ZASTOSOWANIE LAB
W PRZEMYÅšLE
MLECZARSKIM
dr inż. Anna Berthold-Pluta
KULTURA STARTEROWA -
DEFINICJA
Wyselekcjonowane, zdefiniowane i zdolne
do namnażania się mikroorganizmy w
postaci czystych kultur lub
kontrolowanych kultur mieszanych o
specyficznych właściwościach.
Historia wykorzystywania
bakterii w przemyśle
spożywczym
" Pasteur (1857 r.)  odkrył, że za fermentacje
odpowiedzialne sÄ… drobnoustroje,
" Lister (1878 r.)  wyizolował pierwsze LAB z
mleka fermentowanego,
" 80-te lata XIX w.  równolegle w USA, Danii i w
Niemczech zastosowano czyste kultury LAB do
otrzymywania śmietany przeznaczonej do
wyrobu masła,
" Początek XX w. Gwałtowny rozwój produkcji
czystych kultur i zastosowania w mleczarstwie.
Wymagania ogólne dla szczepów
stosowanych jako kultury
starterowe
" Brak patogenności lub aktywności toksycznej
(np. wytwarzania amin biogennych),
" Zdolność do wywoływania pożądanych zmian,
" Zdolność do dominowania nad drobnoustrojami
występującymi w tym samym środowisku,
" A
atwość namnażania,
" A
atwość utrwalania,
" Stabilność pożądanych cech w czasie hodowli i
przechowywania,
" Oporność na fagi.
Postacie handlowe kultur
starterowych (1)
Mrożone kultury skoncentrowane
(zawierają 1010-1011 jtk/g, służą do zaszczepiania
mleka i uzyskania zakwasu lub jako DVS)
Otrzymywanie:
" hodowla kultury w optymalnych, kontrolowanych warunkach pH,
" zagęszczenie komórek metodą wirowania lub ultrafiltracji,
" standaryzowanie zawiesiny komórek,
" dodatek czynnika ochronnego dla komórek w czasie mrożenia
(krioprotektant) np. gliceryna, sacharoza, laktoza,
" pakowanie,
" szybkie mrożenie w ciekłym azocie.
" Przechowywanie w ciekłym azocie (-1960C) lub  400C,
" rozmrażać trzeba bardzo szybko, tak aby w minimalny sposób wpłynąć na stan komórek,
" kartony wielowarstwowe z wkładką Alu lub kubki z tworzywa sztucznego
Postacie handlowe kultur
starterowych (2)
Kultury liofilizowane, służą do zaszczepiania
mleka i uzyskania zakwasu (dłuższy czas
 ruszania ok. 30-60 minut)
Otrzymywanie:
" tj. przy kulturach głęboko mrożonych, ale po etapie mrożenia
kulturę umieszcza się w komorze z mocno obniżonym ciśnieniem i
odwadnia na drodze sublimacji,
" zwykle 60-70% komórek przeżywa proces liofilizacji spośród tych,
które przeżyły mrożenie,
" pakuje się w warunkach aseptycznych, przy ograniczeniu dostępu
tlenu.
" Przechowywanie w  180C,
" torebki z laminowanej folii trójwarstwowej lub w puszki aluminiowe
Postacie handlowe kultur
starterowych (3)
Kultury suszone rozpyłowo
LAB znoszą warunki suszenia rozpyłowego
bardzo z
le, rzadko stosowane
Postacie handlowe kultur
starterowych (4)
np. Chr. Hansen
[G.Bylund (1995): Dairy Processing Handbook]
Sposoby dozowania kultur
starterowych
" DVS (direct vat set), kultura dodawana bezpośrednio
do mleka, z którego otrzymujemy produkt, sposób
najbardziej kosztowny, ale zapobiega ewentualnym
zanieczyszczeniom w czasie produkcji zakwasów,
" Sporządzanie zakwasów o coraz większej objętości
(kultura ®ð zakwas macierzysty ®ð zakwas roboczy ®ð
mleko przerobowe) przygotowuje siÄ™ na mleku
wysoko-pasteryzowanym z wykorzystaniem
handlowych kultur starterowych), mniej kosztowne, ale
możliwości zanieczyszczeń i zakażeń fagowych,
" Sporządzanie zakwasów, ale na bazie specjalnych
płynnych pożywek namnażających.
Cel stosowania kultur
starterowych w mleczarstwie
" Szybkie tworzenie kwasu mlekowego,
" Modyfikowanie tekstury i cech
organoleptycznych produktów
fermentowanych,
" Utrwalenie produktu,
" Wytwarzanie gazowych produktów przemiany
materii ®ð powstawanie oczek w serach,
" Prowadzenie procesu dojrzewania serów
(działalność żywych drobnoustrojów a także
zespołu ich enzymów po lizie komórek).
Podział kultur starterowych (1)
" pojedynczy szczep,
" mieszanka kilku szczepów tego samego gatunku
lub różnych gatunków.
Podział na podstawie zdolności tworzenia aromatu i/lub gazu
lð O (lub N) - kultury skÅ‚adajÄ…ce siÄ™ z ziarniaków mlekowych nie
fermentujących cytrynianów (Lc. lactis subsp. lactis lub cremoris)
lð B (lub L) - kultury zawierajÄ…ce Leuconostoc (fermentacja
cytrynianów),
lð D - kultury zawierajÄ…ce ziarniaki mlekowe fermentujÄ…ce cytryniany
(Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis),
lð BD (lub DL)  kultury zawierajÄ…ce drobnoustroje wymienione w D
oraz B.
Fermentacja cytrynianów ®ð kultury aromatotwórcze
Podział kultur starterowych (2)
lð Mezofilne (optimum 22-260C), do produkcji
śmietany, masła ze śmietany ukwaszonej,
maślanki, mleka zsiadłego, sery Cheddar, typu
holenderskiego (Gouda, Edam, Camembert
lð Termofilne (optimum 420C), do produkcji jogurtu
(Str. thermophilus i Lb. bulgaricus), mleka
acidofilnego (albo w kulturze czystej
Lb.acidophilus albo w napojach
fermentowanych probiotycznych  kultury
jogurtowe + Lb. acidophilus + Bifidobacterium),
serów wysoko-dogrzewanych (typu
szwajcarskiego lub włoskiego).
Charakterystyka wybranych ziarniaków mlekowych
stosowanych w serowarstwie
i do produkcji napojów fermentowanych
cecha Lc.lactis subsp. Leuconostoc Str.thermophilus
mesenteroides subsp.
lactis lactis biovar cremoris mesente- cremoris
diacetylactis roides
Izomer kw. L(+) L(+) L(+) D(-) D(-) L(+)
mlekowego
Wzrost w +/- +/- +/- +/- +/- -/+
10/450C
Laktoza + + + +/- + +
galaktoza + b.d. + + + +/-
Charakterystyka wybranych pałeczek mlekowych
stosowanych w serowarstwie
i do produkcji napojów fermentowanych
cecha Lb. Lb. Lb. Lb. Lb.paracasei Lb.kefir
acidophilus bulgaricus helveticus rhamnosus subsp.paracasei
Izomer kw. DL D(-) DL L(+) L/DL DL
mlekowego
Wzrost -/+ -/+ -/+ +/+ +/-
+ / +/-
w 15/450C
laktoza + + + + +/- +
galaktoza + - + + + -
Funkcje bakterii starterowych
w serowarstwie
" Metabolizm laktozy, wytworzenie kwasu mlekowego, który minimalizuje
wzrost drobnoustrojów niepożądanych obniżających jakość gotowego
produktu a także chorobotwórczych,
" Wytworzenie związków aromatotwórczych biorących tworzących pożądane
cechy sensoryczne serów,
" Wytworzenie innych substancji o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, które
hamują rozwój przeżycia i namnażania patogenów,
" Wytworzenie szerokiej gamy enzymów głównie proteolitycznych i
peptydolitycznych, które biorą udział w dojrzewaniu serów i powstaniu ich
właściwego profilu sensorycznego,
" Zwiększenie właściwości prozdrowotnych serów.
Czynniki hamujące rozwój bakterii
starterowych w serach (1)
" Związki naturalnie występujące w mleku serowarskim (system
laktoperoksydaza/tiocjaniany/H202, wrażliwość starterów na system LPS
zależy od:
- wrażliwości szczepu,
- zdolności szczepu do wytwarzania H202, który aktywuje system LPS,
- obecności w mleku enzymów np. oksydazy ksantynowej, które
zwiększają ilość H202 w mleku.
" pozostałości antybiotyków (leki weterynaryjne: streptomycyna,
chloramfenikol, oksytetracyklina, tetracyklina), wrażliwość LAB zależna od
grupy antybiotyku i szczepu,
" Obecności bakteriofagów (zapobieganie: propagacja starterów
przeprowadzana w oddzielnych pomieszczeniach, przez wyszkolony personel,
bez wstępu dla osób postronnych, filtracja powietrza w pomieszczeniach,
namnażanie starterów w mediach hamujących bakteriofagi, rotacja starterów,
stosowanie starterów fagoopornych) .
Czynniki hamujące rozwój bakterii
starterowych w serach (2)
" Pozostałości środków dezynfekcyjnych,
" Bakteriocyny,
" Różne substancje hamujące obecne w mleku (mleko mastitisowe,
komórki somatyczne, które mają zdolność fagocytozy wobec
komórek drobnoustrojów, obecność >400 000 komórek
somatycznych/ml hamuje startery jogurtowe),
" Obecność środków owadobójczych, pestycydów.
Główne etapy produkcji serów
dojrzewajÄ…cych
ukwaszanie mleka
Å»ð
krojenie skrzepu
Å»ð
obróbka mechaniczno-termiczna skrzepu
Å»ð
solenie
Å»ð
prasowanie
Å»ð
dojrzewanie
Czynniki fizjologiczne wpływające
na aktywność starterów w czasie wytwarzania
serów (1)
Poznanie i zrozumienie aktywności metabolicznej bakterii
starterowych, a także wpływu różnych czynników
technologicznych (surowiec, temp., czas, pH, sól) na tę
aktywność, podstawa kontrolowania procesu otrzymywania
produktu fermentowanego,
" Temperatura ukwaszania mleka (pokrywa siÄ™ z optymalnÄ…
temperaturą wzrostu danej grupy LAB, tak aby zapewnić
optymalne warunki do maksymalnie szybkiego osiągnięcia
logarytmicznej fazy wzrostu), w serach typu holenderskiego,
stosuje siÄ™ startery mezofilne ®ð temp. ukwaszania ok. 320C, w
serach typu szwajcarskiego  startery termofilne ®ð temp.
ukwaszania ok. 370C,
Czynniki fizjologiczne wpływające
na aktywność starterów w czasie wytwarzania
serów (2)
" Temperatura dogrzewania gęstwy serowej (ważne w przypadku
serów wysoko-dogrzewanych ~ 540C/30-60 minut, bakterie
termofilne nie namnażają się wtedy aktywnie, ale muszą przetrwać
ten proces),
" Metabolizm laktozy  wpływ na synerezę skrzepu, zawartość wody
w skrzepie, zawartość pozostałej laktozy w serach po prasowaniu,
wpÅ‚yw na pH skrzepu ®ð paÅ‚eczki tolerujÄ… pH 3,4, laktokoki  pH 4,5.
Czynniki fizjologiczne wpływające
na aktywność starterów w czasie wytwarzania
serów (3)
" Wpływ obecności soli  większość LAB jest hamowanych
częściowo lub całkowicie przez >5% NaCl, ale różne szczepy i
gatunki mają różną tolerancję, tolerancja wobec soli jest jednym z
kryteriów doboru szczepów do zastosowania w serowarstwie,
odmienne warunki w przypadku serów solonych na sucho (sól
wprowadzana do masy serowej w postaci suchej np. Cheddar) ®ð
gwałtowne hamowanie wzrostu drobnoustrojów i tworzenia kwasu
mlekowego, w przypadku serów solonych w solance ®ð czas
działania hamującego soli jest wydłużony, istotna wielkość bloku
sera,
Czynniki fizjologiczne wpływające
na aktywność starterów w czasie wytwarzania
serów (4)
" Wpływ azotanów (na LAB brak wpływu, ale wpływ hamujący na
bakterie propionowe !) ,
" Wpływ zmiany potencjału redox (w mleku +150mV,
w serze -250mV),
" Temperatura dojrzewania serów (sery typu szwajcarskiego I etap
dojrzewania 12st.C/2-3 tygodnie, II etap 22st.C/2-4 tygodnie ®ð
promowanie rozwoju propionowych, IIIetap - 10stC).
Pożądane cechy kultur starterowych LAB
przeznaczonych do produkcji wybranych
produktów mlecznych
" Sery Cheddar,
" Sery typu  szwajcarskiego ,
" Åšmietana,
" Jogurt,
" Kefir.
Pożądane cechy kultur starterowych LAB
przeznaczonych do produkcji
serów typu  Cheddar
" Szybkie wytwarzanie kwasu mlekowego w czasie tworzenia
skrzepu, ale ze stałą szybkością,
" Oporność na fagi,
" Wrażliwość na sól (NaCl dodaje się dopiero po zakończeniu
fermentacji przez LAB, jednakże pewna aktywność jest
wymagana także potem, aby odfermentować resztki laktozy,
które mogłyby być pożywkę dla rozwoju NSLAB gazujących i
powstania wad struktury sera,
" Aktywność w czasie dojrzewania (wytwarzanie proteaz i
peptydaz, aktywność peptydaz > aktywność proteaz, aby
rozkładać gorzkie peptydy),
Stosuje siÄ™ homofermentatywne ziarniaki Lactococcus lactis
subsp. lactis i subsp. cremoris
Pożądane cechy kultur starterowych LAB
przeznaczonych do produkcji
serów typu  szwajcarskiego
" Szybkie odfermentowanie laktozy w czasie pierwszych 24 h, ale
przy niezbyt silnym zakwaszeniu ®ð obniżenie zawartoÅ›ci wody w
serze (homofermentatywne ziarniaki Lactococcus lactis subsp.
lactis i subsp. cremoris oraz Streptococcus thermophilus),
" Kultury, które odpowiedzialne są za dalsze zmiany w serach i
dojrzewanie muszą być odporne na temperaturę stosowaną w
czasie dogrzewania gęstwy serowej (50-540C) (Streptococcus
thermophilus, Lb.helveticus),
" Streptococcus thermophilus powoduje gromadzenie siÄ™ galaktozy
w środowisku, która jest pożywką dla wzrostu pałeczek
mlekowych,
" W czasie dojrzewania rozwój Propionibacterium, które zużywają
mleczany wytwarzając duże ilości CO2, kwas propionowy, kwas
octowy,
" Dojrzewanie trzy-etapowe.
Pożądane cechy kultur starterowych LAB
przeznaczonych do produkcji
śmietany (maślanki)
" Zdolność do tworzenia kwasu mlekowego i
równocześnie zdolności aromatyzujące, czyli tworzenie
diacetylu (metabolizm cytrynianów)
" Zastosowanie znajdujÄ… bakterie mlekowe zakwaszajÄ…ce
- Lactococcus lactis subsp. lactis i subsp. cremoris oraz
fermentujÄ…ce cytryniany Lactococcus lactis subsp.
lactis var. diacetylactis oraz Leuconostoc
mesenteroides subsp. cremoris,
" Diacetyl może być redukowany do acetoiny przy udziale
reduktazy diacetylu (powstawanie wady  zielonego
 jogurtowego aromatu Å›mietany) ®ð dobór szczepów
nie posiadających aktywności reduktazy diacetylu lub o
niskiej jej aktywności.
Metabolizm cytrynianów przez LAB
lð w niektórych produktach mleczarskich cytryniany obecne w
mleku sÄ… wykorzystywane przez LAB aromatyzujÄ…ce,
lð produktami metabolizmu cytrynianów sÄ… substancje bezpoÅ›rednio
wpływające na cechy organoleptyczne produktu: diacetyl,
acetaldehyd, octany, pośrednio wpływające: acetoina lub
wpływające na teksturę: CO2,
lð mleko surowe krowie zawiera ok. 1700 mg cytrynianów w 1litrze
(od 900 do 2900 mg/l) w zależności od pory roku, okresu laktacji,
żywienia,
lð w produktach mlecznych fermentowanych tj. sery typu Gouda,
Cheddar, śmietana, maślanka (kultury mezofilne) cytryniany są
wykorzystane i nie sÄ… obecne w produkcie,
lð w produktach, w których zastosowanie majÄ… kultury termofilne
(jogurt, ser szwajcarskie) cytryniany sÄ… obecne w produkcie, bo nie
zostały zmetabolizowane przez LAB,
lð LAB metabolizujÄ…ce cytryniany: Lactococcus lactis subsp.
lactis var. diacetylactis oraz Leuconostoc mesenteroides
subsp. cremoris.
Metabolizm cytrynianów u Lc. lactis
Permeaza cytrynianowa
cytrynian
octan
Liaza cytrynianowa
CO2
oksoctan
Dekarboksylaza
oksooctanowa
pirogronian
Syntaza acetomleczanu
að-acetomleczan
diacetyl
Dekarboksylaza
að-acetomleczanu
Reduktaza
acetoina diacetylu
Pożądane cechy kultur starterowych LAB
przeznaczonych do produkcji
jogurtu
" Szybkie ukwaszanie,
" Wytwarzanie charakterystycznego zbilansowanego
aromatu (acetaldehyd = aldehyd octowy, diacetyl,
acetoina, aceton, etanol, 2-butanon, lotne kwasy
tłuszczowe np. octowy, masłowy, kaprynowy),
" Zdolność wytwarzania pożądanej struktury (EPS),
" Zastosowanie szczepów z gatunków Streptococcus
thermophilus i Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus ®ð kooperacja,
" Najpierw wzrost Streptococcus, potem pałeczek.
Kooperacja Streptococcus thermophilus
i Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
stymulacja
Kwas mrówkowy
stymulacja
CO2
hamowanie hamowanie
Kwas mlekowy
Str. thermophilus Lb.bulgaricus
stymulacja stymulacja
laktoza
stymulacja
Małe peptydy, aminokwasy
Usuwa nadmiar tlenu
wytwarza aminokwasy
Obniża pH
Wytwarza kwas mrówkowy
Wpływ temperatury inkubacji na proporcje między
Str. thermophilus i Lb. bulgaricus przy stałej dawce
szczepionki i stałym czasie inkubacji
[G.Bylund (1995): Dairy Processing Handbook]
Rozwój Str. thermophilus i Lb. bulgaricus oraz tworzenie
aldehydu octowego przy 2,5% dodatku szczepionki
[G.Bylund (1995): Dairy Processing Handbook]
Rozwój pojedynczej kultury Str. thermophilus, Lb. bulgaricus oraz
mieszanki tych kultur w tych samych warunkach inkubacji
Pożądane cechy kultur starterowych LAB
przeznaczonych do produkcji kefiru
" Kefir to produkt mieszanej fermentacji mlekowej, octowej i
alkoholowej,
" Unikalne cechy zawdzięcza zastosowaniu  ziaren kefirowych
(zooglea, biało-kremowe ziarna o nieregularnym kształcie o
wielkości ziarna pszenicy do ziarna orzecha włoskiego,
nierozpuszczalne w wodzie; na mikroflorÄ™ ziarna kefirowego
składają się: drożdże (Saccharomyces cerevisiae, Candida kefir),
pałeczki mlekowe (Lb. Kefir, Lb.lactis, Lb.bulgaricus,
Lb.helveticus), ziarniaki (Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus
lactis subsp. lactis i subsp. cremoris), bakterie octowe
(Acetobacter aceti),
" Lactococcus  namnażają się najszybciej i mają obniżyć pH,
" Leuconostoc  tworzenie aromatu i smaku, wytwarzajÄ… EPS
tworzące ciągliwą strukturę, właściwości gazujące,
" Drożdże  utrzymywanie symbiozy pomiędzy poszczególnymi
grupami, tworzenie CO2, alkoholu,
" Bakterie octowe  podnoszą lepkość kefiru, utrzymywanie
symbiozy pomiędzy poszczególnymi grupami.