Grupa 1 27.10.2009r

Karolina Łysiak

Robert Janczak

WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA I SZYBKOŚCI MAKSYMALNEJ

(ćwiczenie A)

Przebieg ćwiczenia:

1. Wykonanie krzywej standardowej

Tabela nr1

probówka nr	bufor ml	p-nitrofenol ml	mikromole p-nitrofenolu	NaOH ml	A410
						1	1,70	0,20	0,02	2	0,173
						2	1,50	0,40	0,04	2	0,342
						3	1,30	0,60	0,06	2	0,472
						4	1,10	0,80	0,08	2	0,571
						5	0,90	1,00	0,10	2	0,657
						6	0,70	1,20	0,12	2	0,743
						7	0,50	1,40	0,14	2	0,823
						8	1,90	0,00	0,00	2	odnośnik

• Roztwór p-nitrofenolu, uzywany przez nas w ćwiczeniu, przygotowany został przez rozcieńczenie V_p=0.2 ml (0.2·10^-3dm³) p-nitrofenolu o stężeniu c_p = 5mM = 5·10^-3 mol/dm³ buforem octanowym. Końcowa objętość wynosiła V_K =10ml (1.0·10^-2dm³).

• n₁= c_p· V_p = 0,2·10^-3dm³ · 5·10^-3 mol/dm³ = 1,0·10^-6 mol

• c_k= n₁ / V_K = 1,0·10^-6 / 1,0·10^-2 = 1,0·10^-4 mol/dm³

Dla probówki nr 1: V₁ = 0,20 ml = 0,2·10^-3dm³

n ₁ = c_k · V₁ = 1,0·10^-4mol/dm³ · 0,2·10^-3dm³ = 2·10^-8mol = 0,02μmol

• W analogiczny sposób obliczamy ilość mikromoli p-nitrofenolu w pozostałych probówkach.

2. Pomiar szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu.

Tabela nr2

probówka nr

bufor ml

substrat ml

enzym ml

NaOH ml

A410

∆ A410

1 1' 2 2' 3 3' 4 4' 5 5' 6 6' 7 7' 8 8' 9 9' 10 10' 11

1,75 1,85 1,70 1,80 1,65 1,75 1,60 1,70 1,50 1,60 1,35 1,45 1,20 1,30 1,05 1,15 0,80 0,90 0,50 0,60 1,80

0,05 0,05 0,10 0,10 0,15 0,15 0,20 0,20 0,30 0,30 0,45 0,45 0,60 0,60 0,75 0,75 1,00 1,00 1,30 1,30 -

0,10 - 0,10 - 0,10 - 0,10 - 0,10 - 0,10 - 0,10 - 0,10 - 0,10 - 0,10 - 0,10

2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

0,270 0,068 0,427 0,074 0,399 0,073 0,483 0,075 0,521 0,076 0,731 0,082 0,936 0,082 0,531 0,097 0,666 0,103 0,759 0,113 odnośnik

0,202 0,353 0,326 0,408 0,445 0,649 0,853 0,434 0,563 0,646

Obliczenia:

• Obliczenie stężenia p-nitrofenylofosforanu [S]

V_mieszaniny = 1,90 ml=1,90·10^-3 dm³

C_substratu = 5·10^-3 mol/dm³

• [S] = V_substratu · c_substratu / V_mieszaniny

Dla probówki nr 1 : V_substratu = 0,05 · 10^-3 dm³ =>

[S] = 0,05·10^-3dm³ · 5·10^-3 mol/dm³ / 1,90·10^-3 dm³ =

=1,316·10^-4 mol/dm³ = 131,6μmol/dm³

W analogiczny sposób obliczamy stężenie p-nitrofenylofosforanu [S] dla pozostałych probówek (patrz tabela nr3)

• Korzystając z krzywej standardowej odczytujemy ilość mikromoli powstałego produktu.

Równanie opisujące krzywą standardową: y= 5,75x + 0,07(odczytujemy z wykresu), gdzie y to absorbancja A_410, a x to ilość p-nitrofenolu.

x= (y - 0,07) / 5,75

Dla probówki nr 1: x= (0,202 - 0,07) / 5,75 = 0,0229 [µmol]

Analogicznie dla kolejnych probówek. (tabela nr3)

• Obliczamy ilość mikromoli p-nitrofenolu powstałą w ciągu minuty reakcji, a także ilośc mikromoli powstałego produktu w ciagu 1 minuty na 1 mg białka

czas reakcji 25 min więc x = v [µmol/25min]

Stężenie podstawowe substratu wynosiło: 5mM

Stężenie podstawowe fosfatazy wynosiło: 0,08mg/ml.

Stężenie białka (fosfatazy) w mieszaninie reakcyjnej wynosiło:

c _{białka =} c_{o białka}· V _białka / V_mieszaniny

c_białka= (0,08mg/ml · 0,10 ml) / 1,90 ml = 4,21·10^-3 mg/ml

m_białka= 0,10 ml ·0,08 mg/ml = 0,008 mg

v_c -ilość mikromoli produktu powstałego w reakcji w ciągu 1 min można obliczyć (dla każdej probówki) ze wzoru:

v_c = n/ 25

Dla probówki nr 1: v_c = 0,202/ 25 = 9,2 ·10^-4 [µmol/min]

Analogicznie dla reszty probówek. (tabela nr3)

v_sp -ilość mikromoli powstałego produktu w ciągu 1 min na 1 mg białka w mieszaninie reakcyjnej

ze wzoru:

v_sp = v_c / m _białka

Dla probówki nr 1: v_sp= 2,4·10^-4 / 0,008 = 0,0299 [µmol/ mg·min]

Analogicznie dla reszty probówek. (tabela nr3)

Tabela nr 3

probówka nr	∆A410/kor/	S [µM]	1 / S [µM]^-1	n [µmol/	vc [µmol/ min]	vsp [µmol/ mgbiałkamin]	1 / vsp [min·mg/ µmol]
								1	0,202	131,6	7,599·10^-3	0,0230	9,2·10^-4	0,115	8,71
								2	0,353	263,2	3,799·10^-3	0,0492	19,7·10^-4	0,246	4,06
								3	0,326	394,8	2,533·10^-3	0,0445	17,8·10^-4	0,223	4,49
								4	0,408	526,4	1,900·10^-3	0,0588	23,5·10^-4	0,294	3,4
								5	0,445	789,6	1,266·10^-3	0,0652	26,1·10^-4	0,326	3,07
								6	0,649	1184,4	8,44·10^-4	0,1007	40,3·10^-4	0,503	1,99
								7	0,853	1579,2	6,332·10^-4	0,1362	54,5·10^-4	0,681	1,47
								8	0,434	1974,0	5,066·10^-4	0,0633	25,3·10^-4	0,317	3,16
								9	0,563	2632,0	3,799·10^-4	0,0857	34,3·10^-4	0,429	2,33
								10	0,646	3421,0	2,923·10^-4	0,1002	40,1·10^-4	0,501	2

• Sporządzamy wykresy v_sp= f([s])

Wykres f([1/s])

Odczytane z wykresu:

-1/Km = -0,001743429 ->>>> Km=573,72 [μM]

1/Vmax = 1,58 ->>>Vmax = 0,623 [ μmol/mg*min]

Kinetyka enzymatyczna II

Obliczenie masy fosfatazy w mieszaninie poreakcyjnej.

Objętość w mieszaninie reakcyjnej V=1,9 ml

Stężenie fosfatazy c= 0,08 mg/ml

Objętość fosfatazy : Ve =0,1 ml

Masa fosfatazy : 0,08 mg/ml * 0,1 ml = 0,008 mg

Stężenie inhibitora w mieszaninie poreakcyjnej:

Obliczenia umieszczone w tabeli

Wykres zalezności Vsp=f(s)

Wykres zależnośc 1/Vsp = f(1/S)

Odczytane z wykresu

-1/Km'=-0,000086159 Km'=11606,44 uM

-1/Km=-0,001436918 Km=695,94 uM

1/V'max=1,45 V'max=0,689655172 umol/mg*min

1/Vmax=2,58 Vmax =0,387596899 umol/mg*min

Na podstawie Km,KM' Vmax, Vmax' można stwierdzić iż jest to hamowanie konkurencyjne , gdyż stała Km została zwiększona pod wpływem inhibitora.

Otrzymujemy stałą hamowania

௄೘

Ki =263,16/15,67=16,79 uM

Wnioski:

Wykreślone zależność odwrotności szybkości katalizowanej reakcji od odwrotności stężenia substratu wykazały zgodność z założeniami aktywności enzymatycznej.

Do wykreślonych zależnośći , należało pominąć 3 ostatnie pomiary ,gdyż były one błedne

Doświadczenie wykazało nastepujące wartości stałych Km I Vmax

Km - 573,72 [uM] Vmax = 0,623 [ μmol/mg*min]

Wyznaczone stałe Km oraz Vmax wykazały, że przechowywany enzym nie stracił swej aktywnośc.Aktywności ich rózniła się nieznacznie.

Km- 695,45 [uM[ Vmax - 695,45 [umol/mg*min]

W drugim doświadczeniu wyznaczaliśmy stałą hamowania.Wyznaczyliśmy wartości Vmax' Vmax Km Km' przedstawione w tabeli powyżej.Wyniki te potwierdzają iż inhibitor wpływa na aktyność enzymu.Stałe Km, K' oraz wartości Vmax , Vmax' świadczą jakby w naszym doświadczeniu widoczne było hamowanie konkurencyjne (zwiększona wartość Km , niezmienne Vmax) I hamowanie niekonkurencyjne (zmniejszona wartość V'max o 1+[I]/Ki i niezmienna Km' o 1+[I]/Ki).W naszym przypadku zmniejszyła się wartośc V'max I zwiększyła Km').Ze względu na większą róznicę stałych Km wyznaczyliśmy stałą hamowania Ki dla typu konkurencyjnego , która wyniosła Ki =16,79 uM

---