Sprawozdanie 10.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 7
Data zajęć: 2008/05/29

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie I

Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Wstęp

Doświadczenie 1.

Krzywe miareczkowania aminokwasów

Aminokwasy mają charakter amfoterycznych. Posiadają grupy aminowe zdolne do włączania

protonu oraz grupy karboksylowe zdolne do oddysocjowania protonu. Dodatkowe łańcuchy

boczne mogą ulegaj różniej jonizacji. W roztworze cały czas panuje równowaga pomiędzy

wszystkimi formami jonowymi. W zależności od pH jednych form jonowych jest więcej, nich mniej.

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie krzywych miareczkowania dla dwóch aminokwasów. Jest

to zależność zmiany pH od ilości dodawanego kwasu lub zasady. Wartość pH nie zmienia się

jednostajnie. Dla wartości pH zbliżonych do pK zmiany pH są małe. Mechanizm ten zwany

buforowaniem polega na przesuwaniu równowagi przeciwnie do zmian pH. Gdy dodawany

jest kwas równowaga jest przesuwana w stronę formy niezdysocjowanej tak, aby związać

nadmiar jonów wodorowych. Dla wartości pH zbliżonych do pI zmiany pH są duże.

Glicyna (Gly) jest najprostszym aminokwasem (rysunek 1.).

NH

2

O

O

H

(rysunek 1.)

Kwas asparaginowy (Asp) jest aminokwasem o odczynie kwaśnym (rysunek 2.).

NH

2

O

O

OH

O

H

(rysunek 2.)

Doświadczenie 2.

Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny

Punkt izoelektrycznych (pI) to pH dla którego aminokwas/białko posiada sumaryczny ładunek

elektryczny równy zero. Wówczas cząsteczka taka cząsteczka nie porusza się w polu

elektrycznym. Precyzyjną metodą wyznaczenia pI jest izoelektroogniskowanie. Polega

na przyłożeniu napięcia do płytki żelowej z naniesionym białkiem. Żel został tak

przygotowany, że posiada liniowy gradient pH. Białko zatrzyma się, gdy będzie

nienaładowane, czyli dokładnie w pI. Inna metodą jest wytrącanie osadów. Białko w pI

posiada najmniejszą rozpuszczalność. Sporządza się serię roztworów o różnych pH i rozpuszcza

się w nich białko. Punkt izoelektrycznych białka jest równy pH roztworu, gdzie wytrącił się

największy osad. Jest to metoda szybsza i łatwiejsza do wykonania, jednak mniej dokłada.

Celem doświadczenia jest wyznaczenie pI kazeiny przez wytrącenie osadu. Kazeina jest

kwaśnym białkiem wyizolowanym z mleka ssaków. Pełnia ona funkcje stabilizujące w mleku,

czyli roztworze koloidowym tłuszczu w wodzie. Punkt izoelektryczny kazeiny wynosi od 4,5

[1]

do 4,7

[2]

w zależności od użytej metody jej izolacji.

[1] Van Slyke, L. L., and Baker, J. C., J. Biol. Chem., 1918, xxxv, 127.

[2] Loeb, J., J. Gen. Physiol., 1918-19, i, 237.

Sprawozdanie 10.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 7
Data zajęć: 2008/05/29

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie I

Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Materiały

a)

Odczynniki:

1 N HCl – roztwór mianowany,

1 N NaOH – roztwór mianowany,

0,1 M glicyna,

0,05 M kwas asparaginowy,

1 M CH

3

COOH,

0,5% roztwór kazeiny w wodzie,

b)

Szkło laboratoryjne:

Zlewki wysokie 50 ml (4 szt.) i 250 ml (1 szt.),

Probówki (10 szt.).

c)

Aparatura:

Pehametr cyfrowy z elektrodą szklaną, wzorce pH: 4, 7, 9.

Mieszadło magnetyczne,

Pipety automatyczne (3 szt.),

Stawy na probówki.

Wykonanie

Ćwiczenie przeprowadzono zgodnie z treścią instrukcji „I”.

Doświadczenie 1.

Krzywe miareczkowania aminokwasów

1.

Wykalibrowano pehametr za pomocą wzorców pH: 4, 7 i 9.

2.

Miareczkowano 40 ml wody destylowanej za pomocą 1 N HCl do pH 1,6. Wyniki umieszono w tabeli 1.

3.

Miareczkowano 40 ml wody destylowanej za pomocą 1 N NaCl do pH 12. Wyniki umieszono w tabeli 1.

4.

Miareczkowano 40 ml 0,1 M glicyny za pomocą 1 N HCl do pH 1,6. Wyniki umieszono w tabeli 2.

5.

Miareczkowano 40 ml 0,1 M glicyny za pomocą 1 N NaCl do pH 12. Wyniki umieszono w tabeli 2.

6.

Miareczkowano 40 ml 0,05 M kwas asparaginowy za pomocą 1 N HCl do pH 1,6. Wyniki

umieszono w tabeli 3.

7.

Miareczkowano 40 ml 0,05 M kwas asparaginowy za pomocą 1 N NaCl do pH 12. Wyniki

umieszono w tabeli 3.

Doświadczenie 2.

Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny

1.

Wykalibrowano pehametr za pomocą wzorców pH: 4 i 7.

2.

Przygotowano 9 probówek.

3.

Do pierwszej dodano 13,6 ml wody destylowanej oraz 6,4 ml 1M CH

3

COOH. Wymieszano.

4.

Do następnej probówki dodano 5,0 ml wody destylowanej oraz 5,0 ml roztworu z poprzedniej

probówki. Wymieszano.

5.

Pkt. 4. powtórzono dla probówek od 3 do 9.

6.

Skorygowano objętości probówki 1 i 9 do 5 ml.

7.

Zmierzono pH w probówkach od 1 do 9. Wyniki umieszono w tabeli 4.

8.

Do probówek od 1 do 9 dodano po 1 ml 0,5% roztworu kazeiny. Wymieszano.

9.

Odczekano 30 minut.

10.

Zanotowano wielkość zmętnienia i osadu w tabeli 4.

Sprawozdanie 10.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 7
Data zajęć: 2008/05/29

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie I

Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Wyniki

Tabela 1. – Miareczkowanie wody destylowanej wobec kwasu i zasady

HCl

/ml/

Σ

HCl

/ml/

pH

0,0000

0,0000

7,16

0,0125

0,0125

3,71

0,0125

0,0250

3,15

0,0125

0,0375

2,93

0,0125

0,0500

2,78

0,0125

0,0625

2,66

0,0125

0,0750

2,56

0,0125

0,0875

2,49

0,0125

0,1000

2,42

0,0125

0,1125

2,37

0,0125

0,1250

2,34

0,0125

0,1375

2,30

0,0125

0,1500

2,25

0,0125

0,1625

2,22

HCl

/ml/

Σ

HCl

/ml/

pH

0,0375

0,2000

2,10

0,0375

0,2375

1,96

0,0500

0,2875

1,89

0,0500

0,3375

1,83

0,0500

0,3875

1,78

0,0500

0,4375

1,74

0,0500

0,4875

1,69

0,0500

0,5375

1,65

0,0500

0,5875

1,62

0,0500

0,6375

1,58

0,0500

0,6875

1,55

0,0500

0,7375

1,53

NaOH

/ml/

Σ

NaOH

/ml/

pH

0,0000

0,0000

7,17

0,0125

0,0125

10,44

0,0125

0,0250

10,84

0,0125

0,0375

11,04

0,0125

0,0500

11,25

0,0125

0,0625

11,38

0,0500

0,1125

11,60

0,0500

0,1625

11,73

0,0500

0,2125

11,83

0,0500

0,2625

11,91

0,0500

0,3125

11,98

0,0500

0,3625

12,03

Wykres 1. – Miareczkowanie wody destylowanej

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00

0,20

0,40

1,00

3,00

5,00

7,00

9,00

11,00

13,00

m

l

H

C

l

m

l

N

a

O

H

pH

Sprawozdanie 10.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 4 z 7
Data zajęć: 2008/05/29

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie I

Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Tabela 2a. – Miareczkowanie glicyny wobec kwasu

pH

HCl

/ml/

H



O

/ml/

 

mol HCl

1 mol aa











7,23

0,0000

0,0000

0,0000

0,0000

6,79

0,0125

0,0125

0,0000

0,0000

6,03

0,0250

0,0125

0,0125

0,0031

5,17

0,0375

0,0125

0,0250

0,0063

4,73

0,0500

0,0125

0,0375

0,0094

4,50

0,0625

0,0125

0,0500

0,0125

4,32

0,0750

0,0125

0,0625

0,0156

4,15

0,0875

0,0125

0,0750

0,0188

4,06

0,1000

0,0125

0,0875

0,0219

3,72

0,2000

0,0125

0,1875

0,0469

3,49

0,3000

0,0250

0,2750

0,0688

3,34

0,4000

0,0250

0,3750

0,0938

3,22

0,5000

0,0250

0,4750

0,1188

3,13

0,6000

0,0375

0,5625

0,1406

2,97

0,8000

0,0375

0,7625

0,1906

2,82

1,0000

0,0500

0,9500

0,2375

pH

HCl

/ml/

H



O

/ml/

 

mol HCl

1 mol aa











2,71

1,2000

0,0625

1,1375

0,2844

2,61

1,4000

0,0750

1,3250

0,3313

2,52

1,6000

0,0875

1,5125

0,3781

2,43

1,8000

0,1000

1,7000

0,4250

2,36

2,0000

0,1250

1,8750

0,4688

2,28

2,2000

0,1500

2,0500

0,5125

2,20

2,4000

0,2000

2,2000

0,5500

2,14

2,6000

0,2000

2,4000

0,6000

2,06

2,8000

0,2375

2,5625

0,6406

1,99

3,0000

0,2375

2,7625

0,6906

1,93

3,2000

0,2875

2,9125

0,7281

1,86

3,4000

0,3375

3,0625

0,7656

1,79

3,6000

0,3875

3,2125

0,8031

1,73

3,8000

0,4875

3,3125

0,8281

1,67

4,0000

0,5375

3,4625

0,8656

1,61

4,2000

0,6375

3,5625

0,8906

Tabela 2b. – Miareczkowanie glicyny wobec zasady

pH

NaOH

/ml/

H



O

/ml/

 

mol NaOH

1 mol aa











7,20

0,0000

0,0000

0,0000

0,0000

7,70

0,0125

0,0000

0,0125

0,0031

7,91

0,0250

0,0000

0,0250

0,0063

8,00

0,0375

0,0000

0,0375

0,0094

8,15

0,0500

0,0000

0,0500

0,0125

8,30

0,0625

0,0000

0,0625

0,0156

8,33

0,0750

0,0000

0,0750

0,0188

8,42

0,0875

0,0000

0,0875

0,0219

8,66

0,1875

0,0000

0,1875

0,0469

8,79

0,2875

0,0000

0,2875

0,0719

8,89

0,3875

0,0000

0,3875

0,0969

8,98

0,4875

0,0000

0,4875

0,1219

9,07

0,5875

0,0000

0,5875

0,1469

9,15

0,6875

0,0000

0,6875

0,1719

9,27

0,8875

0,0000

0,8875

0,2219

9,38

1,0875

0,0000

1,0875

0,2719

9,48

1,2875

0,0000

1,2875

0,3219

9,58

1,4875

0,0000

1,4875

0,3719

pH

NaOH

/ml/

H



O

/ml/

 

mol NaOH

1 mol aa











9,67

1,6875

0,0000

1,6875

0,4219

9,75

1,8875

0,0000

1,8875

0,4719

9,84

2,0875

0,0000

2,0875

0,5219

9,92

2,2875

0,0000

2,2875

0,5719

10,01

2,4875

0,0000

2,4875

0,6219

10,09

2,6875

0,0000

2,6875

0,6719

10,15

2,8875

0,0000

2,8875

0,7219

10,24

3,0875

0,0000

3,0875

0,7719

10,37

3,2875

0,0000

3,2875

0,8219

10,48

3,4875

0,0125

3,4750

0,8688

10,59

3,6875

0,0125

3,6750

0,9188

10,79

3,8875

0,0125

3,8750

0,9688

11,02

4,0875

0,0250

4,0625

1,0156

11,35

4,2875

0,0500

4,2375

1,0594

11,69

4,4875

0,1125

4,3750

1,0938

11,94

4,6875

0,2625

4,4250

1,1063

12,05

4,8875

0,3625

4,5250

1,1313

Sprawozdanie 10.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 5 z 7
Data zajęć: 2008/05/29

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie I

Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Wykres 2. – Miareczkowanie glicyny

Z wykresu 2. odczytano:

pK



 2,40

pI  6,20
pK



 10,00

Tabela 3a. – Miareczkowanie kwasu asparaginowego wobec kwasu

pH

HCl

/ml/

H



O

/ml/

 

mol HCl

1 mol aa











2,82

0,0000

0,0000

0,0000

0,0000

2,81

0,0125

0,0000

0,0125

0,0063

2,79

0,0250

0,0000

0,0250

0,0125

2,78

0,0375

0,0000

0,0375

0,0188

2,70

0,0875

0,0125

0,0750

0,0375

2,68

0,1375

0,0125

0,1250

0,0625

2,64

0,1875

0,0250

0,1625

0,0813

2,58

0,2375

0,0250

0,2125

0,1063

2,53

0,2875

0,0375

0,2500

0,1250

2,49

0,3375

0,0375

0,3000

0,1500

2,40

0,4375

0,0625

0,3750

0,1875

2,32

0,5375

0,0875

0,4500

0,2250

2,25

0,6375

0,1000

0,5375

0,2688

pH

HCl

/ml/

H



O

/ml/

 

mol HCl

1 mol aa











2,18

0,7375

0,1500

0,5875

0,2938

2,12

0,8375

0,1500

0,6875

0,3438

2,06

0,9375

0,1875

0,7500

0,3750

2,01

1,0375

0,1875

0,8500

0,4250

1,96

1,1375

0,1875

0,9500

0,4750

1,90

1,2375

0,2375

1,0000

0,5000

1,84

1,3375

0,2875

1,0500

0,5250

1,80

1,4375

0,3375

1,1000

0,5500

1,75

1,5375

0,3875

1,1500

0,5750

1,71

1,6375

0,4375

1,2000

0,6000

1,67

1,7375

0,4875

1,2500

0,6250

1,63

1,8375

0,5375

1,3000

0,6500

1,59

1,9375

0,5875

1,3500

0,6750

1,25

0,75

0,25

0,25

0,75

1,25

1,00

3,00

5,00

7,00

9,00

11,00

13,00

m

o

l

H

C

l/

1

m

o

l

a

a

m

o

l

N

a

O

H

/1

m

o

l

a

a

pH

Sprawozdanie 10.

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Amfoteryczny charakter aminokwasów

Tabela 3b. – Miareczkowanie kwasu asparaginowego wobec zasady

2,85

0,0250

0,0000

0,0250

2,87

0,0375

0,0000

0,0375

2,89

0,0500

0,0000

0,0500

2,91

0,0625

0,0000

0,0625

2,92

0,0750

0,0000

0,0750

2,94

0,0875

0,0000

0,0875

2,96

0,1000

0,0000

0,1000

2,97

0,1125

0,0000

0,1125

2,98

0,1250

0,0000

0,1250

2,99

0,1375

0,0000

0,1375

3,01

0,1500

0,0000

0,1500

3,04

0,1625

0,0000

0,1625

3,14

0,2625

0,0000

0,2625

3,25

0,3625

0,0000

0,3625

3,33

0,4625

0,0000

0,4625

3,39

0,5625

0,0000

0,5625

3,51

0,6625

0,0000

0,6625

3,58

0,7625

0,0000

0,7625

3,68

0,8625

0,0000

0,8625

Wykres

Z wykresu 3. odczytano:

1,00

0,50

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

1,00

3,00

m

o

l

H

C

l/

1

m

o

l

a

a

m

o

l

N

a

O

H

/1

m

o

l

a

a

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona
Data zajęć: 2008/05/29

Ćwiczenie I

Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Miareczkowanie kwasu asparaginowego wobec zasady

0,0250

0,0125

0,0375

0,0188

0,0500

0,0250

0,0625

0,0313

0,0750

0,0375

0,0875

0,0438

0,1000

0,0500

0,1125

0,0563

0,1250

0,0625

0,1375

0,0688

0,1500

0,0750

0,1625

0,0813

0,2625

0,1313

0,3625

0,1813

0,4625

0,2313

0,5625

0,2813

0,6625

0,3313

0,7625

0,3813

0,8625

0,4313

3,73

0,9625

0,0000

3,85

1,0625

0,0000

3,95

1,1625

0,0000

4,19

1,3625

0,0000

4,51

1,5625

0,0000

5,18

1,7625

0,0000

8,76

1,9625

0,0000

9,25

2,1625

0,0000

9,52

2,3625

0,0000

9,73

2,5625

0,0000

9,93

2,7625

0,0000

10,11

2,9625

0,0000

10,32

3,1625

0,0000

10,57

3,3625

0,0125

10,93

3,5625

0,0250

11,45

3,7625

0,0625

11,80

3,9625

0,1625

12,03

4,1625

0,3625

Wykres 3. – Miareczkowanie kwasu asparaginowego

3,00

5,00

7,00

9,00

11,00

pH

Strona 6 z 7
Data zajęć: 2008/05/29
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Miareczkowanie kwasu asparaginowego wobec zasady

0,0000

0,9625

0,4813

0,0000

1,0625

0,5313

0,0000

1,1625

0,5813

0,0000

1,3625

0,6813

0,0000

1,5625

0,7813

0,0000

1,7625

0,8813

0,0000

1,9625

0,9813

0,0000

2,1625

1,0813

0,0000

2,3625

1,1813

0,0000

2,5625

1,2813

0,0000

2,7625

1,3813

0,0000

2,9625

1,4813

0,0000

3,1625

1,5813

0,0125

3,3500

1,6750

0,0250

3,5375

1,7688

0,0625

3,7000

1,8500

0,1625

3,8000

1,9000

0,3625

3,8000

1,9000

13,00

Sprawozdanie 10.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 7 z 7
Data zajęć: 2008/05/29

Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Ćwiczenie I

Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek

Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV

Tabela 4. – Zmętnienie roztworu kazeiny w różnych pH

nr probówki

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

2,44

2,58

2,81

2,96

3,15

3,39

3,63

3,86

4,16

zmętnienie

–

–

+

++

+++

++

–

–

–

osad

–

–

–

+

++

+

–

–

–

Wnioski

Doświadczenie 1.

Krzywe miareczkowania aminokwasów

Zarówno dla glicyny jak i kwasu asparaginowego wyznaczone wartości pK i pI pokrywają się

z danymi tabelarycznymi zawartymi instrukcji „I”.

glicyna

zmierzono

z instrukcji

pK

1

2,40

2,23

pK

2

10,00

9,82

pI

6,20

5,97

kwas asparaginowy

zmierzono

z instrukcji

pK

1

2,00

2,09

pK

2

10,20

9,82

pK

3

3,80

3,86

pI

3,00

2,97

Doświadczenie 2.

Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny

Zgodnie z tabelą 4. największy osad jest w probówce 5. dla pH 3,15. To znaczy, że pI kazeiny

wynosi 3,15. Wyznaczony doświadczalnie punkt izoelektryczny jest znacznie niższy

niż wartość podana w literaturze (pI=4,5). Powodem może być niedokładność użytej metody,

czy subiektywna ocena ilości wytrąconego osadu. Innym powodem może być

zanieczyszczenie badanego roztworu kazeiny.