Sprawozdanie 9.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 3
Data zajęć: 2008/05/21
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie O
Elektroforetyczny rozkład białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wstęp
Elektroforeza to dyfuzja fazy rozproszonej względem ośrodka dyspersyjnego pod wpływem
przyłożonego z zewnątrz pola elektrycznego. Następuje rozdział cząsteczek obdarzonych
ładunkiem. Szybkość przemieszczania się zależy od własności takich jak: wielkość cząsteczki,
ładunek, zdolność do wiązania wody i jonów. Szybkość jest także wprost proporcjonalna
do przyłożonego napięcia. Miarą szybkości poruszania się jest szybkość w jednostkowym polu
elektrycznym zwana ruchliwością elektroforetyczną (R
f
). Ruchliwość elektroforetyczna
danego rozdzielanego składnika jest stała podczas elektroforezy dla stałych warunków
eksperymentu takich jak: natężenie i napięcie prądu, pH, temperatura oraz siła jonowa.
Ruchliwość elektroforetyczna jest wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego
cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.
Ruchliwość elektroforetyczna
gdzie:
droga przebyta przez i-ty składnik (prążek),
droga przebyta przez wskaźnik.
Elektroforeza jako technika analityczna ma wiele odmian. Ze względu na rodzaj ośrodka
dyspersyjnego wyróżniamy: elektroforezę bibułową, kapilarną i żelową. Elektroforeza
kapilarna zwana jest też elektroforezą w wolnym buforze. Elektrolit swobodnie przemiesza
się w aparacie o kształcie U-rurki. Ten rodzaj elektroforezy służy najczęściej do rozdziału
niewielkich cząsteczek.
W elektroforezie żelowej ośrodkiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel.
Najczęściej spotykanym jest żel poliakrylamidowy. Spełnia ona wszystkie cech idealnego
nośnika. Jest uformowany najczęściej na płytce długości kilkunastu centymetrów. Równie
dobrze może być w kształcie okrągłej rurki. Nanosi się próbkę na żel, a do końców żelu
przykłada się stałe napięcie. Otrzymany żel po rozdziale wybarwia się. Rozdzielone frakcje
są widoczne w postaci pasków (prążków). Ten rodzaj elektroforezy jest kombinacją wędrówki
w polu elektrycznym oraz sądzenia molekularnego. Jest najczęściej stosowany do rozdzielania
DNA, RNA lub białek. W elektroforezie można badać ładunek czy wielkość poruszających się
cząsteczek, ale także jednorodność wyizolowanych makrocząsteczek.
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym
białka albuminy oraz kwaśnej fosfatazy.
Materiały
a)
Odczynniki:
0,065 M TRIS – kwas borowy (H
3
BO
3
) – bufor do elektroforezy o pH 9,0,
0,1% roztwór wodny błękitu bromofenolowego – wskaźnik,
50% roztwór sacharozy zabarwionej wskaźnikiem,
rurki z żelem poliakrylamidowym,
roztwór do barwienia żeli,
roztwór do odbarwiania żeli,
roztwór albuminy i fosfatazy kwaśnej – próbki do badań.
(1)
Sprawozdanie 9.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 3
Data zajęć: 2008/05/21
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie O
Elektroforetyczny rozkład białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
b)
Szkło laboratoryjne:
probówki małe (2 szt.),
probówki z korkiem (2 szt.),
bagietka,
szkiełko mikroskopowe podstawowe,
pipeta pasteurowska.
c)
Aparatura:
aparat do elektroforezy z pełnym wyposażeniem,
łaźnia wodna o temperaturze 55°C.
Wykonanie
Część I
Nanoszenie próbek na żel
1.
Przygotowano dwie małe probówki.
2.
Do każdej z nich dodano po 100 μl sacharozy z barwnikiem.
3.
Do pierwszej probówki dodano 100 μl albuminy. Wymieszano.
4.
Do drugiej probówki dodano 100 μl kwaśnej fosfatazy. Wymieszano.
5.
Zgodnie z instrukcją „O” przygotowano aparat do elektroforezy.
6.
Na górę żelu z pierwszej rurki naniesiono 100 μl zawartości probówki pierwszej.
7.
Na górę żelu z drugiej rurki naniesiono 100 μl zawartości probówki drugiej.
Część II
Rozdział elektroforetyczny
1.
Zamknięto górną pokrywą aparat do elektroforezy.
2.
Podłączono przewodami do zasilacza i włączono przepływ prądu.
3.
Ustawiono natężenie prądu na 3 mA na jeden żel.
4.
Odczekano aż wskaźnik przejdzie z żelu zagęszczającego do żelu rozdzielającego w rurce.
5.
Ustawiono natężenie prądu na 5 mA na jeden żel.
6.
Gdy wskaźnik osiągnął dół żelu wyłączono zasilanie.
Część III
Wybarwienie i odbarwianie żelu
1.
Wykręcono obie rurki z aparatu do elektroforezy.
2.
Żel z każdej rurki wypchnięto bagietką na szkiełko mikroskopowe podstawowe.
3.
Odcięto żel zagęszczający oraz część żelu rozdzielającego poniżej wskaźnika.
4.
Środkowe części żeli przełożono do odpowiednich probówek z korkami, wskaźnikiem do dołu.
5.
Dodano odczynnika zabarwiającego, tyle żeby każdy żelu był całkowicie zalany.
6.
Probówki umieszczono w łaźni wodnej 55°C na 15 minut.
7.
Odlano barwnik do specjalnego pojemnika.
8.
Do żeli w probówkach dodano odczynnika odbarwiającego.
9.
Inkubowano w łaźni wodnej 55°C przez 15 minut.
10.
Mieszano zawartość probówek.
11.
Odlano roztwór.
12.
Czynności z pkt. 8, 9, 10,11 powtarzano aż cały żel (poza białkami) odbarwi się.
13.
Naszkicowano położenie prążków rysunek 1. oraz rysunek 2.
14.
Zmierzono położenie powstałych prążków.
Uwagi
Wybarwianie powtórzono 5-krotnie.
Nie przygotowywano żeli ani nie wypełniano rurek żelem. Skorzystano z już przygotowanych.
Sprawozdanie 9.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 3
Data zajęć: 2008/05/21
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie O
Elektroforetyczny rozkład białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wyniki
Po elektroforezie, wybarwieniu i odbarwianiu otrzymano obrazy* prążków na żelu**.
Rysunek. 1. – żel z prążkami
albuminy
Rysunek. 2. – żel z prążkami
kwaśnej fosfatazy
* zachowano skalę 1:1, kierunek dyfuzji białek przebiega z góry na dół,
** z góry odcięto żel zagęszczający, z dołu żel rozdzielający poniżej linii wskaźnika.
Zmierzono położenie prążków w żelu i wyznaczono ruchliwości elektroforetyczne ze wzoru (1).
Dla albuminy (rysunek 1.)
43 mm
25 mm
33 mm
,
25 mm
43 mm
0,58
,
33 mm
43 mm
0,77
Dla kwaśnej fosfatazy (rysunek 2.)
47 mm
20 mm
25 mm
28 mm
,
20 mm
47 mm
0,43
,
25 mm
47 mm
0,53
,
28 mm
47 mm
0,60
Wnioski
Rozdział białek nastąpił ponieważ składają się one z różnych domen, które wykazują różną
ruchliwość elektroforetyczną.
Albumina w elektroforezie dała dwa prążki. Można domniemywać, że składa się z dwóch
heterogenicznych domen. Kwaśna fosfataza w elektroforezie dała trzy prążki. Można
domniemywać, że jest trimerem.
Nie można jednoznacznie zidentyfikować kolejnych domen, ponieważ nie przeprowadzono
elektroforezy porównawczej dla wzorca mas białek. W związku z tym położenie prążka
na żelu nie można przeliczyć na masę danej domeny w Daltonach.
Nie można też jednoznacznie przesądzić o jednorodności badanych preparatów. W tym celu
należałoby przeprowadzić elektroforezę w różnych warunkach, stosując bufory różniące się
pH i siłą jonową.