ENZYMY II
Andrzej K. Bednarek
Zakład Biochemii Lekarskiej
Uniwersytet Medyczny w A
odzi
ENZYMY
Enzymy są katalizatorami zwiększającymi
szybkość spontanicznych reakcji chemicznych.
Szybkość reakcji enzymatycznej zwiększana jest
poprzez obniżenie energii aktywacji.
Szybkość reakcji katalizowanej przez enzym
zależy od stosunku stężeń substratu do enzymu.
Każdy enzym wykazuje wysoką specyficzność w
stosunku do substratu i reakcji.
Niektóre enzymy podlegają regulacji.
Enzymy wykazują dużą
aktywność katalityczną
Anhydraza węglanowa
widoczny jon Zn2+ i węglan
CO2 + H2O = H2CO3
Każda cząsteczka anhydrazy węglanowej
może uwodnić 105 cząsteczek CO2 w ciągu 1
sekundy.
Reakcja spontaniczna przebiega 7 milionów
razy wolniej.
Enzymy charakteryzuje duża
specyficzność działania
Jeden enzym katalizuje najczęściej pojedynczą
reakcję lub grupęściśle pokrewnych.
Enzym jest specyficzny wobec jednego substratu.
Anabolizm
Karboksylaza pirogronianowa
Pirogronian + CO2 + ATP + H2O = Szczawiooctan + ADP + Pi
Katabolizm
Dehydrogenaza pirogronianowa
Pirogronian + NAD+ + CoA Acetylo-CoA + NADH + H+ + CO2
Pośrednia
Dehydrogenaza mleczanowa
Pirogronian + NADH + H+ = Mleczan + NAD+
Aktywność enzymów może
być regulowana
pH
Temperatura
Inne cząsteczki
Inhibitory kompetytywne
Inhibitory niekompetytywne
Modulatory allosteryczne
Modulatory kowalencyjne
Interakcje międzybiałkowe
Stosunek stężeń enzym/substrat
Wpływ pH na szybkość
reakcji enzymatycznej
Wpływ temperatury na szybkość
reakcji enzymatycznej
Inhibitor kompetycyjny
Inhibitor kompetycyjny łączy się z centrum aktywnym
enzymu.
Wiązanie inhibitor i substrat wzajemnie się
wykluczają.
Inhibitor kompetycyjny ogranicza liczbę cząsteczek
enzymu zdolnych do związania substratu.
Inhibitor kompetycyjny
Malonian jest kompetycyjnym inhibitorem
dehydrogenazy bursztynianowej
Inhibitor niekompetycyjny
Inhibitor niekometycyjny wiąże się zarówno z enzymem
jak i kompleksem enzym-substrat.
Przyłączenie inhibitora niekompetycyjnego nie blokuje
aktywności enzymu, ale zmniejsza liczbę obrotów
enzymu (ilość substratu możliwą do przekształcenia w
jednostce czasu).
Inhibitor akompetycyjny
Inhibitor akompetycyjny wiąże się tylko z kompleksem
enzym-substrat.
Inhibitor akompetycyjny stymuluje tworzenie
kompleksu enzym-substrat.
Kompleks enzym-substrat-inhibitor akompetycyjny nie
może przeprowadzić reakcji.
Regulacja allosteryczna
Enzymy allosteryczne posiadają co najmniej dwie
struktury przestrzenne.
Stany konformacyjne różnią się aktywnością
enzymatyczną.
Wiązanie substratu lub ligandu allosterycznego
stabilizuje stan konformacyjny i reguluje aktywność
enzymu.
Najczęściej składają się z kilku podjednostek
katalitycznych.
Modulator allosteryczny
Aktywacja allosteryczna
Inhibicja allosteryczna
Regulacja kowalencyjna
Może być nieodwracalna.
Polega na wytworzeniu nowych wiązań
kowalencyjnych lub usunięciu starych.
Może zmieniać konformację enzymu (efekt
allosteryczny).
Aktywacja zymogenów przez częściową proteolizę.
Fosforylacja reszt Ser, Tyr, Tre w łańcuchu polipetydowym enzymu.
Glikozylacja lub lipidacja białka enzymu.
Nukleotydacja enzymu (kowalencyjne przyłączenie nukleotydów).
Regulacja poprzez
interakcje międzybiałkowe
Enzym jest aktywny jedynie po połączeniu
z innym białkiem.
Połączenie z innym białkiem inaktywuje
aktywność enzymu.
Cyklaza adenylowa
Cyklinozależne kinazy białkowe
Regulacja poprzez zmianę
stosunku enzym/substrat
Indukcja lub represja syntezy białka enzymatycznego
(poziom genomu).
Regulacja translacji (poziom syntezy białka).
Sekwestracja enzymu (przeniesienie do innego
przedziału komórkowego).
Degradacja enzymu (ubikwitynacja i proteoliza).
Blokada przez sprzężenie zwrotne (końcowy produkt
szlaku nieodwracalnie blokuje pierwszy enzym, tzw.
samobójstwo poprzez produkt).
Inhibicja nieodwracalna -
trucizny
Często tworzą wiązanie kowalencyjne z
enzymem, zazwyczaj w centrum aktywnym.
Wiązanie inhibitor-enzym jest znacznie
silniejsze niż substrat-enzym (niemożliwe do
rozpadu przy fizjologicznych stężeniach
substratu).
Sarin reaguje z Ser centrum aktywnego acetylocholinoesterazy
blokując przewodzenie sygnału przez synapsy.
Cyjanek (KCN) blokuje odwracalnie oksydazę cytochromową.
Tlenek węgla wiąże się z hemoglobiną 200-250 razy silniej niż tlen
uniemożliwiając przenoszenie tlenu w warunkach fizjologicznych.
Życie hamuje wzrost entropii
y
ródłem energii dla wszelkich procesów życiowych na Ziemi jest Słońce
"S e" 0
Zasady termodynamiki
Jeżeli dwa układy znajdują się w stanie równowagi z
trzecim układem, to muszą znajdować się w stanie
równowagi względem siebie.
I. Zmiana energii wewnętrznej układu równa jest
dostarczonemu do układu ciepłu i pracy wykonanej nad
układem przez siły zewnętrzne:
"U= "Q+ "W (w układzie izolowanym U = const)
II. Entropia wzrasta proporcjonalnie do ilości dostarczonej
do układu pracy (dS > dQ/T lub dS = dQ/dT).
Entropia układu izolowanego nie maleje ("S e" 0).
III. Entropia układu w temperaturze zera bezwzględnego
równa jest zeru (T 0+ => S S0).
Entalpia
Entalpia to termodynamiczna funkcja stanu, którą
definiuje zależność:
H = U + pV (p  ciśnienie; V  objętość)
Ponieważ entropia S jest wielkością niemierzalną
to również entalpia H jest niemożliwa do pomiaru.
Możemy mierzyć przyrost entropii "S, który
oznacza wzrost energii niedostępnej do wykonania
pracy.
Możemy też mierzyć zmiany entalpii "H, który
oznacza wzrost lub spadek zdolności układu do
wykonania pracy
Reakcje chemiczne
W każdej kompletnej bilansowo mieszaninie
reagentów (układ zamknięty) kierunek reakcji jest
określony przez skład początkowy mieszaniny oraz
narzucone więzy - temperaturę i ciśnienie.
Wszystkie przemiany zachodzące w przyrodzie
przebiegają w określonym kierunku...
H = U + pV ale "S e" 0
Wszystkie przemiany zachodzące
w przyrodzie przebiegają w
określonym kierunku...
Spontaniczny przebieg jakiegokolwiek
procesu pociąga za sobą trwałe -
nieodwracalne zmiany w przyrodzie; z tego
powodu procesy przebiegające rzeczywiście
nazywa się nieodwracalnymi.
Metabolizm komórek
Wszystkie przemiany w komórkach wymagają
transformacji energii.
W reakcjach chemicznych w komórce
następuje przeniesienie i/lub utrata energii
Reakcje wykorzystujące energię połączone są
z reakcjami uwalniającymi energię.
W komórce przebiegają zarówno reakcje
odwracalne jak i nieodwracalne.
Kinetyka reakcji chemicznej
X Y
Różnica energii pomiędzy poziomami a i b jest
energią aktywacji potrzebną dla przebiegu reakcji.
Różnica energii pomiędzy punktami b i c jest różnicą
pomiędzy energią substratów i produktów.
Energia reakcji chemicznej
"G = "H - T "S
"G  zmiana energii potrzebna do inicjacji
przebiegu reakcji (energia aktywacji)
"H  zmiana energii potrzebna do
przebiegu reakcji (entalpia)
T  temperatura
"S  zmiana energii w trakcie przebiegu
reakcji (entropia)
Kinetyka reakcji chemicznej
Nachylenie zależy
od energii aktywacji
Stężenie substratu [mikromole]
Szybkość reakcji [mikromole]
energia reakcji enzymatycznej
różnica w
energii stanu
przejściowego
reakcja bez enzymu
reakcja z enzymem
tworzenie ES
różnica energii
pomiędzy
substratem a
produktem
Rawn Biochemistry, International edition
Kinetyka reakcji enzymatycznej
Wpływ ilości enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej
Kinetyka reakcji enzymatycznej
Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej
Równanie Michaelisa-Mentena
Vmax [S]
v =
E + S "! ES E + P
KM + [S]
KM jest takim stężeniem substratu [S] przy
którym reakcja osiąga połowę szybkości
maksymalnej Vmax
KM jest bardzo użytecznym wskaz
nikiem
określającym powinowactwo enzymu do substratu,
im wartość KM jest mniejsza tym powinowactwo
większe.
Wyznaczanie KM
Wyznaczanie KM
Inhibitor kompetycyjny
Inhibitor kompetycyjny zwiększa stałą KM
nie zmieniając Vmax
Inhibitor niekompetycyjny
Inhibitor niekompetycyjny zmniejsza
Vmax nie zmieniając KM
Inhibitor akompetycyjny
Inhibitor akompetycyjny zmniejsza KM i Vmax
Podsumowanie inhibicji
Modulatory allosteryczne
Zazwyczaj są to enzymy, poprzez które
następuje regulacja szlaków metabolicznych.
Zbudowane są z co najmniej dwu podjednostek.
Regulacja allosteryczna
Enzym posiada co najmniej dwa stany
konformacyjne podjednostek R (łatwe
wiązanie substratu) i T (trudne wiązanie
substratu).
Enzymy
znaczenie w diagnostyce
Oznaczanie aktywności enzymów w osoczu i
innych płynach biologicznych oraz tkankach
Wykorzystywanie enzymów do oznaczania
związków drobnocząsteczkowych w płynach
biologicznych (np. glukozy, mocznika,
etanolu i triglicerydów)
Klasyfikacja enzymów
używanych w diagnostyce
1. OKSYDOREDUKTAZY:
o Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) (LD)
o Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) (LD)
o Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (G-6-PDH)
(G6PD,GPD)
2. TRANSFERAZY:
o Aminotransferaza asparaginianowa (GOT, AspAT)
(AST)
o Aminotransferaza alaninowa (GPT,ALAT) (ALT)
o Kinaza kreatynowa (CPK) (CK)
o ł-glutamylotranspeptydaza (GGTP) (GGT)
o Acylotransferaza lecytyna:cholesterol (LCAT)
Klasyfikacja enzymów
używanych w diagnostyce
3. HYDROLAZY:
o Fosfataza alkaliczna (ALP)
o Fosfataza kwaśna (ACP)
o ą-amylaza (AMY) (AMS)
o Lipaza triglicerydów (LPS, LP)
o Cholinoesteraza (ChE)
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
Enzym cytoplazmatyczny, występuje we wszystkich komórkach
Aktywny w formie tetrameru
Największą zawartość tego enzymu wykazuje: mózg, erytrocyty, mięsień
sercowy, leukocyty, płytki krwi, nerki, wątroba, płuca, mięśnie szkieletowe
Wyróżnia się 5 izoenzymów: LDH1-LDH5 posiadających dwa rodzaje
łańcuchów:
typ H (sercowy)  charakterystyczny dla narządów o nasilonej przemianie
tlenowej.
typ M (mięśniowy)  charakterystyczny dla narządów mających mniejsze
zapotrzebowanie na tlen.
LDH1; LDH2 (H4, H3M)  serce, erytrocyty, nerki.
LDH5 (M4)  wątroba, mięśnie.
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
U osób zdrowych w surowicy dominuje LDH2.
W anemii hemolitycznej rośnie aktywność LDH w surowicy
(nawet 30-50 krotnie) w związku ze wzrostem LDH1 i LDH2.
W zawale mięśnia sercowego na skutek uwolnienia LDH1 z
uszkodzonego mięśnia sercowego dochodzi do odwrócenia
proporcji LDH1>LDH2.
Ponadto oznaczenie LDH1 służy do diagnostyki ostrego
niedokrwienia mięśnia sercowego.
Równoległy wzrost LDH1 i LDH2 z narastaniem LDH5 w trakcie
zawału mięśnia sercowego świadczy o rozwoju niewydolności
krążenia i jest złym wskaz
nikiem prognostycznym.
Aminotransferaza alaninowa (ALAT)
Aminotransferaza asparaginianowa (AspAT)
Ilościowe zróżnicowanie obecności aminotransferaz w tkankach
AspAT  dużo w sercu, wątrobie, mięśniach szkieletowych.
ALAT - w wątrobie.
Wzrost obu aktywności choroby wątroby
100krotny wzrost  ciężkie uszkodzenia (ostre wirusowe
zapalenie wątroby, toksyczne działanie leków).
4 - 10krotny  przewlekłe (marskość, przewlekłe wirusowe
zapalenie).
Wzrost AspAT (10-krotny)  charakterystyczny dla zawału
serca.
2-3 krotny wzrost aktywności aminotransferaz towarzyszy
zastojowi w krążeniu wrotnym, cholestazie, uszkodzeniu mięśni
i nerek  małe znaczenie diagnostyczne.
Fosfataza alkaliczna (ALP)
Wyróżnia się izoformy o specyficzności tkankowej:
- wątrobowa
- kostna
- Jelitowa
- A
ożyskowa
- W nerkach
- W śledzionie
Uszkodzenie tych narządów wiąże się z podwyższeniem aktywności tego
enzymu
Izoformy różnicuje się elektroforetycznie
Z wiekiem obserwuje się fizjologiczne zmiany aktywności tego enzymu,
wynikające z wahania się poziomu frakcji kostnej (np. po 50  tce)
Fosfataza alkaliczna (ALP)
Frakcja kostna
niewielki wzrost  złamania kości.
większy  w chorobach nowotworowych kości.
znaczny  w chorobie Pageta (przewaga nowotworzenia).
Frakcja wątrobowa
ulega 5-10 krotnemu wzrostowi w cholestazie i guzach
wątroby.
Frakcja łożyskowa
w 16-20 tyg. Ciąży wzrost 1,5-krotny, wraca do normy 3-6 dni
po porodzie.
wzrost obserwuje się w powikłaniach ciąży
Frakcja jelitowa
wzrost w różnych chorobach jelit, marskości wątroby i u
pacjentów dializowanych
Fosfataza kwaśna (ACP)
Enzym lizosomalny
Liczne izoformy: gruczoł krokowy, wątroba, nerki, śledziona,
erytrocyty, płytki krwi, osteoklasty.
Znaczenie diagnostyczne ma izoenzym prostaty  wzrost
aktywności u 50 - 80% chorych na raka prostaty (skuteczny
przy monitorowaniu skuteczności terapii i wykrywania
wznowy u pacjentów z pierwotnym odczynem pozytywnym).
Niewielki wzrost w raku jelita i sutka, niedokrwistości
megaloblastycznej , trombocytopeniach i schorzeniach
wątroby.
Kinaza kreatynowa (CK)
Enzym cytoplazmatyczny i mitochondrialny.
Największa aktywność jest w mięśniach szkieletowych, a
następnie w mózgu, mięśniu sercowym, odbytnicy, żołądku,
pęcherzyku żółciowym, okrężnicy, macicy, prostacie, jelicie
cienkim, nerkach, i śladowe ilości w wątrobie.
Jest dimerem: łańcuch M (mięśniowy) i łańcuch B
(mózgowy).
W mózgu  CK-BB
W mięśniach szkieletowych  CK-MM (95%)
W mięśniu sercowym  CK-MB (40%) i CK-MM (60%)
(aktywność CK 10razy mniejsza niż w m. szkieletowym)
Kinaza kreatynowa (CK)
U ludzi zdrowych w surowicy: 95% CK-MM, 5% CK-MB
(w krążeniu nie występuje CK-BB).
Przy zawale serca  wczesne godziny znaczny wzrost
całkowitej aktywności CK-MB.
Znaczny wzrost CK-MM w urazach mięśni, dystrofiach,
zaburzeniach krążenia.
Wzrost aktywności CK-BB w płynie mózgowo-rdzeniowym
po urazach i procesach chorobowych centralnego ukl.
nerwowego.
CK-BB  może pojawić się w surowicy przy nowotworach
prostaty, nerek, jajnika, piersi, pęcherzyka żółciowego
(marker choroby nowotworowej).
ł- glutamylotransferaza (GGTP)
Zlokalizowana w błonach siateczki śródplazmatycznej.
Głównym z
ródłem w osoczu są nerki, wątroba, komórki dróg
żółciowych, trzustka i jelita.
Wzrost aktywności obserwuje się w ostrych i przewlekłych
chorobach wątroby, dróg żółciowych, trzustki.
Należy do enzymów indukowanych przez barbiturany, etanol i
estrogeny.
Pomiar aktywności służy do śledzenia abstynencji u
alkoholików podczas terapii odwykowej (normalizacja GGTP w
ciągu 2-5 tygodni).
Niewielki wzrost obserwuje się w przebiegu zawału mięśnia
sercowego.
Amylaza (AMS)
Poza trzustką występuje w śliniankach, wątrobie
i w mięśniach.
Poziom amylazy w moczu to dobry wskaz
nik
poziomu we krwi.
W ostrym zapaleniu trzustki aktywność AMS
wzrasta i osiąga maks. 12 h po jego wystąpieniu.
Do niewielkiego wzrostu aktywności dochodzi w
odczynach zapalnych jamy brzusznej (kolka
nerkowa, żółciowa, niedrożność jelit i perforacja
wrzodu).
Triglicerydy krwi hamują jej aktywność.
Leczenie  enzymy i inhibitory
W leczeniu niektórych stanów patologicznych:
o Streptokinaza (przemiana plazminogenu w plazminę 
w zawale mięśnia sercowego).
o Asparaginaza  w leczeniu niektórych białaczek.
Leki  inhibitory enzymów:
o Strofantyna  inhibitor Na/K ATPazy  lek nasercowy.
o Aspiryna  inhibitor cyklooksygenazy.
o Inhibitory MAO  leki antydepresyjne.
o Inhibitory ACE (np. captopril)
Angiotensyna-I `"`"> Angiotensyna-II
Leczenie  enzymy i inhibitory
o lovastatin, mevinolin  inhibitory reduktazy HMG-CoA:
AcCoA `"`"> cholesterol
reduktaza
HMG-CoA
o Antybiotyki (inhibitory tarnskrypcji, translacji, replikacji).
o Metotreksat  inhibitor reduktazy dihydrofolianowej,
stosowany w leczeniu białaczek.
o Fluorouracyl  po przekształceniu w tkankach we
fluorodeoksyurydylan jest inhibitorem syntazy
tymidylanowej  lek przeciwnowotworowy.
Kinezyna
Kinezyna transportuje cząsteczki wewnątrz komórki wędrując
po mikrotubulach, na każdy cykl ruchu (dwa kroki) zużywane
są 2 cząsteczki ATP i pokonywana jest odległość 16 nm.
Syllabus
Aminokwasy: endogenne, egzogenne, białkowe i niebiałkowe, właściwości
chemiczne aminokwasów.
Białka: Wiązanie peptydowe, powstanie i hydroliza, budowa. Struktura
pierwszorzędowa, drugorzędowa (konformacje cis i trans, alfa-helisa, beta,
stabilizacja), trzeciorzędowa i czwartorzędowa (wiązania i stabilizacja). Podziały i
funkcje białek.
Enzymy  budowa: białkowe i niebiałkowe, apoenzym, rodzaje kofaktorów,
holoenzym, centrum aktywne.
Enzymy  działanie: klasy enzymów (rodzaje reakcji i przykłady), kompleks aktywny,
regulacja aktywności (pH, temperatura,aktywatory i inhibitory, rodzaje regulacji),
zymogeny, izoenzymy.
Enzymy  kinetyka: różnice pomiędzy reakcją chemiczną i enzymatyczną, stała
Michaelisa, inhibicja, allosteria, układy wieloenzymatyczne, enzymy wielofunkcyjne.
Koenzymy: funkcja i budowa, wzory NAD, NADP, FMN, FAD, CoQ, pirofosforan
tiaminy, fosforan ppirydoksalu, biotyna, witaminy.
Enzymy w diagnostyce: LDH, ALAT, ASPAT, ALP, ACP i CK.