ćwiczenie 8
PRZENOSZENIE DNA I RNA NA MEMBRANY HYBRYDYZACYJNE.
Technika hybrydyzacji umożliwia identyfikację określonych sekwencji kwasów nukleinowych w badanym
materiale genetycznym. W tym celu wykorzystuje się zdolność sond hybrydyzacyjnych, czyli określonych cząsteczek
DNA lub RNA, do wiązania z homologicznymi sekwencjami obecnymi w materiale badanym. Sonda hybrydyzacyjna
przed użyciem powinna zostać wyznakowana i zdenaturowana do formy jednoniciowej. Ponieważ hybrydyzacja
pomiędzy sondą a materiałem badanym zachodzi nawet wówczas, gdy pomiędzy tymi cząsteczkami nie ma pełnej
homologii, dlatego sondami mogą być np.: oligonukleotydy przygotowane na podstawie sekwencji aminokwasowej
badanego białka, homologi danego genu uzyskane z innego gatunku, cDNA badanego genu w przypadku hybrydyzacji
z DNA genomowym lub z RNA itp. Badany DNA lub RNA, przed hybrydyzacją z sondą, powinien zostać przeniesiony
na odpowiednią membranę, tzw. filtr hybrydyzacyjny w postaci jednoniciowej. Do hybrydyzacji na ogół stosowane są
dwa typy membran: nitrocelulozowe i nylonowe. Zasadnicza różnica w ich wykorzystaniu polega na tym, że DNA
umieszczony na nitrocelulozie poddać można hybrydyzacji tylko jeden raz. DNA na membranie nylonowej po
hybrydyzacji można poddać odhybrydyzowaniu (usunięcie pierwszej sondy) i kolejnej hybrydyzacji z inną sondą.
Wśród wielu wariantów hybrydyzacji najczęściej wykonywane są techniki: southern blot, northern blot, dot blot,
hybrydyzacja kolonijna i mikromacierze.
Tab. 1 Bufory używane do przenoszenia kwasów nukleinowych na membrany hybrydyzacyjne. Uwaga! Przed
przystąpieniem do eksperymentu należy sprawdzić, jakie bufory zaleca użyć producent stosowanych membran.
Buf. depurynujący Buf. denaturujący Buf. neutralizujący 20 X SSC
0,25M HCl 0,5M NaOH 0,5M Tris-HCl pH7,5 0,3M cytrynian Na
1,5M NaCl 1,5M NaCl 3,0M NaCl
Southern blot
Technika Southern blot wykorzystywana jest najczęściej do identyfikacji mapy restrykcyjnej danej sekwencji, np.
określonego genu, w genomie badanego organizmu. Metodę Southern a wykorzystuje się również podczas analizy
RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism), która służy do wykrywania polimorfizmu pomiędzy różnymi
organizmami.
Metoda Southern a obejmuje następujące etapy:
1. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi. W przypadku organizmów eukariotycznych, w celu identyfikacji genu
występującego w jednej kopii na genom, należy użyć około 10 źg DNA całkowitego.
2. Rozdział elektroforetyczny DNA w żelu agarozowym. Oprócz prób badanych, należy również pamiętać o
nałożeniu na żel prób kontrolnych (+ i -) oraz markera mas cząsteczkowych. Ich obecność jest niezbędna do
prawidłowej interpretacji wyniku. Czas trwania elektroforezy powinien być uzależniony od przewidywanej ilości
sygnałów hybrydyzacyjnych. W przypadku pojedynczego sygnału, wystarczy krótki rozdział, np. 5-10cm. Jeżeli
spodziewamy się uzyskać większą ilość sygnałów, należy przedłużyć elektroforezę w celu uzyskania lepszego
rozseparowania prążków.
3. Depurynacja, denaturacja i neutralizacja DNA. Etapy te wykonuje się po zakończeniu elektroforezy. Celem
depurynacji (0,25M HCl) jest fragmentacji dłuższych odcinków DNA, co ułatwia ich póz
niejsze przeniesienie na
membranę. Dzięki prowadzonej w warunkach alkalicznych denaturacji (0,5 M NaOH), dwuniciowe cząsteczki
DNA denaturują do formy jednoniciowej, która może podlegać hybrydyzacji z sondą. Neutralizacja wykonana po
denaturacji (0,5 M Tris pH 8,5) przywraca obojętne pH żelu, co ułatwia wiązanie DNA z membraną.
4. Przenoszenie kwasów nukleinowych na membranę nitrocelulozową lub nylonową. Transfer DNA na membrany
przeprowadza się w buforze 20 x SSC lub buforze fosforanowym. Stosuje się w tym celu jedną z trzech technik:
transfer kapilarny, próżniowy lub elektrotransfer. DNA po przeniesieniu na membranę powinien zostać na niej
utrwalony. Proces ten, polegający na wytwarzaniu wiązań kowalencyjnych pomiędzy DNA a membraną, zachodzi
podczas naświetlania UV lub ekspozycji w +80oC.
5. Hybrydyzacja DNA związanego na membranie z sondą DNA.
Postępowanie.
1. Przygotować 0,8% żel agarozowy z bromkiem 4. Wykonać dokumentację fotograficzną obrazu
etydyny. elektroforetycznego, odciąć puste fragmenty żelu a
część przeznaczoną do transferu dokładnie zmierzyć.
2. Nałożyć na żel badane próby, zawierające po ok.
5. Przeprowadzić kolejno depurynacje (25mM HCl, 7
10źg DNA, trawionego enzymami restrykcyjnymi,
min.) a następnie denaturację i neutralizację, płucząc
oraz marker wielkości DNA.
żele w odpowiednich buforach, po 15 min w temp.
3. Prowadzić elektroforezę przy napięciu ok. 100V.
pokojowej.
1
6. W czasie wykonywania etapów opisanych w p.5 10. Na membranę nałożyć 2 bibuły Whatmana nasycone
przygotować: buforem 20xSSC i dwie bibuły suche.
- 2 bibuły Whatman 3MM o wymiarach
11. Nałożyć stos materiału ssącego i przycisnąć całość
umożliwiających przepływ kapilarny buforu z kuwety
ciężarkiem ok. 0,5 kg.
do żelu,
12. Prowadzić transfer przez ok. 16h.
- 4 kawałki bibuły Whatman 3MM o wymiarach żelu,
13. Po zakończeniu transferu zdjąć stos bibuły ssącej, a
- stos papieru lub ligniny o wymiarach żelu,
na membranie zaznaczyć pozycję kieszonek i
- membranę (nitrocelulozową lub nylonową) przyciętą
orientację żelu.
dokładnie do rozmiarów żelu, Uwaga, membran nie
14. Żel wybarwić bromkiem etydyny i obejrzeć w świetle
wolno dotykać bez rękawiczek!
UV, w celu sprawdzenia efektywności przeniesienia
7. Umieścić w kuwecie stolik do transferu a następnie
DNA.
przykryć go dwiema bibułami w taki sposób, aby
15. Membranę po wysuszeniu inkubować 2 godz. w
mogły one zasysać bufor 20xSSC z kuwety do żelu.
+80oC lub poddać naświetlaniu UV, w celu
8. Umieścić żel na stoliku do transferu tak, aby unikać
utrwalenia znajdującego się na niej DNA.
pęcherzyków powietrza pomiędzy żelem i bibułą.
9. Przykryć żel membraną hybrydyzacyjną.
Northern Blot
Technika Northern blot wykorzystywana jest do analizy procesu transkrypcji poszczególnych genów. Dzięki niej
można ustalić, które geny ulegają transkrypcji w badanych tkankach lub na danym etapie rozwoju organizmu. Ponadto,
technika ta umożliwia poznanie długości RNA badanych genów a także intensywności z jaką są one transkrybowane w
różnych układach biologicznych.
Metoda Northern Blott obejmuje następujące etapy:
1. Denaturację RNA i jego rozdział w denaturującym żelu agarozowym, np. w obecności aldehydu mrówkowego lub
glioksalu.
2. Przeniesienie RNA z żelu na membranę nitrocelulozową lub nylonową i jej utrwalenie. Cząsteczki RNA w
przeciwieństwie do dużych fragmentów DNA są przenoszone z żelu na membranę z dużą wydajnością, dlatego nie
ma konieczności ich uprzedniej fragmentacji.
3. Hybrydyzacja ze znakowaną sondą.
Postępowanie:
1. Przygotować 1,5 % żel agarozowy. W przypadku
4. Schłodzić preparat w lodzie a następnie dodać 2 źl
żelu o objętości 50 ml, do 0,7g agarozy dodać do 42,5
buforu LB i całość nałożyć na żel denaturujący.
ml wody i całość zagotować.
5. Elektroforezę prowadzimy w buforze 1x MOPS pH
2. Po schłodzeniu agarozy do ok. +65oC dodać 5 ml 10x
7,0 przy napięciu 4 V/cm.
MOPS oraz 2,5 ml 37% formaldehydu a następnie
6. Transfer wykonujemy analogicznie jak przy metodzie
całość wylać do uprzednio przygotowanego aparatu
Southern blot.
elektroforetycznego. Uwaga - wszystkie te
7. Membranę płukać krótko w 2xSSC. RNA utrwalić na
czynności wykonywać pod dygestorium przy
membranie inkubując ją 2 godz. w +800C lub
włączonym nawiewie. Opary formaldehydu są
naświetlając w świetle UV.
trujące!
8. Żel po transferze wybarwić w bromku etydyny i
3. Do preparatu RNA dodać 1 obj. buforu
sprawdzić na lampie UV czy cały RNA uległ
denaturującego do RNA. Następnie całość
przeniesieniu.
denaturować przez 5 min w +65oC.
Dot-blot i hybrydyzacja kolonijna
Techniki Dot-blot i hybrydyzacja kolonijna wykorzystywane są na ogół do przeglądanie bibliotek genomowych i
cDNA, w celu identyfikacji klonów kodujących poszczególne geny. W przypadku techniki dot blot, na membranę
hybrydyzacyjną nakrapiany jest bezpośrednio oczyszczony DNA badanych klonów. W przypadku hybrydyzacji
kolonijnej na membranie umieszcza się kolonie bakteryjne zawierające poszczególne klony.
Przygotowanie membrany typu dot - blot.
1. Wyciąć fragment membrany nylonowej lub 4. Po denaturacji zneutralizować membranę w
nitrocelulozowej a następnie zaznaczyć na niej roztworze neutralizującym przez 1 min.
ołówkiem miejsca nakrapiania DNA.
5. Membranę wysuszyć na powietrzu.
2. Na membranę nakropić DNA małymi porcjami,
6. Utrwalić DNA na membranie inkubując ją 2 godz. w
susząc ją na bieżąco.
+800C lub naświetlając w świetle UV.
3. Po nakropieniu, DNA zdenaturować przez
umieszczenie membrany na 5 min. na bibule
nasączonej roztworem denaturującym.
2
Przygotowanie membrany do hybrydyzacji kolonijnej.
1. Wyciąć fragment membrany o formacie
odpowiadającym wielkości szalki z koloniami
przeznaczonymi do transferu.
2. Nałożyć membranę na szalkę z koloniami tak, aby
mogły one odcisnąć się na jej powierzchni,
ewentualnie przenieść indywidualnie poszczególne
kolonie na membranę oraz na szalkę dublującą w
zaznaczonych pozycjach.
3. Przenieść membranę z koloniami na bibułę
nasączoną 10% roztworem SDS w celu
przeprowadzenia lizy bakterii. Bakterie lizować przez
3 min.
4. Przenieść membranę na suchą bibułę celem
odsączenia resztek roztworu SDS a następnie
umieścić ją na 5 min. na następnej bibule, nasączonej
buf. denaturującym.
5. Po denaturacji przeprowadzić w analogiczny sposób
neutralizację i płukanie w roztworze 2x SSC.
6. Membranę wysuszyć na powietrzu.
7. Utrwalić DNA na membranie inkubując ją 2 godz. w
+800C lub naświetlając w świet
3
 4