Monika Kuś środa, godz.8.30, 9.11.2011r

Aneta Latacz Prowadzący: Paweł Mak

Paulina Oklejewicz

Sprawozdanie 3

Wyznaczanie stałej Michaelisa dla arylosulfatazy A

Arylosulfatazy są enzymami, które katalizują hydrolizę estrów siarczanowych fenoli według reakcji:

R-S-SO₃H + H₂O R-OH + SO₄^-2 + H⁺

Podczas ćwiczeń użyto siarczanu p-nitrokatecholu. Uwolniony 4-nitrokatechol oznaczono spektrofotometrycznie przy 515nm.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było wyznaczenie stałej Michaelisa-Menten dla substancji: arylosulfatazy A. Dla każdego z użytych substratów wykreślono krzywe kinetyczne. Znaleziono graficznie szybkości początkowe, a po sporządzeniu wykresu Lineweavera-Burka wyznaczono graficznie wartości K_m i V_max.

Sposób wykonania:

W probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml sporządzono mieszaninę reakcyjną: 0,6 ml homogenatu wątroby, który był źródłem arylosulfatazy, 0,6 ml substratu, 0,6 ml 0,5M buforu octanowego zawierającego 10% NaCl.

Mieszaninę wytrząśnięto, inkubowano w temperaturze 37 stopni i po czasie 2,4,6,8 i 10 minut pobierano po 300 µl i przenoszono do 5 przygotowanych uprzednio probówek typu Eppendorf 1,5 ml, zawierających 1ml 0,5M NaOH.

Po wymieszaniu zmierzono absorbancję przy 515 nm ( właśnie tam było 515 czy 400 coś?) na spektofotometrze względem ślepej odczynnikowej.

Ślepą odczynnikową przygotowano w sposób następujący: 100 µl 0,5M buforu octanowego zawierającego 10% NaCl, 100 µl substratu i 100 µl wody inkubowano w temperaturze 37 stopni i po 5 minutach dodano 1ml 0,5M NaOH.

Opisane oznaczenie wykonano dla 6 różnych stężeń substratu w zakresie od 20 do 120 mg/10ml.

Wyniki:

1.Wyniki absorbancji dla poszczególnych stężeń substratów

1. 20mg/10ml

1. 0,125

2. 0,135

3. 0,145

4. 0,165

5. 0,170

1. 40mg/10ml

1. 0,100

2. 0,110

3. 0,125

4. 0,135

5. 0,165

1. 60mg/10ml

1. 0,115

2. 0,125

3. 0,155

4. 0,170

5. 0,165

1. 80mg/10ml

1. 0,165

2. 0,220

3. 0,230

4. 0,320

5. 0,375

1. 120mg/ml

Tych danych już nie mam na mojej kartce

1)

2)

3)

4)

5)

2. Przeliczenie