Sprawozdanie 9.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 3
Data zajęć: 2008/05/21

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie O

Elektroforetyczny rozkład białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Wstęp

Elektroforeza to dyfuzja fazy rozproszonej względem ośrodka dyspersyjnego pod wpływem

przyłożonego z zewnątrz pola elektrycznego. Następuje rozdział cząsteczek obdarzonych

ładunkiem. Szybkość przemieszczania się zależy od własności takich jak: wielkość cząsteczki,

ładunek, zdolność do wiązania wody i jonów. Szybkość jest także wprost proporcjonalna

do przyłożonego napięcia. Miarą szybkości poruszania się jest szybkość w jednostkowym polu

elektrycznym zwana ruchliwością elektroforetyczną (R

f

). Ruchliwość elektroforetyczna

danego rozdzielanego składnika jest stała podczas elektroforezy dla stałych warunków

eksperymentu takich jak: natężenie i napięcie prądu, pH, temperatura oraz siła jonowa.

Ruchliwość elektroforetyczna jest wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego

cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.

Ruchliwość elektroforetyczna













gdzie:





droga przebyta przez i-ty składnik (prążek),





droga przebyta przez wskaźnik.

Elektroforeza jako technika analityczna ma wiele odmian. Ze względu na rodzaj ośrodka

dyspersyjnego wyróżniamy: elektroforezę bibułową, kapilarną i żelową. Elektroforeza

kapilarna zwana jest też elektroforezą w wolnym buforze. Elektrolit swobodnie przemiesza

się w aparacie o kształcie U-rurki. Ten rodzaj elektroforezy służy najczęściej do rozdziału

niewielkich cząsteczek.

W elektroforezie żelowej ośrodkiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel.

Najczęściej spotykanym jest żel poliakrylamidowy. Spełnia ona wszystkie cech idealnego

nośnika. Jest uformowany najczęściej na płytce długości kilkunastu centymetrów. Równie

dobrze może być w kształcie okrągłej rurki. Nanosi się próbkę na żel, a do końców żelu

przykłada się stałe napięcie. Otrzymany żel po rozdziale wybarwia się. Rozdzielone frakcje

są widoczne w postaci pasków (prążków). Ten rodzaj elektroforezy jest kombinacją wędrówki

w polu elektrycznym oraz sądzenia molekularnego. Jest najczęściej stosowany do rozdzielania

DNA, RNA lub białek. W elektroforezie można badać ładunek czy wielkość poruszających się

cząsteczek, ale także jednorodność wyizolowanych makrocząsteczek.

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym

białka albuminy oraz kwaśnej fosfatazy.

Materiały

a)

Odczynniki:

0,065 M TRIS – kwas borowy (H

3

BO

3

) – bufor do elektroforezy o pH 9,0,

0,1% roztwór wodny błękitu bromofenolowego – wskaźnik,

50% roztwór sacharozy zabarwionej wskaźnikiem,

rurki z żelem poliakrylamidowym,

roztwór do barwienia żeli,

roztwór do odbarwiania żeli,

roztwór albuminy i fosfatazy kwaśnej – próbki do badań.

(1)

Sprawozdanie 9.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 3
Data zajęć: 2008/05/21

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie O

Elektroforetyczny rozkład białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

b)

Szkło laboratoryjne:

probówki małe (2 szt.),

probówki z korkiem (2 szt.),

bagietka,

szkiełko mikroskopowe podstawowe,

pipeta pasteurowska.

c)

Aparatura:

aparat do elektroforezy z pełnym wyposażeniem,

łaźnia wodna o temperaturze 55°C.

Wykonanie

Część I

Nanoszenie próbek na żel

1.

Przygotowano dwie małe probówki.

2.

Do każdej z nich dodano po 100 μl sacharozy z barwnikiem.

3.

Do pierwszej probówki dodano 100 μl albuminy. Wymieszano.

4.

Do drugiej probówki dodano 100 μl kwaśnej fosfatazy. Wymieszano.

5.

Zgodnie z instrukcją „O” przygotowano aparat do elektroforezy.

6.

Na górę żelu z pierwszej rurki naniesiono 100 μl zawartości probówki pierwszej.

7.

Na górę żelu z drugiej rurki naniesiono 100 μl zawartości probówki drugiej.

Część II

Rozdział elektroforetyczny

1.

Zamknięto górną pokrywą aparat do elektroforezy.

2.

Podłączono przewodami do zasilacza i włączono przepływ prądu.

3.

Ustawiono natężenie prądu na 3 mA na jeden żel.

4.

Odczekano aż wskaźnik przejdzie z żelu zagęszczającego do żelu rozdzielającego w rurce.

5.

Ustawiono natężenie prądu na 5 mA na jeden żel.

6.

Gdy wskaźnik osiągnął dół żelu wyłączono zasilanie.

Część III

Wybarwienie i odbarwianie żelu

1.

Wykręcono obie rurki z aparatu do elektroforezy.

2.

Żel z każdej rurki wypchnięto bagietką na szkiełko mikroskopowe podstawowe.

3.

Odcięto żel zagęszczający oraz część żelu rozdzielającego poniżej wskaźnika.

4.

Środkowe części żeli przełożono do odpowiednich probówek z korkami, wskaźnikiem do dołu.

5.

Dodano odczynnika zabarwiającego, tyle żeby każdy żelu był całkowicie zalany.

6.

Probówki umieszczono w łaźni wodnej 55°C na 15 minut.

7.

Odlano barwnik do specjalnego pojemnika.

8.

Do żeli w probówkach dodano odczynnika odbarwiającego.

9.

Inkubowano w łaźni wodnej 55°C przez 15 minut.

10.

Mieszano zawartość probówek.

11.

Odlano roztwór.

12.

Czynności z pkt. 8, 9, 10,11 powtarzano aż cały żel (poza białkami) odbarwi się.

13.

Naszkicowano położenie prążków rysunek 1. oraz rysunek 2.

14.

Zmierzono położenie powstałych prążków.

Uwagi

Wybarwianie powtórzono 5-krotnie.

Nie przygotowywano żeli ani nie wypełniano rurek żelem. Skorzystano z już przygotowanych.

Sprawozdanie 9.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 3
Data zajęć: 2008/05/21

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie O

Elektroforetyczny rozkład białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Wyniki

Po elektroforezie, wybarwieniu i odbarwianiu otrzymano obrazy* prążków na żelu**.

Rysunek. 1. – żel z prążkami

albuminy

Rysunek. 2. – żel z prążkami

kwaśnej fosfatazy

* zachowano skalę 1:1, kierunek dyfuzji białek przebiega z góry na dół,

** z góry odcięto żel zagęszczający, z dołu żel rozdzielający poniżej linii wskaźnika.

Zmierzono położenie prążków w żelu i wyznaczono ruchliwości elektroforetyczne ze wzoru (1).

Dla albuminy (rysunek 1.)





 43 mm





 25 mm





 33 mm

,













25 mm

43 mm

 0,58

,













33 mm

43 mm

 0,77

Dla kwaśnej fosfatazy (rysunek 2.)





 47 mm





 20 mm





 25 mm





 28 mm

,













20 mm

47 mm

 0,43

,













25 mm

47 mm

 0,53

,













28 mm

47 mm

 0,60

Wnioski

Rozdział białek nastąpił ponieważ składają się one z różnych domen, które wykazują różną

ruchliwość elektroforetyczną.

Albumina w elektroforezie dała dwa prążki. Można domniemywać, że składa się z dwóch

heterogenicznych domen. Kwaśna fosfataza w elektroforezie dała trzy prążki. Można

domniemywać, że jest trimerem.

Nie można jednoznacznie zidentyfikować kolejnych domen, ponieważ nie przeprowadzono

elektroforezy porównawczej dla wzorca mas białek. W związku z tym położenie prążka

na żelu nie można przeliczyć na masę danej domeny w Daltonach.

Nie można też jednoznacznie przesądzić o jednorodności badanych preparatów. W tym celu

należałoby przeprowadzić elektroforezę w różnych warunkach, stosując bufory różniące się

pH i siłą jonową.