Wyznaczanie krzywej Michaelisa

Do wyznaczenia krzywej i stałej Michaelisa musimy zbadać wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji. Obserwacji będziemy dokonywac na reakcji hydrolizy sacharozy, która będzie katalizowania przez inwertazę. (Inwertaza należy do hydrolaz rozszczepiających wiązania glikozydowe)

Czynności:

1. Przygotowujemy probówki; oznaczamy je odpowiednimi indexami z tabel a i b; oraz przygotowujemy w nich roztwory o takim składzie jak w tabelach a i b

1. Probówki dla próby ślepej (S) i dla czasu t=0:

SA	0.2cm^3 0.1M sacharozy 3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH 0.2cm^3buf octanowego	A0	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH 0.2cm^3 0.1M sacharozy 0,2cm^3enzymu
SB	0.2cm^3 0.1M sacharozy 3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH 0.2cm^3buf octanowego	B0	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.05M NaOH 0.2cm^3 0.1M sacharozy 0,2cm^3enzymu
Sc	0.2cm^3 0.1M sacharozy 3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH 0.2cm^3buf octanowego	C0	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.025M NaOH 0.2cm^3 0.1M sacharozy 0,2cm^3enzymu

2. Probówki dla właściwego doświadczenia

A	3cm^3 0,1M sacharoza 3cm^3enzymu	A5	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH	A10	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH	A15	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH	A30	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH
B	3cm^3 0,05M sacharoza 3cm^3enzymu	B5	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH	B10	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH	B15	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH	B30	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH
C	3cm^3 0,025M sacharoza 3cm^3enzymu	C5	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH	C10	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH	C15	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH	C30	3.5cm^3odcz. Nelsona 0.1cm^3 0.1M NaOH

2. Gotujemy ślepą próbę przez 20 w wrzącej łaźni wodnej. Mierzymy absorbancje dla λ=520 nm :

SA	0,071	A0	0,002
SB	0,063	B0	0,009
Sc	0,059	C0	0,016

3. Probówki A, B, C wstawiamy do łaźni wodnej o temp 37°C i po 5, 10, 15 i 30 minutach od rozpoczęcia reakcji przenosimy po 1cm³ do odpowiednich probówek z pkt 1b index dolny oznacza czas w minutach

4. Następnie probówki z pkt gotujemy w wrzącej łaźni wodnej przez 20 min

5. Z każdej probówki z pkt 4 przenosimy do odpowiednie ponumerowanych probówek zawierających po 10cm³ wody destylowanej

6. Mierzymy absorbancję na spekolu dla λ=520 nm

A5	0,215	A10	0,193	A15	0,251	A30	0,756
B5	0,250	B10	0,366	B15	0,510	B30	0,838
C5	0,148	C10	0,280	C15	0,316	C30	0,546

7. Po odczytaniu z krzywej wzorcowej otrzymano odpowiednie stężenia w mg/cm³

A5	0,814	A10	0,731	A15	0,951	A30	2,864
B5	0,947	B10	1,386	B15	1,932	B30	3,174
C5	0,561	C10	1,061	C15	1,197	C30	2,068

8. Dokonujemy obliczeń trzymając się toku rozumowania zawartego w skrypcie, korzystając z programu Excel:

Ten wykres przedstawia metodę wyliczania prędkości początkowego etapu reakcji. Pokazuje także jakie błędy wystąpiły w rzeczywistych pomiarach.

Wyznaczamy prędkość początkowego etapu reakcji korzystąc z właściwości iż będzie ona równa tg kąta stycznej do początkowej części wykresu, obliczenia przedstawia tabela

stężenie [M]	0,1	0,05	0,025
tg  [mg/min]	0,977	1,136	0,673
1/S	10	20	40
1/V	1,023541	0,880282	1,485884

Część druga tabeli zawiera, odwrotności danych, niezbędne do sporządzenia wykresu Lineawera - Burka. Po sporządzeniu wykresu, z powstałych punktów interpolujemy prostą (przy pomocy odpowiedniej funkcji programu Excel). Odczytujemy (lub obliczamy) z wykresu punkt przecięcia prostej z osią X. Stałą Michaelisa Mentiem wyliczymy ze wzoru

Z wyliczeń stała wynosi K_M=0,0242

z wykresu odczytujemy iż K_M= 0,0242

Wyznaczanie krzywej Michaelisa gr I i gr II

3

---