3. PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM
Każdy preparat mikroskopowy musi spełniać trzy podstawowe warunki:
• musi być przejrzysty (oglądany jest w świetle przechodzącym), czyli odpowiednio cienki. Grubość preparatu nadającego się do rutynowego mikroskopowania nie powinna przekraczać 20 μm, a najlepszą jakość obrazu mikroskopowego uzyskuje się przy preparatach możliwie najcieńszych;
• powinien być odpowiednio skontrastowany (zabarwiony) w celu zróżnicowania występujących w nim struktur;
• struktura komórek i tkanek w preparacie winna być jak najbardziej zbliżona do struktury tkanki żywej, gdyż tylko wówczas uzyskane z obrazu mikroskopowego informacje mogą być wiarygodne.
Przygotowanie materiału biologicznego do badań mikroskopowych, będące niekiedy długą i skomplikowaną procedurą, podporządkowane jest właśnie tym warunkom.
3.1. Rodzaje preparatów mikroskopowych
Do preparatów mikroskopowych sporządzanych z materiałów biologicznych należą:
• skrawki: uzyskane przez pokrojenie materiału na cienkie "plasterki";
• szlify: uzyskane przez zeszlifowanie tkanek twardych (zmineralizowanych) na bardzo cienkie płytki;
• rozmazy: wykonywane z płynów ustrojowych, w których obecne są wolno zawieszone komórki (krew, punktat szpiku krwiotwórczego, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyny wysiękowe), a także z zawiesin komórkowych uzyskanych w badaniach biochemicznych. Kroplę takiego płynu rozprowadza się na szkiełku podstawowym w taki sposób, aby zawarte w nim komórki utworzyły pojedynczą warstwę. W diagnostyce histopatologicznej wykonuje się rozmazy z materiału pobranego ze śluzówek (jama ustna, nosowo-gardłowa, pochwa) oraz z wydzielin (wydzielina oskrzelowa);
• rozgnioty: uzyskiwane poprzez zgniecenie komórek pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym (stosowane jedynie do szczególnych badań, np. analizy chromosomów);
• odciski narządowe: wykonywane poprzez przekrojenie narządów lub ich fragmentów i odciśnięcie powierzchni przekroju na szkiełku podstawowym. Do szkiełka przywierają komórki luźno związane ze swym otoczeniem;
• preparaty całościowe (ang. whole mounts): położone na szkiełko całe fragmenty tkanek lub narządów - zazwyczaj są to wypreparowane warstwy ścian wewnętrznych przewodów (np. warstwa mięśniowa cewy pokarmowej), w których bada się przestrzenny układ włókien nerwowych lub sieci naczyniowych. Taki preparat musi być wystarczająco cienki, aby mogło przezeń przechodzić światło;
• hodowle komórkowe: hodowane w odpowiednich warunkach komórki mogą osadzać się na podłożu (np. szkiełku mikroskopowym), gdzie się namnażają tworząc pojedynczą warstwę (ang. monolayer). W tej postaci mogą być oglądane pod mikroskopem.
W praktyce najczęściej używane są skrawki i rozmazy.
3.2. Pobieranie materiału
Przy pobieraniu materiału należy zwrócić uwagę na dwie zasadnicze sprawy:
• fragment pobranej tkanki powienien być stosunkowo niewielki (do celów mikroskopii świetlnej przynajmniej jeden wymiar nie powinien przekraczać 5 mm, a do celów mikroskopii elektronowej 1 mm), aby zapewnić dobrą i możliwie szybką penetrację płynów stosowanych w dalszych etapach procedury (utrwalacz, płyny odwadniające i pośrednie); przy pobraniu większego fragmentu należy go przed utrwaleniem pokroić na mniejsze kawałki;
• jeżeli materiał pochodzi od uprzednio zabitego zwierzęcia laboratoryjnego, pobranie materiału powinno się odbyć za życia lub natychmiast po śmierci zwierzęcia, aby zapobiec zmianom rozkładowym w tkankach. Z tego samego powodu, jeżeli po pobraniu materiału trzeba go gdzieś przetransportować, należy użyć do tego celu pojemnika z lodem.
3.3. Utrwalanie
Procedura ta, jak sugeruje jej nazwa, ma "utrwalić" strukturę badanego materiału w jego pierwotnej postaci i nie dopuścić do zmian, które mogłyby tę strukturę zniekształcić.
3.3.1. Cele utrwalania
Utrwalanie materiału ma na celu:
• natychmiastowe zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, przede wszystkim poprzez denaturację enzymów. Można w ten sposób zapobiec zmianom autolitycznym, czyli samostrawieniu komórek przez ich własne enzymy lizosomowe, oraz wtórnym zmianom rozkładowym i gnilnym wywołanym przez obecne w materiale lub zawleczone z zewnątrz bakterie;
• związanie i wytrącenie (precypitację) niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych, co zapobiega ich późniejszej dyfuzji i umożliwia uwidocznienie;
• wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności na działanie odczynników używanych w dalszych etapach procedury;
• niekiedy również poprawę optycznego zróżnicowania tkanki poprzez wywołanie w niej reakcji chemicznych ułatwiających późniejsze barwienie.
Niewątpliwie najistotniejsze znaczenie mają trzy pierwsze cele utrwalania i prawie wszystkie utrwalacze spełniają zawarte w pierwszych trzech punktach warunki. Umożliwiają one zachowanie w utrwalonym materiale struktury możliwie najbardziej zbliżonej do naturalnej struktury żywych komórek i tkanek.
3.3.2. Rodzaje utrwalaczy
Utrwalanie możemy podzielić na chemiczne i fizyczne. Do utrwalaczy chemicznych należą (w nawiasach podano najczęściej stosowane stężenia):
• aldehydy: formaldehyd (aldehyd mrówkowy, formalina - 2-10%), aldehyd glutarowy (1,5-6,0%), akroleina (10%);
• alkohole: etylowy i metylowy (50-100%);
• ketony: aceton (50-100%);
• kwasy organiczne i nieorganiczne: kwas octowy (50-100%), kwas pikrynowy (1%), kwas chromowy (2%), kwas taninowy (1%);
• związki metali ciężkich: chlorek rtęci (sublimat - 5-7%), dwuchromian potasu (2,5-5,0%), czterotlenek osmu (0,5-2,0%)
Utrwalacze chemiczne podzielić można na proste, czyli jednoskładnikowe oraz złożone, będące mieszaniną dwóch lub kilku utrwalaczy prostych oraz niekiedy innych substancji. Do najczęściej stosowanych utrwalaczy złożonych należą np.: utrwalacz Bouina (kwas pikrynowy i formalina), utrwalacz Carnoya (alkohol etylowy, chloroform i kwas octowy), i utrwalacz Zenkera (sublimat, dwuchromian potasu, kwas octowy, siarczan sodu).
Rozpuszczalnikiem w roztworach utrwalaczy może być woda, bufory o określonym pH i sile jonowej, a w niektórych przypadkach również alkohole.
Utrwalanie fizyczne polega na oddziaływaniu na materiał mikrofalami lub promieniowaniem jonizującym.
3.3.3. Metody utrwalania
A. Utrwalanie immersyjne polega na zanurzeniu fragmentu tkanki w utrwalaczu na pewien okres (od 1 godz. do kilku dni). Jest to najprostszy sposób utrwalania, posiadający jednak dość istotną wadę. Utrwalacz przenika bowiem do tkanki z zewnątrz z określoną szybkością, zależną od jego rodzaju: najszybciej penetrują utrwalacze bezwodne, np. alkohol czy aceton, a najwolniej związki metali ciężkich. W związku z tym, przy większych fragmentach utrwalonej w ten sposób tkanki, uwidaczniają się w niej strefy różniące się stopniem zachowania struktury. Strefa obwodowa, do której utrwalacz przenika najszybciej, zostaje utrwalona prawie natychmiast i w pełni. Do strefy pośredniej utrwalacz dociera z pewnym opóźnieniem, co może sprzyjać powstawaniu artefaktów związanych z procesami autolitycznymi. Wreszcie strefa centralna, do której utrwalacz przenika najpóźniej, jest najbardziej podatna na procesy destrukcji i jej struktura może w znacznym stopniu odbiegać od stanu naturalnego. Właśnie dlatego przy tej metodzie utrwalania istotne są małe rozmiary utrwalanego fragmentu tkanki.
B. Utrwalanie perfuzyjne polega na wypreparowaniu całego narządu lub jego głównych naczyń krwionośnych. Następnie do tętnicy doprowadzającej krew podłącza się kaniulę, przez którą tłoczona jest najpierw sól fizjologiczna, aby wypłukać krew z łożyska naczyniowego, a potem utrwalacz pod ciśnieniem zbliżonym do fizjologicznego. Przy równoczesnym otwarciu głównego naczynia żylnego stwarza się w ten sposób sztuczne krążenie - z tym, że zamiast krwi przepływa przez łożysko naczyniowe utrwalacz. Biorąc pod uwagę znaczną gęstość sieci naczyniowej (zwłaszcza naczyń włosowatych) w każdym narządzie, jest rzeczą oczywistą, że w tych warunkach utrwalacz dociera natychmiast do każdego rejonu narządu i przenikając przez ściany naczyń krwionośnych utrwala tkankę w sposób równomierny i bardzo szybko. Co za tym idzie, czas utrwalania perfuzyjnego może być krótki (5-15 min). Ta metoda utrwalania zapewnia najdoskonalsze zachowanie struktury komórek i tkanek i dlatego jest szeroko stosowana zwłaszcza w mikroskopii elektronowej.
C. Utrwalanie przy użyciu mikrofal zyskało sobie w ostatnich latach znaczną popularność z uwagi na prostotę i krótkotrwałość procedury oraz na bardzo dobre zachowanie struktury materiału. Mikrofale są falami elektromagnetycznymi o długości od 0,3 mm do 30 cm, a zatem stanowią odcinek widma elektromagnetycznego pomiędzy promieniowaniem podczerwonym a falami radiowymi.
Procedurę utrwalania przeprowadza się w komercyjnie dostępnych kuchenkach mikrofalowych, lub specjalnie do tego celu skonstruowanych urządzeniach. Najczęściej stosuje się mikrofale o długości 12,2 cm (2450 MHz) lub 32,7 cm (915 MHz), doprowadzając tkankę do temperatury 45-55°C. Ekspozycja materiału na działanie mikrofal jest bardzo krótka - od kilku sekund do jednej minuty. Materiał musi być zanurzony w niewielkiej ilości (1-5 ml) roztworu soli fizjologicznej, buforu lub utrwalacza chemicznego, w plastikowym lub szklanym (nie metalowym!) pojemniku.
Istnieją cztery podstawowe sposoby utrwalania przy użyciu mikrofal:
• utrwalenie materiału znajdującego się w chemicznie obojętnym roztworze (czynnikiem utrwalającym są wyłącznie mikrofale);
• utrwalenie materiału zanurzonego w utrwalaczu chemicznym;
• wstępne utrwalenie chemiczne, a następnie ekspozycja na mikrofale;
• wstępna ekspozycja na mikrofale, a następnie utrwalenie chemiczne.
Najdoskonalsze zachowanie struktury (również na poziomie mikroskopu elektronowego) daje drugi z podanych sposobów.
3.3.4. Chemiczne podstawy procesu utrwalania
Każdy utrwalacz posiada grupy chemicznie aktywne, które wiążą się z określonymi grupami chemicznymi substancji obecnych w komórkach i tkankach. Prowadzi to do istotnych zmian chemicznych w utrwalanym materiale. Większość utrwalaczy aldehydowych i związków metali powoduje powstanie tzw. wiązań krzyżowych pomiędzy różnymi grupami chemicznymi struktur komórkowych i tkankowych, czego wynikiem jest ich dodatkowe usieciowanie - usztywnienie i wzmocnienie strukturalne, a także zablokowanie aktywnych centrów enzymów. Przykładowo: aldehydy tworzą wiązania krzyżowe pomiędzy końcowymi grupami polipeptydów i białek oraz mostki metylenowe (formaldehyd); sole chromu tworzą mostki typu -Cr-O-Cr- pomiędzy grupami karboksylowymi i hydroksylowymi, sole rtęci wiążą się z grupami -SH białek i z nukleotydami, a sole osmu przyłączają się do cząsteczek nienasyconych lipidów ulegając redukcji i powodując ich "usztywnienie". Duża grupa utrwalaczy, w tym alkohole i większość kwasów, to tzw. utrwalacze precypitujące, powodujące denaturację i wytrącania się białek bez tworzenia wiązań krzyżowych.
Dla możliwie pełnego zachowania struktury utrwalanej tkanki najkorzystniejsze są utrwalacze wytwarzające największą liczbę wiązań krzyżowych. Pod tym względem najbardziej efektywny jest aldehyd glutarowy - jest on utrwalaczem z wyboru w przygotowaniu materiału do rutynowej mikroskopii elektronowej.
3.3.5. Oddziaływanie mikrofal na tkankę
Działając na materiał biologiczny, mikrofale rozbijają wiązania wodorowe, głównie wytworzone pomiędzy cząsteczkami wody, a wyzwolona z wiązań energia powoduje bardzo szybkie i równomierne ogrzanie materiału. W efekcie dochodzi do denaturacji białek (w tym enzymatycznych) i zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych. Jeżeli materiał jest zanurzony w utrwalaczu chemicznym, mikrofale wybitnie przyspieszają jego penetrację i proces tworzenia się wiązań krzyżowych.
3.3.6. Wypłukiwanie utrwalacza
W przypadku większości utrwalaczy określony jest maksymalny czas utrwalania. Przedłużenie tego czasu może spowodować niekorzystne zmiany strukturalne w komórkach i tkance. Dlatego też proces utrwalania przerywa się poprzez wypłukanie utrwalacza z materiału. W zależności od rodzaju planowanych badań mikroskopowych (rutynowa mikroskopia świetlna, histochemia, mikroskopia elektronowa) płukanie przeprowadza się bądź w wodzie (najlepiej bieżącej), bądź w buforach, które służyły uprzednio jako rozpuszczalnik dla utrwalacza. Jeżeli użyto alkoholowego (bezwodnego) roztworu utrwalacza, płukanie przeprowadza się w kilku zmianach alkoholu o nieco wyższym stężeniu.
3.4. Odwadnianie
Po utrwaleniu materiału, dalsze etapy procedury uzależnione są od rodzaju docelowego preparatu mikroskopowego. W przypadku rozmazów, rozgniotów czy hodowli, można od razu przystępować do barwienia. Jeżeli natomiast chcemy uzyskać skrawki o przydatnej w mikroskopii bardzo niewielkiej grubości, pokrojenie materiału jest możliwe jedynie pod warunkiem jego należytego utwardzenia. Im cieńsze mają być skrawki, tym twardszy musi być krojony materiał.
Utwardzenie można uzyskać poprzez zamrożenie materiału (technika mrożeniowa, p. rozdz. 5), albo poprzez przepojenie go odpowiednimi substancjami: parafiną, celoidyną lub polimeryzującymi żywicami (proces ten nosi nazwę zatapiania). Substancje, w których zatapiamy materiał mogą być polarne (czyli rozpuszczalne w wodzie) lub niepolarne (nierozpuszczalne w wodzie). Parafina, celoidyna, a także większość żywic to substancje niepolarne, stąd prawidłowe przepojenie tkanki podczas zatapiania wymaga uprzedniego usunięcia z niej wody.
W procesie odwadniania zastępujemy wodę obecną w tkance alkoholem lub acetonem. Proces ten polega na przeprowadzeniu materiału przez szereg wodnych roztworów tych substancji o stopniowo wzrastających stężeniach (np. 50, 70, 80, 90%) aż do dwóch zmian bezwodnego (absolutnego) alkoholu lub acetonu. Odwadniania dokonuje się w szczelnie zamkniętych naczyniach - jest to szczególnie istotne podczas ostatniego etapu tej procedury, gdyż zwłaszcza absolutny alkohol jest niezwykle higroskopijny i z łatwością chłonie wodę z powietrza.
3.5. Płyny pośrednie
Odwodnionego materiału zazwyczaj nadal nie można zatopić, gdyż substancja, którą chcemy go przepoić, nie rozpuszcza się również w alkoholu czy acetonie. Istnieje zatem konieczność wstępnego przepojenia tkanki płynem, który rozpuszczałby się zarówno w odwadniaczu, jak i w środowisku użytym do zatapiania. Płyny takie noszą nazwę płynów pośrednich, bowiem pośredniczą pomiędzy odwadnianiem a zatapianiem. Dopiero po dokładnym przepojeniu materiału płynem pośrednim można rozpocząć jego zatapianie.
W przypadkach, gdy materiał zatapia się w środowiskach polarnych, nie jest konieczne ani odwadnianie, ani przepajanie płynem pośrednim.
3.6. Zatapianie w parafinie
Płynami pośrednimi są tu rozpuszczalniki organiczne: benzen, toluen, ksylen, chloroform, itp. Używając parafiny do utwardzania materiału przed jego skrojeniem wykorzystuje się fakt, iż w temperaturze pokojowej parafina jest substancją stałą, natomiast po stosunkowo nieznacznym ogrzaniu przechodzi w stan płynny.
W pierwszym etapie umieszcza się materiał w roztworze płynu pośredniego i parafiny (1:1) w temperaturze 37°C. Pozwala to na wstępne wprowadzenie parafiny do tkanki. Następnie materiał przeprowadza się przez 2 lub 3 zmiany czystej parafiny, aby usunąć zeń nawet śladowe resztki płynu pośredniego, którego obecność wpłynęłaby niekorzystnie na własności materiału podczas krojenia.
W rutynowej technice histologicznej używa się kilku odmian parafiny różniących się twardością i temperaturą topnienia (im wyższa twardość, tym wyższa temperatura topnienia: od 45°C dla parafiny bardzo miękkiej do 60°C dla bardzo twardej). Proces przepajania parafiną odbywa się w cieplarce, w temperaturze o kilka stopni wyższej od temperatury topnienia użytej parafiny. Czas przepajania jest zależny od rodzaju tkanki (jej twardości, spoistości, itp.) oraz od rozmiarów zatapianego materiału i wynosi od kilku godzin do kilku dni.
Skonstruowano urządzenia (tzw. procesory tkankowe), w których cały proces od odwodnienia materiału do jego przepojenia parafiną odbywa się automatycznie. Są one wykorzystywane w pracowniach wykonujących szczególnie duże ilości preparatów mikroskopowych (np. duże pracownie histopatologiczne).
3.6.1. Formowanie bloczków
Po zakończeniu procesu zatapiania materiał wkłada się do specjalnych foremek, zalewa płynną parafiną i szybko oziębia, np. przez zanurzenie w zimnej wodzie. Parafina zestala się i tak uzyskany bloczek można następnie przyciąć do pożądanego kształtu i rozmiarów za pomocą ostrego noża.
Przy równoczesnym opracowywaniu większej ilości materiałów niezbędne jest odpowiednie oznakowanie bloczków. Najprościej można to zrobić przez włożenie do foremki niewielkiego paska papieru zawierającego symbol danego materiału w ten sposób, aby po zestaleniu parafiny oznakowany fragment paska wystawał poza bloczek.
3.6.2. Zalety i ograniczenia techniki parafinowej
Technika parafinowa jest najpowszechniej stosowaną procedurą przygotowania tkanek do rutynowych badań w mikroskopie świetlnym z uwagi na niskie koszty, możliwość uzyskania wystarczająco cienkich skrawków, skrawków seryjnych (p. dalej) oraz stosunkowo krótki czas trwania procedury (1-3 dni od momentu pobrania materiału do otrzymania preparatów).
Technika ta posiada jednak istotne wady, do których należą:
• stosowanie wysokiej temperatury (50-60°C), powodującej inaktywację enzymów i obkurczanie się niektórych tkanek;
• konieczność używania rozpuszczalników organicznych powodujących wypłukiwanie z materiału tłuszczów (lipidów);
• konieczność dodatkowego przygotowania skrawków do barwienia (p. dalej).
• kruszenie się i rozwarstwianie skrawków przy materiałach twardych lub o niejednorodnej strukturze;
• znaczne trudności przy krojeniu skrawków o dużej powierzchni.
3.7. Zatapianie w celoidynie
Celoidyna (dwunitroceluloza) jest materiałem łatwopalnym, w pewnych warunkach nawet wybuchowym, i należy przy jej używaniu zachować ostrożność. W porównaniu do parafiny jest bardziej spoista i elastyczna. Rozpuszcza się w octanie amylu lub w mieszaninie alkoholu etylowego i eteru (1:1) - są to płyny pośrednie w technice celoidynowej.
W celoidynie zatapia się materiały twarde (chrząstka, odwapniona kość), łatwo rozwarstwiające się (oko) lub o znacznych rozmiarach (całe zarodki). Znaczna spoistość celoidyny pozwala w tych przypadkach na uzyskanie dobrej jakości skrawków, niemożliwych do otrzymania po zatopieniu w stosunkowo kruchej parafinie. Skrawki te są jednak dość grube - w granicach 10-20 μm.
Proces zatapiania w celoidynie polega na stopniowym przepajaniu tkanki (uprzednio odwodnionej i zanurzonej w płynie pośrednim) wzrastającymi stężeniami celoidyny w płynie pośrednim. Stosuje się tu kolejne roztwory o stężeniu celoidyny 2%, 4% i 8%. Ponieważ roztwory te cechują się wzrastającą gęstością (8% celoidyna ma konsystencję gęstego miodu), proces przepajania jest długotrwały - przeciętnie od 2 do 8 tygodni, a w przypadku materiałów o dużych rozmiarach może trwać nawet kilka miesięcy. Procedurę tę można jednak prawie dwukrotnie skrócić przez stałe mieszanie roztworów celoidyny (np. przy zastosowaniu mieszalnika obrotowego).
Po zakończeniu przepajania, 8% celoidynę wraz z materiałem umieszcza się w eksykatorze z 70% alkoholem lub chloroformem na okres 7-10 dni. Dochodzi wówczas do częściowego odparowania rozpuszczalnika, a celoidyna osiąga stopniowo pożądaną konsystencję (twardej gumy). Można ją wówczas pociąć na bloczki zawierające dany materiał, które przechowuje się w 70% alkoholu etylowym, aby uniknąć całkowitego wyschnięcia celoidyny (uległaby ona wówczas obkurczeniu i fragmentacji).
Technika celoidynowa wychodzi obecnie z użycia - zastępuje ją zatapianie w żywicach akrylowych.
3.8. Zatapianie w żywicach
W badaniach na poziomie mikroskopu świetlnego coraz częściej stosuje się do zatapiania materiałów biologicznych żywice, które po spolimeryzowaniu charakteryzują się znaczną twardością i spoistością, przewyższając pod tym względem zarówno parafinę, jak i celoidynę. Umożliwia to krojenie tak zatopionego materiału na bardzo cienkie skrawki (1-2 μm), które pozwalają na uzyskanie obrazu mikroskopowego wysokiej jakości. Ponadto zatopienie w żywicy ułatwia krojenie skrawków o znacznych rozmiarach.
3.8.1. Zatapianie w żywicach akrylowych
Do celów mikroskopii świetlnej stosuje się z reguły polarne żywice akrylowe: metakrylan glikolu (GMA) i jego kombinacje z innymi żywicami akrylowymi lub związkami chemicznymi (butoksyetanol, glikol polietylenowy). Dostępne są również firmowe zestawy żywic akrylowych (Histo-resin, Histocryl, JB-4). Pomimo polarnego charakteru żywicy, najlepsze wyniki uzyskuje się po odwodnieniu materiału (w alkoholu lub acetonie). Potem materiał należy przepoić monomerem żywicy z domieszką związku chemicznego wspomagającego polimeryzację (np. nadtlenek benzoilu). W zależności od składu i odmiany żywicy, proces polimeryzacji może zachodzić po dodaniu jej inicjatora (akceleratora) w temperaturze pokojowej, pod wpływem podwyższonej temperatury (50-60°C), a przypadku specjalnych badań (np. immunocytochemicznych) można wywołać polimeryzację w niskich temperaturach (rzędu -20 - -50°C), naświetlając żywicę promieniowaniem UV.
3.8.2. Zatapianie w żywicach epoksydowych
Niepolarne żywice epoksydowe są używane prawie wyłącznie do badań na poziomie mikroskopu elektronowego, wobec czego zostaną omówione w rozdz. 4.
3.9. Krojenie skrawków
3.9.1. Mikrotomy
Do krojenia skrawków histologicznych służą przyrządy zwane mikrotomami. Każdy mikrotom składa się z czterech podstawowych części: noża mikrotomowego, stolika przedmiotowego, na którym montuje się skrawany bloczek, mechanizmu skrawania oraz mechanizmu regulującego grubość skrawków. W zależności od typu konstrukcyjniego, częścią ruchomą może być albo stolik, albo (rzadziej) nóż.
Istnieje kilka typów mikrotomów:
• mikrotom rotacyjny, najpowszechniejszy, w którym obrotowy ruch korby przekształcany jest w posuwisto-zwrotny ruch stolika względem noża;
• mikrotom wahadłowy, w którym obrotowy lub wahadłowy ruch uchwytu jest przekazywany systemem dźwigni na stolik przedmiotowy, wykonujący ruch wahadłowy (po wycinku koła);
• mikrotom saneczkowy, w którym stolik wraz z uchwytem przesuwa się ruchem posuwisto-zwrotnym wzdłuż prowadnic, a nóż jest nieruchomy (lub odwrotnie).
Nowoczesne mikrotomy często wyposażone są w napęd elektryczny oraz układy elektroniczne umożliwiające regulację szybkości skrawania, automatyczne dosuwanie nowo założonego bloczka do noża, itp.
Noże mikrotomowe z reguły wykonane są z wysokogatunkowej stali, lub z węglika wolframu (do krojenia materiałów twardych). W zależności od ukształtowania przeciwległych płaszczyzn noża wyróżniamy:
• noże klinowe (płasko-płaskie), uniwersalnego zastosowania,
• noże płasko-wklęsłe, do skrawków celoidynowych,
• noże dwuwklęsłe, do skrawków parafinowych.
Coraz częściej zamiast dość kosztownych i trudnych do ostrzenia noży używa się do mikrotomów wymiennych ostrzy żyletkowych, mocowanych w specjalnych uchwytach.
Mechanizm regulujący grubość skrawków zbliża stolik względem noża po każdym cyklu pracy mikrotomu o dystans, który odpowiada grubości skrawka. Dystans ten można regulować w dość szerokim zakresie (0,5-30 μm).
3.9.2. Zasady krojenia
Przed rozpoczęciem krojenia skrawków należy wstępnie przygotować płaszczyznę skrawania w bloczku: bloczek powinien mieć kształt ostrosłupa ściętego, a płaszczyzna skrawania formę prostokąta lub kwadratu. Powierzchnię płaszczyzny skrawania wyrównuje się już w mikrotomie, używając do tego celu noża o niższej jakości ostrza. Następnie, po założeniu noża przeznaczonego do właściwego krojenia, trzeba go odpowiednio ustawić względem bloczka. Ważne są tu głównie dwa parametry:
• kąt między długą osią ostrza a krawędzią bloczka (ryc. 3.1): normalnie ostrze i krawędź bloczka powinny być równoległe, natomiast rozwarcie tego kąta zwiększa się przy skrawaniu materiałów twardych;
• kąt nachylenia tylnej płaszczyzny ostrza noża do płaszczyzny skrawania bloczka (kąt prześwitu, ryc. 3.2): kąt ten powinien się mieścić w granicach od 3° do 10°. Przy materiałach miękkich kąt prześwitu winien być mniejszy niż przy krojeniu tkanek twardych.
Pewne znaczenie ma również szybkość i temperatura krojenia. Przy zbyt znacznej szybkości następuje z reguły kompresja skrawka i jego zniekształcenie, natomiast przy krojeniu zbyt wolnym - zwłaszcza w przypadku skrawków parafinowych - może dochodzić do ich kruszenia się. Każdy rodzaj materiału wymaga zatem doświadczalnego dobrania optymalnej szybkości krojenia.
Temperatura krojenia ma znaczenie przede wszystkim przy obróbce materiału zatopionego w parafinie. Zbyt wysoka temperatura otoczenia (25-30°C) powoduje obniżenie twardości parafiny i niekorzystnie odbija się na jakości skrawków, a także uniemożliwia uzyskanie skrawków cienkich. Dlatego przed krojeniem szczególnie cienkich skrawków parafinowych obniża się temperaturę bloczków, umieszczając je w zamrażalniku.
3.9.3. Krojenie skrawków parafinowych
Przy krojeniu materiału zatopionego w parafinie tworzy się tzw. wstęga, złożona z kolejnych (seryjnych) skrawków zlepionych ze sobą krawędziami. Używane obecnie mikrotomy pozwalają na uzyskanie skrawków parafinowych o grubości 2-10 μm. Skrawki takie można przechowywać dowolnie długo bądź w formie wstęgi, bądź po ich uprzednim naklejeniu na szkiełka podstawowe.
Naklejenie skrawka parafinowego na szkiełko podstawowe wymaga jego rozprostowania, gdyż podczas krojenia skrawki mocno się fałdują. W celu rozprostowania skrawka umieszcza się go na powierzchni wody ogrzanej do ok. 40°C - działają nań wówczas siły napięcia powierzchniowego wody, a parafina staje się miękka. Po podłożeniu szkiełka pod rozprostowany skrawek wyjmuje się go z wody, a skrawek "przykleja" się do powierzchni szkła. Naklejone skrawki suszy się przez ok. godzinę w temperaturze 37°C, co powoduje mocne przywarcie wciąż miękkiej parafiny skrawka do szkiełka podstawowego.
W przypadku niektórych materiałów oraz pewnych procedur wiążących się z intensywnym działaniem chemicznym na skrawek (np. utlenianie) lub z gwałtownymi zmianami środowiska (szybkie odwadnianie) skrawki mogą jednak odklejać się od szkiełka podstawowego. Zapobiega się temu przez pokrycie szkiełka przed naklejeniem skrawka cienką warstwą roztworu albumin lub poli-L-lizyny.
3.9.4. Krojenie skrawków celoidynowych
Podczas krojenia skrawków celoidynowych należy stale zwilżać nóż i bloczek 70% alkoholem. W trakcie całej procedury (krojenia, a potem barwienia i zamykania) skrawki celoidynowe nie mogą pozostawać na wolnym powietrzu, bowiem bardzo szybko uległyby wyschnięciu i obkurczeniu. Natychmiast po skrojeniu pojedyncze skrawki przenoszone są do naczynia z 70% alkoholem, w którym muszą być przechowywane aż do chwili zabarwienia.
3.9.5. Krojenie skrawków z żywic akrylowych
Krojenie materiału zatopionego w żywicach akrylowych wymaga noża z węglika wolframu lub noża szklanego (specjalnie łamane płytki szklane, tzw. noże Ralpha, p. rozdz. 4.5.3). Skrawki nie tworzą wstęgi, i choć można je przechowywać w tej postaci, w jakiej zeszły z noża, dla wygody lepiej je nakleić na szkiełka podstawowe w ten sam sposób, w jaki nakleja się skrawki parafinowe. Materiał zatopiony w żywicach akrylowych można pokroić na skrawki o grubości 0,5-2,0 μm nawet w przypadkach, gdy powierzchnia skrawanego bloczka jest bardzo duża.
3.9.6. Krojenie skrawków z żywic epoksydowych
Materiały zatopione w żywicach epoksydowych mogą być krojone przy użyciu noży szklanych lub diamentowych. Procedura ta jest omówiona w rozdziale 4.5.
3.10. Barwienie
Barwienie histologiczne ma na celu skontrastowanie struktur komórkowych i tkankowych za pomocą zróżnicowanych barwników. Cząsteczka każdego barwnika posiada dwie istotne dla jego funkcji grupy chemiczne: grupę barwną, decydującą o jego kolorze, i grupę chwytną, odpowiedzialną za wiązanie się cząsteczek barwnika z tkankowymi grupami chemicznymi. Proces barwienia polega na przyłączaniu się grup chwytnych określonego barwnika do struktur komórkowych lub tkankowych posiadających odpowiednie grupy wiążące. Barwienie ma zatem niski stopień swoistości (wiele różnych struktur i substancji może wiązać ten sam barwnik).
3.10.1. Przygotowanie skrawków do barwienia
W histologii używane są przede wszystkim wodne (rzadziej alkoholowe) roztwory barwników. Przepojone niepolarną parafiną skrawki nie zabarwią się, gdyż cząsteczki barwnika w wodnym środowisku są "odpychane" przez parafinę. Dlatego z takich skrawków trzeba najpierw usunąć parafinę (przez zanurzenie w ksylenie lub innym rozpuszczalniku organicznym), a następnie przeprowadzić przez szereg roztworów alkoholu o coraz niższych stężeniach (nawadnianie, odwrotność odwadniania), aby w końcu przenieść je do czystej wody. Skrawki celoidynowe i skrawki z żywic akrylowych są mikroporowate i przepuszczalne dla wodnych roztworów niskocząsteczkowych barwników; dlatego można je barwić natychmiast po skrojeniu, bez żadnych procedur wstępnych.
Skrawki z żywic epoksydowych dają się barwić bez uprzedniego przygotowania jedynie nielicznymi barwnikami. Z uwagi na fakt, iż ich analiza w mikroskopie świetlnym jest z reguły procedurą pomocniczą przy mikroskopii elektronowej, barwienie to omówiono w rozdz. 4.5.1. Jeżeli z jakichś względów potrzebne jest bardziej skomplikowane barwienie tych skrawków lub przeprowadzenie na nich reakcji histochemicznej, niezbędne jest wstępne usunięcie żywicy ze skrawków przy pomocy roztworów wodorotlenku sodu lub potasu w alkoholu absolutnym, a następnie ich nawodnienie.
3.10.2. Barwienie barwnikami kwaśnymi i zasadowymi
Najpopularniejszą metodą barwienia jest wykorzystanie barwników kwaśnych (eozyna, floksyna, oranż G) i zasadowych (hematoksylina, błękit metylenowy, safranina). Barwienie ma tu charakter reakcji zobojętniania: barwniki kwaśne wiążą się z tymi strukturami komórkowymi i tkankowymi, które wykazują odczyn zasadowy (struktury kwasochłonne), jak np. białka cytoplazmatyczne, włókna kolagenowe, itp., natomiast barwniki zasadowe wiążą się ze strukturami wykazującymi odczyn kwaśny (struktury zasadochłonne), jak np. chromatyna jądrowa (obecność DNA), czy rejony cytoplazmy bogate w rybosomy (obecność RNA). W najpowszechniej stosowanym barwieniu przeglądowym z użyciem hematoksyliny i eozyny, jądra komórkowe wybarwiają się hematoksyliną na granatowo, a cytoplazma eozyną na czerwono. W komórkach zawierających liczne rybosomy, cytoplazma barwi się na kolor fioletowy (efekt nałożenia barwy czerwonej i niebieskiej).
3.10.3. Barwienie przyżyciowe
Barwieniem przyżyciowym nazywamy wprowadzenie barwnika do żyjącego organizmu. Taki barwnik nie może wykazywać działania toksycznego i z reguły dostaje się do wnętrza komórek na drodze endocytozy. Do najczęściej stosowanych barwników przyżyciowych należą: czerwień obojętna, błękit metylenowy, toluidynowy i tusz chiński (do uwidocznienia komórek fagocytujących i sieci naczyniowych) oraz zieleń Janusowa (wybarwia przyżyciowo mitochondria).
3.10.4. Impregnacja związkami metali
Niektóre związki metali mogą być redukowane w tkankach do metalicznego strątu, widocznego w obrazie mikroskopowym. Powszechnie stosowane sole srebra impregnują włókna kratkowe tkanki łącznej i ziarna wydzielnicze niektórych komórek dokrewnych (tzw. komórki srebrochłonne, np. w śluzówce jelit), sole złota impregnują niektóre komórki nerwowe i glejowe w ośrodkowym układzie nerwowym, a związki osmu są redukowane przez lipidy zawarte w osłonkach mielinowych włókien nerwowych.
3.10.5. Bejcowanie
Barwienie może być niekiedy procesem dwuetapowym: najpierw tkankę poddaje się tzw. bejcowaniu, tzn. działa się na nią substancją chemiczną, która sama nie kontrastuje struktur, lecz jej związanie z tkanką jest konieczne do następowego przyłączenia barwnika. Zastosowany w drugim etapie barwnik tworzy z bejcą tzw. lakę - nierozpuszczalny i barwny kompleks. Bejce, stosowane głównie z barwnikami zasadowymi, obejmują m.in. sole żelaza, chromu i glinu (ałuny).
3.10.6. Różnicowanie
Technikę barwienia można podzielić na barwienie progresywne, w którym przerywamy proces barwienia w momencie uzyskania pożądanej intensywności koloru, oraz barwienie regresywne, w którym tkankę rozmyślnie przebarwiamy, a następnie stosując odpowiednie roztwory odbarwiające doprowadzamy do wymaganego nasilenia barwy. Może się również zdarzyć, że podczas barwienia progresywnego - zwłaszcza kilkoma różnymi barwnikami - dojdzie wbrew naszej woli do przebarwienia preparatu i trzeba zmniejszyć intensywność koloru. Traktowanie zabarwionego preparatu roztworami odbarwiającymi nosi nazwę różnicowania i przeprowadza się go oczywiście pod kontrolą mikroskopu. Do różnicowania służą - w zależności od rodzaju użytego barwnika - roztwory alkoholi, kwasów, a także substancji o właściwościach utleniających.
3.10.7. Płukanie
Po zabarwieniu konieczne jest wypłukanie z preparatu nie związanego barwnika. Preparaty płucze się w kilku zmianach wody (lub alkoholu, jeżeli uprzednio stosowano alkoholowy roztwór barwnika). Płukanie zapobiega dyfuzyjnemu zabarwieniu tła pochodzącemu od nadmiaru barwnika.
Proces barwienia może być zautomatyzowany - służą temu urządzenia barwiące równocześnie kilkadziesiąt preparatów; można w nich zaprogramować kolejność oraz czas barwienia poszczególnymi barwnikami.
3.11. Zamykanie preparatów
Po zabarwieniu i wypłukaniu preparat jest praktycznie gotowy do analizy mikroskopowej - należy go jednak zabezpieczyć przed niekorzystnym wpływem otoczenia (uszkodzenia mechaniczne, wysychanie, utlenianie niektórych barwników). Do tego celu służy tzw. zamykanie preparatów, czyli umieszczenie ich pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym i wypełnienie przestrzeni pomiędzy oboma szkiełkami substancją, która powinna spełniać dwa podstawowe warunki:
• powinna posiadać taki sam współczynnik załamania światła jak szkło (w celu uniknięcia uginania i rozpraszania promieni świetlnych na pograniczu środowisk o różnej charakterystyce optycznej);
• powinna w temperaturze pokojowej hermetycznie i trwale spajać oba szkiełka.
Oba warunki najlepiej spełniają niepolarne żywice - albo naturalne (balsam kanadyjski), albo syntetyczne (DPX, Malinol, XAM, Entellan). Ponieważ żywice te są rozpuszczalne jedynie w rozpuszczalnikach organicznych, zabarwione preparaty muszą być poddane ponownemu odwodnieniu (tym razem szybkiemu, gdyż dłuższe przetrzymywanie w roztworach alkoholi odbarwia preparaty) i zanurzone w toluenie lub ksylenie (tzw. prześwietlanie). Dopiero wówczas preparaty można pokryć kroplą żywicy i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Po wysuszeniu (przez kilka godzin, w temperaturze ok. 60-80°C) oba szkiełka są ze sobą ściśle i hermetycznie spojone, i tak przygotowany preparat zachowuje swe własności optyczne nawet przez kilkadziesiąt lat.
W sytuacji, gdy potrzebne jest natychmiastowe zamknięcie preparatu po barwieniu (np. blaknący barwnik), lub gdy preparatu nie można poddać odwodnieniu i prześwietleniu (w niektórych reakcjach histochemicznych barwny produkt rozpuszcza się w alkoholu lub rozpuszczalnikach organicznych), stosuje się mniej trwałe, wodne środowiska zamykające, które całkowicie spełniają tylko pierwszy z dwóch wymienionych powyżej warunków. Są to np.: żel glicerolowy (roztwór glicerolu i żelatyny), glicerol w soli fizjologicznej, roztwór gumy arabskiej i sacharozy, alkohol poliwinylowy. Środowiska te nie zapewniają dłuższej trwałości preparatu (ok. miesiąca); aby ją poprawić, można dodatkowo uszczelnić obrzeża szkiełka nakrywkowego szybko schnącym lakierem.
3.12. Przygotowanie tkanek zmineralizowanych do badań mikroskopowych
Szczególnym problemem metodycznym jest wykonanie preparatów mikroskopowych z tkanek zmineralizowanych (kość, ząb). Stosuje się tu dwie podstawowe procedury.
3.12.1. Technika szlifów
Technika szlifów ujawnia strukturę zmineralizowanych części tkanek twardych. Rozpoczyna ją częściowe usunięcie z tkanki składników organicznych: tkanka poddawana jest tzw. procesowi maceracji, polegającemu na rozkładzie części miękkich (niezmineralizowanych substancji organicznych) pod wpływem roztworów ługów lub podchlorynów, a następnie na dokładnym wypłukaniu ich wodą. W ten sposób ze zmineralizowanej tkanki usuwa się np. komórki i naczynia krwionośne, a pozostają składniki najsilniej zmineralizowane, czyli głównie włókna kolagenowe wraz z zawartymi w nich kryształkami soli wapniowych, jak również struktury utworzone prawie wyłącznie przez substancje mineralne, np. szkliwo zęba. Tak przygotowany fragment tkanki szlifuje się mechanicznie, najpierw drobnoziarnistymi materiałami ściernymi, a następnie na zmatowionych powierzchniach szklanych, aż do otrzymania bardzo cienkich płytek (ok. 20 μm), które przepuszczają promienie świetlne, a zatem mogą być oglądane pod mikroskopem. Taka płytka nosi nazwę szlifu. Nasączenie szlifu barwnikiem uwidacznia wszystkie przestrzenie, które w żywej tkance były zajęte przez niezmineralizowane struktury organiczne. W ten sposób w szlifie kości można dostrzec kanały naczyniowe oraz wybarwione jamki i kanaliki kostne, a w zębie kanaliki zębinowe i jamki cementu. Wykonywanie szlifów jest pracą bardzo żmudną i trudną technicznie.
3.12.2. Technika skrawków
Zmineralizowana tkanka da się bez trudności pokroić na skrawki jedynie pod warunkiem uprzedniego usunięcia z niej składników mineralnych. Odczynniki służące do procesu demineralizacji (odwapniania) tkanek twardych powinny równocześnie zachowywać pierwotną strukturę komórek i innych tworów organicznych oraz nie wywierać ujemnego wpływu na barwliwość tkanki. Stosujemy tu roztwory: kwasu azotowego (5-10%), kwasu trójchlorooctowego (2-5%), kwasu askorbinowego (2%) oraz najlepszy z odczynników demineralizujących - kwas etylenodwuaminoczterooctowy (EDTA, 10-15%). Ta ostatnia substancja należy do tzw. związków chelatujących i tworzy z jonami wapnia niedysocjujące, rozpuszczalne kompleksy.
Zdemineralizowaną kość lub ząb można zatopić w celoidynie lub żywicy, pokroić na skrawki i zabarwić w zależności od potrzeb.
Zatopienie w żywicy akrylowej lub epoksydowej umożliwia również wykonanie skrawków z tkanek nieodwapnionych - jest to jednak bardzo trudne i wymaga użycia specjalnych noży z węglika wolframu lub noży diamentowych.
3.13. Przepisy praktyczne
3.13.1 Utrwalacze
Uwagi ogólne. Przy utrwalaniu immersyjnym objętość utrwalacza powinna co najmniej 10-krotnie przewyższać objętość utrwalanego fragmentu tkanki. Należy również wziąć pod uwagę twardnienie materiału podczas utrwalania i unikać wciskania fragmentów tkanek do buteleczek o wąskich szyjkach, gdyż po utrwaleniu taki materiał nie da się wyjąć bez rozbicia butelki.
A. Buforowana 4% formalina (pH 7)
formalina handlowa (40%) 100 ml
woda dest. 900 ml
kwaśny fosforan sodu jednowodny 4 g
fosforan dwusodowy bezwodny 6,5 g
Utrwalacz uniwersalny, optymalny czas utrwalania 7-10 dni. Należy unikać niezobojętnionej formaliny, gdyż może to prowadzić do powstania strątów tzw. barwnika formalinowego.
B. Utrwalacz Susa
chlorek rtęci 45 g
chlorek sodu 5 g
kwas trójchlorooctowy 20 g
kwas octowy lodowaty 40 ml
formalina 200 ml
woda dest. 800 ml
Utrwalacz uniwersalny, używany często do materiałów biopsyjnych. Czas utrwalania 3-24 godz. Płukanie w 95% alkoholu.
C. Utrwalacz Zenkera
chlorek rtęci 5 g
dwuchromian potasu 2,5 g
siarczan sodu 1 g
woda dest. 100 ml
kwas octowy lodowaty 5 ml (dodać bezpośrednio przed użyciem)
Utrwalacz uniwersalny. Czas utrwalania 3-18 godz.
D. Utrwalacz Bouina
nasycony roztwór kwasu pikrynowego 75 ml
formalina 25 ml
kwas octowy lodowaty 5 ml
Utrwalacz dobrze zachowujący w tkankach glikogen i chromatynę. Czas utrwalania 6-24 godz. Żółte zabarwienie tkanki można usunąć przez płukanie w 70% alkoholu, a następnie odbarwienie w 2,5% tiosiarczanie sodu. Należy bardzo starannie wypłukać, w przeciwnym razie może dojść do znacznego uszkodzenia tkanki. Nie nadaje się do utrwalania nerki.
E. Utrwalacz Carnoya
alkohol etylowy absolutny 60 ml
chloroform 30 ml
kwas octowy lodowaty 10 ml
Utrwalacz bezwodny, bardzo szybko penetruje do tkanek. Dobrze zachowuje chromatynę i chromosomy, a także glikogen. Tkanki mogą ulec pewnemu obkurczeniu. Czas utrwalania 30-90 min (dla fragmentów tkanki nie grubszych niż 3 mm). Płukanie w 95% alkoholu.
3.13.2. Odwadnianie
Zalecany czas odwadniania materiału (godz.)
----------------------------------------------------------
Stężenie Grubość fragmentu utrwalanego
alkoholu (%) do 2 cm do 1 cm do 5 mm
----------------------------------------------------------
50 2-4 2 1
60 2-4 2 1
70 4-6 3 2
80 6-10 4 2
90 6-10 4 2
96 12-24 6 4
absolutny I 4-6 2 2
absolutny II 4-6 2 2
----------------------------------------------------------
Podaną powyżej procedurę w uzasadnionych przypadkach można skrócić, stosując jedynie alkohole o stężeniu 50%, 80%, 96% i alkohol absolutny. W przypadku wypłukiwania utrwalacza roztworem alkoholu, odwodnienie rozpoczynamy od kolejnego (wyższego) stężenia alkoholu.
3.13.3. Zatapianie w parafinie
A. Przepajanie płynami pośrednimi:
a) alkohol absolutny/ksylen 1:1 1-2 godz.
karboksylol 1-2 godz.
ksylen 1 godz.
b) benzoesan metylu I, II po 15 min.
benzen 5-15 min.
c) chloroform I, II, III po 1 godz.
W czasie przepajania materiał utrzymuje się na powierzchni płynu pośredniego. Można go uznać za dostatecznie przepojony, gdy opadnie na dno naczynia.
Uwaga: Większość płynów pośrednich to substancje toksyczne, zwłaszcza przy długotrwałej ekspozycji. Należy unikać ich inhalacji i chronić skórę przed bezpośrednim kontaktem.
B. Przepajanie parafiną
płyn pośredni/parafina 1:1 1 godz. 37°C
parafina I 2 godz.
parafina II 2 godz. 50-60°C
parafina III 2-16 godz.
C. Przygotowanie skrawków parafinowych (do 10 μm) do barwienia
ksylen I 5 min
ksylen II 5-10 min
alkohol absolutny 2-5 min
alkohol 96% 5 min
alkohol 80% 5 min
alkohol 70% 5 min
alkohol 50% 5 min
woda dest. 5 min
3.13.4. Zatapianie w celoidynie
przy ciągłym bez mieszania
mieszaniu
-----------------------------------------------------------------
alkohol absolutny/eter 1:1 6-24 godz.
2% celoidyna 1-3 dni 2-5 dni
4% celoidyna 5-7 dni 2 tygodnie
8% celoidyna 5-7 dni 6 tygodni
Po przepojeniu materiału 8% celoidyną wylewa się ją na płytkę Petry'ego, rozmieszczając fragmenty tkanki równomiernie na dnie. Płytkę przykrywa się szklaną nakrywką, a całość szklanym kloszem, lub wstawia do eksykatora. Całość pozostaje na stałe przykryta, natomiast znajdującą się wewnątrz płytkę Petry'ego przykrywa się i odkrywa na przemian co 2-3 godz. Przez noc płytka pozostaje przykryta. Postępowanie takie prowadzi do łagodnego odparowania eteru i alkoholu z celoidyny, która stopniowo twardnieje. Gdy przybierze konsystencję miękkiej gumy i da się wyjąć z płytki Petry'ego w postaci krążka z zatopionym materiałem, ustawiamy taki krążek na szklanych prętach nad płytką, do której nalewamy 70% alkoholu lub chloroformu. Celoidyna ulega wówczas dalszemu twardnieniu - jest to tzw. proces hartowania celoidyny - i osiąga konsystencję twardej gumy. Czas twardnienia wynosi kilka dni. Po zakończeniu tego procesu krążek celoidynowy kroimy na bloczki z zatopionym wewnątrz materiałem, które należy przechowywać w 70% alkoholu.
3.13.5. Zatapianie w żywicy akrylowej Histocryl
Materiał utrwalony, odwodniony w alkoholu lub acetonie
Roztwór przepajający (1) 48 godz., +4°C
Roztwór polimeryzujący (2) 1 godz., +4°C
(1) Roztwór przepajający
Histocryl 10 ml
nadtlenek benzoilu 150 mg
(2) Roztwór polimeryzujący
Histocryl 10 ml
nadtlenek benzoilu 150 mg
akcelerator 60 μl
3.13.6. Barwienie hematoksyliną i eozyną
hematoksylina 2-20 min (zależnie od rodzaju hematoksyliny)
woda dest. 1 min
0,5% kwas solny 5-30 sek
woda dest. 15 sek (dla hem. Harrisa) (1)
0,05% węglan litu 2-4 min
woda bieżąca 5-15 min (dla hem. Mayera) (2)
0,25%-1% eozyna 1-3 min
woda dest. 3 min
Wynik: jądra komórkowe: granatowe, cytoplazma komórek i zrąb tkanki łącznej: czerwone, zasadochłonne rejony cytoplazmy: niebieskofioletowe.
(1) Hematoksylina Harrisa
hematoksylina 1 g
alkohol absolutny 10 ml
ałun amonowy lub potasowy 20 g
woda dest. 200 ml
żółty tlenek rtęci 0,5 g
Rozpuścić hematoksylinę w ogrzanym na łaźni wodnej alkoholu, a oddzielnie ałun we wrzącej wodzie. Zmieszać, któtko zagotować i dodać tlenku rtęci. Szybko oziębić roztwór pod bieżącą wodą i dodać 8 ml kwasu octowego lodowatego. Przed użyciem przesączyć.
(2) Hematoksylina Mayera
hematoksylina 1 g
jodan sodu 0,2 g
ałun potasowy 50 g
kwas cytrynowy 1 g
wodzian chloralu 50 g
woda dest. 1000 ml
Kwas cytrynowy i wodzian chloralu dodaje się dopiero po całkowitym rozpuszczeniu pozostałych składników. Zagotować przez 5 min. Po oziębieniu roztwór nadaje się do użycia. Gotowanie można zastąpić przez odstawienie barwnika na ok. 3 miesiące do jasnego i ciepłego miejsca ("dojrzewanie" barwnika).
3.13.7. Barwienie metodą AZAN-Mallory
0,1% anilina w alkoholu 96% 1-2 min
0,1% azokarmin G (1) 1 godz.
woda dest. 5 min
0,1% anilina w alkoholu 96% 10-30 min (różnicowanie)
1% kwas octowy w alkoholu 96% 1 min
3% kwas fosforowolframowy 1-3 godz. (bejcowanie)
woda dest. 5 min
odczynnik Heidenheina (2) 1-3 godz.
woda dest. 1-5 min
alkohol 96% 1-5 min (różnicowanie)
Wynik: włókna kolagenowe i kratkowe tkanki łącznej: niebieskie, jądra komórkowe: czerwone, cytoplazma komórek: czerwonopomarańczowa lub czerwonofioletowa.
(1) Roztwór azokarminu G: Rozpuścić 0,1 g azokarminu w 100 ml wody dest., podgrzać do momentu wrzenia, oziębić do temperatury pokojowej, przesączyć. Dopełnić wodą dest. do 100 ml i dodać 1 ml kwasu octowego.
(2) Odczynnik Heidenheina: Rozpuścić 0,5 g błękitu anilinowego i 2 g oranżu G w 100 ml wody dest., dodać 8 ml kwasu octowego, zagotować i przesączyć. Przed barwieniem rozcieńczyć 1:1 wodą dest.
3.13.8. Barwienie włókien sprężystych rezorcyno-fuksyną
alkohol 80% 5 min
alkoholowy roztwór rezorcyno-fuksyny (1) 30-60 min
woda bieżąca 1 min
alkohol 96% - różnicować do odbarwienia tła
Wynik: włókna sprężyste: szaroniebieskie
(1) Alkoholowy roztwór rezorcyno-fuksyny
Roztwór A: rozpuścić 0,5 g fuksyny i 1 g rezorcyny w 50 ml wody dest., podgrzewając.
Roztwór B: Rozpuścić 2 g chlorku żelazowego w 10 ml wody dest.
Podgrzać roztwór A do wrzenia, zmieszać z roztworem B i gotować przez 5 min. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej przesączyć. Osad rozpuścić w 100 ml alkoholu 96% ogrzanego do temperatury wrzenia na łaźni wodnej (nie na palniku!). Po oziębieniu dodać 0,7 ml stężonego kwasu solnego i powtórnie przesączyć.
3.13.9. Impregnacja srebrem włókien kratkowych
0,5% nadmanganian potasu 2 min
woda bieżąca 5 min
2% pirosiarczan potasu 1 min
woda bieżąca 10 min
woda dest. 2 min
2% ałun żelazowy 1 min
woda bieżąca 5 min
woda dest. 2 x 2 min
2% azotan srebra 24 godz.
woda dest. 2 x 3 sek
amoniakalny roztwór azotanu srebra (1) 5-10 min
woda dest. 2 x 5 sek
4% formalina (w wodzie wodociągowej) 5 min
woda bieżąca 15 min
woda dest. 1 min
roztwór chlorku złota (2) 5-15 min
5% tiosiarczan sodu 30-60 sek
woda bieżąca 5-30 min
Wynik: włókna kratkowe tkanki łącznej: czarne.
(1) Amoniakalny roztwór azotanu srebra
Do 10 ml 10% azotanu srebra dodać 5 kropli 40% wodorotlenku sodu. Utworzy się ciemnobrązowy strąt. Następnie dodawać kroplami amoniak, stale mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia się strątu. Szkło używane do przygotowania odczynnika winno być idealnie czyste.
(2) Roztwór chlorku złota
Do 10 ml wody dest. dodać 5 kropli 1% chlorku złota i 2 krople kwasu octowego lodowatego.
3.13.10. Barwienie rozmazów krwi i szpiku metodą May-Grünwalda-Giemsy
Barwienie przeprowadza się na płaskiej płytce Petry'ego. Odczynniki nalewa się na dno płytki, a preparaty ustawia (np. na cienkich prętach szklanych) rozmazem ku dołowi tak, aby zetknęły się z powierzchnią barwnika. Gotowe odczynniki May-Grünwalda i Giemsy są dostępne jako preparaty handlowe.
odczynnik May-Grünwalda 3 min
dodać równą objętość wody dest. 1 min
opłukać szybko w wodzie dest.
barwnik Giemsy (1 kropla na 1 ml wody) 10-15 min
woda dest. 2-5 min
Osuszyć rozmaz bibułą filtracyjną, można przechowywać bez zamknięcia.
Wynik: erytrocyty: różowe, jądra komórkowe: fioletowe, cytoplazma limfocytów: niebieska, cytoplazma monocytów: szaroniebieska, ziarnistości granulocytów kwasochłonnych: czerwonopomarańczowe, zasadochłonnych: niebieskofioletowe, obojętnochłonnych: różowofioletowe.
Podpisy pod ilustracje:
Ryc. 3.1. Kąt pomiędzy długą osią noża a krawędzią bloczka. Strzałka wskazuje kierunek skrawania
Ryc. 3.2. Kąt prześwitu noża
Artefakt - struktura nie istniejąca w żywej tkance, a pojawiająca się w materiale biologicznym pod wpływem procedury przygotowania materiału do badań.
35