Strona 1 z 4
Sprawozdanie 5.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/10
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie G
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Chromatografia żelowa
Grupa: IV
Wstęp
Chromatografia żelowa jest metodą rozdziału próbki na poszczególne składniki. Poprzez przepuszczenie roztworu próbki przez żel, który przemywa się eluentem. Chromatografia jest prowadzona w pionowej kolumnie, gdzie u góry umieszcza się próbkę i oddaje eluentu, a u dołu obiera poszczególne frakcje. Chromatografia może służyć zarówno do oznaczania jakościowego jak i ilościowego. Dokładność rozdziału próbki zależy od użytego wypełniania kolumny. Nie powinno ono reagować z rozdzielaną mieszaniną. Wielkość grudek żelu i stopień usieciowana są różne. Wypełnienie kolumny powinno być homogeniczne (jednorodne). Ważne jest utrzymanie stałej temperatury i odpowiedniego pH.
Żele wypełniające kolumnę są zbudowane z porowatych grudek, do których swobodnie wnika rozpuszczalnik. Istotą chromatografii żelowej jest rozdział składników mieszaniny względem wielkości cząsteczkowej. Większe cząsteczki nie mogą wniknąć do grudek więc wędrują w dół
kolumny najszybciej. Mniejsze cząsteczki częściowo wnikają do grudek, co spowalnia ich wędrówkę w dół kolumny. Najmniejsze cząsteczki są w stanie wnikną i wypełnić praktycznie całą przestrzeń wewnętrzną grudek żelu, one wędrują najwolniej. Są obierane jako ostatnie frakcje. Chcąc stwierdzić zawartość danego składnika w zebranej frakcji bada się absorbancję przy odpowiednio dobranej, charakterystycznej, długości fali stosując metody kolorymetryczne.
Celem ćwiczenia będzie rozdzielenie mieszaniny zawierającej: Blue Dextran (2000 kDa), Cytochrom C (12 kDa) i chromian potasu (194 Da). Stosując chromatografię w kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-25 wykreślić profilu elucji. Wykres powinien przedstawiać zależności objętości eluentu od absorbancji frakcji. Blue Dextran ma maksymalną absorbancję przy fali długości 620 nm, natomiast Cytochrom C i chromian potasu przy 410 nm. Wyznaczyć dostępne współczynniki podziału Cytochromu C i chromianu potasu.
Współczynnik ten jest wielkością bezwymiarową oznaczającą jaka część wewnętrznej objętości grudki żelu może być wypełniona przez rozdzielaną substancję. Jest różny dla różnych kolumn, żeli, czy też rozdzielanych związków.
Dostępny współczynnik podziału
(1)
gdzie:
oznacza dostępny współczynnik podziału,
oznacza objętość elucji, tj. taka objętość rozpuszczalnika, która jest niezbędna na wymycia frakcji zawierającej maksymalne stężenie danego składnika próbki,
oznacza objętość zerową kolumny, tj. objętość rozpuszczalnika we wnętrzu kolumny, tutaj jest równa objętości elucji Blue Dextranu.
objętość całkowita kolumny
Strona 2 z 4
Sprawozdanie 5.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/10
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie G
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Chromatografia żelowa
Grupa: IV
Materiały
a) Odczynniki:
mieszanina Blue Dextranu, Cytochromu C i chromianu potasu – próbka,
Sephadex G-25 – żel,
Bufor TRIS 0,1 M NaCl o pH 7,5 – eluent.
b) Szkło laboratoryjne:
probówki chemiczne (30 szt.),
cylinder miarowy 250 ml (1 szt.),
zlewka 250 ml (2 szt.),
pipeta 2 ml (1 szt.),
c) Aparatura:
fotokolorymetr „Specol” (1 szt.),
kuwety szklane do „Specola” (2 szt.),
kolumna chromatograficzna (1 szt.),
statyw (1 szt.),
nożyczki (1 szt.), wata szklana, bibuła.
Wykonanie
Ćwiczenie przeprowadzono zgodnie z treścią instrukcji „G”.
1. Przygotowano 20 ponumerowanych probówek, do których pobierane będą frakcje z kolumny oraz wycięty z bibuły krążek wielkości przekroju poprzecznego kolumny.
2. Kolumnę umieszczono na statywie dokładnie w pozycji pionowej.
3. Zamknięto wypływ kolumny za pomocą nasadki na końcówkę wężyka i napełniono ją do 1/3
wysokości eluentem.
4. Za pomocą bagietki umieszczono na dnie kolumny mały kłębek waty szklanej.
5. Przytrzymując watę bagietką, powoli wlewano do kolumny zamieszaną zawiesinę Sephadexu.
6. Wężyk wypływu umieszczono w małej zlewce i otwarto wypływ kolumny.
7. W miarę osiadania złoża, dolewano zawiesinę Sephadexu i upakowywano kolumnę do wysokości ok. 3 cm przed jej szczytem.
8. Zamknięto wypływ kolumny, poczekano do momentu opadnięcia całej objętości złoża.
9. Na wierzchu żelu umieszczono za pomocą pęsety i bagietki wycięty z bibuły krążek.
10. Podłączono do kolumny naczynie z eluentem, które ustawiono powyżej poziomu kolumny.
11. Powietrze znajdujące się w wężyku doprowadzającym eluent do kolumny zassano przy użyciu strzykawki.
12. Ustawiono przepływ kolumny na ok. 20 ml na godzinę zmieniając wysokości wylotu wężyka, przepłukano jednocześnie kolumnę eluentem.
13. Zamknięto wypływ kolumny i zaznaczono pisakiem poziom upakowanego złoża.
14. Odłączono kolumnę od naczynia z eluentem.
15. Ostrożnie zebrano pipetą warstwę eluentu znad krążka.
16. Otrzymaną próbkę ostrożnie naniesiono na żel za pomocą pipety.
17. Otworzono wypływ kolumny tylko na czas wniknięcia próbki do wierzchniej warstwy żelu i ponownie zamknięto wypływ kolumny, żeby Sephadex nie wysechł.
18. Pipetą naniesiono na złoże co najmniej 2 cm warstwę eluentu.
19. Podłączono naczynie z eluentem do kolumny.
20. Wężyk wypływu kolumny umieszczono w cylindrze miarowym o pojemności 10 ml.
21. Otwarto wypływ kolumny i zbierano eluent do cylindra do momentu przeniknięcia barwnych składników próbki do dna kolumny.
22. Sprawdzono objętość eluentu zebranego do cylindra i zapisano do zeszytu .
23. Przełożono wężyk z cylindra do pierwszej próbki chemicznej i rozpoczęto zbieranie frakcji do analizy metodą kolorymetryczną.
Strona 3 z 4
Sprawozdanie 5.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/10
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie G
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Chromatografia żelowa
Grupa: IV
24. Zbierano do przygotowanych probówek 2 ml frakcje z kolumny aż do pobrania ostatniej barwnej frakcji.
25. Po pobraniu ostatniej barwnej frakcji, przełożono wężyka wypływu do zlewki i zwiększono przepływ kolumny w celu wypłukania ze złoża ewentualnych resztek próbki.
26. Zmierzone wartości absorbancji poszczególnych frakcji umieszczono w tabeli 1.
27. Zamknięto wypływ kolumny. Odłączono naczynie z eluentem. Zdjęto kolumnę ze statywu.
28. Pomagając sobie bagietką, wypłukano za pomocą eluentu złoże z kolumny do czystej zlewki, uważając, by nie zaplątać w grudki żelu kłębka waty szklanej z dna kolumny.
29. Watę wyrzucono, a czyste złoże wlano do kolby, w której się początkowo znajdowało.
30. Zamknięto wypływ pustej kolumny i wlano do niej wodę destylowaną – do poziomu wcześniej zaznaczonego pisakiem.
31. Włożono wężyk kolumny do cylindra miarowego i otwarto wypływ kolumny, mierząc objętość wypływającej wody przepłukującej kolumnę i wężyk. Zapisano do zeszytu .
Wyniki
Tabela 1. – Wartości absorbancji poszczególnych frakcji
frakcja
Vf*
Ve
A620
A410
/nr/
/ml/
/ml/
1
2,00
10,30
0,07
-
2
2,00
12,30
0,59
-
3
2,00
14,30
0,245
-
4
2,00
16,30
0,075
-
5
2,00
18,30
0,025
0,51
6
2,00
20,30
0,015
0,76
7
2,00
22,30
0,015
0,98
8
2,00
24,30
0,010
0,92
9
2,00
26,30
0,005
0,72
10
2,00
28,30
0,000
0,60
11
2,00
30,30
-
0,77
12
2,00
32,30
-
1,3
13
2,00
34,30
-
1,2
14
2,00
36,30
-
1,0
15
2,00
38,30
-
0,77
16
2,00
40,30
-
0,52
17
2,00
42,30
-
0,25
18
2,00
44,30
-
0,12
19
2,00
46,30
-
0,05
20
2,00
48,30
-
0,02
* objętość zbieranych frakcji wynosiła 2 cm
Strona 4 z 4
Sprawozdanie 5.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/10
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie G
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Chromatografia żelowa
Grupa: IV
Wykres 1. – Profil elucji
1,40
1,20
1,00
cjan 0,80
a
rb
so 0,60
bA
0,40
0,20
0,00
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
50,0
V [ml]
e
Zmierzono objętość frakcji zerowej:
8,30 cm
Wyznaczono objętość elucji Blue Dextranu:
8,30 cm 4,00 cm 12,30 cm
…jest równa objętości zerowej kolumny:
12,30 cm
Zmierzono całkowitą objętość kolumny:
30,00 cm
Wyznaczono objętość elucji i obliczono (1) dostępny współczynnik podziału dla Cytochrom C:
22,30 cm
22,30 12,30
0,565
30,00 12,30
Wyznaczono objętość elucji i obliczono (1) dostępny współczynnik podziału dla chromianu potasu:
32,30 cm
32,30 12,30
1,130
30,00 12,30
Wnioski
Wejściowa próbka miała kolor ciemnozielony. W wyniku przeprowadzonej chromatografii żelowej rozdzielono ją na trzy składniki. Pierwszym wymytym był Blue Dextranu koloru niebieskiego, o największej masie cząsteczkowej. Drugą substancją był Cytochrom C koloru pomarańczowego. Trzecią i ostatnią wymytą substancją był chromian potasu koloru żółtego.
Odbierano substancje zgodnie z oczekiwaniami, malejąco względem masy cząsteczkowej.
Uzasadnieniem liczby rozdzielonych substancji jest wykres 1. przedstawia zależność absorbancji (przy dwóch różnych długości fali) od objętości elucji. Charakteryzuje się trzema wyraźnymi maksimami, które odpowiadają kolejnym rozdzielanym składnikom.
Wyznaczono dwa dostępne współczynniki podziału, dla Cytochromu C wynosi: 0,565, natomiast drugi wyliczony dla chromianu potasu 1,130. W rzeczywistości wartość
nie może przekroczyć 1, ponieważ rozdzielona substancja może maksymalnie tylko w 100%
wypełnić objętość wnętrza grudek żelu.