Biochemia I Laboratorium

Ćwiczenie K

PROFIL TOPNIENIA DNA Z GRASICY CIELĘCEJ

Prowadzący:

Mgr inż. Agnieszka Szamborska

Data wykonania ćwiczenia: 18 kwietnia 2008

Piątek 12:15

Justyna Budzicz 152049

Olga Mielczarek 153881

1. CEL ĆWIECZENIA

Wyznaczenie temperatury topnienia oraz zawartości par G-C DNA z grasicy cielęcej.

2. PRZEBIEG ĆWICZENIA

Odczynniki:

0.1M roztwór SSC (1.5∙10^-2M NaCl w 1.5∙10^-3M cytrynianie trójsodowym o pH=7)

Olej parafinowy

Próbka DNA w 0.1M SSC

Włączono spektrofotometr, włączono lampę UV, założono papier rejestracyjny, ustawiono długość fali 260nm. W celu ustawienia zero aparatu dwie kuwety kwarcowe napełniono po 2ml 0.1M roztworem SSC i ustawiono pisak rejestracyjny w pozycji `'0'' papieru rejestracyjnego. W jednej kuwecie pozostawiono SSC jako odnośnik, a drugą napełniono 2ml otrzymanego roztworu DNA. Na powierzchnie cieczy w obu kuwetach nawarstwiono olej parafinowy dodając po 1 kropli w każdy róg kuwety. Olej zapobiega parowaniu zawartości kuwet. Kuwety wstawiono w uchwyty spektrofotometru. Do sieci oraz instalacji wodnej podłączono ultratermostat. Przeprowadzono denaturacje DNA, w tym celu ustawiono mieszanie + grzanie. Następnie przeprowadzono renaturację DNA, w tym celu ustawiono mieszanie + dopływ wody chłodzącej do holdera na kuwety i schładzanie próbki oraz odnośnika. Na papierze rejestracyjnym zaznaczano temperatury od 60°c do 90°C co 2,5 stopnia, a następnie podczas renaturacji od 90°C do 20°C.

3. OBLICZENIA

• Założenie E₂₆₀^25°C = E₂₆₀^60°C

• Odczytano temperaturę topnienia DNA z wykresu 1

Tm=82°C

• Odczytano temperaturę topnienia DNA z wykresu 2

Tm=82°C

• wyznaczono szerokość przejścia temperaturowego

ΔT: od 77,5°C do 95°C

• Obliczono procentową zawartość par G-C

G-C=2,44⋅(Tm-69,3)=38,3%

• Hiperchromizm H_λ = 1 - (E_spirali)/(E_kłebka) = 1 - (0,710)/(0,950) = 0,253

• Procentowa wielkość renaturacji

0,950 - 0,710 = 0,240

0,240/100 = 0,0024 - jest to 1%

Poniższe wartości odczytano w wykresu na papierze rejestracyjnym jako najwyższy punkt denaturacji i najniższy punkt renaturacji (zakończenie ćwiczenia): 0,950 - 0,845 = 0,105

0,105/0,0024 = 43,75

procentowa wielkość renaturacji wynosi 43,57%

4. WYNIKI

Tabela A.

Temperatura [°C]	E260	E260^temp. - E260^25^°^C	ΔE260
60	0,710	0	0
62,5	0,710	0
65	0,710	0		0
67,5	0,710	0
70	0,710	0		0
72,5	0,710	0
75	0,710	0		0,030
77,5	0,740	0,030
80	0,780	0,070		0,040
82,5	0,840	0,130
85	0,870	0,160		0,030
87,5	0,900	0,190
90	0,920	0,210		0,020
92,5	0,940	0,230
95	0,950	0,240		0
97,5	0,950	0,240
100	0,950	0,240		0
102,5	0,950	0,240

Tabela B.

Temp. [°C]	Temp. średnia	Δtemp.	ΔE260	ΔE260/Δtemp.
60	61,25	2,5	0	0
62,5
65					66,25	2,5	0	0
67,5
70					71,25	2,5	0	0
72,5
75					76,25	2,5	0,030	0,012
77,5
80					81,25	2,5	0,040	0,016
82,5
85					86,25	2,5	0,030	0,012
87,5
90					91,25	2,5	0,020	0,008
92,5
95					96,25	2,5	0	0
97,5
100					101,25	2,5	0	0
102,5

Wykres 1.

Wykres 2.

5. WNIOSKI

• Cel ćwiczenia został zrealizowany.

• Denaturacja i renaturacja DNA powiodła się. DNA ulega denaturacji pod wpływem podwyższonej temperatury, nici ulegają rozpleceniu, ekstynkcja przy długości fali 260nm rośnie. Przy obniżaniu temperatury DNA ulega renaturacji, paruje ponownie, co powoduje spadek wartości ekstynkcji.

• Temperatura topnienia Tm DNA wynosi 82°C, co odczytano z wykresu.

• Szerokość przejścia temperaturowego wynosi od 77,5°C do 95°C, co odczytano z wykresu.

• Zawartość par G-C wynosi 38,3%

• Procentowa wielkość renaturacji wynosi 43,57%. Nie jest ona zbyt wysoka, gdyż ćwiczenie nie było wykonywanie dostatecznie długo, w związku z czym próbka nie była chłodzona dostatecznie wolno, aby renaturacja mogła przebiec w całości. Poprawna renaturacja powinna przebiegać powoli, przy powolnym przepływie wody chłodzącej, aby DNA mogło parować z powrotem z naturalną szybkością.

• Przebieg krzywych denaturacji i renaturacji zależy od szybkości przeprowadzenia eksperymentu oraz od częstotliwości i dokładności zaznaczania wyników na wykresie na papierze rejestracyjnym. Ćwiczenie przeprowadzone poprawnie trwałoby o wiele dłużej, pozwalając nici DNA na bardzo powolną denaturacje i renaturację, wtedy wykresy były by równiejsze, wykres B byłby symetryczny.

• Z wykresu B można odczytać ΔT z większą dokładnością, gdyż mamy tam wartości średnie ekstynkcji ΔT jest wyznaczone przez miejsca zerowe funkcji, możemy je nawet obliczyć z równania krzywej. (Nie rozumiem tylko dlaczego krzywa wykresu B przy miejscach zerowych schodzi w dół, na wartości ujemne, chyba tak nie powinno być, to jakieś fanaberie Excela, żeby krzywa szła płynniej).

• Hiperchromizm wynosi 0,253. Hiperchromizm to zjawisko zwiększania absorbancji światła przez DNA w miarę jego denaturacji.

6

Tm ΔT

ΔT

ΔT

---