Wykład 5

PULULAN

Pululan- to polisacharyd, pochodzenia drobnoustrojowego , stosowany w przemyśle. Producentem pullulanu jest Pullularia pullulus (czarne drożdże), Ascomycetes (workowce) z rodziny Dothideales.

Cechy:

• najbardziej rozpowszechniony w strefie umiarkowanej, gdzie występuje na powierzchni roślin i owoców ( odpowiedzialny za patologiczne miękniecie tkanek roślinnych) w glebie, w wodach słodkich i słonych, ściekach i na żywych organizmach, niektóre gatunki mogą zasiedlać skórę i inne tkanki człowieka.

• duży polimorfizm zależnie od warunków i czasu wzrostu przyjmuje różne postaci morfologiczne: -okrągłe formy drożdżopodobne -wydłużone formy mycelinarne - chlamidospory - blastospory

Pululan- obojętny poliglukan zbudowany z liniowych łańcuchów reszt glukozowych. Reszty D- glukopiranozy połączone są wiązaniami α- 1,4 i α- 1,6- glikozydowymi.

α- 1,4 α- 1,6

maltotrioza

Maltotrioza.
W zależności od warunków biosyntezy pululanu może być kilka wstawek maltotetratriozy, które zaburzają ułożoną budowę tego związki, który głównie składa się z jednostek maltotriozy.

Właściwości pullulanu:

1)Wysuszony- bezbarwny proszek bez smaku i zapachu,

2)Dobrze rozpuszcza się w wodzie, tworząc lepkie, obojętne roztwory, trwałe przy wysokich stężeniach soli. Przy wyższych stężeniach pululanu roztwór wykazuje pseudoplastyczność,

3)Odparowując wodę z roztworu pululanu można otrzymać:
- błonę o dobrych właściwościach mechanicznych, odporną na oleje mineralne i tłuszcze, przepuszczalną dla tlenu,
- cienkie folie polimeru (10 µm),
- włókna polisacharydu o dobrych właściwościach mechanicznych,

4)Sproszkowany pululan połączony z niewielka ilością wody i wytłoczony, daje materiał przypominający polietylen twardością i wytrzymałością na rozciąganie, ale bardziej elastyczny,

5)Nie rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych- aceton i metanol są wykorzystywane do wytrącania polisacharydu z roztworów wodnych,

6)Odporny na działanie zasad i słabych kwasów, rozrywają wiązania glikozydowe do glukozy,

7)Nie jest trawiony przez enzymy pokarmowe człowieka

8)Wolne grupy w pululanie mogą być częściowo lub całkowicie zestryfikowane lub zeteryfikowane , co zmniejsza lub znosi rozpuszczalność pululanu

Hydroliza enzymatyczna pululanu.

1. Pululanaza

- enzym pozakomórkowy wytworzony przez Aerobacter aerogenes, Streptomycetes flarochromogena, Bacillus sp.

- hydrolizuje tylko wiązania α -(1,6)- glikozydowe dając ostatecznie cząsteczki maltotriozy:

maltotrioza

2. Izopululanaza.
   - wytwarzana przez Aspergillus Niger,
   - hydrolizuje tylko wiązania α- (1,4)- glikozydowe łącząc tę resztę glukozy która w pozycji C6 łączy się wiązaniem α- (1,6)- glikozydowym z resztą glukozy w kolejnej maltotriozie:

Izopentoza

3. Neopullulonaza.
   - rozrywa drugie z obecnych w reszcie maltotriozowej wiązania α-1,4-

Pentoza

Metody chemiczne Pululan:

1. Estryfikowany pululan (głównie kwasami karboksylowymi)- uzyskuje się różne stopnie rozpuszczalności i nierozpuszczalności w wodzie i przepuszczalności tlenu przez folie.

2. Eteryfikowany pululan- podobne cechy.

3. Hydrogenizowany (uwodniony) pululan- uzyskiwanie wysokiej odporności termicznej, brak przepuszczalności tlenu przez folie.

4. Siarczany pululanu i ich sole- lek na wrzody żołądka i przy niskiej antykoagulacji krwi.

5. Karboksylowany pululan- uzyskuje się wysoką rozpuszczalność w wodzie zimniej, zastosowanie jako dodatek do leków, środków spożywczych.

6. Usieciowany pululan- otrzymuje się hydrofilowe żele i mikrożele o różnej zdolności absorpcji wody.

7. Dialdehydowany pululan- uzyskuje się nieprzepuszczalność wody.

8. Aminoalkiloeteryfikowany pululan- protonowanie daje kationowy polimer o różnym zastosowaniu.

9. Jonowy żel pululonowy- żel z ładunkiem elektrycznym w swojej strukturze

10. Cyjanoetylowany- wysoka odporność termiczna, nierozpuszczalny w wodzie

Źródło C:

• Fruktoza,

• Sacharoza

• Maltoza,

• Laktoza

• Galaktoza,

• Arabinoza,

Najefektywniejsza biosynteza pululanu zachodzi z sacharozy.

Źródło N:

• Siarczan amonu, magnezu

• Chlorek żelaza

• Tiaminy

• Ekstrakt drożdżowy

Hodowla drożdży (biosynteza) wymaga bardzo intensywnego mieszania i natlenienia. W trakcie hodowli ciesz hodowlana robi się bardzo gęsta, dlatego też powinien być stosowany do tego celu odpowiedni fermentor i mieszadło (wydzielanie pululanu powoduję gęstnienie cieczy).

Mieszadła stosowane przy produkcji pululanu:

• Posuwisto- zwrotne mieszadło płytowe,

• Turbiny Rushtona

• Heliakalne mieszadło wstęgowe

Metoda wsadowa polega na jednokrotnym wprowadzeniu do fermentora pożywki ze składnikami (odpowiednia ilość).

Metoda wsadowa z dożywianiem- dodawane są składniki odżywcze w miarę prowadzenia procesu; osiągnięcie większych wydajności procesu biosyntezy (g pululanu/ objętość pożywki).

Metoda ciągła- ciągłe odbieranie płynu pohodowlanego w czasie, z równoczesnym uzupełnianiem fermentora świeżą pożywką. Metoda ta ograniczona jest szczepem cechą wytarzania melanin (niepożądany jest ciemny barwnik).

Szczepy zmutowane, ulepszone (melanina”-„) mutanty pozbawione są cechy wytwarzania melaniny, potrafią w pewnym momencie odzyskać tę cechę (rewersja) formy rewenta. Istnieje możliwość prowadzenia procesu do momentu szarzenia hodowli.
Problem zabarwienia pululantu melaninami rozwiązywany jest przez wykorzystanie mutantów A.pululans produkujących pululan słabo zabarwiony oraz dobierania składu pożywki (gł. Źródła azotu).
Stosunek C:N powinien być wysoki, bowiem azot w niedoborze będzie ograniczał biomasę, a węgiel będzie intensywnie przekształcany w pululan. Przewaga stężenia źródła węgla jest pożądana.
Zastosowano olej sojowy jako źródło C by namnożyła się biomasa drożdży, a jako źródło N zastosowano kwas glutaminowy. Gdy drobnoustroje zużyły podstawowe składniki, wówczas do takiego układu dodawano sacharozę w dużych stężeniach, nie dodawano już źródła N. Namnażanie biomasy drożdży została zahamowana.

Sabati i Bukmenew- wymyślili alby rozdzielono proces na 2 części: 1) tworzenie biomasy z drożdżopodobną przewagą, jako źródło węgla zastosowano olej sojowy, jako źródło azotu- kwas glutaminowy 2) jeśli drobnoustrój zużył to wszystko dodano sacharozę jako źródło węgla do produkcji pululanu, przy braku źródła azotu ( brak namnożenia biomasy). Tym sposobem można otrzymać biały pululan. Sacharoza zużywana jest jako źródło węgla przez formy drożdżopodobne, które powodują jedynie biosyntezę pululanu.

Medium fermentacyjne

Sterylizacja

inoculum


Fermentacja napowietrzanie

Usuwanie komórek

Oczyszczanie

odbarwinie
Odbarwienie

Odsalanie

zatężanie zatężanie
Zatężanie

wysuszenie wysuszenie
Wysuszenie

proszkowanie proszkownie
proszkowanie

produkt 1 produkt 2 Produkt 3

otrzymywania produktu 1szego nie jestem pewna!!!!!!

Zastosowanie pululanu:

1. Pakowanie lub pokrywanie żywności- tworzenie cienkich błon, które nie przepuszczają tlenu, są nietoksyczne, bez smaku i zapachu.

2. Dodatek do żywności niskokalorycznej jako wypełniacz zastępujący skrobię oraz nośnik witamin.

3. Otrzymanie niskokalorycznego środka słodzącego, zawierającego produkty hydrolizy pululanu przez neopululanozę.

4. Pokrywanie i kapsułkowanie leków.

5. Otrzymanie płynów zastępujących plazmę krwi.

6. Nośnik antygenów i wirusów produkcji przeciwciał, szczepionek przeciwwirusowych.

7. Stosowany do kremów, maści, pudrów- niweluje podrażnienia skóry.

Mechanizm biosyntezy.

Glukoza jest przekształcona w kilku typowych reakcjach do UDPG. Polimeraza UDPG do pululanu zachodzi w zewnętrznej części błony kom. UDPG jest transportowany do cytoplazmy przez hydrofobnową cząsteczkę- ufosforylowany lipid albo pirofosforan lipidowo- cukrowy. Powstaje pirofosforan lipidowo- glukozowy, którego łańcuch polisacharydowy wydłuża się w wyniku reakcji z kolejnymi cząsteczkami UDPG. W rezultacie tworzy się pirofosforan lipidu związany z pululanem jako resztą cukrową.

Wykład 6

METODY RACJONALNEGO SKRININGU

Dzięki postępowi wiedzy z zakresu genetyki i fizjologii mikroorganizmów, w wyniku poznania szlaków biosyntezy wielu produktów i mechanizmów regulujących te syntezy, możliwym stało się opracowanie efektywnych, racjonalnych metod skriningu populacji poddanej zabiegowi doskonalenia. Procedura racjonalnego skriningu polega na podobnym postępowaniu jak w przypadku skriningu losowego z tym, że racjonalna jego forma prowadzona jest w warunkach, które ograniczają wzrost niepożądanych kultur lub limitują ujawnianie się niekorzystnych cech, a tym samym ułatwiają selekcję monokultur najcenniejszych.

Metody racjonalnego skriningu sklasyfikowano w 2 grupach: - metody bezpośrednie -metody pośrednie

W metodach bezpośrednich analizowanym parametrem jest produktywność, czyli podstawowy cel skriningu, jego doskonalenia, przy czym warunki doświadczenia dobiera się tak, by produktywność ta była w pewnym stopniu ograniczona.

W metodach pośrednich, w pierwszym etapie wykrywa się inną cechę ( nadproduktywność), wpływającą w sposób zasadniczy na wydajność biosyntezy danego produktu. I dopiero w oparciu o pierwszy etap porównuje się produktywność wyselekcjonowanych klonów.

METODY BEZPOŚREDNIE RACJONALNEGO SKRININGU:

1)Metoda homeostatu 2) poszukiwanie reweransów

Metoda homeostatu polega na prowadzeniu hodowli ciągłej, która jest szczepiona populacją poddaną zabiegowi doskonalenia. Najczęściej hodowla prowadzona jest w typowym podłożu odżywczym, które jest równomiernie wzbogacane coraz większymi dodatkami substancji limitującej syntezę danego produktu. Kontrola tej hodowli polega na równomiernym pobieraniu próbek i pomiarze produktywnośc,i typowo po okresie wstępnym obserwuje się spadek tej aktywności, po czym jeżeli tylko w mieszaninie występują mutanty pozytywne następuje moment wzrostu produktywności. W tym momencie udział komórek pozytywnych w populacji jest znaczący i bez trudu można jest wyizolować w warunkach typowego wysiewu na płytki. Metoda homeostatu jest bardzo skuteczna, efektywna i stosowana nie tylko w poszukiwaniu pozytywnych mutantów. Stosuje się ją powszechnie w poszukiwaniu szczepów ze środowiska naturalnego, degradujących niebezpieczne ksenobiotyki.

UWAGA!!!!( ten fragment był w wykładzie 4 ale jest wstępem do poszukiwania reweransów)

POSZUKIWANIA REWERANTÓW

Metoda ta ma dwa cele:

1. Poszukuje się szczepów ( komórek), które zatraciły zdolność do syntezy danego produktu. Izoluje się tę kolonię, poddaje się ponownie mutagenizacji. Pozytywne mutanty będą miały zmieniony metabolizm i mogą być bardzo dobrymi producentami wybranych metabolitów.

2. Celem jest poszukiwanie auksotrofów, następnie kolonii prototroficznych i detekcji ponownej auksotrofii. W wyniku takiego postępowania uzyskuje się mutanty, które wykształciły dodatkowe elementy szlaków metabolicznych i mogą być bardzo cennymi producentami zarówno metabolitów centralnych jak i peryferyjnych. Doświadczenia te wykonuje się metodą tzw. welwetowego stempla. Metoda umożliwia detekcję auksotrofii lub prototrofii poprzez przeniesienie na stemplu kolonii wyrosłych na podłożu zwierającym wszystkie niezbędne składniki na podłoża pozbawione wybranych aminokwasów, witamin czy ko faktorów.

GŁÓWNE KRYTERIA SKRININGU POŚREDNIEGO MUTANTÓW- SZCZEPÓW

1. Poszukiwanie mutantów konstytutywnych o obniżonym stopniu inhibicji produktem końcowym

2. O obniżonym wpływie katabolicznej represji

3. O zwiększonej oporności w stosunku do toksycznych pośredników przemian

4. O zwiększonej aktywności detoksykacyjnej

5. O obniżonej wrażliwości w stosunku do wybranych składników pożywek i prekursorów

6. O korzystnej morfologii

7. O zwiększonej przepuszczalności ściany komórkowej

Ad1) Mutanty konstytutywne o obniżonym stopniu inhibicji .

Terminem mutanty konstytutywne określane są szczepy u których mutagenizacja wywołała niezależną od obecności inhibitora ekspresję genów związanych z biosyntezą wybranego enzymu ( maltodekstryny pobudzają Bacillus subtilis do wytwarzania α- amylzay). Mutanty konstytutywne izoluje się w warunkach hodowli ciągłej gdzie w wyniku substratu czynnikiem limitującym jest induktor syntezy enzymu, użyty w stężeniu znacznie niższym od tego jakie jest wymagane dla indukcji syntezy enzymu.

- Przemienne posiewy populacji na podłoża z dodatkiem/ bez dodatku inhibitora - poszukiwanie nowych substratów, które będą pełniły rolę słabego induktora produkcji określonego białka - Selekcja mutantów o obniżonej wrażliwości na obecność produktu końcowego

Zastosowanie tej formy skriningu polega na wprowadzeniu do podłoża selekcyjnego produktu o odpowiednio wysokim stężeniu. Zdać sobie należy sprawę, że taka forma skriningu może sprzyjać nie tylko znalezieniu szczepów mniej wrażliwych na obecność produktów ale i indukcje enzymów, które będą rozkładały wytworzony wcześniej produkt. Dlatego też skrining ten prowadzi się dodając do podłoża nie produkt ale jego analog. Analogami są substancje o strukturze chemicznej bardzo podobnej do produktu- substancji wyjściowej. Analog jest odczytywany przez enzym jako właściwy substrat, nie może jednak dojść do reakcji ze względu na różnice w strukturze.

Ad2) selekcja w kierunku obniżenia katabolicznej represji

Celem tej selekcji jest wyizolowanie mutantów zachowujących zdolność do syntezy enzymu mimo obecności w podłożu łatwo przyswajalnego źródła węgla, czyli w warunkach sprzyjających przede wszystkim obfitemu wzrostowi, a nie nadprodukcji metabolitów. Podstawową metodą selekcji jest wysiew populacji na podłoża zawierające łatwo przyswajalne źródło węgla (glukoza) w dużych stężeniach danego enzymu. Selekcję prowadzi się najczęściej w warunkach homeostatu, typowym przykładem jest hodowla w obecności glukozy i ……………. spowodowała wyselekcjonowanie cennych szczepów E. coli produkujących deaminazę serynową.

Ad3) selekcja mutantów opornych na toksyczne analogi metabolitów pośrednich

Selekcja ta ma na celu ułatwienie wyizolowania mutantów regulatorowych, u których zakłócony jest lub wyeliminowany system kontroli metabolicznej działającej na zasadzie sprzężenia zwrotnego. Chodzi o uzyskanie szczepów nie rozpoznających konkretnych inhibitorów przemian, a tym samym wykazujących stałą derepresję syntezy enzymów danego szlaku. Selekcja prowadzona jest najczęściej w warunkach homeostatu, a do podłoża dodaje się wybrane aminokwasy lub nukleotydy, które pełnią rolę tych inhibitorów. W badaniach tych wskazane jest aby do podłoża selekcyjnego dodawać analogi tychże aminokwasów, a nie substancje podstawowe. Likwidacja tego systemu kontrolnego okazała się bardzo skuteczna dla szczepów produkujących antybiotyki i tak skrining w obecności analogu tryptofanu pozwolił zwiększyć wydajność kandycydyny. Skrining w obecności analogu metioniny pozwolił zwiększyć wydajność produkcji cefalosporyn.

Ad4) Zwiększona aktywność detoksykacyjna

Synteza metabolitów zwiększa się na………………………………………………………………………………………. Skrining pod kątem selekcji mutantów do neutralizacji związków toksycznych jest bardzo często stosowany. Powiązanie mechanizmów nabywania przez szczepy podwyższonej aktywności detoksykacyjnej z produktywnością jest często trudne do wyjaśnienia i różne w zależności od szczepu i typu biosyntezy. Skrining polega na wprowadzeniu do podłoża danej substancji toksycznej w najmniejszym stężeniu hamującym wzrost, a następnie izolowanie klonów wykazujących wzrost mimo jej obecności. Przykłady: zwiększenie produkcji penicyliny uzyskano dzięki wprowadzeniu do podłoża selekcyjnego hydroksyloaminy, imidazolu, jonów metali ciężkich. Szczepy Bacillus produkowały więcej amylazy po wprowadzeniu do podłoża selekcyjnego antybiotyków: tunikamycyna, streptomycyna, amplimycyna, d-cykloseryna

Ad5) Skrining w kierunku obniżenia wrażliwości szczepów na określone składniki pożywek.

Klasycznym przykładem tej formy skriningu jest selekcja mutantów Streptomyces w obecności jonów fosforanowych (homeostat). Szczepy te generalnie produkują streptomycynę tylko w obecności bardzo niskich stężeń jonów fosforanowych. Częsta zmiana składu ………... powoduje ograniczenie produkcji. Skrining ten dobrze jest prowadzić niw w obecności i nie z zastosowaniem samych fosforanów ale ich analogów arsenianów lub wanadanów. Dobre efekty dla produkcji penicyliny dała również selekcja w obecności prekursora kwasu fenylooctowego. Zwiększenie tolerancji na stężenie prekursora pozwoliło w znacznym stopniu podwyższyć produkcję antybiotyku. Korzystną formę skriningu są również hodowle przy ograniczonym natlenieniu. Tlen jest zwykle najdroższą pożywką w procesach biosyntezy, tak więc wyizolowanie klonów zachowujących zdolność do syntezy produktów mimo deficytu tlenu może przynieść duże oszczędności.

Ad6) Selekcja mutantów o korzystnej morfologii

Problem dotyczy głównie hodowli grzybów strzępkowych i drożdży. W hodowli wgłębnej grzyby strzępkowe mogą tworzyć pulę luźnych strzępek grzybów. Zawiesina taka ma charakter nie newtonowski i trudno zabezpieczyć dla takiego płynu jednolite warunki mieszania i napowietrzania. Stąd koniecznym jest selekcjonowanie mutantów, które będą miały naturalną skłonność do tworzenia kuleczek- pellets o średnicy od 0,5 do 1,5mm i tak rosnąco w warunkach wgłębnych grzybnia może być w wystarczającym stopniu zaopatrzona w pożywki i natleniona. Niekorzystne jest również tworzenie dużych kłębuszków o średnicy 3mm, ze względu na ograniczony transport pożywek i metabolitów do ich wnętrza. W przypadku drożdży ważną cechą charakterystyczną jest szybkość ich koagulacji i osadzania się ( piwa górnej i dolnej fermentacji). Zbyt silne osadzanie się komórek utrudnia procesy filtracji i ultrafiltracji. W przypadku drożdży gorzelniczych pozostałe w płynie drożdże po fermentacji mogą mieć negatywny wpływa na jakość produkcji po destylacji. Szybko osadzające się drożdże gorzelnicze wykorzystano w technologii produkcji etanolu metodą przy wysokim stężeniu biomasy.

Ad7 ) zwiększona przepuszczalność ściany komórkowej

Jak wynika z danych literaturowych, czynnikiem ograniczającym wydajność biosyntezy jest niewystarczająca szybkość transportu bioproduktu przez membranę cytoplazmatyczną lub okrywę zewnętrzną ( ścianę komórkową). Spowodowanie mutacji powodujących zmiany struktury błon komórkowych nie gwarantuje wzrostu szybkości wydzielania bioprodktu, zwiększa prawdopodobieństwo tego zjawiska. W badaniach nad tym zagadnieniem wykorzystuje się wpływ biotyny jako czynnika modyfikującego ścianę komórkową. Skrining w obecności biotyny pozwolił na zwiększenie szybkości wydzielania kwasu glutamionowego. Zaobserwowano również, że skrining prowadzony w podłożach z dodatkiem antybiotyków może powodować zmiany w przepuszczalności membrany cytoplazmatycznej.

Wykład 7

BAKTERIE METYLOTROFICZNE

Metanogenne- tworzą metan, wykorzystywane do produkcji biogazu Metylotroficzne- metan i metanol jako źródło węgla

1) Odkrycie tych bakterii stało się poważnym przełomem w biotechnologiii wykorzystuje się je do produkcji SCP. 2) otrzymywanie tlenków alkilenowych, nienasyconych węglowodorów ( tlenek etylenu, propylenu- tworzywo sztuczne) 3) otrzymywanie optycznie czynnych epoksydów 4) do degradacji pochodnych etylenu- biodegradacja rozpuszczalników 5) usuwanie metanu z pokładów węgla

Metylotrofy to mikroorganizmy wykazujące zdolność do wykorzystywania związków jędnowęglowych tj.: metan, metanol, formaldehyd, kwas mrówkowy, metyloamina oraz wielowęglowych tj.: (CH3)2NH, (CH3)3N, CH3OCH3 zawierających w swej budowie grupę metylenową, nie zawierają jednak wiązania węgiel- węgiel. Bakterie te bytują zarówno w wodzie jak i w glebie. Wyróżniają się szczególnym ułożeniem błon komórkowych, wytwarzają przetrwalniki. System (geneza) powstawania przetrwalników jest inna niż u bakterii rodzaju Bacillus. Tutaj cała komórka przekształca się w przetrwalnik. Bakterie te dzieli się na 2 grupy:

• Metylotrofy bezwzględne

• Metylotrofy względne

Kryterium podziału- wykorzystanie jako źródła węgla metanu i innych źródeł węgla np.; węglowodorów(węglowodanów?). Metylotrofy bezwzględne wykorzystują metan i metanol ( częściej metan), względnie oprócz wymienionych związków wykazują zdolność do wzrostu w obecności wielu kompleksowych związków organicznych, nie są jednak zdolne do wykorzystania samego metanu. Muszą być obecne w podłożu jego pochodne: mrówczan, metanol, metyloamina. Typowe gatunki bezwzględnych: Methylobacillus. Methylococcus, Methylomonas, Methylophilus, względnych: Corynebacterium, Flavobacterium, Achromobacter, Bacillus, Micrococcu, Pseudomonas, Vibrio, Brevibacterium.

Większość z tych bakterii jest gram ujemnych. Błoniaste grzebieniaste struktury biorą bezpośredni udział w przyswajaniu metanu i metanolu. Występują szczególnie licznie u bezwzględnych metylotrofów. Przyswajanie tych surowców wymaga uaktywnienia szczególnych szlaków metabolicznych i jest to szlak rybomonofosforanowy (RMP) i szlak serynowy.

Cykl Krebsa u bakterii metylotroficznych bezwzględnych jest niekompletny i przyswajanie metanu (metanolu) zachodzi dzięki funkcjonowaniu szlaku RMP.

U bakterii względnych asymilacja metanu przebiega według szlaku serynowego i cykl Krebsa jest kompletny. Proces całkowitego utlenienia metanu przebiega według typowej reakcji charakterystycznej dla degradacji alkanów:

CH₄
CH₃OH
HCOH
HCOOH
CO₂

metanol formaldehyd kwas mrówkowy

Przemiana formaldehydu do kw. mrówkowego i kwasu masłowego do CO₂ przebiega z włączeniem kofaktora NAD-u.

W ramach szlaku RMP mrówczan zostaje włączony do rybozo-5-P tworząc cząsteczkę heksulozo-6-P i ten związek może ulegać przemianom zbliżonym ( podobnym ) do EMP i HMP i być włączony do fosfotrioz ( fosfoenolopirogronianiu) i włączony do przemian centralnych.

U metylotrofów względnych funkcjonuje szlak serynowy i substratem który łączy utlenienie metanu z przemianami centralnymi jest podobnie jak w RMP formaldehyd. W szlaku serynowym dzięki enzymowi transferazie hydroksymetylowej formaldehyd włączony jest do glicyny w następstwie czego powstaje seryna i ten aminokwas w wyniku kilku przekształceń ( reakcji) przekształcany jest do fosfoendopirogronianu. Dzięki reakcji anaplerotycznej do fosfoendopirogrinianu włączona zostaje cząsteczka CO₂ (reakcja karboksylacji) i powstaje szczawiooctan. Szczawiooctan stawowi punkt wejścia do cyklu Krebsa.

Porównując obie drogi metaboliczne RMP i szlak serynowy należy stwierdzić, że o wiele więcej gatunków przyswaja metan/metanol według szlaku RMP. Wydajność produkcji biomasy z wykorzystaniem szlaku RMP wynosi 60%, według serynowego 40% w stosunku do ilości użytego substratu.

Poważnym mankamentem hodowli prowadzonych z wykorzystaniem metanu/metanolu jest to, że są one w różnych stężeniach toksyczne dla komórek. Szczególnie dotyczy to metanolu jako dobrze rozpuszczalnego w wodzie. Dla większości metylotrofów stężenie metanolu nie powinno przekraczać 1%. Dlatego też substrat w tych hodowlach musi być precyzyjnie dozowany. Jeszcze bardziej toksyczny jest formaldehyd w stężeniu 1g/l ( 10krotnie mniejszym) hamuje całkowicie wzrost metylotrofów (środek bakteriobójczy).

WYKORZYSTANIE PRZEMYSŁOWE BAKTERII METYLOTROFICZNYCH:

1. SCP

Do tej technologii wykorzystuje się zarówno metan jak i metanol. Cena metanu jest bardzo niska (niskie koszty wydobycia i transportu,) choć wygodniejszym do transport na większe odległości jest metanol. Dlatego też część wydobywanego metanu utleniana jest chemicznie do metanolu by obniżyć koszty transportu. Technologie produkcji SCP z metanu i metanolu są stosowane powszechnie przez koncern Shell zarówno w Afryce jak i Ameryce Południowej. Zakłady te lokalizowane są głównie przy miejscach wydobycia ropy naftowej w celu ograniczenia kosztów transportu. Proces jest tak zorganizowany by ciepło tworzące się podczas chemicznego utleniania metanu do metanolu wykorzystać do sterylizacji aparatury. Białko otrzymywane z metanolu jest niesłychanie czyste, biomasa jest łatwa do oddzielenia, a wydajność biomasy w stosunku do substratu metanolu w skali przemysłowej utrzymuje się na poziomie 50%.

2. tlenek propylenu/ etylenu

To ważny surowiec dla przemysłu chemicznego, powstaje w wyniku utlenienia propenu (reakcja biotransformacji). Do tego procesu wykorzystuje się komórki szczepów Methylosinus. Komórki są zwykle immobilizowane w kulkach z porowatego szkła, stanowią one wypełnienie reaktora kolumnowego. Propen nasycany wodą przetłacza się przez tę kolumnę, temperatura utrzymywana jest na poziomie 45^oC. Mniej więcej po 12h katalizator (unieruchomione komórki) przestają być aktywne, wyczerpana została ich energia i musi być on poddany regeneracji polegającej na umieszczeniu komórek w pożywce z metanolem. Utlenienie propenu lub etylenu zachodzi dzięki monooksygenazie metanowej. Reakcja przebiega w kilku etapach: wiązania, tworzenia kompleksu enzym-substrat, następnie włącza się katalizator ENADH, dzięki któremu dochodzi do przeniesienia elektronów i regeneracja enzymów.

WYKLAD 8

1

---