Biochemia I Laboratorium

Ćwiczenie A

WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA

I SZYBKOŚCI MAKSYMALNEJ

Prowadzący:

Mgr inż. Agnieszka Szamborska

Data wykonania ćwiczenia: 7 marca 2008

Data wykonania sprawozdania: 8 marca 2008

Piątek 12:15

Justyna Budzicz 152049

Olga Mielczarek 153881

1. CEL ĆWICZENIA

Wyznaczenie stałej Michaelisa i szybkości maksymalnej dla reakcji fosfatazy kwaśniej z ziemniaka dla reakcji:

H₂O

p-nitrofenylofosforan p-nitrofenol + H₃PO₄

fosfataza

Metoda:

Szybkość określono na podstawie spektrofotometrycznego oznaczenia ilości produktu.

Odczynniki:

• Roztwór fosfatazy w buforze

• Roztwór p-nitrofenolu w buforze (standard)

• 5.0mM Roztwór p-nitrofenylofosforanu

• 0.25M bufor octanowy o pH 5.0

• 0.5M NaOH

Szkło laboratoryjne i aparatura:

• 29 probówek chemicznych

• Pipety miarowe

• Kuwety szklane

• Łaźnia wodna 37°C

• Spektrofotometr

2. PRZEBIEG ĆWICZENIA

1) Pomiar szybkości reakcji w funkcji substratu

a) Roztwór fosfatazy przeniesiono na lód.

b) Do probówek 1-11 dodano zgodnie z tabelą 2:

- 0.25M buforu octanowego o pH 5.0

- 5.0mM p-nitrofenolofosforanu (substrat).

c) Inkubowano mieszaniny 1-11 przez 5 minut w łaźni wodnej 37°C, aby stworzyć warunki optymalne dla dodania fosfatazy.

d) Po wyjęciu probówek z łaźni, do nieprimowanych probówek dodano po 0.10ml fosfatazy.

e) Probówki 1-11 inkubowano przez 25 minut w łaźni 37°C w celu zapewnienia fosfatazie optymalnych warunków do przeprowadzenia reakcji enzymatycznej dla uzyskania maksymalnych ilości produktu w każdej z probówek.

f) W tym czasie wyznaczono krzywą standardową (punkt 2).

g) Po 25 minutach do probówek 1-11 dodano po 2ml 0.5M NaOH w celu przerwania reakcji. (NaOH powoduje denaturację enzymu, wprowadzając alkaliczne pH).

h) Zmierzono absorbancję roztworów 1-10 przy długości fali 410nm używając próby 11 jako odnośnika, a wyniki zamieszczono w tabeli 2.

2) Wyznaczenia krzywej standardowej

a) 200μl 5.0mM roztwory p-nitrofenolu przeniesiono do kolbki i dopełniono do 10ml buforem octanowym o pH 5.0. Dokładnie wymieszano roztwór w kolbie.

b) Do probówek 1-8 dodano zgodnie z tabelą 1:

- 0.25M buforu octanowego o pH 5.0

- 0.1mM p-nitrofenolu w buforze (standard)

- 0.5M NaOH

c) Zmierzono absorbancję prób 1-7 przy długości fali 410nm, używając próby 8 jako odnośnika.

3. OBLICZENIA

• Stężenie fosfatazy w mieszaninie reakcyjnej:

• Stężenie p-nitrofenolu, którego użyto do sporządzenia krzywej standardowej:

• Obliczono stężenia p-nitrofenolofosforanu [S] oraz 1/[S]

Przykładowe obliczenia dla próbki nr 1:

• Na podstawie krzywej standardowej obliczono V (liczność powstającego produktu (w μmol) w czasie 25min)

podstawiając kolejne wartości A_kor do równania krzywej standardowej

y=A_kor

x=V

y=4.4643x+0.02

Przykładowe obliczenia dla próbki nr 1:

y=0.095

• Obliczono szybkość reakcji, czyli ilość p-nitrofenolu powstałego w czasie 1min (V_c):

Przykładowe obliczenia dla próbki nr 1:

• Obliczono ilość mikromoli produktu przekonwertowanego przez 1mg enzymu w czasie 1 minuty (V_sp), a następnie 1/V_sp

Przykładowe obliczenia dla próbki nr 1:

• Krzywa 1/V_sp = f(1/S) jest opisana równaniem y = 368.44x + 0,2384 (y=ax+b)

• Miejsce zerowe funkcji 1/V_sp = f(1/S) (punkt przecięcia się krzywej z osią OX), czyli wartość 1/[S] dla którego 1/V_sp=0, wynosi 1/[S]= -0,0006471 [1/μmol]

V_max to punkt przecięcia się krzywej z osią OY, czyli punkt dla którego 1/S=0)

• Obliczono V_max i K_m:

V_max=

K_m= 1545 [μM]

4. WYNIKI

Tabela 1.

Próbka (nr)	Bufor [ml]	p-nitrofenol [ml]	p-nitrofenol [μmol]	NaOH [ml]	A410
1	1.700	0.200	0.020	2	0.090
2	1.500	0.400	0.040	2	0.210
3	1.300	0.600	0.060	2	0.300
4	1.100	0.800	0.080	2	0.380
5	0.900	1.000	0.100	2	0.470
6	0.700	1.200	0.120	2	0.550
7	0.500	1.400	0.140	2	0.640
8	1.900	0.000	0.000	2	odnośnik

Wykres 1.

Krzywa standardowa została opisana równaniem y=4.4643x+0.02

Tabela 2.

Probówka (nr)	Bufor [ml]	Substrat [ml]0	Enzym [ml]	NaOH [ml]	A410	ΔA410(kor)
1	1.750	0.050	0.100	2	0.095	0.095
1'	1.850	0.050	-	2	0.000
2	1.700	0.100	0.100	2	0.200		0.190
2'	1.800	0.100	-	2	0.010
3	1.650	0.150	0.100	2	0.270		0.266
3'	1.750	0.150	-	2	0.004
4	1.600	0.200	0.100	2	0.330		0.325
4'	1.700	0.200	-	2	0.005
5	1.500	0.300	0.100	2	0.480		0.470
5'	1.600	0.300	-	2	0.010
6	1.350	0.450	0.100	2	0.590		0.575
6'	1.450	0.450	-	2	0.015
7	1.200	0.600	0.100	2	0.575		0.555
7'	1.300	0.600	-	2	0.020
8	1.050	0.750	0.100	2	0.630		0.605
8'	1.150	0.750	-	2	0.025
9	0.800	1.000	0.100	2	0.790		0.760
9'	0.900	1.000	-	2	0.030
10	0.500	1.300	0.100	2	0.80		0.759
10'	0.600	1.300	-	2	0.0410
11	1.800	-	0.100	2	odnośnik

A_/kor/ = A₄₁₀ - A'₄₁₀

Tabela 3.

Probówka (nr)	ΔA410 (kor)	[S] [μM]	1/[S] [1/μM]	V [μmol/25min]	Vc [μmol/min]	Vsp [μmol/mgb⋅min]	1/Vsp [min⋅mgb/μmol]
1	0.095	64.100	0.01560	0.01679	0.000672	0.1596	6.2656
2	0.190	128.200	0.00780	0.03808	0.001523	0.3617	2.7647
3	0.266	192.300	0.00520	0.05510	0.002204	0.5235	1.9102
4	0.325	256.400	0.00390	0.06832	0.002733	0.6492	1.5404
5	0.470	384.500	0.00260	0.10079	0.004032	0.9577	1.0442
6	0.575	576.900	0.00173	0.12432	0.004972	1.1809	0.8468
7	0.555	769.200	0.00130	0.11984	0.004794	1.1387	0.8782
8	0.605	961.500	0.00104	0.13104	0.005242	1.2451	0.8031
9	0.760	1282.100	0.00078	0.16576	0.006630	1.5748	0.6350
10	0.759	1666.600	0.00060	0.16554	0.006622	1.5729	0.6357

Wykres 2.

Wykres 3.

Krzywa 1/V_sp = f(1/S) jest opisana równaniem y = 368.44x + 0,2384 (y=ax+b)

5. WNIOSKI

• Cel ćwiczenia został zrealizowany w 100%, gdyż doświadczenie to pozwoliło na wyznaczenie szukanych V_max oraz K_m dla reakcji hydrolizy p-nitrofenylofosforanu do p-nitrofenol prowadzonej przez fosfatazę kwaśną z ziemniaka.

• W warunkach optymalnych fosfataza kwaśna z ziemniaka konwertuje p-nitrofenylofosforan do p-nitrofenolu z szybkością maksymalną równą 4.1946 [μmol/mg_białka⋅min]

• Stała K_m dla tego enzymu w warunkach optymalnych wynosi 1545 [μM], czyli przy stężeniu substratu równym 1545 [μM] szybkość reakcji enzymatycznej równa się połowie szybkość maksymalnej. K_m jest miarą powinowactwa enzymu do substratu, dlatego też można obliczyć szybkość maksymalną reakcji przy określonej ilości enzymu i nadmiarze substratu, obserwując wysycanie całego enzymu substratem.

• Enzym ten jest enzymem zachowującym się zgodnie z modelem Michaelisa-Menten, ponieważ, jak wynika z wykresu 2 i 3 szybkość reakcji przez niego prowadzonej osiąga wartość maksymalną po całkowitym wysyceniu enzymu substratem.

• Reakcję prowadzono w warunkach optymalnych dla fosfatazy, co pozwoliło zaobserwować maksymalną wydajność reakcji przez nią katalizowanej.

9

---