ROZDZIAA
2. ELEMENTY ENZYMOLOGII
Enzymy są swoistymi białkami, katalizującymi zachodzące w przyrodzie ożywionej reakcje
chemiczne. Pod pojęciem katalizy enzymatycznej rozumie się zwiększenie szybkości reakcji termody-
namicznie możliwych (nawet milionkrotne), jedynie poprzez zmniejszenie energii aktywacji cząste-
czek substratu bez naruszania stanu końcowej równowagi. Enzym nie wchodzi w skład końcowych
produktów reakcji i zasadniczo pozostaje w stanie nie zmienionym po zakończeniu reakcji.
Zdecydowana większość dotychczas poznanych enzymów ma budowę białkową. Niektóre z nich
są białkami prostymi, zbudowanymi wyłącznie z aminokwasów (np. większość hydrolaz). Jednak w
przeważającej liczbie przypadków składają się one z części białkowej (a p oe nzymu ) i niebiałkowej
(witamin i ich pochodnych, jonów metali oraz małocząsteczkowych związków organicznych) tzw.
gr up prost et ycznych i koe n zy mów . Pod nazwą gr up a pr ost et yc zna rozumie się
różnorodne niebiałkowe związki chemiczne (sacharydy, żelazoporfiryny) i jony metali luz
no zwiÄ…zane
z apoenzymem oraz silnie związane z częścią białkową koenzymy. K oe nzymy są witaminami lub
ich pochodnymi. Połączenie koenzymu z apoenzymem określa się mianem holoe nzymu . Trwałość
tego połączenia jest różna; bardzo często koenzym łatwo oddysocjowuje od apoenzymu.
Ap oe n zym jest czynny wyłącznie w połączeniu z koenzymem lub grupą prostetyczną i
decyduje o swoistości substratowej enzymu, a niekiedy również kierunkowej, np. dekarboksylację i
transaminację aminokwasów katalizują enzymy o różnych apoenzymach i tych samych koenzymach.
Dla porządku należy wspomnieć, iż aktywność biokatalityczną mogą również wykazywać cząsteczki kwasów
nukleinowych (Nagroda Nobla w 1989 roku dla G. Altmana i T. Czecha).
2.1. Ogólne właściwości katalityczne enzymów
Szczególną cechą enzymów jest ich duża specyficzność (określana także jako wybiórczość czy
swoistość) zarówno pod względem rodzaju katalizowanej reakcji chemicznej - tzw. specyficzność
kierunkowa, jak i wobec związków (substratów) biorących w niej udział - tzw. specyficzność
substratowa. Swoistość idzie często tak daleko, że enzym rozróżnia odmianę stereoizomeryczną
substratu, działając wyłącznie na jedną z nich  tzw. stereospecyficzność. Nic więc dziwnego, iż
enzymy mogą katalizować w sposób wybiórczy takie przekształcenia, których trudno lub wręcz nie
można dokonać w inny znany sposób.
Specyficzność kierunkowa. Określony enzym katalizuje na ogół pojedynczą reakcję lub grupę
ściśle spokrewnionych przemian chemicznych. Dokonuje on niejako selekcji wśród możliwych
reakcji, wybierając jedną z nich. Na przykład cząsteczka glukozo-6-fosforanu może w komórce ulec
wielu różnym przemianom, w tym utlenieniu (do laktonu kwasu 6-fosfoglukonowego), izomeryzacji
(do fruktozo-6-fosforanu) czy też mutarotacji (do glukozo-1-fosforanu).
Każda z tych reakcji jest katalizowana przez inny enzym: pierwszą katalizuje dehydrogenaza
glukozo-6-fosforanu, drugÄ…  izomeraza heksozofosforanowej, wreszcie trzeciÄ… - fosfoglukomutaza.
CH2O
P
C O
dehydrogenaza H
glukozo-6-fosforanowa
H
C C O
OH H
HO
C C
H
OH
CH2O
P
lakton kwasu 6-fosfoglukonowego
C O
O
H
H P OH2C CH2OH
H
C C
C C
izomeraza
OH H
H
OH
heksozofosforanowa
HO OH
H
OH
C C
C C
H OH
H OH
CH2OH
glukozo-6-fosforan
fruktozo-6-fosforan
C O
H H
fosfoglukomutaza
H
C C
OH H
HO O
P
C C
H OH
glukozo-1-fosforan
33
Specyficzność substratowa. Od specyficzności działania enzymu należy odróżnić jego
specyficzność substratową, polegającą na katalizowaniu przez dany enzym przemiany chemicznej
tylko jednego określonego substratu lub ograniczonej ich liczby. Znane są enzymy, wykazujące
absolutną wybiórczość wobec substratu: np. ureaza działa tylko i wyłącznie na mocznik powodując
jego rozpad, dehydrogenaza metanolowa utlenia jedynie metanol. Jednakże nie wszystkie enzymy
wykazują tak daleko posuniętą specyficzność substratową, np. proteinazy, lipazy czy amylazy
hydrolizują większość swoich substratów tj. odpowiednio białek, lipidów oraz pochodnych ą-glukanu
niezależnie od specyficznych cech budowy tych związków. O tych enzymach mówi się, że wykazują
szeroką specyficzność (są mało specyficzne). Ich przeciwieństwem są enzymy o wąskiej
specyficzności (wysoko specyficzne).
Stereospecyficzność. W Rozdziale 1 tego podręcznika omówiono zjawisko izomerii związków
chemicznych. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w
stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub
trans, Ä…- lub ²-, D- lub L-, itp. Klasycznym
FAD FADH2
przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa,
H2C COOH
HC COOH
która przekształca bursztynian do fumaranu
dehydrogenaza
H2C COOH
HOOC CH
(odmiana trans kwasu etenodikarboksylowego-
bursztynianowa
1,2). Kwas maleinowy (odmiana cis kwasu
bursztynian
fumaran
etenodikarboksylowego-1,2) nie tylko, że nie
powstaje w tej reakcji, lecz jÄ… hamuje.
Innym przykładem, który dobrze obrazuje zagadnienie stereospecyficzności enzymów, jest
ą-glukozydaza. Ta hydrolaza działa na wszystkie ą-D-glukopiranozydy, nie biorąc jednak udziału w
reakcjach hydrolizy innych glikozydów (np. ²-D-glukopiranozydów, fruktofuranozydów, itp.). Z kolei
subtilizyna (serynowa proteinaza z B.subtilis) z mieszaniny racemicznej estrów
N-acetyloaminokwasów hydrolizuje jedynie formę L-aminokwasu.
Znane są enzymy wykazujące regioselektywność. Rozpoznają one miejsce w cząsteczce związku
chemicznego (np. atom węgla, grupę funkcyjną, itp.), w którym pod
działaniem enzymu następuje przekształcenie właściwe dla jego
O CH3
specyficzności kierunkowej. Takie właściwości przejawiają m.in.
C
að monooksygenazy, które mogÄ… selektywnie wbudowywać atom tlenu w
jedno, ściśle określone miejsce cząsteczki, hydroksylując ją. Niektóre z
11
15
nich, hydroksylujące np. progesteron, mogą przejawiać jednocześnie
stereospecyficzność. To, czy hydroksylowanie nastÄ…pi w pozycji að lub
að,ðbð
6
bð oraz w którym pierÅ›cieniu i przy którym atomie wÄ™gla zależy, z
O
jakiego drobnoustroju pochodzi enzym. Monooksygenazy bakterii
bð
B.megaterium ATCC, jako jedne z nielicznych, hydroksylujÄ…
progesteron przy 15 atomie wÄ™gla w pozycji að i bð.ð Monooksygenazy
Progesteron
szczepu B.megaterium KM hydroksylujÄ… progesteron w kilku
pozycjach: 15 að i bð,ð 6 bð oraz 11að.
Natomiast tautomerazy, epimerazy lub "-izomerazy przekształcają jeden izomer w drugi.
Przykładem może być epimeraza UDP-glukozowa przekształcająca UDP 1-glukozę w UDP-1-
galaktozÄ™.
2.2. Istota katalizy enzymatycznej
Według aktualnej wiedzy, katalityczne działanie enzymów związane jest ze zjawiskiem
międzycząsteczkowych oddziaływań. Enzym (E) i substrat (S) - ewentualnie substraty - tworzą
przejściowo połączenie ES, w którym na skutek specyficznych właściwości centrum katalitycznego
enzymu następuje aktywacja cząsteczki substratu z jednoczesnym osłabieniem niektórych jego wiązań
kowalencyjnych. Uaktywniony kompleks ES przekształca się w połączenie EP, gdzie P oznacza
produkt reakcji. W końcowym etapie połączenie EP rozpada
ES EP
siÄ™ na wolny enzym i produkt reakcji. Schematycznie reakcjÄ™ E + S E + P
taką można zapisać równaniem:
Dokładne poznanie natury oddziaływań odpowiedzialnych za katalizę enzymatyczną jest
przedmiotem badań i rozważań w literaturze naukowej od wielu lat. Pionierami w tej dziedzinie byli
34
E. Fischer, pierwszy sugerujący komplementarność centrów aktywnych enzymów do substratów, oraz
L.Pauling, autor koncepcji silnej stabilizacji stanu przejściowego przez centrum aktywne. Od tego
czasu, pojawiało się wiele alternatywnych propozycji jak teoria naprężeń sterycznych, optymalnego
nałożenia orbitali, elektrostatycznego klucza i zamka, itp.
Jedno z bardziej nowoczesnych opracowań na temat czynników odgrywających rolę w katalizie
enzymatycznej zawarł w swojej książce Warshel*. Na drodze rozważań teoretycznych (półempirycznych)
dochodzi on do wniosku o dominującej roli oddziaływań o naturze elektrostatycznej w katalizie enzymatycznej.
Warshel rozpatruje następujące czynniki, które w różnych modelach teoretycznych proponowano jako z
ródło
aktywności katalitycznej enzymów:
-ð naprężenia steryczne;
-ð desolwatacjÄ™ reagentów;
-ð optymalne nakÅ‚adanie orbitali (OS);
-ð wiÄ…zania wodorowe o niskiej barierze przeniesienia protonu (LBHB);
-ð efekty dynamiczne;
-ð zmiany entropii w wyniku wiÄ…zania z enzymem,
-ð oddziaÅ‚ywania elektrostatyczne w preorientowanym, polarnym centrum aktywnym.
Zmiany energii swobodnej podczas reakcji niekatalizowanej i enzymatycznej można przedstawić
schematycznie jak na rysunku obok. Wielkość energii swobodnej tworzenia stanu przejściowego
wyznacza barierę energetyczną dla całej
stan przejściowy
reakcji. Ta bariera dla reakcji
enzymatycznej jest wyraz
nie niższa (o "GE)
"GE
niż bariera energetyczna dla reakcji
niekatalizowanej. Enzymy: zmniejszajÄ…c
energiÄ™ swobodnÄ… tworzenia stanu
przejściowego znacznie przyspieszają
substraty
produkty
przekształcenie substratów w produkty.
reakcja enzymatyczna
2.2.1. Mechanizm działania enzymów
Postęp reakcji
W czasie reakcji enzymatycznej
czÄ…steczka substratu jest wiÄ…zana w
określonym obszarze do cząsteczki enzymu
w tzw. centrum aktywnym, przez co tworzy się kompleks enzym substrat. Dzięki specyficznemu
rozkładowi grup chemicznych w centrum, enzym oddziałuje na ugrupowania chemiczne substratu
rozluz
niając konkretne wiązanie chemiczne. W wyniku rozerwania tych wiązań substrat przekształca
się w produkt, który uwalniany jest z kompleksu z enzymem. Enzym po powrocie do formy
pierwotnej (w enzymach złożonych po przyłączeniu przenoszonych grup do innego związku) tworzy
nowy kompleks z następną cząsteczką substratu itd.
Mechanizm łączenia enzymu z substratem tłumaczy się obecnie indukowanym dopasowaniem,
polegającym na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu i przekształceniu go w produkt. Przy tym
enzym może zniekształcić substrat wymuszając
w nim konformacjÄ™ podobnÄ… do stanu
E + S E S
przejściowego. Przykładem może być wiązanie
glukozy z heksokinazÄ….
Centrum aktywne enzymów. Centrum aktywne to określony obszar cząsteczki białka
enzymatycznego, w którym podczas katalizy następuje wiązanie substratu i następnie jego
przekształcenie w produkt względnie produkty reakcji. Specyficzność kierunkowa i substratowa
enzymów, a także wiele ich właściwości, zdeterminowanych jest budową centrum aktywnego.
Przyjmuje się, że centrum aktywne enzymów zlokalizowane jest w głębi globularnej cząsteczki białka
w kieszonce kształtem przypominającej szczelinę lub rowek. Obszar centrum aktywnego w
przeważającej ilości tworzą reszty aminokwasów o właściwościach hydrofobowych, a co za tym idzie,
panują w tym obszarze warunki hydrofobowe. Tak więc, jest to mikrośrodowisko o małej stałej
* [Warshel, A.: Computer Modelling Of Chemical Reactions In Enzymes And Solutions", John Wiley & Sohns,
Inc., New York, Chichester, Brisbane, Toronto and Singapore, 1991 ]
35
Energia swobodna
dielektrycznej, a stąd o zwielokrotnionych oddziaływaniach elektrostatycznych. Dzięki temu możliwe
jest rozluz
nienie określonych wiązań kowalencyjnych w cząsteczce substratu i ich przekształcenie w
inne układy wiązań.
Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego - z uwagi na funkcję, jaką pełnią  dzieli się
na cztery kategorie:
1. aminokwas lub ami no kwas y b e zpośre dni o dzi a łaj ą ce ; w enzymach złożonych ich
rolę pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne,
2. a mi n okwa s y ws poma gaj Ä…ce ,
3. a mi n okwa s y konta kt owe , zwane również wiążą cymi ,
4. a mi n okwa s y po mo cnic ze .
Ami nokwa s y p omoc ni c ze nie biorą bezpośredniego udziału w katalizie, lecz niezbędne są
do utrzymanie właściwej konformacji przestrzennej pozostałych aminokwasów centrum aktywnego
(można je traktować, jako czynniki strukturotwórcze centrum aktywnego).
Ami nokwas y kont akt owe (wi ą żąc e ) odpowiedzialne są za rozpoznanie substratu i
 wciągniecie go do kieszonki centrum aktywnego. Z reguły są zlokalizowane na obrzeżach
kieszonki. Odpowiedzialne są za specyficzność substratową enzymów.
Rola a mi nokwa s u b ezpo śr ed ni o dzi ał aj ącego i ami no kwasów wsp omagaj ą c ych
zostanie wyjaśniona na przykładzie centrum katalitycznego endopeptydaz serynowych. Enzymy te
hydrolitycznie rozszczepiają wiązania peptydowe w białkach. Omawiane aminokwasy zlokalizowane
są w głębi kieszonki; w przestrzeni znajdują w bliskiej od siebie odległości przyjmując z góry ściśle
określoną konfigurację (tak, jak to pokazano na rysunku).
32
64
32
64
Asp
His
Asp
His
221
221
Ser
Ser
CH2 CH2
CH2 CH2
CH2
CH2
C
C
O O- H N N H O
O OH N N H O-
221
221
Ser
Ser
221
Ser
CH2
CH2
R2
CH2
R2
O C
O-
R2 COOH +
dð+C
O-
O -
NH
OH
-
dð
O
R1
H2O
NH2
R1
Mechanizm działania centrum katalitycznego proteinaz serynowych (opis w tekście).
W centrum katalitycznym wszystkich proteinaz serynowych występuje triada aminokwasów.
Aminokwasem bezpośrednio działającym jest seryna, która w subtilizynach zajmuje pozycję 221 w
łańcuchu polipeptydowym, a np. w chymotrypsynie 195. Aminokwasami wspomagającymi są
histydyna i kwas asparaginowy. W środowisku alkalicznym zdysocjowana, silnie ujemna grupa
karboksylanowa rodnika aspartylowego wywołuje efekt indukcyjny, który w wyniku rezonansu
przenosi siÄ™ poprzez rodnik imidazolowy histydyny i na azocie 3 pojawia siÄ™ silny Å‚adunek ujemny; w
konsekwencji wodór grupy hydroksylowej seryny zostaje przeniesiony na azot i jednocześnie
powstaje ujemny jon alkoholanowy seryny. Jeżeli w jego pobliżu znajdzie się odpowiednio ustawiony
przestrzennie węgiel wiązania peptydowego  naładowany dodatnio  to oba przeciwnie naładowane
atomy zaczną się zbliżać do siebie. Na skutek silnych oddziaływań elektrostatycznych panujących w
tym obszarze wiązanie peptydowe ulegnie rozerwaniu. Proton z cząsteczki wody przyłączy się do
atomu azotu grupy aminowej i ten fragmentu łańcucha peptydowego odłączy się od centrum
36
aktywnego. Drugi fragment łańcucha peptydowego przejściowo utworzy wiązanie estrowe z resztą
seryny centrum aktywnego, by po chwili ulec hydrolizie pod działaniem wolnej grupy OH- i też
oddzieli siÄ™ od centrum aktywnego proteinazy.
2.2.2. Koenzymy i grupy prostetyczne.
W enzymach złożonych rolę aminokwasu bezpośrednio działającego pełnią koenzymy lub grupy
prostetyczne. Spełniają one rolę przenośników elektronów, atomów lub niewielkich grup
chemicznych. Biorą udział w 2 kolejnych reakcjach enzymatycznych: w pierwszej pobierają z jednego
substratu grupÄ™ chemicznÄ…, w drugiej oddajÄ… jÄ… drugiemu substratowi, odtwarzajÄ…c siÄ™ w pierwotnej
postaci, po czym proces się powtarza. Przenoszenie takie może również odbywać się w obrębie tej
samej cząsteczki i mamy wtedy do czynienia z izomeryzacją substratu. Trwałość połączenia
apoenzymu z koenzymami jest różna; jeśli koenzym łatwo dysocjuje, reakcje przenoszenia grup
chemicznych na koenzymy i z koenzymów katalizuje układ złożony z 2 enzymów o wspólnym
koenzymie; jeśli koenzym jest związany z enzymem trwale (pełniąc rolę grupy prostetycznej), enzym
ten katalizuje kolejno obie reakcje. Uogólniając, niebiałkowe składniki enzymów można traktować,
jako kosubstraty reakcji enzymatycznej. W tabeli 2.1. zestawiono ważniejsze koenzymy i grupy
prostetyczne, których budowa chemiczna i mechanizm działania zostaną omówione dalej.
Tabela 2.1. Ważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne
Przenoszone grupy lub
Nazwa koenzymu lub grupy prostetycznej Skrót
charakterystyczna cecha
Koenzymy oksydoreduktaz
Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy NAD Atomy wodoru i epimeryzacja
Fosforan dinukleotydu NADP Atomy wodoru
nikotynamidoadeninowego
Dinukleotyd flawinoadeninowy FAD Atomy wodoru i koenzym oksydaz
Mononukleotyd flawinowy FMN Atomy wodoru
Metaloflawoproteidy Me-Fp Transport elektronów
Flawoproteidy transportujące elektrony ETF Transport elektronów
Ubichinon Q Transport elektronów
S
Lip
Liponian Atomy wodoru i grupy acylowe
S
Porfiryny - Cytochromy, oksydaza cytochromowa
koenzym katalazy i peroksydaz
Koenzymy transferaz
- Grupy metylowe
Adenozynometionina
ATP Grupy fosforanowe, pirofosforanowe i
Adenozynotrifosforan
AMP
CO2 (koenzym karboksylaz)
-
Biotyna
Grupy aldehydowe lub dekarboksylacja
DPT
Difosfotiamina
Przemiany aminokwasów (w tym
TPP
Fosforan pirydoksalu
deaminacja)
Grupy acylowe
CoASH
Koenzym A
B12 WewnÄ…trzczÄ…steczkowe przeniesienie
Koenzym B12
grupy -COOH
FH4 Grupy formylowe, hydroksymetylowe,
Kwas foliowy
formimidowe
Reszta kwasu siarkowego
PAPS
Siarczan fosfoadenilowy
Grupy glikozylowe
UDP
Urydynodifosforan
37
Koenzymy i grupy prostetyczne oksydoreduktaz
Nukleotydy nikotynamidowe. Koenzymem wielu dehydrogenaz, czyli enzymów odrywających
lub przyłączających atomy wodoru do substratów, jest dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+)
lub jego fosforan - NADP+. Jak wskazuje nazwa, koenzymy te sÄ… dinukleotydami
O
C
zbudowanymi z nukleotydu adeninowego i nukleotydu nikotynamidowego lub jego
NH2
fosforanu. Podstawowym składnikiem nukleotydu nikotynamidowego jest amid
N
kwasu nikotynowego. Kwas nikotynowy, (znany także jako niacyna), jest pochodną
amid kwasu
pirydyny i jest jednÄ… z witamin z grupy B o nazwie witamina PP.
nikotynowego
Niedobór witaminy PP w organizmie człowieka powoduje zaburzenia czynności przewodu pokarmowego
oraz ośrodkowego układu nerwowego a także powoduje zmiany skórne znane jako pelagra. Kwas nikotynowy w
wystarczających dla człowieka ilościach występuje w mięsie, rybach oraz nasionach zbóż. Dzienne
zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi około 30mg.
Postać utleniona dinukleotydu nikotynamidoadeninowego przedstawiana jest skrótem NAD+, a
jego forma zredukowana NADH + H+. Umownie, dla wygody, dopuszcza się również symboliczne
zapisy NAD (zamiast NAD+) i NADH2 (zamiast NADH+H+).
NH2
CONH2
H H
CONH2 XH2 X
CONH2
N N
+
N
+
N N +
H+
N
CH2O OH2C N
P P
O
OH HO
Ryb Aden
P P Aden
Ryb P P
O
NAD
NADH + H+
OH OH ( )
P
mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2
dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD)
przez NAD
i jego fosforan (NADP)
Poznano przeszło 200 dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP. Właściwości i działanie
obu koenzymów jest analogiczne. Stężenie NAD w komórkach jest znacznie większe niż NADP i stąd
dehydrogenazy sprzężone z NAD są liczniejsze. Ogólnie można przyjąć, że NAD pełni w żywej
komórce rolę akceptora wodoru, natomiast jego fosforan jest donorem wodoru (pełni rolę reduktora).
W wielu przemianach enzymatycznych oba koenzymy mogą być nawzajem wymieniane. Ale znane są
przemiany, w których różnice pomiędzy NAD i NADP są bardzo wyraz
ne. Np. dehydrogenaza
alkoholowa z NAD (EC 1.1.1.1) jest 10000 razy aktywniejsza niż z NADP (EC 1.1.1.2); stąd
rozróżnienie w klasyfikacji enzymów. Istnieje możliwość wymiany H pomiędzy obu koenzymami:
transdehydrogenaza
NADP + NADH2
NADPH2 + NAD
EC 1.6.1.1
Zredukowane formy NADH2  wyjątkowo również NADPH2 - w żywych komórkach
regenerowane (utleniane) są w łańcuchu oddechowym. Ale NADH2 może też regenerować się w
reakcjach, w których staje się donorem wodoru
NADH+H+ NAD
(w tym, jako donor wodoru dla oksygenaz z HC COOH
H2C COOH
pod-podklas EC 1.14.12. i EC 1.14.13.).
HOOC CH
H2C COOH
Większość reakcji katalizowana przez
reduktaza fumaranowa
(EC 1.3.1.6)
dehydrogenazy sprzężone z NAD jest
kwas fumarowy
kwas bursztnowy
odwracalna. Jeżeli reakcja redukcji ma przewagę
nad reakcją utlenienia, enzym nazywa się reduktazą, np. przyłączenie atomów wodoru do podwójnego
wiązania w kwasie fumarowym katalizuje reduktaza fumaranowa (sprzężona z NAD - EC 1.3.1.6).
Identyczną reakcję tyle, że biegnącą głownie w przeciwnym kierunku katalizuje dehydrogenaza
bursztynianowa (sprzężona z FAD - EC 1.3.99.1).
Swoistość substratowa dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zależy od rodzaju
apoenzymu. Nie jest ona jednak absolutna. W wielu przypadkach wyraża się bardzo dużymi różnicami
38
szybkości katalizowanych reakcji, np. dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego utlenia również
aldehyd glicerynowy, ale około 1000 razy wolniej.
Apoenzymy licznych dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zawierają związane jony
metali Mg2+, Zn2+, Mn2+. Jony te są aktywatorami działania tych dehydrogenaz. Np. jony Mg2+ lub
Zn2+ odgrywają ważną rolę podczas utleniania alkoholi, ułatwiając powstawanie jonu
alkoholanowego.
Niektóre dehydrogenazy sprzężone z NAD lub NADP podczas swojego  właściwego działania, czyli
utleniania substratu mogą równocześnie prowadzić do jego d e k a r b o k s y l a c j i . Takiej dekarboksylacji ulegają
tylko ą-ketokwasy lub ą-hydroksykwasy. Utlenianie ą-ketokwasów połączone z ich dekarboksylacją nazywa się
ą - o k s y d a c j ą i katalizowane jest przez u k ł a d y w i e l o e n z y m a t y c z n e (sprzężone z Lip S ,DPT, FAD,
S
CoASH i NAD). Przykładem jest przemiana pirogronianu do acetylo~SCoA katalizowana przez
d e h y d r o g e n a z ę p i r o g r o n i a n o wą ( d e k a r b o k s yl u j ą c ą ) , o czym będzie mowa dalej. Natomiast
przykładem dekarboksylacji ą-hydroksykwasów podczas ich utlenienia jest działanie dehydrogenaz
jabłczanowych (dekarboksylujących). Ogólnie znane są aż cztery dehydrogenazy jabłczanowe sprzężone z NAD
lub NADP, w tym trzy o właściwościach dekarboksylujących:
EC 1.1.1.37  d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a - znana z cyklu Krebsa, sprzężona z NAD, utlenia jabłczan do
szczawiooctanu,
EC 1.1.1.38  d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( s zc z a wi o o c t a n - d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z
NAD, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność
dekarboksylacji szczawiooctanu,
EC 1.1.1.39  d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z NAD, podczas
utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; nie posiada zdolności dekarboksylacji
szczawiooctanu,
EC 1.1.1.40  d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( s zc z a wi o o c t a n - d e k a r b o k s yl u j ą c a ) - sprzężona z
NADP, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność
dekarboksylacji szczawiooctanu.
Nukleotydy flawinowe. W skład tych nukleotydów wchodzi r ybofl a wi na . Związek ten
zbudowany jest z heterocyklicznej izoalloksazyny i przyłączonego do niej rybitolu,
pięciowodorotlenowego alkoholu, będącego pochodną rybozy. Ryboflawina jest witaminą B2.
O
H3C
N
NH
O
H3C
N
H3C N N O
NH
CH2
NH2
H3C N N O
CHOH
N
CH2 N
CHOH
CHOH
CHOH
N N
CHOH
CH2O P
P OH2C
O
CHOH
CH2OH
ryboflawina
OH OH
dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)
Ryboflawina posiada charakterystyczne żółte zabarwienie. Jej niedobór w organizmie człowieka powoduje
zmiany chorobowe w obrębie jamy ustnej; m.in. pękanie kącików ust i śluzówki, obrzęki warg i ich łuszczenie się,
zmiany zapalne języka a także zaburzenia ze strony narządu wzroku. Duże ilości tej witaminy występują w
drożdżach, w ziarnach zbóż i jajach. Zapotrzebowanie człowieka wynosi 2mg na dobę.
Fosforan ryboflawiny  mon onukl e ot yd fl a wi nowy  zapisuje siÄ™ symbolicznie FMN, a
jego połączenie z nukleotydem adeninowym  d i nukl e ot yd f lawino ad en in owy  oznacza się
skrótem FAD. Oba nukleotydy flawinowe są nierozerwalnie związane z odpowiednimi białkami
enzymatycznymi, tworząc f lawo pr ote idy, będąc jednocześnie przykładem grup prostetycznych.
FMN i FAD są grupami prostetycznymi dehydrogenaz, przenoszących głównie atomy wodoru.
Ich cechą charakterystyczną jest zdolność odrywania atomów wodoru od dwóch sąsiadujących ze sobą
atomów węgla, tworząc podwójne wiązanie: -CH2-CH2- -CH=CH-. Przykładem może być
wspomniana już dehydrogenaza bursztynianowa (EC 1.3.99.1). Zredukowaną formę FAD
39
symbolicznie zapisuje siÄ™ FADH2. Podobnie jak zredukowany NADH2, zredukowany FADH2 w
komórce regeneruje się (utlenia) w łańcuchu oddechowym.
O
H O
H3C
XH2 X H3C
N
N
NH
NH
H3C N N O
H3C N N O
H
rybitol Aden
P P
rybitol Aden
P P
FAD
FADH2
mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2
przez FAD
Ale FMN i FAD mogą być również koenzymami oksydaz: enzymów posiadających zdolność
bezpośredniego przenoszenia oderwanych od substratu atomów wodoru na tlen  uaktywnianie
cząsteczki tlenu prowadzą in situ, tj. w miejscu zetknięcia się enzymu z cząsteczką tlenu. Reakcja ta
przebiega bez zmiany formy grup prostetycznych na ich formy zredukowane. Przykładem takiego
enzymu może być oks yda za a mi n owa
O2
za wi er aj Ä…ca FAD (EC 1.4.3.4). ReakcjÄ™ takÄ…
(FAD)
H2O
O
symbolicznie zapisuje się z FAD ujętym w nawias
R CH2 NH2 R C
+
NH3
+ H2O2
oksydaza
H
dla podkreślenia, że nie zmienia się jego forma po
aminowa
zakończeniu reakcji. Dla podkreślenia roli FAD
lub FMN w tego typu reakcjach, nazywa siÄ™ je kofaktorami reakcji utlenienia.
FAD jest również elementem składowym systemu enzymatycznego cytochromu
P450. Zredukowany FADH2 może z kolei być donorem wodoru dla oksygenaz z
podpodklasy EC 1.14.14.
Fe2+
Dość często apoenzym oksydoreduktaz, sprzężonych z FMN lub
O
FAD, zawiera w swojej budowie jony metali Fe2+, Zn2+ lub Mo2+, które
H3C
N
NH
współdziałają podczas reakcji utleniania i redukcji; enzymy tego typu
nazywa siÄ™ metaloflawoproteidami i oznacza symbolem Me-Fp.
H3C N N O
TransportujÄ… one przede wszystkim elektrony.
R
metaloflawoproteid
Ubichinon (koenzym Q). Przenośnikiem atomów wodoru może być również ubichinon, zywany
też koenzymem Q. Związek ten pod względem budowy przypomina witaminy E i K, choć sam
witaminą nie jest, gdyż w komórkach zwierzęcych jest syntetyzowany (z tyrozyny). A
ańcych boczny
zbudowany jest z jednostek izoprenoidowych. Ich liczba bywa rózna w zależności od z
ródła
pochodzenia ubichinonu. Np. ubichinon z serca świni ma ich 50, a z serca wołu 10, co zapisuje się
symbolicznie Q-50 i odpowiednio Q-10. Ilośc jednostek izoprenoidowych w ubichinonach
drobnoustrojowych waha siÄ™ od 5 do 13.
O
O
OH
XH2 X
H3C
(
)n H H3C R
H3C R
H3C CH3
H3C CH3
H3C CH3
O
O
OH
ubichinon (Q) Q
QH2
mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2
przez ubichinon
Mechanizm przenoszenia atomów wodoru przez ubichinon polega na utlenianiu i redukcji
pierścienia chinonowego.
40
Ubichinon jako koenzym dehydrogenaz bÄ…dz
reduktaz spotykany jest rzadko. Jednym z
nielicznych przykładów może być de h yd r oge n aza NADH ( ubi c hi non owa )  EC 1.6.5.3, która
katalizuje reakcjÄ™ utlenienia NADH2 do NAD z jednoczesnÄ… redukcjÄ… ubichinonu do ubichinolu.
Ciekawym enzymem jest de hyd ro ge na za me t ano l owa (EC 1.1.99.8) znaleziona u niektórych
metylotrofów, której grupą prostetyczną jest ubichinonoproteina (kofaktor PQQ).
Natomiast ubichinon w komórkach pełni bardzo ważną rolę, będąc elementem składowym
ł ańc uc ha oddec h owego.
Związki porfirynowe. Porfiryny to związki, w których 4 pierścienie pirolowe połączone są ze
sobÄ… mostkami metinowymi (=CH ). Przy atomach wÄ™gla ² (3 i 4) pierÅ›cieni pirolowych zamiast
atomów wodoru występują różne grupy
1
2
1
2
að
chemiczne (metylowe, winylowe, octanowe i dð
I
HC CH
I
inne). W celu ujednolicenia zapisu związków
N
tego typu Fisher zaproponował symboliczny, 8
3
3
8
uproszczony ich wzór. Pominięto w nim mostki
II
N H IV II
IV HN
metinowe a pierścienie pirolowe zaznaczano
4
7
4
7
kodem kreskowym. Pierścienie ponumerowano
N
III
cyframi rzymskimi od I do IV, atomy węgla w
HC CH
III
gð bð
5
pierścieniach od 1 do 8, a mostki metinowe 6
5
6
symboliczny, uproszczony
literami alfabetu Å‚aciÅ„skiego od Ä… do ´, jak to
zapis wzoru porfiryny
porfiryna
przedstawiono na rysunku obok.
Z uwagi na możliwość podstawiania atomów wodoru 1-8 w pierścieniach pirolowych różnymi
podstawnikami, istnieje teoretycznie olbrzymia ilość izomerów pochodnych porfiryny. Jednakże w
naturalnych systemach biologicznych głównie występuje izomer typu III, w którym podstawniki przy
IV pierścieniu pirolowym są ułożone asymetrycznie w stosunku do innych pierścieni. Oznaczony i
nazwany jest on przez Fishera pr ot opor fir ynÄ… IX . Izomer ten jest prekursorem me t al opo rfi r yn
wchodzących w skład he mop ro te in i chl or ofi li .
V
M
V
M
I
I
M
M
M
M
Fe2+
IV II
IV II Fe2+
ferrochelataza
EC 4.99.1.1
P
V
P
V
III
III
CH3
M =
P M
P M
CH=CH2
V =
CH2 COOH
CH2
P =
hem
protoporfiryna IX
enzymatyczna transformacja protoporfiryny IX w hem
M e t a l o p o r f i r y n y to pochodne protoporfiryny IX z atomem metalu (żelaza, magnezu, miedzi)
centralnie wbudowanym w układ porfirynowy za pośrednictwem atomów azotu pierścieni pirolowych.
Metaloporfiryny z wbudowanym żelazem (hem i heminy) występują jako grupy prostetyczne w
he mop r ot ei nach. Metaloporfiryny z wbudowanym Mg2+ są składnikami chl or of il u.
H e m o p r o t e i n y to białka zawierające jako grupę prostetyczną hem lub heminę.
H e m to połączenie żelaza występującego na II stopniu utlenienia (Fe2+) z protoporfiryną IX.
Hem jest barwnÄ… grupÄ… prostetycznÄ… hemoglobiny i mioglobiny. W organizmach zwierzÄ…t,
hemoglobina  czerwony barwnik krwi - uczestniczy w transporcie tlenu, CO2 a także jonów
wodorowych. Mioglobina uczestniczy w transporcie tlenu w mięśniach i w jego magazynowaniu.
H e m i n y to połączenia protoporfiryny IX z jonem żelaza występującym na III stopniu utlenienia
(Fe3+). Heminy we wszystkich organizmach pełnią funkcję przenośników elektronów w łańcuchu
oddechowym (układ cytochromów), a także są grupami prostetycznymi katalaz i peroksydaz,
katalizując procesy utleniania. Powstają z hemoglobiny pod wpływem kwasu solnego, a reakcja ta
służy w medycynie sądowej do wykrywania śladów krwi.
41
C y t o c h r o m y to hemoproteiny, które dzięki odwracalnej zmianie stopnia utlenienia żelaza
grupy heminowej (z Fe2+ na Fe3+) stanowią układ przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym
w żywych organizmach. Na podstawie budowy chemicznej, widma absorpcyjnego i przede wszystkim
miejsca w łańcuchu oddechowym, cytochromy dzieli się na grupy: a, b i c (np. cytochromy b) oraz
podgrupy (np. cytochromy a3). Kompleks hemoprotein a + a3 jest enzymem znanym jako oks yd aza
cyt ochro mo wa.
HOOC CH2 CH2 CH3
HC CH
N
CH3
HOOC CH2 CH2
miejsce przyłączenia heminy
N Fe+3 N
H3C
N
HC CH
CH2
S S
CH2 Liz Cys Ser Glu(NH2) Cys His
CH3
H2C
fragment łańcucha polipeptydowego
cytochromu c
Å„
CH2
hemina
cytochrom c
O k s y d a z a c yt o c h r o m u c (EC 1.9.3.1) to enzym będący kompleksem hemoprotein a i a3,
składający się z kilku łańcuchów polipeptydowych o różnej masie cząsteczkowej, 2 grup heminowych
oraz 2 atomów miedzi. Oksydaza cytochromowa jest końcowym enzymem łańcucha oddechowego;
aktywuje tlen atomowy do przyłączenia atomów wodoru, przenosząc na niego elektrony.
C h l o r o f i l e , pochodne protoporfiryny IX, zielone barwniki występujące u fotosyntetyzujących
roślin, glonów i bakterii (bakteriochlorofil). Chlorofile pełnią rolę grupy prostetycznej chromoproteidu
zwanego chloroplastynÄ…. SÄ… to metaloporfiryny, zawierajÄ…ce wbudowany w centrum jon magnezu
(Mg2+). Połączone są wiązaniem estrowym z
fitolem. Rozróżnia się 4 rodzaje chlorofilu. U CH3 CH CH2
wszystkich roślin wyższych i glonów
występuje chlorofil a (niebieskozielony, co
HC CH
N
najmniej w 3 formach: P700, Ca680, Ca670 -
CH3
CH3
liczby oznaczają długość fali świetlnej, przy
której występuje maksimum absorpcji światła). N Mg2+ N
Chlorofil b - żółtozielony, występujący u
C2H5
C20H39
OOC CH2 CH2
roślin wyższych i niektórych glonów. Chlorofil
N
fityl
C
CH
c  występuje w małych ilościach w
czerwono zabarwionych roślinach wodnych
CH3OOC CH
CH3
(m.in. z rodzaju Alternanthera), brunatnicach,
H H
C
niektórych okrzemkach i wiciowcach.
O
Chlorofil d znajdowany jest u krasnorostów.
chlorofil a
Chlorofil a absorbuje głównie światło
fioletowe i czerwone, oraz żółtozielone, chlorofil b absorbuje głównie światło niebieskie
i pomarańczowe. Chlorofile z karotenoidami wchodzą w skład fotosystemów PS-I i PS-II.
Kwas liponowy (tiooktanowy). Związek ten uczestniczy w transporcie elektronów, a także w
przenoszeniu grup acylowych w reakcjach ą-oksydacji (oksydacyjnej dekarboksylacji ą-ketokwasów).
Jest elementem składowym układów wieloenzymatycznych wraz z DPT, CoASH, FAD i NAD, np. w
dehydrogenazie pirogronianowej (dekarboksylujÄ…cej). Jest to kwas 6,8-ditiolooktanowym. A
atwo
ulega odwracalnemu utleenieniu i redukcji.
42
XH2 X
CH2
Enzym-NH
S
SH
C CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH2 Lip
Lip
S
S H
O
S S
liponian
liponian
uteniony
liponian zredukowany
Jak już wspomniano, liponian jest składnikiem układów wieloenzymatycznych. W układach tych,
jako kosubstrat, transportuje rodniki acylowe.
FAD
FADH2
O
OH
SH
S
CH3 C
Lip ~SCoA
Lip
DPT CH
S H
S
CH3
enzym
O
DPT
S
~C CH3
Lip
CoASH
S H
enzym
Koenzymy i grupy prostetyczne transferaz
Adenozynometionina. Jest to koenzym transferaz przenoszących jednowęglową grupę  CH3.
Grupa metylowa w tym układzie jest wybitnie reaktywna (tzw.  aktywny metyl ). I dlatego, w formie
jonu CH3+, może być przenoszona na elektroujemnie naładowane inne grupy chemiczne
(najkorzystniej z wolną parą elektronową). Koenzym ten bierze udział w wielu szlakach
anabolicznych, metylujÄ…c m.in. grupÄ™ aminowÄ… (np. w biosyntezie choliny).
NH2
N N
CH3
OH
H
O COOH
N N
N
CH2 S CH2
4
5
O N3 6 CH2 NH C NH CH
+
9 10
CH2 2
7
1
8
CH2
H2N N N
CHNH2
CH2
H
COOH
COOH
OH OH
kwas tetrawodorofoliowy (H4folian)
adenozynometionina
Kwas foliowy. Koenzym ten jest pochodną pterydyny, heterocyklicznego dipierścieniowego
związku, do którego bocznej gupy metylowej przy C6 przyłączona jest cząsteczka kwasu
p-aminobenzoesowego i dalej poprzez wiązanie amidowe jedna lub więcej cząstwczek kwasu
glutaminowego. Kwas foliowy jest witaminą. Jej niedobór w ustroju człowieka może prowadzić do
pojawienia się trombocytopenii i pokrewnych odmian niedokrwistości. Do organizmu człowieka
dostarczany jest przez bakterie jelitowe.
Kwas foliowy - a właściwie produkt jego redukcji, kwas 5,6,7,8-tetrawodorofoliowy (H4folian) -
jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących jednowęglowe rodniki typu:
Øð CH3
Øð HOCH2
Øð  CH2
Øð  CH=
Øð HOC
Øð HN=CH
Miejscem przyłączenia grup C1 są atomy N-5 lub N-10 tetrawodorofolianu. Natomiast z
ródłem
ich pochodzenia są przemiany aminokwasów: histydyny, tryptofanu, seryny i metioniny.
43
Biotyna. Biotyna jest grupą prostetyczną karboksylaz i dekarboksylaz. Przyłączenie grupy
-COO- do substratu wymaga dostarczenia energi chemicznej; jej dawcą jest ATP, który transformuje
do aż AMP.
O
O O
HOOC
ATP AMP+PP
HN NH
HN NH N NH
NH-Enzym
karboksylaza
S R
S C S R
CO2
O
karboksybiotyna
biotyna
biotyna
Biotyna jest witaminą H. Jej brak w organizmie człowieka wywołuje zaburzenia skórne oraz zmiany
psychomotoryczne: depresjÄ™, brak Å‚aknienia i snu, itp. Witamina ta jest wytwarzana przez bakterie jelitowe.
Koenzym A. Na pierwszy rzut oka przypomina on opisane wcześniej dinukleotydy. Jednakże
koenzym ten nie jest zaliczany do dinukleotydów. Zbudowany jest z adenozyno-3 -fosforanu 5 -
pirofosforanu połączonego wiązaniem estrowym z kwasem pantotenowym, a ten z kolei wiązaniem
peptydowym z cystoaminÄ…. Cysteoamina jest produktem dekarboksylacji cysteiny. Kwas pantotenowy
jest amidem kwasu 2,4-dihydroksy-3,3-dimetylomasÅ‚owego i ²-alaniny. Symbolicznie koenzym A
zapisuje siÄ™ jako CoASH.
NH2
N N
CH3 O O
N N
O CH2 C CH C NH CH2 CH2 C NH CH2 CH2 SH
O CH2 P P
CH3OH
OH O
P
kwas pantotenowy
cysteoamina
adenozyno-3'-fosforan-5`-pirofosforan
koenzym A (CoA-SH)
Kwas pantotenowy jest witaminą B . Niezbędna jest ona do prawidłowego metabolizmu białek, cukrów i
5
tłuszczów oraz do syntezy niektórych hormonów, uczestniczy w regeneracji tkanek i przyspiesza gojenie ran,
zapobiega przemęczeniu i usprawnia układ sercowo-naczyniowy, nerwowy i pokarmowy, bierze udział w
wytwarzaniu tłuszczów, cholesterolu, poprawia pigmentację i stan włosów. Kwas pantotenowy wytwarzany jest w
organizmach roślin, drobnoustrojów, a także niektórych pleśni. Bogatym z
ródłem tego związku są drożdże,
grzyby, groch, wątróbka, otręby pszenne, ryby (np. śledzie, makrele, pstrągi), mleko pełne, mięso kurczaka,
mleczko pszczele, pestki słonecznika, sery, orzechy, jajka, owoce awokado, pomarańcze, ziemniaki, brokuły,
ciemny ryż, melony, pełnoziarnisty chleb, soja, masło orzechowe, banany.
Koenzym A odgrywa podstawowÄ… rolÄ™ podczas aktywacji i
ATP AMP+PP
przenoszenia rodników acylowych. Reakcje przyłączenia CoASH
O
do kwasu karboksylowego katalizują syntetazy, które do swego X COOH
X C
SCoA
~
syntetaza
działania wymagają dostarczenia energii, której z
ródłem jest
X-CoA
CoASH
ATP. Powstałe wiązanie tioestrowe jest wiązaniem
wysokoenergetycznym (zaznaczane we wzorach chemicznych
tyldą  ~ ). Przykładem może być synteza acetylo~SCoA z kwasu octowego, katalizowana przez
syntetazÄ™ acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).
Difosfotiamina. Tiamina jest związkiem zbudowanym z pierścienia pirymidynowego
połączonego z heterocyklicznym pierścieniem tiazolowym grupą metylenową. W difosfotiaminie
grupa hydroksylowa łańcucha bocznego pierścienia tiazolowego jest zestryfikowana pirofosforanem.
Z apoenzymem wiąże się właśnie przez ugrupowanie pirofosforanowe. Symbolicznie diosfotiaminę
zapisuje siÄ™ jako DPT.
44
CH2 + CH3
N
N
CH2 O
CH2 P
P
H3C N NH2
S
difosfotiamina (DPT)
Tiamina jest w i t a m i n ą B . Skutkami jej niedoboru są zaburzenia czynności centralnego układu
1
nerwowego (uczucie osłabienia i zmęczenie, możliwy oczopląs, zaburzenia pamięci i koncentracji a nawet
depresja), niewydolność krążenia (przyspieszona akcja serca, powiększenie wymiarów serca, obrzęki kończyn),
zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego (utrata łaknienia, nudności, wymioty, biegunki, bóle brzucha, brak
apetytu, spadek wagi). W przypadku silnej awitaminozy B może wystąpić choroba Beri-beri, objawiająca się
1
bólami kończyn, osłabieniem mięśni i ich drżeniem oraz wyraz
ną niewydolnością układu krążenia. Etanol
powoduje rozkład tego związku, o czym powinni pamiętać ludzie nadużywający alkoholu i dbać o dostarczanie jej
do organizmu. y
r ó d ł e m t e j w i t a m i n y są produkty zbożowe, mięso, groch, fasola, drożdże, orzechy, ryby,
owoce i warzywa. Zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi ok. 1,5 mg na dobę.
Difosfotiamina jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących aldehydy: glikolowy, octowy i
semialdehyd bursztynowy.
Jako grupa prostetyczna k e t o l a z , DPT przenosi aldehyd glikolowy, który odrywa od ksylulozo-
5-fosforanu i transportuje go na erytrozo-4-fosforan.
Jako e l e me nt u k ł a dó w wi e l o en z yma t y cz n yc h - podczas ą-oksydacji - np.
pirogronianu lub ą-ketoglutaranu zachowuje się jak transferaza, a równocześnie jak liaza. Jako
dehydrogenaza pirogronianowa (acetyl-transportujÄ…ca)  EC 1.2.4.1, prowadzi dekarboksylacjÄ™
pirogronianu do aldehydu octowego, a jako dehydrogenaza ketoglutaranowa (bursztynian-
transporująca)  EC 1.2.4.2, dekarboksyluje ą-ketoglutaran do semialdehydu bursztynianowego, które
dalej przenosi na kwas liponowy.
CH2OH
CH3
R R
+ CH3 + CH3
C O
N N
C O
HO CH
COOH
CH2 O PP CH2 O PP
CH2 CH2
H S H S
CH OH
pirogronian
Enzym Enzym
P
CH2O DPT
DPT
fragment dehydrogenazy
ksylulozo-5-fosforan
pirogronianowej
transketolaza
(dekarboksylujÄ…cej)
R
R
+ CH3
O CO2
+ CH3 N
H
C H
N
H
CH3 C
~ CH2 O PP
CH2
CH OH
S
HO C
~
CH2 O PP
CH2
S
OH
CH2O
P Enzym
CH2OH
Enzym
aldehyd
hydroksyetylo
~DPT
aktywny aldehyd glikolowy
3-fosfoglicerynowy
~DPT
Pirydoksyna. Mieszanina trzech naturalnych związków: pirydoksyny, pirydoksalu i
pirydoksaminy. SÄ… one pochodnymi pirydyny.
O
CH2OH
CH2NH2
C
H
HO CH2OH
HO CH2OH
HO CH2OH
H3C N
H3C N
H3C N
pirydoksyna pirydoksamina
pirydoksal
45
5 -F o s f or a n pi r y d o ks al u (PLP) jest koenzymem lub grupą prostetyczną przeszło 50
enzymów. Bierze udział w przemianach aminokwasów. Przede wszystkim współdziała z
aminotransferazami przenoszącymi grupę aminową z aminokwasów na ą-ketokwasy i odwrotnie. Jest
koenzymem dekarboksylaz aminokwasów. Uczestniczy ponadto w przemianie tryptofanu w amid
kwasu nikotynowego, transformacji glicyny w serynę i w biosyntezie cysteiny. Szczegóły dotyczące
reakcji transaminacji i dekarboksylacji aminokwasów zostaną opisane w rozdziale omawiającym
metabolizm aminokwasów.
Mieszanina pirydoksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy nazywana jest witaminÄ… B . Wszystkie trzy zwiÄ…zki
6
ulegają w organizmie wzajemnym przekształceniom i wykazują podobne działanie biologiczne. Niedobór witaminy
B6 występuje tylko wyjątkowo, np. u małych dzieci karmionych sztucznymi odżywkami lub karmionych przez
matki, które długo przyjmowały doustne środki antykoncepcyjne oraz u alkoholików i ich potomstwa. Do
najczęściej spotykanych objawów należą stany zapalne skóry (łojotokowe zmiany na twarzy), podrażnienie języka
i błon śluzowych jamy ustnej (języka, kącików warg) zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym (apatia,
bezsenność, nadwrażliwość, napady drgawek), zwiększona podatność na infekcje. Witamina B wytwarzana jest
6
przez florę bakteryjną przewodu pokarmowego, w dużych występuje w wątrobie, jajach, jarzynach i mięsie.
Cyjanokobalamina. Jej nazwa wywodzi się od jonu cyjankowego połączonego koordynacyjnie
z atomem kobaltu, wbudowanym w rdzeń porfirynowy. Rdzeń porfirynowy wraz z jonem kobaltu
noszą nazwę kobal a mi ny. Zamiast jonu CN-, z kobalaminą może być połączony inny anion, np.
hydoksylowy, chlorkowy czy azotynowy. W tym ostatnim przypadku zwiÄ…zek nosi nazwÄ™
nitrokobalaminy, a znajdowany jest w podłożach hodowlanych Streptomyces griseus.
Cyjanokobalamina jest koenzymem niektórych dehydrataz, amoniako-liaz i mutaz.
H3C CH2CONH2
CH2CH2CONH2
CH3
HC CH
CH3
N
H2NOH2CH2C
+
CH3
N CH3
N Co N
H2NOH2C
CH3
CH2CH2CONH2
CN
N
N HOH2C
H3C O
CH3 C
CH3
CH3
H2NOH2C
CH2 CH3
CH2 CO NH CH2 CH
P O OH
cyjanokobalamina
Witamina B , znana jako czynnik przeciwdziałający niedokrwistości złośliwej lub jako czynnik
12
przeciwanemiczny. Brak tej witaminy powoduje charakterystyczne zmiany w obrazie krwi, zwiÄ…zane z anemiÄ…
złośliwą. Obserwuje się również zmiany zapalne języka oraz brak kwasu solnego w żołądku. Organizmy roślin i
zwierząt nie produkują cyjanokobalaminy. Zdolność tą mają niektóre gatunki bakterii (choć u niektórych
mikroorganizmów jest ona także czynnikiem wzrostowym). Zwierzęta mięsożerne zapotrzebowanie na tę
witaminę pokrywają, spożywając mięso innych zwierząt. Szczególnie obfita w cyjanokobalaminę jest wątroba.
Zwierzęta roślinożerne wykorzystują cyjanokobalaminę wytwarzaną przez florę bakteryjną ich przewodu
pokarmowego. y
ródło to jest czasem niewystarczające i u niektórych gatunków zwierząt dochodzi niekiedy do
zjadania własnych odchodów, co prowadzi do zwiększenia ilości tej witaminy w organizmie. Organizm dorosłego
człowieka potrzebuje ok. 3 mg cyjanokobalaminy dziennie. Zapotrzebowanie to jest w zupełności pokrywane
przez normalnÄ… dietÄ™.
Nukleozydofosforany. Nukleotydy, które do swojej reszty fosforanowej dodatkowo mają
przyłączoną jedną lub dwie cząsteczki kwasu fosforowego, czyli nukleozydodi- i trifosforany są
koenzymami, a właściwie poprawniej definiując kofaktorami czy też kosubstratami reakcji
katalizowanych przez liczne enzymy. Zaliczane są one do związków bogatych w energię chemiczną;
tzw. związków makroergicznych lub inaczej związków wysokoenergetycznych. Wśród nich
najczęściej kosubstratem w reakcjach enzymatycznych bywa a de n ozyn otri fos f ora n  ATP. Jest
on kosubstratem większości ligaz (enzymów z klasy EC 6.), kinaz (transferaz z podklasy EC 2.7.,
46
przenoszących grupę fosforanową na różne substraty) czy wreszcie niektórych karboksykinaz
(enzymów z pod-podklasy EC 4.1.1.).
NH2
N N O O O
N N
P O P OH
O CH2 O P O
~ð
~ð
OH OH
OH
OH O
H
adenozyna
AMP
ADP
ATP
T e r mo d y n a mi ka r e a kcj i e n z yma t yc z n y ch . Zgodnie z prawami termodynamiki reakcje
endoergiczne nie mogą przebiegać spontanicznie, nawet jeśli są katalizowane przez enzymy. Tego
typu reakcje muszą być sprzężone z inną reakcją silnie egzoergiczną, tak by suma ich energii
swobodnej "G była równa zero lub ujemna.
-H2O
glukozo-6- P DðG= 12 kJ/mol
glukoza + H3PO4
Przykładowo reakcja glukozy z kwasem
+H2O
fosforowym jest reakcjÄ… endoergicznÄ…; zmiana
DðG= -29 kJ/mol
ATP ADP + Pi
energii swobodnej "G = 12 kJ/mol. StÄ…d
ADP
ATP
równowaga tej reakcji jest silnie przesunięta
na lewÄ… stronÄ™; glukozo-6-fosforan
DðG= -17 kJ/mol
glukozo-6- P
glukoza
praktycznie nie powstaje. Reakcja hydrolizy
ATP do ADP + Pi* jest z kolei silnie egzoergiczna; "G = -29 kJ/mol. Przy tak dużej ujemnej wartości
"G jest to reakcja praktycznie nieodwracalna. W przypadku enzymatycznego sprzęgnięcia obu tych
reakcji suma energii swobodnej "G = -17 kJ/mol. W takim układzie równowaga reakcji przesunięta
jest zdecydowanie na prawą stronę i praktycznie cała pula glukozy jest przemieniona w glukozo-6-P.
W ATP pierwsza cząsteczka kwasu fosforowego przyłączona jest do grupy  OH rybozy
zwykłym wiązaniem estrowym. Energia swobodna jego hydrolizy wynosi "G = -14 kJ/mol.
Natomiast kolejne cząsteczki kwasu fosforowego wiążą się ze sobą wiązaniem bezwodnikowym.
Energia swobodna ich hydrolizy odpowiednio wynosi:
, DðG=
ADP AMP + Pi DðG= -28 kJ/mol ATP ADP + Pi -29 kJ/mol
Stąd ATP i ADP (adenozynodifosforan) należą do związków bogatych w energię chemiczną.
Natomiast AMP (adenozynomonofosforan) jest związkiem niskoenergetycznym. Przyjmuje się, że
dolną wartością energii swobodnej hydrolizy, która decyduje o zaliczeniu związku do
makroergicznych jest "G zbliżone do -29 kJ/mol.
W tabeli 2.2. przykładowo podano przybliżone średnie wartości energii swobodnej hydrolizy
kilku związków zawierających grupę fosforanową. Energia swobodna hydrolizy ATP do ADP+Pi
wynosi "G = -29 kJ/mol, co sprawia, że ten nukleozydotrifosforan wraz z ADP i pirofosforanem
należą do grupy fosforanów znajdujących się pośrodku listy cytowanych związków
wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych. Dlatego ATP może być donorem fosforanów dla
związków niskoenergetycznych znajdujących na liście poniżej, o "G >-29 kJ/mol. Z tego samego
powodu ADP może być akceptorem wysokoenergetycznego fosforanu od związków znajdujących się
na tej liście powyżej, o "G <-29 kJ/mol.
* umownie Pi oznacza fosforan nieorganiczny
47
Należy jeszcze dodać, że wiązania bezwodnikowe w ATP łatwo ulegają rozerwaniu. Oderwana
reszta fosforanowa lub pirofosforanowa może być przenoszona na różne substraty, tym łatwiej, iż
rozkład ATP jednocześnie dostarcza energii swobodnej niezbędnej dla takich reakcji.
Tabela 2.2. Energia swobodna hydrolizy niektórych fosforanów
Nazwa zwiÄ…zku "G [kJ/mol] 1
-62
Fosfoenolopirogronian
-51
Karbamoilofosforan
-49
1,3-difosfoglicerynian
-43
Fosfokreatyna
-34
Acetylo~SCoA
-31
ATP®ðAMP+PP
-29
ATP®ðADP+P
-28
ADP®ðAMP+P
-27
PP (pirofosforan)
Glukozo-1-fosforan -21
AMP -14
Glukozo-6-fosforan -14
1
cytowane dane są przybliżonymi wartościami "G
ATP zawiera dwa wysokoenergetyczne wiÄ…zania bezwodnikowe. Oderwanie fosforanu, prowa-
dzÄ…ce do powstania ADP, powoduje utratÄ™ jednego z nich ("G =-29 kJ/mol). Oderwanie fosforanu od
ADP prowadzi do powstania AMP ("G =-28 kJ/mol). Teoretycznie wyliczona, sumaryczna energia
swobodna takiej dwuetapowej przemiany ATP do AMP obniża się więc o "G =-57 kJ/mol*. Ale od
ATP może być oderwany również pirofosforan, jednoetapowo prowadząc do powstania AMP. Zmiana
energii swobodnej "G takiej przemiany równa jest -31 kJ/mol. Dla pełnego jej bilansu należy jednak
uwzględnić dodatkowo energię swobodną zawartą w pirofosforanie
pirofosfataza
PPi nieorganiczna
2Pi
("G =-27 kJ/mol), co po podsumowaniu daje "G =-58 kJ/mol*. Ta
swobodna energia zawarta w PPi jest uwalniana podczas jego
enzymatycznej hydrolizy pod działaniem pirofosfatazy nieorganicznej (EC 3.6.1.1).
W komórkach żywych organizmów pomiędzy ATP, ADP i AMP istnieje pewnego typu
specyficzna równowaga. Kinaza adenylanowa (EC 2.7.4.3)
kinaza
2 ADP
ATP + AMP
przenosi jeden z wysokoenergetycznych fosforanów z ATP na adenylanowa
AMP, co prowadzi do powstania dwóch cząsteczek ADP, tak jak
to przedstawiono na rysunku obok.
Dla pełnego obrazu należy jeszcze wspomnieć, że w komórkach ATP uczestniczy w reakcjach
enzymatycznych w postaci kompleksu z jonem Mg2+. Stąd jony Mg2+ są aktywatorami enzymów
współdziałających z ATP.
Reasumując, r ol a AT P j a ko ko s ub s t r a t u w reakcjach enzymatycznych jest następująca:
1. ATP jako d on or e ner gi i s w ob od n ej w reakcjach syntez katalizowanych przez ligazy. W
większości takich przypadków ATP ulega rozkładowi do AMP + PPi. Jak już wspomniano,
ilość energii swobodnej dostarczona do takiego układu jest równoważna "G =-58 kJ/mol, co
wystarcza do przeprowadzenia rozmaitych syntez, niekiedy nawet związków
wysokoenergetycznych. Za przykład niech posłuży synteza acetylo~SCoA katalizowana przez
syntetazÄ™ acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).
* Sumaryczna energia swobodna wyzwolona w jednoetapowym i dwuetapowym przekształceniu ATP do AMP
oczywiście musi być taka sama. Różnica 1 kJ/mol pomiędzy wyliczeniami wynika ze stosowania przybliżonych wartości "G.
48
ATP dużo rzadziej, jako koenzym ligaz, ulega podczas reakcji rozkładowi do ADP. Tym
niemniej znanych jest sporo i takich przypadków. Dla podkreślenia, że ATP rozkłada się
jedynie do ADP w nazwie ligazy w nawiasie umieszcza się (ADP-tworząca). Jako przykład
podana zostanie syntetaza acetylo-CoA (ADP-tworzÄ…ca)  EC 6.2.1.13. Wybrano jÄ… celowo,
gdyż tylko wyjątkowo niektóre bakterie posiadają ten enzym, a z energetycznego  punktu
widzenia komórki jest on korzystniejszy od wcześniej opisanej syntetazy acetylo-CoA.
ADP+P
ATP
ATP AMP+PP
O
O
CH3 COOH
CH3 C
SCoA
~
CH3 COOH
syntetaza
CH3 C
SCoA
~
syntetaza
acetylo-CoA
acetylo-CoA (ADP-tworzaca)
CoASH
CoASH
2. ATP jako d on or or t of o sf or a n u . Odpowiednie transferazy (kinazy) przenoszÄ… rodnik
fosforanowy na rozmaite substraty, np. na monosacharydy,
ADP
ATP
glicerol, nukleozydy, itp. Za przykład posłuży synteza NADPH z
NADH katalizowana przez kinazÄ™ NADH (EC 2.7.1.86).
NADH NADPH
kinaza NADH
Na marginesie omawianego zagadnienia warto zwrócić uwagę na fakt, że w wyjątkowych sytuacjach
z
ródłem ortofosforanu może być pirofosforan. Nie powinno to budzić większego zdziwienia, bowiem
energia swobodna jego hydrolizy "G =-27 kJ/mol. Przykładem może być kinaza octanowa
(pirofosforanowa)  EC 2.7.2.12, katalizujÄ…ca przeniesienie fosforanu z PP na kwas octowy z
i
wytworzeniem acetylofosforanu.
3. ATP jako d o n or pi r o f os f or an u . W niektórych przypadkach konieczne jest przyłączenie
do substratu rodnika pirofosforanowego. Jego donorem jest ATP, a reakcjÄ™ katalizujÄ…
pirofosfokinazy. Jako przykład może posłużyć synteza
AMP
ATP
difosfotiaminy z tiaminy. ReakcjÄ™ katalizuje
difosfotiamina
tiamina
pirofosfokinaza
pirofosfokinaza tiaminowa (EC 2.7.6.2).
tiaminowa
4. ATP jako d on or r od n i ka a de n yl i l o we g o . Adenylacja to reakcja przeniesienia rodnika
adenylilowego z ATP na substrat z jednoczesnym odłączeniem PPi. Reakcja ta ma
podstawowe znaczenie dla syntezy dinukleotydów adenilowych i związków o podobnej
budowie (choćby wspomnianego wcześniej CoASH). Reakcję katalizują adenylilotransferazy
(zwane zwyczajowo pirofosforylazami). Jako przykład posłuży synteza FAD z FMN
katalizowana przez adenylilotransferazÄ™ FMN (EC 2.7.7.2).
Ale enzymy z pod-podklasy EC 2.7.7. mogą również transportować inne nukleotydilowe
rodniki z nukleotydotrifosforanów. Jedną z takich reakcji o podstawowym znaczeniu dla
procesów biochemicznych jest synteza UDPG (urydyliloglukozy). Reakcja katalizowana jest
przez urydylilotransferazÄ™ glukozo-1-fosforanowÄ… (EC 2.7.7.9).
PPi PPi
ATP UTP
FMN glukozo-1- P
UDPG
FAD
adenylilotransferaza FMN urydylilotransferaza
glukozo-1-fosforanowa
5. ATP jako d o n o r ade no z yn y . W pewnych szczególnych przypadkach ATP staje się
donorem adenozyny. Przykładem może być synteza adenozynometioniny. Koenzym ten
powstaje w reakcji metioniny z ATP, katalizowanej przez adenozynotransferazÄ™ metioninowÄ…
(EC 2.5.1.6).
adenozynotransferaza
metioninowa
adenozynometionina
metionina + ATP
EC 2.5.1.6
PP + P
Niekiedy rolę ATP w omówionych wyżej reakcjach może pełnić inny z
nukleozydotrifosforanów. O urydynotrifosforanie (UTP) i jego roli już wspomniano.
Guanozynotrifosforan (GTP) lub inozynotrifosforan (ITP) sÄ… koenzymami syntetazy bursztynylo-CoA
49
(patrz cykl Krebsa). Cytydynotrifosforan (CTP) bierze udział w syntezie substancji lipidowych pod
postaciÄ… cytydylodifosfocholiny.
Pomiędzy ATP a pozostałymi nukleotydotrifosforanami występuje zależność:
kinaza
nukleozydodifosforanowa
nukleozydodifosforan + ATP
nukleozydotrifosforan + ADP
2.2.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych
EC 2.7.4.6
S z y b ko ś ć r e a kc j i e nz y ma t yc z ne j , podobnie jak każdej reakcji chemicznej, wyraża się
ubytkiem stężenia jednego z substratów lub też przyrostem stężenia któregoś z produktów:
d[S] d[P]
enzym
S
P v =ð -ð =ð (2.1)
dt dt
R ó w no wa g a r e a k cj i e n zyma t y c z n yc h . Teoretycznie wszystkie reakcje chemiczne
(również katalizowane enzymatycznie) są odwracalne. Po pewnym czasie ustala się równowaga
pomiędzy substratami reakcji a jej produktami, objawiająca się tym, że szybkość powstawania
produktów jest równa szybkości ich rewersji do substratów. Szybkość powstawania produktów v1 jest
proporcjonalna do stężeń reagujących substratów. Szybkość reakcji rewersji produktów v-1 jest
proporcjonalna do stężeń produktów. W stanie równowagi:
v+1, k+1
v1 =ð v2 v1 =ð k+ð1 ´ð[A]´ð[B] v-ð1 =ð k-ð1 ´ð[AB] (2.2)
A + B
AB
v-1, k-1
gdzie: A,B  substraty; AB  produkt; k+1, k-1  stałe szybkości reakcji
Dla przypomnienia: stałe szybkości reakcji k są charakterystyczne dla konkretnych reagentów. Rosną wraz
ze wzrostem temperatury reakcji.
Zgodnie z prawem działania mas Guldberga i Waagego w stanie równowagi, stężenia reagentów
spełniają zależność:
k1 [AB]
=ð =ð K gdzie: K jest staÅ‚Ä… równowagi konkretnej reakcji. (2.3)
k-ð1 [A]´ð[B]
Im większa jest stała równowagi K, tym większe stężenie produktu AB, czyli równowaga reakcji
bardziej przesunięta na prawo. Reakcja pomiędzy A i B zachodzi tym energiczniej, im większa jest
stała równowagi reakcji K.
Jeszcze raz należy wyraz
nie podkreślić: obecność enzymu w układzie nie zmienia wartości
stałej K. Enzym jedynie przyspiesza moment osiągnięcia równowagi przez reagenty. Jeżeli K>1
to reakcja jest spontaniczna.
Stałą K można wyrazić liczbowo, o ile znane są stężenia substratów i produktów reakcji w stanie
równowagi. Wartości K można również wyliczyć na drodze termodynamicznej. Pomiędzy zmianami
energii swobodnej "G a stałą równowagi reakcji K istnieje zależność:
DðG =ð -RT ×ð ln K gdzie: R - staÅ‚a gazowa, T  temperatura bezwzglÄ™dna (2.4)
Z zależności tej wynika prosta formuła potwierdzająca wcześniejsze stwierdzenia: im większa
stała równowagi reakcji K, tym większa różnica pomiędzy wartościami energii swobodnej substratów
i produktów. I odwrotnie: im większe "G, tym równowaga reakcja jest bardziej przesunięta na korzyść
produktów. W krańcowych przypadkach, gdy ujemna wartość "G jest bardzo duża cały substrat ulega
przekształceniu w produkt, a reakcja praktycznie staje się nieodwracalna.
Z kolei pomiędzy zmianami energii swobodnej "G (w chemii fizycznej znanej pod słuszną
nazwą potencjału termodynamicznego), entalpią układu i zmianami entropii występuje zależność:
DðG =ð DðH -ð TDðS
(2.5)
V
[S]>>[E]
S z y b ko ś ć p o c zą t k ow a r e a k cj i en z yma t yc z n ej .
Szybkość początkowa reakcji v jest to szybkość wyznaczona przed
powstaniem dostatecznie dużej ilości produktu, który by umożliwiał
zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji
enzymatycznej jest zawsze proporcjonalna do stężenia enzymu.
[E]
50
Wpływ stężenia enzymu [E] na
szybkość reakcji enzymatycznej V
Stąd oznaczenie ilości enzymu (jego aktywności) powinno być oparte, o ile jest to możliwe, na
pomiarach początkowej szybkości reakcji przy znacznym nadmiarze substratu S. W takim
układzie szybkość reakcji nie zależy od stężenia substratu i reakcja jest rzędu zerowego.
A k t y w n o ś ć e n z y m a t y c z n a . Oznaczenie bezwzględnej ilości enzymu (np. w gramach lub
molach) jest trudne do wykonania, gdyż wiąże się z oczyszczeniem białka enzymatycznego do stanu
homogenności. Stąd umówiono się, że za miarę ilości enzymu w biopreparatach przyjmuje się jego
aktywność katalityczną (enzymatyczną), czyli szybkość, z jaką w założonych warunkach preparat
enzymatyczny przekształca określoną ilość wybranego arbitralnie substratu. Miarą tej szybkości jest
ubytek substratu lub przyrost produktów reakcji enzymatycznej w przeliczeniu na jednostkę czasu.
Zdefiniowano również oficjalnie obowiązujące standardowe jednostki enzymatyczne.
Pierwszą z nich, obowiązującą w układzie SI, nazwano kat ale m (Kat). 1 Kat to taka ilość
enzymu, która katalizuje przemianÄ™ 1 mola substratu w czasie 1 sekundy w temperaturze 30°ðC.
Druga z tych oficjalnie obowiązujących jednostek, rekomendowana przez Międzynarodową Unię
Biochemiczną, nazwana została mi ę d zyn a r o do wą j e d n os t ką e n z yma t yc z n ą (w skrócie
m.j.e.). 1 m.j.e. to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 źmola substratu w ciągu 1 minuty
w temperaturze 30°ðC.
Jednakże dla wielu enzymów obie te oficjalne obowiązujące jednostki nie znalazły praktycznego
zastosowania. Natomiast powszechnie przyjęły się jednostki enzymatyczne skojarzone z
odpowiednimi metodami oznaczania aktywności opracowanymi dla całej gamy konkretnych enzymów
a nawet grup enzymów.
Teoria Michaelisa-Menten. W 1913 roku L.Michaelis i M.L.Menten przedstawili swojÄ…
koncepcję katalizy enzymatycznej. Model Michaelisa Menten opiera się na założeniu powstawania
przejściowego kompleksu enzymu-substrat:
k2
k1
ES E + P
E + S
k-2
k-1 (2.6)
Zgodnie z tym równaniem, przy niewielkich stężeniach substratu - równoważnym stężeniom
enzymu - reakcja enzymatyczna staje się reakcją I rzędu i jej szybkość staje się proporcjonalna do
stężenia zarówno substratu [S], jak i enzymu [E]. Przy stałym stężeniu enzymu [E] szybkość reakcji
będzie zależała jedynie od stężenia substratu. Wpływ stężenia substratu [S] na początkową szybkość
reakcji enzymatycznej przy stałym stężeniu enzymu przedstawia poniższy wykres.
V
Vmax
V
max
2
[S]
Km
Dla pewnych stężeń substratu - równoważnym ilościom dostępnych centrów aktywnych
enzymu - reakcja osiągnie szybkość maksymalną Vmax. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie
przyspiesza jego przemiany. Jak już wspomniano wcześniej szybkość reakcji enzymatycznej zależy
od łatwości tworzenia kompleksu enzymu z substratem. Z równania (2.6) wynika, że w stanie
równowagi szybkość tworzenia kompleksu ES jest równa szybkości jego rozpadu:
v1 +ð v-ð2 =ð v2 +ð v-ð1 (2.7)
v1 =ð k+ð1 ´ð[E]´ð[S] v-ð1 =ð k-ð1 ´ð[ES] v2 =ð k+ð2 ´ð[ES] v-ð1 =ð k-ð2 ´ð[E]´ð[P] (2.8)
Po podstawieniu zależności (2.8) do równania (2.7) i po prostych matematycznych
przekształceniach otrzymuje się:
51
[ES] k+ð1 ´ð[S] k-ð2 ´ð[P]
=ð +ð (2.9)
[E] k-ð1 +ð k+ð2 k-ð1 +ð k+ð2
UwzglÄ™dniajÄ…c fakt, że na poczÄ…tku reakcji [P] Þð 0 oraz po dalszych prostych przeksztaÅ‚ceniach
równania (2.9), otrzymuje się:
[E]´ð[S] k-ð1 +ð k+ð2
=ð =ð Km (2.10)
[ES] k+ð1
Wielkość Km nosi nazwę s t a ł e j Mi c ha el i s a . J est ona charakterystyczna dla danego układu
enzym-substrat. A
atwo zauważyć, że im mniejsza wartość Km, tym większe stężenie kompleksu
przejściowego [ES].
AnalizujÄ…c równania (2.6) ¸ð (2.10) należy zauważyć, że
1. stężenie enzymu [E] w równaniu (2.10), w rzeczywistości jest stężeniem enzymu wolnego w
danym momencie reakcji, czyli niezwiązanego w kompleks przejściowy ES. Na każdym
etapie reakcji część enzymu wyjściowego [E0] obecnego w układzie reakcyjnym jest związana
w ES. StÄ…d [E]= [E0]-[ES].
2. Szybkość reakcji enzymatycznej v, czyli szybkość powstawania produktu P, zależy tak
naprawdÄ™ od szybkoÅ›ci rozpadu kompleksu ES, czyli od v+2. StÄ…d: v = v+2=k+2 ´ð [ES].
3. Gdy cały enzym jest w kompleksie z substratem, czyli [E0]=[ES] szybkość reakcji
enzymatycznej osiąga maksymalną szybkość Vmax.
Uwzględniając powyższe założenia w równaniu (2.10) otrzymuje się r ó w na ni e
ma t e ma t yc z n e Mi c ha el i s a -M e nt e n:
Vmax ´ð[S]
v =ð (2.11)
Km +ð [S]
Równanie (2.11) pozwala w prosty sposób zdefiniować stałą Michaelisa Km:
gdy: v= 1/2´ðVmax to Km = [S]
Stała Michaelisa Km jest to takie stężenie substratu [S], przy którym szybkość reakcji
enzymatycznej równa się połowie szybkości maksymalnej Vmax.
A
atwo wykazać, że:
1. JeÅ›li [S]<2. JeÅ›li [S]=Km, to v=1/2´ðVmax
3. Jeśli [S]>>Km, to reakcja jest 0 rzędu i v=Vmax.
Odwrotność stałej Michaelisa 1/Km nazywana jest powinowactwem danego enzymy do substratu.
Im mniejsza stała Michaelisa Km, tym większe powinowactwo enzymu do substratu, co pokazuje
poniższy rysunek. Celowo dla obu substratów - S1 i S2  przyjęto identyczne szybkości maksymalne
reakcji Vmax. Km2>Km1, co oznacza, że ten enzym wykazuje większe powinowactwo do substratu S1
aniżeli do S2. Oznacza to, że szybciej przekształca on substrat S1 aniżeli S2.
1
v
v
Vmax
tgÄ… = Km/Vmax
S1 S2
að
Vmax
1
Km1 Km2 -1
[S]
[S]
Km
Wpływ rodzaju substratu na szybkość reakcji Wykres Lineweavera-Burka
enzymatycznej
Stałe Michaelisa Km dla różnych układów enzym-substrat mogą mieć różne wartości; nawet od
10 2 mola/dm3 do 10 7mola/ dm3.
Stałą Km można wyznaczyć graficznie korzystając ze wzoru Lineweavera-Burka..
52
1 Km 1 1
=ð ´ð +ð
v Vmax [S] Vmax
Szczegółowo kinetyką reakcji enzymatycznych zajmuje się enzymologia i tam można znalez
ć więcej danych
odnośnie tematu.
2.2.4. Klasyfikacja i nomenklatura enzymów
Pierwotne nazewnictwo enzymów było nieuporządkowane i dopuszczało stosowanie dowolnych
nazw takich, jak pepsyna, papaina, subtilizyna. W póz
niejszym okresie nazwÄ™ enzymu wywodzono od
typu reakcji lub substratu, na który działał, przy czym za charakterystyczną dla enzymów uznano
końcówkę -aza (np. reduktaza, lipaza, itp.).
Od 1964 roku Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej zaleciła stosowanie
s ys t e ma t yc zn yc h n a zw e n z ymó w , składających się przeważnie z dwu części. Pierwsza jest
utworzona od nazwy katalizowanej reakcji i określa jej rodzaj (np. oksydoreduktaza, glukohydrolaza,
itp.). Druga część nazwy enzymu składa się z nazwy substratu lub substratów biorących udział w
reakcji. Np.:
maltohydrolaza 1,4-Ä…-D-glukanu (zwana oficjalnie i zwyczajowo ²-amylazÄ…) - EC 3.2.1.2,
oksydoreduktaza alkohol:NAD (oficjalnie zwana dehydrogenazÄ… alkoholowÄ…) - EC 1.1.1.1.
Nazwy systematyczne enzymów są długie i niekiedy bardzo skomplikowane. Z tego powodu ich
stosowanie napotyka na spory opór ze strony biochemików. Ponadto do wielu enzymów przylgnęły
nazwy stosowane pierwotnie. Dlatego zdecydowano, że obok nazwy systematycznej, dopuszczalne
jest stosowanie nazw zwyczajowych. Ostatnio (po 2000 roku) pojawiła się koncepcja wprowadzenia
tzw. nazw oficjalnych enzymów wywodzących się od nazw zwyczajowych. I tak np. nazwa ą-amylaza
jest w świetle tej koncepcji nazwą oficjalną enzymu sklasyfikowanego pod numerem EC 3.2.1.1.
Należy jeszcze uzupełnić, że pierwotne, zwyczajowe nazwy niektórych enzymów (np. sacharaza,
maltaza) okazały się w świetle aktualnej wiedzy bez pokrycia i dla nich nie zaleca się ich stosowania.
Ponadto zdarza się, że pod jedną i tą samą nazwą zwyczajową są znane nawet trzy różne enzymy, np.
tyrozynaza. Nazwa  tyrozynaza dla dwóch z nich oczywiście jest nazwą błędną.
W numerze 1 czasopisma "Postępy Biochemii" z 1985 roku zamieszczono słownik zalecanych i
zwyczajowych nazw enzymów w języku polskim.
Wszystkie poznane enzymy zostały ujęte przez Komisję Enzymową w jednolity system
klasyfikacji (EC). Każdy enzym w ramach tego systemu posiada odpowiedni numer złożony z
czterech członów liczbowych oddzielonych kropkami (np. dehydrogenaza alkoholowa ma numer EC
1.1.1.1). Podanie tego numeru jednoznacznie określa konkretny enzym, co pozwala uniknąć
nieporozumień i pomyłek. Zasady klasyfikacji i numeracji zbadanych enzymów oparte zostały o ich
specyficzność kierunkową (rodzaj katalizowanej reakcji) i substratową. Wszystkie enzymy podzielono
na sześć głównych klas:
ð EC.1. Oksydoreduktazy - enzymy katalizujÄ…ce reakcje odÅ‚Ä…czania lub przyÅ‚Ä…czania atomów
wodoru, przyłączenia atomu tlenu lub przenoszenia elektronów.
ð EC.2. Transferazy - enzymy przenoszÄ…ce grupy funkcyjne, rodniki, fragmenty czÄ…steczek itp.
ð EC 3. Hydrolazy - enzymy katalizujÄ…ce reakcje hydrolizy.
ð EC 4. Liazy - enzymy niehydrolitycznie rozrywajÄ…ce wiÄ…zania.
ð EC 5. Izomerazy - enzymy katalizujÄ…ce przemiany wewnÄ…trzczÄ…steczkowe (racemizacja,
izomeryzacja, przenoszenie grup itp.).
ð EC 6. Ligazy - enzymy syntetyzujÄ…ce, katalizujÄ…ce tworzenie wiÄ…zaÅ„.
Każda klasa główna dzieli się na szereg podklas, których kolejne numery stanowią drugi człon
numeru klasyfikacyjnego i wynikają, ogólnie biorąc, z uściślonej specyficzności kierunkowej. Na
przykład EC.3.4. jest numerem podklasy hydrolaz peptydowych, czyli enzymów hydrolizujących
wiązanie peptydowe. W obrębie podklas rozróżnia się pod-podklasy - trzeci człon numeru
klasyfikacyjnego. Określa on dokładniej specyfikę katalizowanej reakcji. Dla oksydoreduktaz określa
grupę funkcyjną będącą akceptorem; dla transferaz uściśla rodzaj przenoszonej grupy; dla hydrolaz -
typ hydrolizowanego wiÄ…zania; dla liaz - rodzaj odszczepianej grupy; dla izomeraz - charakter
przekształcenia i wreszcie dla ligaz - rodzaj powstałego związku.
53
Dostęp do internetowej bazy danych dotyczącej nomenklatury enzymów (Enzyme Nomenclature
Database) można znalez
ć pod adresem http://www.expasy.org/enzyme/. Na następnej stronie
przykładowo pokazano stronę internetową ExPASy dla dehydrogenazy alkoholowej  EC 1.1.1.1.
54
Wzór strony ExP A Sy dla EC 1.1.1.1  dehydrogenaza alkoholowa.
Official Name
Alcohol dehydrogenase.
Alternative Name(s)
Aldehyde reductase.
Reaction catalysed
An alcohol + NAD(+) <=> an aldehyde or ketone + NADH
Cofactor(s)
Zinc or Iron.
Comment(s)
·ð Acts on primary or secondary alcohols or hemiacetals.
·ð The animal, but not the yeast, enzyme acts also on cyclic secondary alcohols.
Cross-references
Biochemical
D8 ; E6 ; J10
Pathways; map
number(s)
PROSITE PDOC00058 ; PDOC00059 ; PDOC00060
BRENDA 1.1.1.1
PUMA2 1.1.1.1
PRIAM enzyme-
1.1.1.1
specific profiles
Kyoto University
1.1.1.1
LIGAND chemical
database
IUBMB Enzyme
1.1.1.1
Nomenclature
1.1.1.1
IntEnz
MEDLINE Find literature relating to 1.1.1.1
P80222, ADH1_ALLMI; P49645, ADH1_APTAU; P06525, ADH1_ARATH;
P41747, ADH1_ASPFL; P12311, ADH1_BACST; Q17334, ADH1_CAEEL;
P43067, ADH1_CANAL; P48814, ADH1_CERCA; P23991, ADH1_CHICK;
P23236, ADH1_DROHY; P48586, ADH1_DROMN; P09370, ADH1_DROMO;
P22246, ADH1_DROMT; P07161, ADH1_DROMU; P12854, ADH1_DRONA;
P08843, ADH1_EMENI; P05336, ADH1_HORVU; P20369, ADH1_KLULA;
Q07288, ADH1_KLUMA; P00333, ADH1_MAIZE; P80512, ADH1_NAJNA;
Q9P6C8, ADH1_NEUCR; P20306, ADH1_ORYSA; P12886, ADH1_PEA;
Swiss-Prot
P14219, ADH1_PENAM; P25141, ADH1_PETHY; O00097, ADH1_PICST;
Q03505, ADH1_RABIT; P22797, ADH1_RANPE; P14673, ADH1_SOLTU;
P80338, ADH1_STRCA; P13603, ADH1_TRIRP; P00330, ADH1_YEAST;
Q07264, ADH1_ZEALU; P20368, ADH1_ZYMMO; P42327, ADH2_BACST;
O45687, ADH2_CAEEL; O94038, ADH2_CANAL; P48815, ADH2_CERCA;
P27581, ADH2_DROAR; P25720, ADH2_DROBU; P23237, ADH2_DROHY;
P48587, ADH2_DROMN; P09369, ADH2_DROMO; P07160, ADH2_DROMU;
P24267, ADH2_DROWH; P37686, ADH2_ECOLI; P54202, ADH2_EMENI;
Q24803, ADH2_ENTHI; P10847, ADH2_HORVU; P49383, ADH2_KLULA;
Zasady klasyfikacji enzymów w podklasach i pod-podklasach.
Oksydoreduktazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, na
jaką grupę funkcyjną lub grupę związków działa dana oksydoreduktaza. Pewnego typu odstępstwo
występuje w podklasach EC 1.13. i EC 1.14. Te dwie podklasy skupiają oksygenazy  enzymy
55
wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratów, choć oficjalnie mówi się o
 oksydoreduktazach działających na pojedyncze lub podwójne donory z jednoczesnym
wybudowaniem atomów tlenu .
Poniżej przedstawiono przykłady podklas (w EC 1.13. i EC 1.14. również pod-podklas) w tej
klasie enzymów.
EC 1. Oksydoreduktazy
EC 1.1. działające na grupę  CH
2-OH jako donor
EC 1.2. działające na grupę  CHO lub >C=O jako donor
EC 1.3. odrywajÄ…ce atomy wodoru od  CH -ð, prowadzÄ…c do  CH=CH-ð
2-CH
2
EC 1.4. działające na grupę  CH jako donor
2-NH
2
EC 1.5. działające na grupę -CH-NH- jako donor
EC 1.6. działające na NADH lub NADPH
EC 1.7. działające na inne związki azotowe jako donory
EC 1.8. działające na związki siarki jako donory
EC 1.9. działające na grupę hemową jako donor
EC 1.10. działające na związki difenolowe i pokrewne jako donory
EC 1.11. działające na H O jako akceptor peroksydazy
2 2
SÄ… to p e r o k s y d a z y . W tej podklasie brak jest pod-podklas, stÄ…d ich numer zaczyna siÄ™ od
EC 1.11.1. Na przykład numer EC 1.11.1.6 odnosi się do k a t a l a z y .
EC 1.12. działające na wodór jako donor
EC 1.13. oksygenazy, enzymy wbudowujÄ…ce atom lub dwa atomy tlenu do substratu, nie wymagajÄ…
dodatkowego donoru wodoru
EC 1.13.11. dioksygenazy- wbudowujÄ… dwa atomy tlenu
EC 1.13.12. monooksygenazy  wbudowujÄ… jeden atom tlenu
EC 1.14. oksygenazy, enzymy wbudowujÄ…ce atom lub dwa atomy tlenu do substratu, wymagajÄ…
dodatkowego donoru wodoru
Schematycznie, reakcje katalizowane przez te enzymy można przedstawić następująco:
O2 DH2 D O2 DH2
D
OH
X-OH
XH X
XH2
OH
H2O
mechanizm działania
mechanizm działania
dioksygenazy z podklasy EC 1.14.
monooksygenazy z podklasy EC 1.14.
EC 1.14.11. dioksygenazy, DH2 = 2-ketoglutran
EC 1.14.12. dioksygenazy, DH = NADH
2
EC 1.14.13. monooksygenazy, DH = NADH
2
EC 1.14.14. monooksygenazy, DH = FADH lub zredukowany FMN
2 2
EC 1.14.15. monooksygenazy, DH2 = zredukowane żelazowo-siarkowe białka
EC 1.14.16.  EC 1.14.20. monooksygenazy, DH = inne zredukowane zwiÄ…zki
2
EC 1.15. działające na ponadtlenki jako akceptory
EC 1.16. utleniajÄ…ce jony metali
EC 1.17. dziaÅ‚ajÄ…ce na grupy =CH-ð lub  CH2-ð jako donory
EC 1.18. działające na siarkowo-żelazowe białka jako donory
EC 1.19.  EC 1.21. działające na inne związki jako donory
EC 1.97. inne oksydoreduktazy
W klasie oksydoreduktaz trzeci człon numeru - czyli pod-podklasa - wskazuje, co jest donorem lub
akceptorem atomów wodoru względnie elektronów. Poniżej podano kilka przykładów pod-podklas z
klasy oksydoreduktaz.
EC 1.x.1. akceptorem wodoru jest NAD lub NADP, dehydrogenazy i reduktazy
EC 1.x.2. akceptorem elektronów są cytochromy
EC 1.x.3. akceptorem wodoru jest tlen czÄ…steczkowy, oksydazy
Oksydazy sÄ… flawoproteidami (np. z FAD), metaloflawoproteidami bÄ…dz
hemoproteidami. Znane sÄ…
dwa typy oksydaz: oksydazy typu I wytwarzają podczas działania wodę, oksydazy typu II wytwarzają
nadtlenek wodoru.
1/2
O2 O2
(koenzym) (koenzym)
XH2 X XH2 X
H2O2
H2O
oksydazy typu I oksydazy typu II
56
Przykładem oksydazy typu I jest oksydaza cytochromu-c (EC 1.9.3.1), a przykładem oksydazy typu II
oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4).
EC 1.x.4. akceptorem sÄ… zwiÄ…zki disulfidowe (min. liponian) dehydrogenazy (dekarboksylujÄ…ce)
EC 1.x.5. akceptorem wodoru jest ubichinon dehydrogenazy
EC 1.x.7. akceptorem są żelazo-siarkowe białka
EC1.x.99.z innym akceptorem (najczęściej z FAD) dehydrogenazy
Transferazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, jaką grupę
funkcyjną transportuje dana transferaza. Trzeci człon numeru  pod-podklasa  uściśla o jaki rodnik
chodzi lub wskazuje akceptor przenoszonej grupy.
EC 2. Transferazy
EC 2.1. transportujące grupy jednowęglowe (C )
1
EC 2.1.1. metylotransferazy (-ðCH )
3
EC 2.1.2. hydroksymetylo- i formylotransferazy (-ðCH -ðOH, -ðCHO)
2
EC 2.1.3. karboksy-ð i karbamoilotransferazy
EC 2.1.4. amidynotransferza (-ðCONH )
2
EC 2.2. transportujÄ…ce grupy aldehydowe lub ketonowe
EC 2.3. Acylotransferazy
EC 2.3.1. transportujące grupy inne niż acetylo-aminowe
EC 2.3.2. aminoacylotransferazy
EC 2.3.3. acylowe grupy przekształcane na alkilowe rodniki podczas transportu
EC 2.4. glikozylotransferazy
EC 2.4.1. heksozylotransferazy
EC 2.4.2. pentozylotransferazy
EC 2.4.99 transportujÄ…ce inne glikozylowe grupy
EC 2.5. transportujące alkilowe lub arylowe grupy, inne niż metylowe grupy
EC 2.6. transportujÄ…ce grupy z azotem
EC 2.6.1. Transaminazy aminotransferazy
EC 2.6.2. Oksymotransferazy
EC 2.6.99. transportujÄ…ce inne grupy z azotem
EC 2.7. transportujÄ…ce grupy zawierajÄ…ce fosfor
EC 2.7.1. Fosfotransferazy z grupÄ… alkoholowÄ… jako akceptorem kinazy
EC 2.7.2. Fosfotransferazy z grupÄ… karboksylowÄ… jako akceptorem kinazy
EC 2.7.3. Fosfotransferazy z grupÄ… z azotem jako akceptorem kinazy
EC 2.7.4. Fosfotransferazy z grupÄ… fosforowÄ… jako akceptorem kinazy
EC 2.7.6. Difosfotransferazy difosfokinazy
EC 2.7.7. Nukleotydilotransferazy
EC 2.7.8. Transferazy dla innych pochodnych grup fosforowych
EC 2.7.9. Fosfotransferazy z parą akceptorów dikinazy
EC 2.8. transportujÄ…ce grupy zawierajÄ…ce siarkÄ™
EC 2.8.1. Siarkotransferazy
EC 2.8.2. Siarczanotransferazy
EC 2.8.3. CoA-transferazy
EC 2.8.4. transportujÄ…ce grupy tioalkylowe
EC 2.8. transportujÄ…ce grupy zawierajÄ…ce selen
Hydrolazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju
wiązanie ulega hydrolizie. Trzeci człon numeru  pod-podklasa  uściśla typ hydrolizowanego
wiÄ…zania.
EC 3.Hydrolazy
EC 3.1. działające na wiązanie estrowe
EC 3.1.1. Hydrolazy estrów karboksylowych esterazy, lipazy i laktonazy
EC 3.1.2. Hydrolazy tioestrów
EC 3.1.3. Hydrolazy monoestrów fosforowych fosfatazy i nukleotydazy
EC 3.1.4. Hydrolazy diestrów fosforowych fosfolipazy i fosfodiesterazy
EC 3.1.5. Hydrolazy monoestrów trifosforowych
EC 3.1.6. Hydrolazy estrów kwasu siarkowego
EC 3.1.7. Hydrolazy monoestrów difosforowych difosfatazy
EC 3.1.8. Hydrolazy triestrów fosforowych
EC 3.1.11. ¸ð3.1.31. Egzo- i endorybonukleazy
EC 3.2. Glikozylazy
57
EC 3.2.1. Glikozydazy, i inne enzymy hydrolizujÄ…ce O- i S-glikozyle
EC 3.2.2. hydrolizujÄ…ce zwiÄ…zki N-glikozylowe
EC 3.3. działające na wiązanie eterowe
EC 3.3.1. Hydrolazy tioeterowe i trialkilosulfonianowe
EC 3.3.2. Hydrolazy eterowe
EC 3.4. działające na wiązanie peptydowe hydrolazy peptydowe
EC 3.4.11. Aminopeptydazy
EC 3.4.13. Dipeptydazy
EC 3.4.14. Dipeptydylo- i tripeptydylo-peptydazy
EC 3.4.15. Peptydylo-dipeptydazy
EC 3.4.16 Karboksypeptydazy serynowego typu
EC 3.4.17 Metalokarboksypeptydazy
EC 3.4.18 Karboksypeptydazy cysteinowego typu
EC 3.4.19 Omega peptydazy
EC 3.4.21. Endopeptydazy serynowe
EC 3.4.22. Endopeptydazy cysteinowe
EC 3.4.23. Endopeptydazy aspartylowe
EC 3.4.24. Metaloendopeptydazy
EC 3.4.25. Endopeptydazy treoninowe
EC 3.4.99. Endopeptydazy o nierozpoznanym mechanizmie działania
EC 3.5. dziaÅ‚ajÄ…ce na wiÄ…zanie C-ðN, inne niż peptydowe
EC 3.5.1. w linearnych amidach m.in. amidazy i deacylazy
EC 3.5.2. w cyklicznych amidach
EC 3.5.3. w linearnych amidynach
EC 3.5.4. w cyklicznych amidynach
EC 3.6. działające na bezwodniki kwasowe
EC 3.6.1. w zwiÄ…zkach zawierajÄ…cych fosforanowe bezwodniki m.in. difosfatazy
EC 3.6.2. w zwiÄ…zkach zawierajÄ…cych sulfonowe bezwodniki
EC 3.6.3. działające na bezwodniki kwasowe; katalizujące przenoszenie transmembranowe
EC 3.6.5. działające na GTP; związane z komórkowym transportem
EC 3.7. dziaÅ‚ajÄ…ce na wiÄ…zanie C-ðC
EC 3.7.1. w ketonowych substancjach
EC 3.8. działające na halogenkowe wiązania
EC 3.8.1. w zwiÄ…zkach C-ðhalogen
EC 3.9. działające na wiązanie fosforo-azotowe
EC 3.10. działające na wiązanie siarkowo-azotowe
EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-fosforowe
EC 3.11. działające na wiązanie siarkowo-siarkowe
EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-siarkowe
Liazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju wiązanie
ulega rozerwaniu. Trzeci człon numeru  pod-podklasa  uściśla typ rozrywanego wiązania.
EC 4. Liazy
EC 4.1. Liazy węgiel-węgiel
EC 4.1.1. karboksy-liazy dekarboksylazy
EC 4.1.2. aldehydo-liazy
EC 4.1.3. liazy ketokwasów
EC 4.1.99. inne węgiel-węgiel liazy
EC 4.2. Liazy węgiel-tlen
EC 4.2.1. hydro-liazy dehydratazy
EC 4.2.2. działające na polisacharydy
EC 4.2.3. działające na fosforany syntazy
EC 4.2.99 inne węgiel-tlen liazy
EC 4.3. Liazy węgiel-azot
EC 4.3.1. amoniako-liazy
EC 4.3.2. liazy działające na amidy, amidyny, itp.
EC 4.3.3. amino-liazy
EC 4.3.99. inne węgiel-azot liazy
EC 4.4. Liazy węgiel-siarka
EC 4.5. Liazy węgiel-halogen
EC 4.6. Liazy fosfor-tlen
Izomerazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) uściśla typ katalizowanej
reakcji. Trzeci człon numeru  pod-podklasa  wskazuje, jakie związki lub ugrupowania ulegają
izomeryzacji.
EC 5. Izomerazy
58
EC 5.1. Racemazy i epimerazy
EC 5.1.1. działające na aminokwasy i ich pochodne
EC 5.1.2. działające na hydroksykwasy i ich pochodne
EC 5.1.3. działające na węglowodory i ich pochodne
EC 5.1.99. działające na inne związki
EC 5.2. cic-trans izomerazy
EC 5.3. wewnÄ…trzczÄ…steczkowe oksydoreduktazy
EC 5.3.1. wzajemnie przekształcające się aldozy i ketozy
EC 5.3.2. wzajemnie przekształcające się ugrupowania enolowe i ketonowe tautomerazy
EC 5.3.3. przenoszÄ…ce wiÄ…zania C=C "-izomerazy
EC 5.3.4. przenoszÄ…ce wiÄ…zania S-ðS
EC 5.3.99. inne wewnÄ…trzczÄ…steczkowe oksydoreduktazy
EC 5.4.wewnÄ…trzczÄ…steczkowe transferazy mutazy
EC 5.4.1. transportujÄ…ce grupy acylowe
EC 5.4.2. fosfotransferazy fosfomutazy
EC 5.4.3. transportujÄ…ce grupy aminowe
EC 5.4.99. transportujÄ…ce inne grupy
EC 5.5. wewnÄ…trzczÄ…steczkowe liazy
EC 5.99. inne izomerazy
Ligazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego typu wiązanie jest
tworzone. Trzeci człon numeru  pod-podklasa  uściśla, jakiego typu związki lub ugrupowania
powstajÄ… w wyniku syntezy.
EC 6. Ligazy
EC 6.1. tworzące wiązanie węgiel-tlen
EC 6.1.1. ligazy tworzÄ…ce aminoacylo-tRNA i spokrewnione zwiÄ…zki
EC 6.2. tworzące wiązanie węgiel-siarka
EC 6.2.1. ligazy kwas-tiol syntetazy acylo-CoA
EC 6.3. tworzące wiązanie węgiel-azot
EC 6.3.1. ligazy kwas-amoniak syntetazy amidowe
EC 6.3.2. ligazy kwas- D-aminokwas syntetazy peptydowe
EC 6.3.3. cyklo-ligazy
EC 6.3.4. inne ligazy tworzące wiązanie węgiel-azot
EC 6.3.5. ligazy wiązania węgiel-azot z glutaminą, jako amido-N donorem
EC 6.4. tworzące wiązanie węgiel-węgiel
EC 6.5. tworzÄ…ce wiÄ…zanie fosforowoestrowe
EC 6.6. tworzÄ…ce wiÄ…zanie azot-metal chelatazy
Izoenzymy
Izoenzymy, to odmiany tego samego enzymu o identycznym centrum aktywnym i mechanizmie
działania, a różniące się w niewielkim stopniu sekwencją aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.
Konsekwencją tego mogą być pewne różnice właściwości fizyko-chemicznych i biologicznych takich
odmian enzymu, np.: różne pI, optymalne pH i temperatura działania, KM i odczyn immunologiczny.
Izoenzymy są umieszczane w Klasyfikacji i Nomenklaturze Enzymów pod tym samym numerem.
Zazwyczaj w komentarzu do danego enzymu wspomina siÄ™ o jego odmianach i podaje odpowiednie
odnośniki literaturowe.
2.2.5. Czynniki wpływające na efektywność działania enzymów
Zaletą enzymów są łagodne pod względem temperatury, pH i ciśnienia warunki działania, co
obniża koszt procesów, w których uczestniczą oraz pozwala na zachowanie w otrzymanych
produktach cennych, a nieodpornych na drastyczne warunki obróbki, składników. Ponadto przebieg
procesów katalizowanych przez enzymy można łatwo regulować, zmieniając stężenie enzymu bądz

temperaturę lub pH środowiska reakcyjnego.
Do podstawowych czynników określających przebieg (kinetykę) reakcji enzymatycznych należą:
pH środowiska, temperatura, stężenie jonów, potencjał oksydoredukcyjny, obecność inhibitorów,
aktywatorów oraz stabilizatorów (substancji hamujących lub podwyższających efektywność działania
enzymu) i oczywiście tak istotne parametry procesu, jak stężenie enzymu i substratu, o czym mowa
była już wcześniej. Optymalne pH
59
pH środowiska. Szybkość reakcji enzymatycznych w znacznym stopniu zależy od pH
środowiska. Każdy enzym wykazuje charakterystyczne dla siebie optimum pH. Na poniższym
rysunku przedstawiono wpływ pH na aktywność trzech endopeptydaz: pepsyny, metaloproteinazy z
Bacillus subtilis oraz subtilizyny.
metaloproteinaza
100
subtilizyna
pepsyna
B.subtilis
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12
pH
Wpływ pH na aktywność trzech różnych endopeptydaz
Jak widać, każda z tych endopeptydaz działa w zupełnie innym zakresie pH: pepsyna w
środowisku kwaśnym (optymalne pH 1,8), metaloproteinaza w obojętnym (optymalne pH 7,3), a
subtilizyna w alkalicznym (optymalne pH 10,2). Związane jest to z wpływem stężenie jonów
hydronowych na konformację centrum aktywnego każdej z nich. Pepsyna, której aminokwasem
bezpośrednio działającym w centrum aktywnym jest kwas asparaginowy, wymaga jego formy
niezdysocjowanej (czyli grupy -COOH). Grupa taka w przewadze występuje w środowisku kwaśnym.
Endopeptydazy serynowe, których centrum aktywne opisano wyżej, wymagają do aktywnego
działania zdysocjowanej formy kwasu asparaginowego (grupy karboksylanowej  COO-), która
występuje w przewadze w środowisku alkalicznym.
Należy ponadto zwrócić uwagę na to, że o ile subtilizyna jest aktywna w szerokim zakresie pH od
6 do 11, to pozostałe dwie proteinazy działają w bardzo wąskim przedziale pH i niewielkie jego
zmiany wykazują znaczny wpływ na wzrost lub obniżenie ich aktywności. Optymalne pH niektórych
enzymów (np. aktywność subtilizyny) zmieniać się może w zależności od substratu na który działają,
choć są to wahania nie większe niż 0.5 jednostki (np. subtilizyna wobec hemoglobiny optimum pH
wykazuje przy 10,2, a wobec kazeiny 10,5).
Optymalna temperatura. Temperatura z jednej strony przyspiesza samÄ… reakcjÄ™ enzymatycznÄ…, z
drugiej jednak przyspiesza denaturacjÄ™ enzymu,
co wiąże się z jego inaktywacją. Na poniższym
100
rysunku przedstawiono wpływ temperatury na
80
aktywność subtilizyny. Do osiągnięcia pewnej
60
granicznej wielkości (w tym przypadku
40
temperatury 60°ðC), szybkość reakcji
katalizowanej przez ten enzym wzrasta, podobnie
20
jak to siÄ™ dzieje przy wszystkich reakcjach
0
chemicznych, a następnie dość gwałtownie spada
-20 0 20 40 60 80
do wartości zerowych. Większość enzymów
Temperatura [oC]
drobnoustrojowych najefektywniej działa w
Wpływ temperatury na aktywność subtilizyny
granicach 60°ðC. Enzymy roÅ›linne i zwierzÄ™ce z
reguÅ‚y już powyżej 40-50°ðC ulegajÄ… denaturacji. Znane sÄ… enzymy z bakterii termofilnych,
wykazujÄ…ce optimum dziaÅ‚ania nawet w temperaturach siÄ™gajÄ…cych 90°ðC.
Stabilność enzymów w roztworach wodnych. Jak już wspomniano pH środowiska i temperatura
bezpośrednio wpływają na szybkość reakcji enzymatycznej. Jednakże mogą również niekorzystnie
oddziaływać na sam enzym, prowadząc do jego inaktywacji. Dlatego niezbędna jest znajomość
wpływu tych dwóch czynników na aktywność enzymu w subtilizyny stabilność subtilizyny warunkach
rzeczywistych lub do nich zbliżonych, panujących podczas procesu prowadzonego z jego udziałem.
60
Aktywność względna [%]
Aktywność względna [%]
Większość enzymów jest względnie stabilna w obszarze pH zbliżonym dla ich optymalnego działania,
jakkolwiek nie jest to regułą. Na rysunku 3 przedstawiono wpływ pH na stabilność subtilizyny. Jej
optymalne pH (porównaj rys.1) przekracza 10, jednakże obszar stabilności tego enzymu w warunkach
przykładowej reakcji (1% kazeiny, 45 C, 60 min.) zawarty jest w zakresie 6.5-9.5, a w pH zbliżonym
do optymalnego straty aktywności (w wyniku postępującej autolizy) sięgają 50% wyjściowej.
100
80
Z dodatkiem
1% CaCl2
60
w buforze
40
Preinkubacja:
20
45°ðC, 60min
0
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH
Wpływ pH na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1% CaCl2
Dużo poważniejsze straty enzymu spowodowane mogą być wpływem podwyższonej temperatury
reakcji. Znaczna część enzymów jest bardzo wrażliwa na ten czynnik (wyjątkiem są niektóre enzymy
termostabilne otrzymywane ze szczepów drobnoustrojów termofilnych). Na rys.4 pokazano wpływ
temperatury na zachowanie się subtilizyny podczas przykładowego procesu hydrolizy kazeiny (1%
roztwór substratu w buforze o pH 9).
100
20°ðC
80
40°ðC
60
Z dodatkiem
1%CaCl2 60°ðC
40
Preinkubacja:
20
w buforze o pH 9
60°ðC
70°ðC
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120
c z as [minuty ]
Wpływ temperatury na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1%CaCl2
Należy wyraz
nie zaznaczyć, że subtilizyna (konsekwentnie w tekście niniejszego opracowania
rozpatrywana jako enzym modelowy) jest wyjątkowo odporna na działanie wielu czynników fizyko-
chemicznych, w tym temperatury. Tym niemniej w warunkach testu, po 40 minutach reakcji
prowadzonej w 60 C straty jej aktywności sięgają 70%. W tym samym czasie w temperaturze 70 C
enzym ulega już peÅ‚nej inaktywacji. Natomiast w 50°ðC po 60 minutach straty enzymu sÄ… stosunkowo
niewielkie i wynoszą 36%. Oczywiście, ostatecznego wyboru temperatury dokonuje się po
szczegółowej analizie wyników wszystkich badań, uwzględniającej aspekty technologiczne i
ekonomiczne procesu. Przy tego typu analizach przydatne jest wyznaczenie produktywności reakcji
enzymatycznej w kilku wytypowanych temperaturach (rys.5). Wybór optymalnej temperatury
skojarzony jest w tym przypadku z czasem procesu, który może być determinowany innym
czynnikiem (np. kosztem energii).
61
Aktywność względna [%]
Aktywność względna [%]
Rys. 5 Produktywność subtilizyny w hydrolizie kazeiny
Inhibitory, aktywatory, stabilizatory.
Oprócz wymienionych wyżej czynników inaktywujących działanie enzymów, istnieje grupa
substancji zdolnych do wybiórczego hamowania ich aktywności katalitycznej (są to tzw. inhibitory
specyficzne). W opracowaniu pominięto szczegóły dotyczące tego działu enzymologii. Należy jednak
wiedzieć, że tego typu naturalne inhibitory występują w przyrodzie, co może mieć istotne znaczenie
dla aplikacji enzymów w niektórych przypadkach. Przykładem mogą być specyficzne inhibitory
proteinaz serynowych (w tym subtilizyny) znalezione m.in. w ziemniakach czy soi, które skutecznie
blokują aktywność tej grupy enzymów.
Istnieje wiele typów cząsteczek , które są zdolne do zakłócania aktywności danego enzymu.
Każda cząsteczka działająca bezpośrednio na enzym w kierunku zmniejszenia jego aktywności
katalitycznej jest określana jako inhibitor. Pewne inhibitory enzymów są normalnymi metabolitami
komórkowymi, które hamują dany enzym w ramach naturalnej metabolicznej kontroli odpowiedniego
szlaku. Inne inhibitory mogą być substancjami obcymi dla organizmu, takimi jak toksyny i leki, i w
tym przypadku hamowanie enzymu może mieć działanie terapeutyczne , ale również letalne.
Rozróżnia się dwa główne typu inhibicji : - nieodwracalną - odwracalną.
Inhibicję odwracalną można podzielić na:
1) kompetycyjnÄ…
2) niekompetycyjnÄ…
Inhibicja nieodwrcalna polega na wiązaniu się inhibitora i enzymu w sposób trwały ,
nieodwracalny, często tworząc wiązania kowalencyjne z resztami aminokwasów, znajdującymi się w
miejscu aktywnym lub jego pobliżu i w ten sposób inaktywują enzym na stałe. W wiązaniu tym biorą
udział reszty Ser i Cys mające , odpowiednio, reaktywne grupy -OH i -SH . Przykładem może być
związek diizopropylofluorofosforan (DFP) , składnik gazów bojowych (soman) działający na układ
nerwowy, reaguje z resztÄ… Ser w miejscu aktywnym enzymu esterazy acetylocholinowej,
nieodwracalnie hamując enzym i uniemożliwiając przekazywanie impulsów nerwowych.
Inhibitor kompetycyjny jest zazwyczaj strukturalnie podobny do normalnego substratu danego
enzymu. Dzięki temu współzawodniczy z cząsteczkami o wiązanie się z miejscem aktywnym. Enzym
może się wiązać albo z cząsteczkę substratu, albo cząsteczkę inhibitora, ale nie z obiema
jednocześnie. Inhibitor kompetycyjny wiąże się z miejscem aktywnym odwracalnie. Przy dużych
stężeniach substratu działanie inhibitora kompetycyjnego zostaje przezwyciężone , ponieważ duże
stężenie substratu będzie z powodzeniem współzawodniczyć z cząsteczką inhibitora o wiązanie się w
miejscu aktywnym. Nie nastąpi więc żadna zmiana w wartości Vmax enzymu , ale w obecności
inhibitora kompetycyjnego zmniejsza się powinowactwo enzymu do jego substratu i dlatego wratośc
62
Km wzrasta. Przykładem hamowania kompetycyjnego może być dehydrogenaza bursztynianowa.
Enzum ten używa bursztyniany jako substratu i jest hamowany kompetycyjnie przez malonian, który
różni się od bursztynianu posiadniem tylko jednej, a nie dwóch grup metylenowych.
Inhibitor niekompetycyjny wiąże się odwracalnie w innym miejscu enzymu niż jego miejsce
aktywne i powoduje zmianę przestrzennego kształtu enzymu, co prowadzi do zmniejszenia
aktywności katalitycznej. Ponieważ inhibitor wiąże się w innym miejscu niż substrat, enzym może
wiązać albo inhibitor, albo substrat równocześnie. Efektu inhibitora niekompetycyjnego nie można
przezwyciężyć przez zwiększanie stężenia substratu i dlatego zmniejsza się wartość Vmax . W inhibicji
niekompetycyjnej powinowactwo enzymu do substratu pozostaje nie zmienione, a więc wartość Km
nie zmienia się . Przykładem inhibicji niekompetycyjnej jest działanie pepstatyny na enzym reninę .
Na działanie enzymów wpływ mogą wywierać jony obecne w środowisku reakcyjnym. Jony
dwuwartościowych metali, jak magnez, wapń, cynk, mangan lub kobalt w specyficzny sposób
aktywują wielu enzymów (t.zn. zwiększa- ją szybkość reakcji przez nie katalizowanej). Aktywatorami
mogą być też aniony np. amylaza ślinowa jest aktywowana jonami Cl . Jony metali mogą wykazywać
również wpływ stabilizujący na enzym (tzn. podwyższać jego stabilność wobec niekorzystnego
wpływu m.in. pH i temperatury). Przy- kładem może być wpływ jonów Ca na subtilizynę. Na rys. 3 i
4 pokazano, że jony te podwyższają termostabilność subtilizyny (z 50 do 60 C) i jej trwałość w
alkalicznym środowisku (z pH 9.5 do 10.5). Natomiast jony wielu metali ciężkich (np. Hg, Cu, Pb) są
63
silnymi inhibitorami enzymów (tzn. inaktywują one enzym, tym samym hamując reakcję
przebiegającą przy jego udziale). Jest to inhibicja niespecyficzna, której podlegają wszystkie znane
enzymy. Istnieje ponadto wiele innych substancji mających zdolność niespecyficznej inaktywacji
enzymów (związanej ze zniszczeniem naturalnej struktury białka). Do nich zalicza się mocznik,
aldehyd mrówkowy czy glutarowy, silne utleniacze (np. nadmanganian lub chlor).
Koncentracja wody.
W praktyce nie wszystkie reakcje katalizowane przez enzym przebiegają do końca. Należy
bowiem pamiętać, że są one odwracalne i po pewnym czasie ustala się równowaga pomiędzy reakcją
przebiegającą do "przodu" i odwrotną. Jednym z czynników wpływających na ich stałą równowagi
może być stężenie wody w środowisku reakcyjnym. Dotyczy to zwłaszcza prze- mian, w których
woda jest jednym z reagentów (np. w reakcjach enzymatycznej hydrolizy). Wykazano, że stężenie
wody decyduje o kierunku ich przebiegu. I tak, subtilizyna w środowisku wodnym katalizuje
hydrolizę wiązań peptydowych w białkach lub wiązań estrowych w licznych estrach, natomiast w
środowisku bezwodnym lub o obniżonej koncentracji wody katalizuje rewersję tych reakcji. Dla
pożądanego przesunięcia stałej równowagi takich reakcji stosuje się rozmaite zabiegi. M.in. rewersję
enzymatycznej hydrolizy (czyli syntezę) osiąga się, stosując w środowisku reakcyjnym
rozpuszczalniki organiczne, prowadząc proces w układzie dwufazowym (z rozpuszczalnikiem
apolarnym nasyconym wodÄ…), korzystnie z immobilizowanÄ… formÄ… enzymu itp. Obecnie jest to jeden z
najbardziej preferowanych kierunków badawczych, m.in. z uwagi na potencjalnie możliwe do
uzyskania efekty (również o charakterze aplikacyjnym w wielu procesach przemysłowych).
Charakterystyka biokatalizatorów przemysłowych
Termin "biokatalizatory przemysłowe" (używany obecnie w bardzo szerokim znaczeniu) oznacza
katalizatory otrzymywane w skali przemysłowej na drodze biologicznej. Pod tym pojęciem rozumie
się zarówno enzymy: natywne, spreparowane rozmaitymi technikami (np. ich immobilizowane
formy), ich mikstury, rozmaite proszki zawierające ich dodatek, jak i komórki: całe lub ich fragmenty,
żywe i martwe.
Enzymy wyodrębniane są z tkanek zwierzęcych lub roślinnych oraz wytwarzane przez
drobnoustroje. Te pochodzące z dwóch pierwszych wymienionych z
ródeł występują na rynku
stosunkowo w małych ilościach i są względnie drogie. Niektóre z nich: renina, pepsyna, trypsyna,
papaina i bromelaina są ekstrahowane ze spożywczych surowców.
Tabela 1 Enzymy produkowane przez mikrobiologicznÄ… fermentacjÄ™ (adaptowane z Trampera, 1994).
Enzym Substrat Mikroorganizm
að-amylaza Skrobia Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus licheniformis
bð-amylaza Skrobia Bacillus polymyxa
Amyloglukozydaza Dekstryny Aspergillus niger
(glukoamylaza) Rhizopus niveus
Celulazy Celuloza Phanerochaete chrysosporium
Trichoderma reesei
Izomeraza glukozowa Glukoza Actinoplanes missouriensis
Streptomyces murinus
Streptomyces olivochromogenus
Oksydaza glukozowa Glukoza Aspergillus niger
bð-glukozydaza Maltoza Aspergillus niger
Bacillus amyloliquefaciens
Saccharomyces cerevisiae
64
Lipazy Lipidy Aspergillus niger
Candida rugosa
Geotrichum candidum
Rhizopus arrhizus
Pektynoesteraza Pektyna Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Proteinaza alkaliczna Białka Aspergillus oryzae
(serynowa) Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis
Proteinaza kwaśna Białka Aspergillus oryzae
(pepsyno-podobna) Aspergillus saitoi
Proteinaza kwaśna (renino- białka Endothia parasitica
podobna) Mucor michei
Mucor pusillus
Proteinaza obojętna białka Bacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis
Pullulanaza Amylopektyna Aerobacter aerogenes
Bacillus cereus var.mycoides
W wyniku rozwoju biotechnologii, mikroorganizmy stanowiÄ… podstawowe z
ródło enzymów.
Zastosowanie mutacji i specjalnych technik selekcji drobnoustrojów pozwoliło osiągnąć wysoki
poziom produkowanych przez nie enzymów, w niektórych przypadkach sięgający 10% wszystkich
wytwarzanych białek . Ponadto użycie dużych fermentorów (do 300 m ) sprawia, że obecnie w
krótkim czasie i przy niskich kosztach produkuje się na skalę przemysłową olbrzymie ilości
rozmaitych enzymów (tabela 1).
Niezależnie od z
ródła pochodzenia enzymy mogą katalizować te same reakcje chemiczne, ale nie
muszą posiadać identycznej budowy chemicznej, a tym samym mogą znacznie różnić się optymalnymi
warunkami działania. I tak na przykład ą -amylaza katalizuje hydrolizę wiązań U
-1,4- między
czÄ…steczkami D-glukozy w polisacharydach, takich jak amyloza. Ä…-amylaza trzustkowa posiada
optymalne pH około 7 i optymalną temperaturę 37 C, podczas gdy enzym ten wyodrębniony z
Aspergillus oryzae - optymalne pH 4,7 i optymalną temperaturę działania 50 C, a z Bacillus subtilis
odpowiednio pH 6,5 i 75 C. W zasadzie te dwa parametry (pH i temperatura) decydują o możliwości
zastosowania enzymów w procesach produkcji środków spożywczych przebiegających w różnych
warunkach (np. w różnych gałęziach przemysłu spożywczego). Fakt ten tłumaczy występowanie na
rynku rozmaitych preparatów homologicznych enzymów. Należy jednak mieć na uwadze, że tylko
część drobnoustrojów i wytwarzanych przez nie bioproduktów (w tym enzymów) traktowana jest jako
nieszkodliwa dla stosowania w środkach spożywczych (tabela 2).
W ogólnym zarysie proces produkcji enzymów drobnoustrojowych polega na hodowli
wyselekcjonowanych kultur mikroorganizmów na specjalnie opracowanych dla każdej z nich
pożywkach, z zachowaniem specyficznych warunków fizycznych środowiska hodowlanego, a w
następnym etapie wyodrębnieniu wytworzonego enzymu. Jeśli enzym jest nagromadzany
pozakomórkowo, to można go wyodrębnić z podłoża pohodowlanego na drodze wirowania lub
filtracji. Filtrat lub supernatant poddaje się ogólnie stosowanym proce- durom wydzielania i
oczyszczania białek. Jeśli zanieczyszczenia zawarte w preparacie nie działają ujemnie na własności
katalityczne enzymu oraz nie stanowią toksykologicznego zagrożenia dla konsumenta nie zachodzi
konieczność poddawania ich skomplikowanym i drogim procesom oczyszcza- nia. W dużej mierze
przeznaczenie enzymu decyduje o stopniu czystości jego handlowych preparatów. Ogólnie biorąc,
preparaty enzymów wykorzystywane dla celów analitycznych charakteryzują się najwyższą czystością
(niekiedy są one homogennym białkiem enzymatycznym). Również enzymy stosowane w farmacji
posiadają wysoką czystość. Natomiast te same enzymy przeznaczone dla przemysłu spożywczego nie
wymagają już tak wysokiego stopnia czystości. Dla niektórych technologii nie muszą być nawet
wyjaławiane. Coraz częściej dla konkretnego procesu wytwarza się specjalnie przeznaczony preparat
enzymu, dobierając jego aktywność tak, aby dodana ilość wynosiła 0.05-0.5 % na kg substratu.
65
Tabela 1 Mikroorganizmy używane dla produkcji enzymów (adaptowane z Gacesa i Hubble, 1987).
Grupa A Mikroorganizmy tradycyjnie używane w produkcji żywności (nie wymagające
testowania)
-ð Bacillus subtilis (wÅ‚Ä…czajÄ…c szczepy znane jako mesentericus, natto i
amyloliquefaciens),
-ð Aspergillus niger (wÅ‚Ä…czajÄ…c awamori, foetidus, phoenicis, saitoi i usamii),
-ð Asp. oryzae (wÅ‚Ä…czajÄ…c sojae i effesus)
-ð Mucor javanicus
-ð Rhizopus arrhizus, oligosporus, oryzae
-ð Saccharomyces cerevisiae
-ð Kluyveromyces fragilis, lactis
-ð Leuconostoc oenos
Grupa B Mikroorganizmy uważane za nieszkodliwe w żywności (enzymy wytwarzane
przez nie, testowane są jedynie pod kątem ewentualnej toksyczności)
-ð Bacillus stearothermophilus, licheniformis, coagulans, megaterium, circulans,
-ð Klebsiella aerogenes
Grupa C Mikroorganizmy nie włączone do grup A i B (ewentualne stosowanie enzymów
produkowanych przez nie w produkcji żywności, wymaga specjalistycznych
testów)
-ð Mucor miehei, pusillus
-ð Endothia parasitica
-ð Actinoplanes missouriensis
-ð Streptomyces albus, olivaceus
-ð Bacillus cereus
-ð Trichoderma reesei (T. viride)
-ð Penicillium dimorphosporum, simplicissium, funiculosum
Zwykle handlowe preparaty zawierajÄ… od 2 do 10% suchej masy czystego enzymu. Reszta to
zanieczyszczenia pochodzące z podłoża hodowlanego (np. inne białka wytworzone przez rosnącą
kulturę, niektóre z nich będące również enzymami) oraz celowo dodane stabilizatory, wypełniacze itp.
Z aplikacyjnego punktu widzenia istotna jest zwłaszcza wiedza na temat enzymów stanowiących
zanieczyszczenie handlowych preparatów. Niektóre z nich mogą bowiem katalizować niekorzystne,
uboczne reakcje chemiczne. Niekiedy jednak gotowe preparaty celowo są mieszaniną kilku enzymów
(np. preparaty typu "Protogal" przeznaczone dla detergentów, a otrzymywane w oparciu o technologię
opracowanÄ… w Instytucie Biochemii Technicznej PA
zawierają w swoim składzie proteinazę, U
-
amylazę i lipazę- wszystkie trzy przydatne w środkach piorących).
Przeznaczenie preparatu enzymatycznego określa jego postać końcową. Mogą być one
otrzymywane w postaci ciekłego koncentratu lub ciała stałe- go, o różnym stopniu oczyszczenia,
ewentualnie z dodatkiem stabilizatorów. Preparaty enzymatyczne w stanie stałym charakteryzują się
znacznie wyższą stabilnością od preparatów ciekłych. Te drugie podatne są na działanie
drobnoustrojów, a ponadto w środowisku wodnym enzym ulega łat- wiej denaturacji i dodatkowo
narażony jest na działanie enzymów proteolitycznych, których obecność w gotowych preparatach
(choćby w nieznacznych ilościach) jest dość powszechna. Preparaty stałe enzymu nie powinny być
pyliste (z uwagi na możliwość wywołania reakcji alergicznych u pracowników), stąd najczęściej
wytwarzane sÄ… w postaci granulowanej.
Zasadniczym przełomem w biotechnologii było zastosowanie enzymów immobilizowanych. W
uogólnieniu, immobilizacją enzymu można nazwać za- biegi umożliwiające wielokrotne jego użycie.
Jeden ze sposobów immobilizacji polega na unieruchomieniu enzymu na nośniku. Takie formy
enzymów w wielu przypadkach wykazują wyższą stabilność od natywnych enzymów, zarówno w
66
trakcie przechowywania jak i w warunkach samej reakcji bio- chemicznej. Jednakże największa
korzyść związana jest z możliwością ich wielokrotnego stosowania, w tym w procesach o charakterze
ciągłym (np. w reaktorze o działaniu ciągłym z immobilizowaną izomerazą glukozową produkuje się
wysoko fruktozowy syrop). Metody stosowane w immobilizacji enzymów mogą być również
wykorzystane w unieruchamianiu komórek zarówno martwych jak i żyjących. Unieruchomione
biokatalizatory (enzymy i komórki) są szczególnie obiecujące w zastosowaniu do procesów
przetwórstwa żywności. Chemiczne katalizatory nie mogą konkurować z enzymami, chociażby ze
względu na przepisy sanitarne obowiązujące w produkcji żywności. Najnowszym kierunkiem badań w
tym zakresie jest ko-immobilizacja enzymów, czyli jednoczesne unieruchomienie na wspólnym
nośniku dwu lub więcej enzymów przeznaczonych do katalizowania pojedynczego procesu.
Cena preparatów enzymatycznych jest bardzo zróżnicowana (od 3 $/kg w przypadku preparatu
glukoamylazy przeznaczonego do scukrzania dekstryn, aż do 1 miliona $/kg w przypadku czynnika
VIII enzymów trombolitycznych stosowanych w medycynie). Zależy ona od wiele czynników, w tym
tak oczywistych jak koszty produkcji (a głównie stopień oczyszczenia enzymu), ale także w dużej
mierze zależy od rynkowego zbytu, konkurencyjności i skuteczności działania (ich produktywności w
aplikacyjnych warunkach). Ogólnie biorąc, najdroższe są enzymy przeznaczone dla analityki, a naj-
tańsze stosowane masowo w różnych gałęziach przemysłu (tabela 3). Przyjmuje się ponadto, że koszt
aplikacyjny enzymów przemysłowych powinien stanowić 2-4 % kosztów całego procesu, co w pewien
sposób determinuje ich cenę.
Tabela 2 Wielkość produkcji enzymów i ich cena (adaptowane z Trampera, 1994)
Typ aplikacji Wielkość produkcji (tony) Cena ($/kg)
Analityka 10-3 - 1 106  109
Farmacja 1  102 102  105
Specjalna 1  102 102  105
Przemysł masowy 102  104 3  50
Potencjał aplikacyjny enzymów tkwi w specyficzności i ich katalitycznej wydajności, przy czym
działają one w umiarkowanych warunkach pH, temperatury i ciśnienia zapewniając wysoką
wydajność nawet w skomplikowanych reakcjach lub ich ciągach. Jednakże z aplikacyjnego punktu
widzenia dla każdego konkretnego procesu i enzymu w nim biorącego udział konieczna jest
skojarzona optymalizacja temperatury, pH środowiska reakcyjnego, stężenia reagentów oraz innych
parametrów technologicznych. Niepowodzenia napotykane niekiedy w stosowaniu enzymów w
krajowych technologiach, o których się nieraz słyszy, wynikać mogą z niepełnej wiedzy o
właściwościach samych enzymów, ich preparatów lub procesach, w których biorą udział.
67
ROZDZIAA
3. BIOCHEMIA GENÓW
DNA
RNA
Nukleotyd
H3PO4
H3PO4
Nukleozyd
ryboza
deoksyryboza
zasady purynowe
i pirymidynowe
'
'
HOH2C5 O OH
HOH2C5 O OH
6
N N
1 5
N3 4 5 C C
7 C C
4'
4'
1'
1'
2
4 H H
2 8 H H
6
3 9
1
H
H
2'
2' 3' H
3' H
N N
N
C C
C C
H
OH OH H
OH
pirymidyna puryna
bð-ðD-deoksyryboza
bð-ðD-ryboza
NH2 OH
OH
NH2
OH
CH3 N
N N N
N
N
N
N N H2N N N
O N
O N
O N
H H
H H
H
cytozyna
uracyl
adenina
tymina
guanina
68
Biochemia ma olbrzymie znaczenie praktyczne dla wielu dziedzin życia codziennego, w tym
również w przemyśle spożywczym. Powstały nowe gałęzie przemysłu spożywczego oparte na
osiągnięciach biochemii (m.in. biotechnologia). Wielka rola przypada biochemii w unowocześnianiu
procesów technologicznych przemysłu spożywczego oraz w opracowaniu nowych metod przeróbki
surowców (a zwłaszcza wykorzystania enzymów). Dzięki temu udaje się zredukować do minimum
różnorodne straty zarówno ilościowe, jak i jakościowe, wynikające z procesów niepożądanych dla
technologii.
69
70
PISMIENNICTWO
Stryer L.: Biochemia, PWN, W-wa 1986
Gacesa P., Hubble J.: Enzyme technology. Open University Press, 1987.
Chaplin M.F., Bucke C.: Enzyme technology. Cambridge University Press, 1990.
Chmiel A., Biotechnologia, PWN, W-wa 1991
Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.: Biochemia Harpera, Wyd. Lekarskie
PZWL, W-wa 1994
Tramper J. W: Applied Biocatalysis. ed.by Cabral J.M.,Best D.,Boross L., and Tramper J.,
Harwood Ac. Publish., 1994, s.1-45
Galas E.: Wiadomości chemiczne (1984), 11, 11-30
Galas E., Trzmiel T.: Kosmos (1989), 38, 15-24
71
Dodatek
Lip
S
O
NH2
CONH2
H3C
N
NH
N N
+
N
H3C N N O
N N
CH2O OH2C
P P
CH2
O
OH HO
CHOH
CHOH
O
CHOH
OH OH ( )
P
CH2O P adenozyna
P
dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD)
dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)
i jego fosforan (NADP)
O
CH2
H3C ( )n H Enzym-NH
C CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH2
O
H3C CH3
S S
O
liponian
NH2
ubichinon (Q)
N N
CH3
HOOC CH2 CH2 CH3
N N
CH2 S CH2
O
+
CH2
HC CH
CHNH2
N
CH3
HOOC CH2 CH2 COOH
OH OH
N Fe+3 N
adenozynometionina
CH
H3C
N CH2
HC CH
OH
CH CH3
H
O COOH
N
CH2
N CH2 NH C NH CH
CH2
hemina (porfiryna)
H2N N N
CH2
H
COOH
kwas tetrawodorofoliowy (H4folian)
O
HN NH
CH2
+ CH3
N N
NH-Enzym
CH2 CH2 O P P
S C
H3C N NH2
S
O
biotyna
difosfotiamina (DPT)
O
H
C
HO CH2OH
CH3 O
adenozyno-5`-fosforan
P O CH2 C CH C NH CH2 CH2 SH
P
H3C N
CH3OH
pirydoksal
koenzym A (CoA-SH)
72