 50 do 200 mesh. "Mesh" jest to liczba oczek przypadająca na 1 cal kwadratowy w sicie, przez które przeszła frakcja przesiewanego materiału, i w sicie, na którym się zatrzymała. Średnice ziaren odpowiadające jednostkom mesh meshśrednica ziaren, mm 20-500,840-0,297 50-1000,297-0,149 100-2000,149-0,074 200-4000,074-0,038 Ze względu na bardzo silnie rozwiniętą powierzchnię adsorbenty mogą podczas chromatografowania katalizować niepożądane reakcje. Unika się tego przez stosowania materiału o wysokim stopniu czystości, a substancje wrażliwe na utlenianie chromatografuje się w atmosferze gazu obojętnego (Ar, N2). Należy jednak zawsze brać pod uwagę możliwość zachodzenia wtórnych reakcji na kolumnie. Adsorbentem najczęściej stosowanym w chromatografii kolumnowej jest tlenek glinu (Al2O3). Jego aktywność zależy od zawartości wody i jest określana w sposób standardowy w pięciu stopniach (aktywność maleje od I do V) według Brockmanna. Innym powszechnie stosowanym adsorbentem jest żel krzemionkowy (zwany "silikażelem"). Rzadziej stosuje się takie adsorbenty jak węgiel aktywny, tlenki, wodorotlenki oraz węglany wapnia i magnezu, talk, ziemię okrzemkową, ziemię Fullera, cukier, skrobię, sproszkowaną celulozę i tzw. sita molekularne. 1.8.1.2. Rozpuszczalniki Do rozwijania chromatogramu można stosować czyste rozpuszczalniki lub ich mieszaniny. Właściwy dobór rozpuszczalnika (eluenta) ma decydujący wpływ na efektywność uzyskiwanego rozdziału substancji i stanowi najtrudniejsze zadanie do rozwiązania. Ustalono kilka ogólnych reguł, którymi można się kierować przy doborze rozpuszczalnika. Wzrost polarności rozpuszczalnika zwiększa jego zdolność do wymywania (eluowania) substancji z polarnego adsorbenta, natomiast zmniejsza jego zdolność do wymywania substancji z adsorbenta niepolarnego. Im bardziej polarne są substancje, które rozdzielamy, tym bardziej polarny układ rozpuszczalników trzeba stosować do ich eluowania i tym mniej aktywny adsorbent. Rozpuszczalniki najczęściej stosowane w chromatografii zostały ułożone według ich zdolności do wymywania w tzw. szeregi eluotropowe. Kolejność rozpuszczalników w szeregach eluotropowych ustalonych przez różnych badaczów różni się nieznacznie, ponieważ była ustalana tylko dla pewnych grup substancji i określonych adsorbentów. Dlatego też nie można korzystać z danych tego typu w sposób bezkrytyczny. Do najczęściej stosowanych mieszanin dwuskładnikowych należą: heksan-benzen, benzen-octan etylu, benzen-aceton, chloroform-aceton, chloroform-metanol, o różnym stosunku składników. Nawet niewielka domieszka bardziej polarnego rozpuszczalnika wpływa silnie na właściwości eluotropowe. Taką domieszkę może stanowić woda zaadsorbowana z powietrza, kwasy i alkohole w estrach, alkohol lub inne środki stabilizujące chlorowcowęglowodory, chlorowodór powstały z rozkładu chlorowęglowodorów itp. Dlatego rozpuszczalniki stosowane do chromatografii trzeba oczyszczać, a przynajmniej przedestylować. Tablica 1.4: Szereg eluotropowy według Troppego Eter naftowy (t.w. 35-50°C) Heksan Cykloheksan Czterochlorek węgla Trójchloroetylen Benzen Chlorek metylenu Chloroform Dioksan Eter etylowy Octan etylu Dwuchloroetan Aceton Propanol Etanol Metanol Wodaa Pirydyna Kwasy organiczne a Szereg eluotropowy ułożony przez Troppego kończył się na metanolu; woda, pirydyna i kwasy są substancjami o jeszcze silniejszych zdolnościach eluotropowych. Najbardziej odpowiedni układ rozpuszczalników dobiera się zazwyczaj metodą chromatografii cienkowarstwowej (p. 1.8.3.) Ze względu jednak na odmienne warunki panujące na kolumnie należy zwiększyć w dobranej metodą cienkowarstwową mieszaninie eluującej stężenie rozpuszczalnika o słabszych zdolnościach eluotropowych (patrz tabl. 1.4). 1.8.1.3. Aparatura Jako kolumn chromatograficznych używa się w laboratorium rur szklanych zakończonych kranem. Kranu, który musi być szczelny, nie należy smarować, żeby uniknąć zanieczyszczania rozdzielanych substancji smarem. Kolumna może pracować pod ciśnieniem normalnym, nieznacznie zmniejszonym lub zwiększonym (patrz rys. 1.15). Rys. 1.15. Różne rodzaje kolumn chromatograficznych. 1 - wata bawełniana lub szklana pokryta ew. warstwą piasku, 2 - warstwa adsorbenta, 3 - wata, 4 - rozpuszczalnik, 5 - rurka ze środkiem suszącym, 6 - płytka porowata Zmniejszone ciśnienie zwiększa szybkość przepływu roztworu przez kolumnę, stosuje się je jednak rzadko. Gdy bowiem eluentami są rozpuszczalniki lotne, wówczas zbyt szybkie ich parowanie zakłóca pracę kolumny. Zwiększenie szybkości przepływu osiąga się wówczas stosując nadciśnienie. Kolumnę dobiera się tak, żeby była ona napełniona adsorbentem mniej więcej do połowy. Adsorbenta używa się dwadzieścia do trzydziestu razy tyle co substancji rozdzielanej. Im większy jest stosunek wysokości (l) warstwy adsorbenta do jej średnicy (d), tym lepszy osiąga się rozdział. Zwykle jednak stosunek ten wynosi 10-20, ponieważ zbyt wysoka warstwa stawiałaby przepływającemu rozpuszczalnikowi za duży opór hydrauliczny. 1.8.1.4. Napełnianie kolumny Kolumna musi być ustawiona dokładnie w pionie i tak wypełniona, aby w warstwie adsorbenta nie pozostały pęcherzyki powietrza. Do kolumny wlewa się rozpuszczalnik (warstwę kilku centymetrów), a następnie za pomocą szklanego pręta wsuwa się na dno zwitek waty bawełnianej lub szklanej, służący do utrzymywania adsorbenta. (Na wacie można jeszcze umieścić około dwucentymetrową warstwę czystego piasku, najlepiej morskiego. Oczyszcza się go przez ogrzewanie z mieszaniną chromową, a następnie, po odsączeniu, przemywa kolejno wodą destylowaną do odczynu obojętnego, alkoholem i eterem). Odważoną ilość adsorbenta wstrząsa się z rozpuszczalnikiem (na przykład w zamkniętej kolbie stożkowej) w celu otrzymania rzadkiej zawiesiny. Otwiera się kran na dole kolumny i jednocześnie wlewa zawiesinę adsorbenta. Po wprowadzeniu całej ilości adsorbenta przepuszcza się przez kolumnę rozpuszczalnik dopóty, dopóki wysokość warstwy adsorbenta nie przestanie się zmniejszać. Osiadaniu adsorbenta sprzyja ostukiwanie kolumny grubościennym wężem gumowym. Jednocześnie należy zwracać uwagę na to, by warstwa adsorbenta była przez cały czas przykryta co najmniej pięciomilimetrową warstwą rozpuszczalnika. Górną powierzchnię adsorbenta można przykryć cienkim krążkiem waty i centymetrową warstwą piasku, co zapobiega unoszeniu adsorbenta podczas wprowadzania roztworu na kolumnę. 1.8.1.5. Wprowadzanie substancji i rozwinięcie chromatogramu Do przygotowanej kolumny wprowadza się przez lejek lub z wkraplacza roztwór rozdzielanych substancji w możliwie małej objętości rozpuszczalnika. Cały proces można prowadzić stosując tylko jeden rozpuszczalnik, można też wymywać poszczególne składniki mieszaniny coraz bardziej aktywnymi eluentami; wówczas substancje wprowadza się na kolumnę w najmniej polarnym rozpuszczalniku. Jednocześnie z wprowadzaniem roztworu spuszcza się z kolumny rozpuszczalnik. Po osadzeniu rozdzielanej mieszaniny na kolumnie przystępuje się do jej wymywania. Szybkość wypływu cieczy (tzw. eluatu) z kolumny powinna wynosić do kilku kropel na sekundę. Jeśli substancje nie są zabarwione, to ich rozdział można kontrolować oglądając kolumnę w świetle nadfioletowym, można również odbierać niewielkie frakcje, na przykład po 5, 10, 50 cm3 (istnieją automatyczne kolektory frakcji, za pomocą których można odbierać frakcje o ustalonej objętości lub masie), i sprawdzać ich skład metodą chromatografii cienkowarstwowej. Frakcje o identycznym składzie łączy się ze sobą. Frakcje zawierające kilka składników (tzw. międzyfrakcje) poddaje się ponownemu chromatografowaniu (już na nowej kolumnie) lub wylewa, jeśli jest ich niewiele, a rozdzielane substancje nie są zbyt cenne. Substancję wydziela się przez odparowanie rozpuszczalnika pod ciśnieniem zmniejszonym, ew. normalnym, jeśli substancja jest odporna na ogrzewanie. Porównując masę substancji wprowadzonej i masę rozdzielonych frakcji ustala się wydajność procesu. Pełne oczyszczenie wydzielonych frakcji wymaga jeszcze zwykle przeprowadzenia krystalizacji lub destylacji. 1.8.1.6. Przykład zastosowania chromatografii kolumnowej 1. Rozdzielanie mieszaniny Z(cis) i E(trans) azobenzenów (związki barwne). W 50 cm3 benzenu cz. d. a. rozpuszcza się 1g azobenzenu (produkt handlowy stanowi izomer E o t.t. 68°) i otrzymany roztwór naświetla lampą kwarcową przez 1 godzinę. Jednocześnie napełnia się kolumnę o wymiarach 15x200 mm tlenkiem glinu (aktywność I) w ilości 20g. Roztwór azobenzenu po naświetleniu wprowadza się na kolumnę i następnie przemywa ją 100 cm3 benzenu. Do eluatu przechodzi niezmieniony pomarańczowy (E)-azobenzen. Na kolumnie pozostaje czerwono zabarwione pasmo (Z)-azobenzenu, który eluuje się 75cm3 benzenu zawierającego 3% metanolu. Rozpuszczalnik oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze poniżej 22°, aby zapobiec izomeryzacji. Pozostały osad krystalizuje się na zimno z eteru naftowego i otrzymuje pomarańczowoczerwone kryształy (Z)-azobenzenu o t.t. 70-71°. [Według: N. M. F. Bright, T. Carson i T. A. Dysan, Research 3, 185 (1950)]. 2. Rozdzielanie alkaloidów belladonny (związki fluoryzujące). Kolumnę o wymiarach 15x200 mm napełnia się 15g silikażelu w bezwodnym etanolu na wysokość 150mm. Na kolumnę wprowadza się 1cm3 wodnoalkoholowego ekstraktu belladonny (Tinctura Belladonnae) i rozwija chromatogram 96%-owym etanolem (rektyfikat). Chromatogram rozwija się w zaciemnionym pomieszczeniu oświetlając kolumnę światłem nadfioletowym. (Uwaga: nie wolno patrzeć bezpośrednio w źródło światła. Pierwsza frakcja fluoryzująca jasnoniebiesko zawiera atropinę, następna, fluoryzująca różowo - hioscyjaminę, a trzecia, fluoryzująca zielononiebiesko - skopolaminę). Przez miareczkowanie poszczególnych frakcji oznacza się ilościowo skład mieszaniny. (Według: W. S. Krasnowa, Żurn. Prikł. Chim., 18, 284 (1945)]. 3. Rozdzielanie 3-metylonaftorezorcynolu (I) i 4-benzoilo-2-metylonaftorezorcynolu (II) (chromatografia w atmosferze gazu obojętnego). W reakcji benzoilowania związku I powstaje mieszanina związków I i II. Na kolumnie związek I ulega natychmiast utlenieniu do 2-hydroksy-3-metylonaftochinonu (III). Aby temu zapobiec przeprowadza się chromatografowanie w atmosferze argonu lub azotu. Kolumnę chromatograficzną o wymiarach 20x400 mm przedmuchuje się dokładnie odtlenionym i osuszonym argonem i napełnia benzyną (t.w. 90-100°), przez którą przedmuchiwano przez godzinę argon w celu usunięcia rozpuszczonego powietrza. W benzynie przygotowuje się zawiesinę 50g silikażelu, przez którą również przedmuchuje się argon i wprowadza z wkraplacza na kolumnę (patrz. rys. 1.16). Na kolumnę wprowadza się roztwór 2g mieszainny poreakcyjnej (związki I i II) w 10cm3 mieszaniny benzyna-aceton (9:2) i taką mieszaniną rozpuszczalników prowadzi eluowanie, przepuszczając jednocześnie pęcherzyki argonu przez ciecz we wkraplaczu. Pierwszą frakcję stanowi związek II (po odparowaniu 0,8g) drugą frakcję - związek I (1g). (Według: J. Prejzner, praca doktorska, Politechnika Warszawska 1968). Rys. 1.16. Kolumna do rozwijania chromatogramu w atmosferze gazu obojętnego 1.8.2. Chromatografia bibułowa 1.8.2.1. Uwagi wstępne Chromatografia bibułowa jest najczęściej stosowanym typem chromatografii podziałowej, w której rolę nośnika fazy nieruchomej (wody) spełnia bibuła. W czasie rozwijania chromatogramu, tj. w czasie wędrówki fazy ruchomej po bibule, następuje nieustanne ustalanie się równowagi między fazami, czyli ciągłe przechodzenie substancji rozpuszczonych z jednej fazy do drugiej. Składniki rozdzielanej mieszaniny są ekstrahowane z rozpuszczalnika nieruchomego (wody) za pomocą rozpuszczalnika przepływającego, zgodnie z wartością współczynnika podziału. Składniki przesuwają się więc w mniejszym lub większym stopniu na nowe miejsca fazy nieruchomej, skąd zostają ponownie ekstrahowane fazą ruchomą. Jest to więc niejako zwielokrotniony proces ekstrakcji przeciwprądowej. Szybkość przesuwania się różnych składników mieszaniny, zależna od współczynników podziału jest więc różna, wyraża się ją współczynnikiem przesunięcia RF. Współczynnik ten jest stały dla określonego związku i układu, może więc być wykorzystany do chromatograficznej identyfikacji substancji. Współczynnik RF jest to stosunek drogi, którą od startu przebyła substancja, do odległości, którą w tym czasie przebył rozpuszczalnik rozwijający (patrz rys. 1.17). Współczynnik RF jest zawsze mniejszy od 1, lub gdy wyrażamy go w procentach - mniejszy od 100. Rys. 1.17. Wyznaczanie RF. RF=A/B lub % RF = (A/B)x100 1.8.2.2. Bibuła i rozpuszczalniki Do chromatografii stosuje się bibuły - czasem odpowiednio impregnowane - o bardzo wysokim stopniu czystości i idealnie równej grubości całego arkusza. Różnią się one porowatością, rodzajem powierzchni oraz szybkością przepływu rozpuszczalników. W analizie organicznej największe zastosowanie mają bibuły firm Whatman oraz Schleicher i Sch�ll, o średnio szybkim przepływie i o grubości ok. 0,2 mm. Na opakowaniach tych bibuł wskazany jest strzałką kierunek włókien, w tym też kierunku szybkość przepływu rozpuszczalnika jest największa. Rozpuszczalniki do chromatografii bibułowej muszą odznaczać się również bardzo wysokim stopniem czystości (cz.d.a.). Substancję identyfikowaną lub mieszaninę związków, które mają być rozdzielone, rozpuszczamy w dowolnym, dostatecznie lotnym rozpuszczalniku. Układy rozwijające (eluenty) nie mogą reagować z substancją chromatografowaną, powinny one odznaczać się zbliżoną lotnością i przynajmniej częściowo rozpuszczać się w wodzie, która jest fazą nieruchomą i stanowi zawsze jeden ze składników eluentów. Stosuje się dwu- lub wieloskładnikowe układy rozpuszczalników, w których składnikami niewodnymi są alkohole (metanol, etanol, propanole, butanole), fenol, kwasy karboksylowe (mrówkowy, octowy, propionowy, masłowy), ketony (aceton, etylometyloketon), dioksan, zasady (amoniak, pirydyna, kolidyna), eter etylowy, octan etylu i węglowodory (eter naftowy, benzen, toluen, ksylen). 1.8.2.3. Techniki chromatografii bibułowej W zależności od sposobu rozwijania chromatogramu, tzn. kierunku przepływu fazy ruchomej, chromatografię bibułową dzielimy na wstępującą, spływową i krążkową. Podstawowym aparatem jest tzw. komora - naczynie szklane ze szczelną pokrywą, zaopatrzone w odpowiedni uchwyt arkusza bibuły lub rynienkę. W technice wstępującej eluent wędruje do góry po bibule, która jest zanurzona dolną krawędzią w rozpuszczalniku (rys. 1.18a). Metodą tą można rozwijać chromatogram jedno- i dwukierunkowo. Rys. 1.18. a) Komora do chromatografii bibułowej wstępującej: a - bibuła, b - rozpuszczalnik, c - miejsca naniesienia substancji, b) Schemat komory do chromatografii bibułowej spływowej: a - bibuła, b - rozpuszczalnik, c - miejsce naniesienia substancji, d - rynienka z rozpuszczalnikiem, e - bagietka podtrzymująca bibułę Po wysuszeniu chromatogramu, uzyskanego przez rozwinięcie w pierwszym układzie rozpuszczalników, obraca się go o 90° i zawiesza w komorze, w której umieszczono inny układ rozpuszczalników. Technika dwukierunkowa ma szczególne znaczenie przy rozdzielaniu i identyfikacji chromatograficznej aminokwasów, peptydów, cukrów itp. Technika spływowa polega na spływaniu po bibule rozpuszczalników umieszczonych w rynience, znajdującej się w górnej części komory (rys. 1.18b). Bardzo dobry rozdział szeregu substancji uzyskuje się za pomocą metody krążkowej. Sączek bibułowy umieszcza się między dolną częścią a pokrywą eksykatora. Eluent wkrapla się przez cienką rurkę lub pipetę na środek sączka (rys. 1.19a). Pewną modyfikacją tej metody jest umieszczenie sączka między dwiema płytami szklanymi. W górnej znajduje się otwór o średnicy ok. 6mm, przez który wprowadza się rozpuszczalniki (rys. 1.19b). Technika krążkowa ma szereg zalet, które stawiają ją na pierwszym miejscu wśród metod chromatografii bibułowej. 1. Rozwinięcie chromatogramu krążkowego trwa stosunkowo krótko. Rozdzielenie substancji na sączku o średnicy 20 cm wymaga ok. 2 godzin, przy średnicy 32 cm - od 4 do 5 godzin. Eliminuje się całkowicie nasycanie parami rozpuszczalników atmosfery w komorze, co wymaga zwykle od kilku do kilkudziesięciu godzin. 2. Uzyskuje się bardzo dobre rozdzielenie substancji i znacznie większą ostrość niż w metodach wstępującej i spływowej. Jest to niewątpliwie związane z centrycznym rozchodzeniem się substancji, a więc i z coraz mniejszym jej stężeniem w miarę oddalania się od punktu naniesienia. W związku z tym ilość substancji nanoszonej w miejscu startu może być stosunkowo duża. Rys. 1.19. a) Schemat komory do chromatografii bibułowej: a - krążek z bibuły, b - pipeta z rozpuszczalnikiem, c - miejsce naniesienia próbki substancji b) Chromatografia krążkowa: a - bibuła, b - krążki szklane, c - pipeta, d - trójnóg druciany, e - korek Rys. 1.20. Chromatografia metodą Rocklanda i Dunna Rys. 1.21. Schemat identyfikacji substancji metodą chromatografii krążkowej 3. Identyfikacja substancji za pomocą różnych odczynników jest bardzo ułatwiona, można bowiem osobno, za pomocą odrębnych odczynników, identyfikować związki na szeregu wycinków tego samego chromatogramu. W celu szybkiego stwierdzenia czystości badanego preparatu lub jakościowej jego identyfikacji stosuje się często metodę Rocklanda i Dunna [L. B. Rockland, M. S. Dunn Science, 109, 539 (1949)], w której komorą jest zwykła probówka laboratoryjna. Zwężający się ku dołowi pasek bibuły przymocowuje się do korka za pomocą rozgiętego spinacza biurowego (rys. 1.20). 1.8.2.4. Przygotowanie chromatogramu W metodzie chromatografii wstępującej lub spływowej ważne jest wysycenie atmosfery komory parami odpowiedniego rozpuszczalnika, stosowanego później jako faza rozwijająca. Po umieszczeniu rozpuszczalników na dnie komory lub w rynience naczynie zamyka się pokrywą. Ustalenie się równowagi następuje w zasadzie dopiero po ok. 24 godzinach; po upływie tego czasu należy umieścić w komorze bibułę z substancją. Na arkuszu lub pasku bibuły, dostosowanym wymiarami do komory, zaznaczamy ołówkiem linię startu, oddaloną od brzegu bibuły o ok. 6 cm, i punkty startowe poszczególnych substancji, mieszanin lub wzorców w odstępach co 2-3 cm. Na zaznaczone miejsca nanosimy mikropipetą lub rurką kapilarną roztwór substancji, tak by średnica plamki nie przekraczała 3-5 mm. Naniesienie odpowiedniej ilości związku (możliwie niewielkiej, pozwalającej na identyfikację plamki na rozwiniętym chromatogramie) uzyskujemy przez kilkakrotne wprowadzenie niewielkich ilości roztworu; bibułę po każdym nakropleniu suszymy ręczną suszarką elektryczną. Na przeciwnym krańcu bibuły rysujemy oddaloną o 2-3 cm od brzegu linię czoła, zaznaczając w ten sposób odległość, na którą pozwolimy dojść układowi rozwijających rozpuszczalników. Tak przygotowaną bibułę umieszczamy w komorze zawierającej rozpuszczalniki. Rozwinięcie chromatogramu trwa od kilku do kilkudziesięciu godzin, zależnie od użytych rozpuszczalników, rodzaju bibuły i długości odcinka start-czoło. Po dojściu rozpuszczalników do naznaczonej przed procesem linii czoła otwieramy komorę i suszymy chromatogram na powietrzu lub w suszarce w temp. 40-60°. W technice krążkowej w przypadku nanoszenia kilku substancji (na przykład mieszaniny i wzorców) roztwory nakrapla się na narysowanym ołówkiem kręgu o średnicy 1-2 cm. Schemat chromatograficznego rozdziału i identyfikacji za pomocą wzorców przedstawiono na rys. 1.21. Ponieważ stosunkowo nieliczne związki organiczne są barwne, w większości przypadków umiejscowienie plam na chromatogramie nie jest sprawą prostą. Przede wszystkim należy obejrzeć bibułę w promieniach ultrafioletowych, w których wiele związków organicznych wykazuje charakterystyczną fluorescencję. Zlokalizowane plamy obwodzi się na chromatogramie ołówkiem i oblicza RF poszczególnych substancji. Jeśli rozdzielane lub identyfikowane substancje są bezbarwne i nie wykazują fluorescencji, to chromatogram należy wywołać, spryskując bibułę roztworem odpowiedniego odczynnika. W metodzie tej wykorzystuje się szereg reakcji barwnych (tworzenie soli, kompleksów, barwnych produktów utlenienia i redukcji, reakcje kondensacji, sprzęgania itp.). Rodzaje wywoływaczy i układy rozwijające zależą oczywiście od typu związków chromatografowanych; są one dokładnie omówione w specjalnych monografiach. 1.8.2.5. Przykłady zastosowania chromatografii bibułowej 1. Rozdzielanie i identyfikacja mieszaniny alkoholi. Mieszaninę metanolu, etanolu, propanolu-1 i propanolu-2 przeprowadzamy w 3,5-dwunitrobenzoesany (p. 4.8.6) i chromatografujemy metodą spływową na bibule Whatman Nr 1, stosując jako układ rozwijający mieszaninę dioksan-woda (20:80). Jako wywoływacz stosujemy 0,5%-owy alkoholowy roztwór 1-naftyloaminy. Rysunek 1.22 przedstawia chromatogram, na którym w prawej części w celu identyfikacji naniesiono estry wzorcowe. Rys. 1.22. Chromatogram spływowy 3,5-dwunitrobenzoesanów: 1 - metylu, RF = 0,24, 2 -etylu, RF = 0,39, 3 - 1-propylu, RF = 0,46, 4 = 2=propylu, RF = 0,51. Rys. 1.23. Chromatogram krążkowy 2,4-dwunitrofenylohydrazonów: 1 -etylometyloketonu, RF = 0,38, 2 - izopropylometyloketonu, RF = 0,48, 3 - metylo-n-propyloketonu, RF = 0,54 2. Rozdzielenie i identyfikacja mieszaniny ketonów. Mieszaninę etylometyloketonu i metylopropyloketonu przeprowadzamy w 2,4-dwunitrofenylohydrazony (p. 4.13.8). Do chromatografii krążkowej stosujemy sączek analityczny Schleicher i Schull, który zwilżamy 10%-owym roztworem wodnym tzw. szkła wodnego, następnie 10%-owym kwasem solnym i po dokładnym wypłukaniu wodą destylowaną suszymy w temp. 110°. Dwunitrofenylohydrazony nanosimy w roztworze chloroformu, chromatogram rozwijamy mieszaniną eter etylowy-benzyna (1:20). Rozwinięty chromatogram przedstawiono na rys. 1.23. 1.8.3. Chromatografia cienkowarstwowa W metodzie chromatografii cienkowarstwowej stosuje się cienkie warstwy adsorbenta (0,25-2 mm) umieszczonego na płytkach szklanych. Sam proces polega na naniesieniu na płytkę z adsorbentem na przykład kropli roztworu rozdzielanej mieszaniny i na doprowadzeniu eluującego rozpuszczalnika, który, wędrując dzięki siłom kapilarnym, rozwija chromatogram. Po wysuszeniu płytki i odpowiednim wywołaniu otrzymuje się chromatogram składający się z szeregu plam, na które rozdzieliła się naniesiona mieszanina. Powszechne zastosowanie metody cienkowarstwowej datuje się od lat sześćdziesiątych, kiedy to po okresie intensywnych badań wprowadzono do handlu odpowiednie adsorbenty oraz kompletne zestawy chromatograficzne. Metoda ta stanowi obecnie jedno z podstawowych narzędzi pracy w laboratoriach chemicznych, farmaceutycznych i biochemicznych. Metoda cienkowarstwowa zawdzięcza swe rozpowszechnienie swej prostocie, niskiemu kosztowi sprzętu, szybkości rozwijania chromatogramu oraz możliwości operowania niewielkimi ilościami substancji (5-100 µg). Stosuje się ją do celów diagnostycznych, do rozdzielania preparatywnego oraz do oznaczeń ilościowych. W badaniach diagnostycznych metoda cienkowarstwowa jest szybsza i dokładniejsza od metody bibułowej, a w swym wariancie preparatywnym pozwala rozdzielać substancje (w ilości do 1 g) znacznie szybciej i skuteczniej niż metoda kolumnowa. Zależnie od użytego adsorbenta można rozwijać chromatogram techniką adsorpcyjną, rozdzielczą lub jonowymienną, a tym samym prowadzić rozdział wszystkich rodzajów związków (oprócz zbyt lotnych). Na płytkach można ponadto prowadzić kilkakrotne lub dwukierunkowe rozwijanie chromatogramu tym samym lub różnymi eluentami oraz łączyć proces chromatografii i elektroforezy. Metoda cienkowarstwowa może w analizie oddawać wielorakie usługi: pozwala stwierdzić, czy dana substancja jest jednorodna, i ewentualnie rozdzielić ją na składniki, umożliwia śledzenie przebiegu reakcji chemicznych oraz dobór warunków pracy kolumny chromatograficznej, jak również szybkie ustalanie składu frakcji otrzymywanych z kolumny. Ponadto metoda cienkowarstwowa pozwala identyfikować bezpośrednio związki danej klasy na podstawie wartości współczynnika RF (p. 1.8.2.1). Identyfikację można również opierać na barwie poszczególnych plam otrzymanych po wywołaniu chromatogramu. W technice cienkowarstwowej posługujemy się również współczynnikiem Rx, który określa stosunek drogi przebytej przez daną substancję do drogi przebytej przez wybraną substancję wzorcową. 1.8.3.1. Adsorbenty i rozpuszczalniki Do celów chromatografii cienkowarstwowej produkuje się specjalne adsorbenty o bardzo drobnych ziarnach (200-400 mesh). Zawierają one często środek wiążący, który zwiększa mechaniczną trwałość oraz przyczepność warstwy adsorbenta do szkła. Środkiem wiążącym jest najczęściej silikażel (naczęściej z gipsem - Silica Gel G, rzadziej bez gipsu - Silica Gel H). Stosuje się poza tym tlenek glinu, ziemię okrzemkową lub celulozę. Jeśli używa się eluentów niepolarnych, to na silikażelu przeważa proces adsorpcyjny (rozdzielanie mieszanin niepolarnych o charakterze obojętnym i kwasowym). Przy zastosowaniu natomiast mieszanin rozpuszczalników niepolarnych i silnie polarnych przeważa proces rozdzielczy (rozdzielanie substancji polarnych). Tlenek glinu stosowany jest częściej bez gipsu. Zachodzą na nim głównie procesy adsorpcji (rozdzielanie substancji obojętnych i niepolarnych o charakterze zasadowym). Tlenek glinu ma mniejszą pojemność niż silikażel i trzeba nanosić nań bardziej rozcieńczone roztwory, ale otrzymuje się na nim plamy o ostrzejszych konturach niż na silikażelu. Pewną wadą tlenku glinu może być katalizowanie w czasie chromatografowania niepożądanych reakcji (na przykład utleniania, hydrolizy). Ziemia okrzemkowa ma znacznie słabsze właściwości adsorpcyjne i stosowana jest głównie do rozdziału substancji polarnych metodą podziałową. Sproszkowana celuloza jest najsłabszym adsorbentem; służy ona do rozdziału substancji silnie polarnych, przy czym na płytkach z celulozy osiąga się lepszy i szybszy rozdział niż na bibule. Wymienione adsorbenty poddaje się często różnym modyfikacjom. Stosuje się niekiedy również wymieniacze jonowe i sita molekularne. Doboru najodpowiedniejszego układu rozwijającego można dokonać, wykorzystując wyniki licznych badań zebrane w opracowaniach monograficznych, lub doświadczalnie, wykorzystując wstępne dane o rozdzielanych substancjach oraz ogólne wskazówki podane przy omawianiu metody kolumnowej. W celu ustalenia układu rozpuszczalników najlepiej rozdzielających badaną mieszaninę nanosi się kroplę jej roztworu (p. 1.8.3.3) na płytkę w kilkucentymetrowych odstępach. Do środka powstałych plamek doprowadza się za pomocą kapilar rozpuszczalniki o różnej polarności, a po wysuszeniu i wywołaniu obserwuje się rozdział poszczególnych plamek (uwaga: poszczególne rozpuszczalniki nie mogą się stykać na płytce). Inna metoda polega na rozwijaniu szeregu chromatogramów jednocześnie w kilku komorach, zawierających różne typowe rozpuszczalniki lub ich mieszaniny, na przykład heksan, benzen, chloroform, octan etylu, aceton, metanol. Takie stale gotowe zestawy komór z różnymi rozpuszczalnikami są jak najbardziej godne polecenia, jeśli stosuje się technikę cienkowarstwową. 1.8.3.2. Przygotowanie płytek W chromatografii cienkowarstwowej stosuje się płytki szklane o standardowych wymiarach zaproponowanych przez Stahla (5x20, 10x20 i 20x20 cm). Węższe płytki stosuje się do jednoczesnego rozwijania kilku plam, natomiast płytki 20x20 cm - do jednoczesnego rozwijania kilkunastu plam oraz do chromatografii dwukierunkowej i preparatywnej. Płytki muszą mieć równą powierzchnię oraz lekko oszlifowane brzegi. Do wielu badań diagnostycznych doskonale nadają się przedmiotowe szkiełka mikroskopowe (mikropłytki, 25x76 mm). Można na nich rozwijać jednocześnie trzy plamki, a ich mały rozmiar pozwala na urządzenie kącika chromatograficznego w każdym pokoju laboratoryjnym. Płytki przed powlekaniem muszą być dokładnie umyte (szczególnie z tłuszczu) mieszaniną chromową lub detergentem a następnie rozpuszczalnikiem. Rys. 1.24. a) Powlekanie płytek prętem szklanym: 1 - płaskownik grubszy od płytek o 0,25 0,5, 1 lub 1,5 mm, zależnie od tego, jakiej grubości warstwę adsorbenta się nanosi, 2 - płytki, 3 - zawiesina adsorbenta, 4 - pręt. b) Powlekanie mikropłytek: 1 - szablon, 2 - szkiełka przedmiotowe ułożone według malejącej grubości (jeśli nie są jednakowe), 3 - powlekacz, 4 - warstwa adsorbenta. c) Powlekacz do mikropłytek: A - widok z dołu, B - przekrój poprzeczny Do celów diagnostycznych nakłada się warstwę adsorbenta o grubości 0,25 mm, a do celów preparatywnych - o grubości od 1 do 2 mm. Adsorbent nanosi się na płytki w postaci zawiesiny, którą przygotowuje się przez wytrząsanie adsorbenta w zamkniętym naczyniu przez około półminuty z dwukrotną ilością wody destylowanej (przy nanoszeniu grubszych warstw bierze się mniej wody, na przykład na płytki w ciągu 2-3 minut od momentu przygotowania zawiesiny. Płytki układa się na odpowiednim szablonie jedna przy drugiej i specjalnym powlekaczem (W polsce można nabyć importowane gotowe urządzenia do chromatografii firmy Quickfit lub sam powlekacz o regularnej grubości warstwy produkowany według wzoru firmy Desaga) rozprowadza zawiesinę adsorbenta. Proste urządzenie do nanoszenia można sporządzić samemu. Jako szablon może służyć płyta winidurowa lub laminowana płyta wiórowa. Do płyty umocowuje się równolegle dwa płaskowniki aluminiowe tak, żeby można było między nimi układać płytki. Płaskowniki muszą być o 0,25 mm grubsze od płytek szklanych. Na ułożone płytki nalewa się przy jednym końcu zawiesinę adsorbenta i rozprowadza ją przeciągając po płaskownikach prętem lub płytką szklaną. Niezależnie od sposobu nanoszenia szablon należy ustawić poziomo. Do pokrycia jednej płytki o wymiarach 20 x 20 cm potrzeba do celów diagnostycznych 5g adsorbenta a do celów preparatywnych 30-35 g: do pokrycia dziesięciu szkiełek mikroskopowych potrzeba 5g adsorbenta. Powleczone płytki pozostawia się na 15-30 minut, a następnie zdejmuje z szablonu i suszy przez 24 godziny w temperaturze pokojowej i ewentualnie aktywuje (dla procesu adsorpcyjnego) w temp. 110° przez 10-30 minut. Płytki aktywowane należy przechowywać nad środkiem suszącym. Tlenek glinu bez gipsu można też aktywować w wyższej temperaturze (do 300°). 1.8.3.3. Nanoszenie substancji Substancję badaną nanosi się w postaci roztworu (najczęściej ok. 1%-owego) za pomocą kapilary (na przykład do oznaczania temperatury topnienia, wyciągniętej na końcu do średnicy ok. 0,1 mm) w odległości ok. 2 cm od brzegu na zwykłe płytki i ok. 1 cm od brzegu na mikropłytki, tak by otrzymać plamki o średnicy odpowiednio ok. 2 i ok. 1 mm. Na płytki preparatywne roztwór nanosi się w sposób ciągły od brzegu (najlepiej w rowek wyżłobiony na pół grubości warstwy), stosując możliwie maksymalne stężenie roztworu, które ustala się na płytce diagnostycznej. Na jednej płytce o wymiarach 20x20 cm można rozdzielać od 10 do 100mg substancji. Po naniesieniu substancji płytkę suszy się fenem. 1.8.3.4. Rozwijanie chromatogramu Rozwijanie przeprowadza się najczęściej techniką wstępującą w zamkniętych naczyniach zawierających na dnie rozpuszczalnik (rys. 1.25). W celu lepszego wysycenia komory rozpuszczalnikiem umieszcza się na bocznych ściankach paski bibuły stykające się z rozpuszczalnikiem. Do rozwijania większych płytek używa się akwariów szklanych a mikropłytki można rozwijać w naczyńkach do barwienia. Płytki ustawia się pionowo lub lekko skośnie zanurzając je na głębokość ok. 5 mm w cieczy (w żadnym przypadku naniesione plamki nie mogą zostać zanurzone w rozpuszczalniku). Rys. 1.25. Komora chromatograficzna do rozwijania jednej płytki. 1 - płytka, 2 - pasek bibuły, 3 - rozpuszczalnik. Strzałką zaznaczono punkt naniesienia substancji. Rys. 1.26. Chromatogramy cienkowarstwowe. a) Produktu izopropylowania aniliny: 1 - mieszanina poreakcyjna, 2 - izopropyloamina, 3 - izopropyloamina+anilina, 4 - mieszanina reakcyjna po przemyciu wodą. b) Nitrofenoli: 1 - produkt nitrowania fenolu, 2 - p-nitrofenol, 3 - m-nitrofenol, 4 - o-nitrofenol. Literą S oznaczono linię startu. W przypadku rozdzielania preparatywnego w tym samym naczyniu umieszcza się kilka płytek w szklanej ramce. Rozwijanie przerwya się, zanim czoło rozpuszczalnika dojdzie do końca płytki, punkt ten zaznacza się, a płytkę suszy (na przykład fenem). 1.8.3.5. Wywołanie chromatogramu Chromatogramy ogląda się w świetle zwykłym oraz nadfioletowym. Do uniwersalnych wywoływaczy należą m.in. stężony kwas siarkowy i mieszanina chromowa. Po spryskaniu płytki za pomocą szklanego rozpylacza (na przykład typu rozpylacza do lakieru do włosów), rozpylającego wywoływacz na mgłę, płytkę suszy się w temp. 100°. Plamy rozdzielanych związków można też wywoływać parami jodu. W tym celu płytkę wstawia się do zlewki zawierającej kryształek jodu, zlewkę przykrywa i ogrzewa. Pary jodu nie wywołują jednak wszystkich plamek a ponadto wywołane plamki znikają po pewnym czasie. Istnieje ponadto szereg wywoływaczy specyficznych dla poszczególnych klas związków. Występowanie plamek z tzw. "ogonami" świadczy zwykle o zbyt dużym stężeniu nanoszonego roztworu. Płytek preparatywnych oczywiście się nie wywołuje (najwyżej wąski pasek na brzegu), ale warstwy adsorbenta zawierającego poszczególne substancje zeskrobuje i następnie ekstrahuje lub wymywa odpowiednimi rozpuszczalnikami w maleńkich kolumienkach chromatograficznych. 1.8.3.6. Przykłady zastosowania chromatografii cienkowarstwowej 1. Kontrola reakcji izopropylowania aniliny siarczanem izopropylu. Podczas ogrzewania 2 moli aniliny z 1 molem siarczanu izopropylu wypada osad izopropylosiarczanu aniliny. Po odsączeniu osadu skład roztworu poreakcyjnego zbadano chromatograficznie. Na mikropłytkę powleczoną silikażelem nieaktywowanym naniesiono kroplę mieszaniny poreakcyjnej, kroplę benzenowego roztworu N-izopropyloaniliny i kroplę roztworu mieszaniny aniliny i izopropyloaniliny. Chromatogram rozwijano czterochlorkiem węgla zawierającym 5% metanolu i następnie wywołano parami jodu. Anilina dawała plamkę brunatną o RF = 0,14, a izopropyloanilina - plamkę zieloną o RF = 0,43. Chromatogram mieszaniny poreakcyjnej składał się z plamek obydwu związków (rys. 1.26). W celu usunięcia rozpuszczonego w benzenie izopropylosiarczanu aniliny roztwór poreakcyjny przemyto wodą i jego skład sprawdzono chromatograficznie. Plamka aniliny zmniejszyła się, ale nie znikła. Dalsze oczyszczanie przeprowadzono metodą chemiczną. Mieszaninę poreakcyjną poddano acetylowaniu; uległa mu tylko anilina. Izopropyloanilinę wyekstrahowano kwasem solnym, roztwór wodny zalkalizowano i wyekstrahowano benzenem. Tak otrzymany roztwór dawał na chromatogramie już tylko jedną plamkę odpowiedającą izopropyloanilinie. 2. Oznaczenie składu mieszaniny nitrofenoli. Mieszaninę otrzymaną po nitrowaniu fenolu rozcieńczonym kwasem azotowym rozcieńczono wodą i wyekstrahowano benzenem. Kroplę roztworu benzenowego o barwie jasnobrunatnej naniesiono na mikropłytkę pokrytą silikażelem. Obok naniesiono kolejno krople roztworów p-, m- i o-nitrofenolu. Chromatogram rozwinięto mieszaniną benzen-etanol (95:5). Widać było na nim bladożółte plamki o- i p-nitrofenolu oraz brunatną plamkę na starcie mieszaniny poreakcyjnej, odpowiadającą produktom smolistym. Po wywołaniu parami jodu plamki o-nitrofenolu przybrały barwę brunatnożółtą a plamki p-nitrofenolu - jaskrawożółtą. Jednocześnie pojawiła się bladożółta plamka m-nitrofenolu (patrz rys. 1.26). Zgodnie z przewidywaniem mieszanina poreakcyjna zawierała o- i p-nitrofenol. 2.1. Oznaczanie temperatury topnienia Stopień czystości stałego związku organicznego charakteryzuje najlepiej jego temperatura topnienia. Bardzo czyste substancje topią się w granicach 0,5-2°, temperatury topnienia mieszanin mają tę granicę rozciągniętą do kilku lub kilkunastu stopni. Temperaturę topnienia oznacza się w cienkościennych kapilarach sporządzonych najlepiej ze szkła twardego (obojętnego), o średnicy wewnętrznej 1,0-1,5 mm, o długości 50-70 mm. Dobrze sproszkowaną substancję nabija się do kapilary w takiej ilości, by tworzyła ona na dnie słupek wysokości 2-3 mm. Oznaczenie temperatury topnienia przeprowadza się najczęściej w aparatach ogrzewanych elektrycznie, w których termometr i kapilara są umieszczone obok siebie w bloku grzejnym i obserwowane przez lupę. Badając temperaturę topnienia nieznanej substancji nastawia się przyrząd na szybkie grzanie i odczytuje temperaturę, w której substancja uległa stopieniu. Następnie wyłącza się grzanie, przygotowuje nową kapilarkę z substancją i wstawia ją do bloku, gdy termometr wskazuje temperaturę niższą o ok. 20° od odczytanej w pierwszej, orientacyjnej próbie. Aparat nastawia się teraz na powolne ogrzewanie (1° na minutę) i obserwuje wygląd substancji w kapilarze, kontrolując jednocześnie wskazania termometru. Za początek temperatury topnienia uważa się temperaturę, w której pojawia się faza ciekła, tworząc menisk w kapilarze, za koniec - temperaturę, w której zniknie całkowicie faza stała i stopiona ciecz stanie się całkowicie klarowna. Prawidłowo oczyszczona substancja wykazuje identyczną temperaturę topnienia po dwóch kolejnych krystalizacjach. Jeżeli podczas ogrzewania związek ulega rozkładowi, to obserwuje się wydzielanie się pęcherzykół gazu, mętnienie, zmianę barwy, zwęglenie. Temperaturę, której towarzyszą te zmiany, nazywa się temperaturą rozkładu. Czasem towarzyszy zmianie stanu skupienia, co określa się jako topnienie z rozkładem. 2.1.1. Temperatura topnienia mieszaniny W celu stwierdzenia identyczności dwóch substancji o tej samej temperaturze topnienia bada się temperaturę topnienia ich mieszaniny. Proszkuje się dokładnie mniej więcej równowagowe ilości obu substancji, mieszaniną tą napełnia kapilarę i oznacza temperaturę topnienia. Jeśli substancje są identyczne, oznaczona temperatura topnienia mieszaniny jest taka sama jak temperatura topnienia poszczególnych substancji. W przypadku różnych związków mieszanina topi się w szerokim zakresie, często kilkunasto- lub kilkudziesięciostopniowym, przy czym topnienie rozpoczyna się w temperaturze niższej od temperatury topnienia substancji badanej. 2.1.2. Korygowanie temperatury topnienia W celu uniknięcia błędów wynikających z niedokładności termometru, konieczności stosowania poprawki na wystający słupek rtęci itp., określa się poprawkę dla całej aparatury przez oznaczenie za jej pomocą temperatur topnienia kilku lub kilkunastu substancji wzorcowych (patrz tabl. 2.1). Następnie sporządzamy na papierze milimetrowym wykres w układzie współrzędnych: temperatury właściwe (wzorcowe, skorygowane) - temperatury oznaczone w danym aparacie. Otrzymana krzywa, charakterystyczna dla całego układu wraz z termometrem, pozwala na natychmiastowe podanie temperatury skorygowanej na podstawie temperatury odczytanej. Tablica 2.1: Temperatury topnienia substancji wzorcowych SubstancjaT.t., °C Lód - woda0,00 Benzofenon48,10 p-Nitrotoluen51,65 Naftalen80,25 Acetanilid114,2 Kwas benzoesowy122,36 Mocznik132,8 Kwas salicylowy158,3 Kwas bursztynowy182,8 Antracen216,18 Ftalimid233,5 Kwas p-nitrobenzoesowy241,0 Fenoloftaleina265,0 Antrachinon286,0

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Elementarna analiza jakościowa związków organicznych
analiza jakościowa związków organicznych
1 Analiza jakościowa
Wyodrębnianie, badanie właściwości i analiza jakościowa sacharydów
Analiza jakościowa
laboratorium analizy jakosciowe Nieznany
Przywództwo w organizacjach Analiza najlepszych praktyk Rafał Mrówka
Wykonywanie podstawowych analiz jakościowych
analiza jakosciowaaaa
07 Węglowodany analiza jakościowa
ANALIZA JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA LABOR chem
f [t] analiza jakosciowa teoria cz 1 [2014]

więcej podobnych podstron