Ilościowe oznaczenie glikogenu oraz badanie niektórych jego właściwości
Wykonanie:
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z podstawową wiedzą dotyczącą budowy, funkcji i właściwości glikogenu jak również poznanie zasad najczęściej stosowanych metod ilościowego oznaczania zawartości tego polisacharydu.
Oznaczanie stężenia glikogenu metodą Samogyi i Nelsona
Otrzymany w kolbie miarowej na 10ml wyciąg roztwór glikogenu uzupełniamy wodą destylowaną do kreski i mieszamy. Pobieramy z kolby 2 ml roztworu i dodajemy 5 ml 2M kwasu solnego, mieszamy i prowadzimy hydrolizę glikogenu we wrzącej łaźni wodnej przez 30 minut. Następnie próbę chłodzimy zimną wodą, zobojętniamy hydrolizat przez dodanie 5 ml 2 M wodorotlenku sodowego i mieszamy. Do 2 probówek pobieramy po 1ml hydrolizatu. Do trzeciej dodajemy 0,5 ml 2 M kwasu solnego i 0,5 ml 2M wodorotlenku sodowego, będzie to próba kontrolna. Do wszystkich trzech probówek odmierzamy po 1 ml odczynnika Samogyi, mieszamy i wstawiamy do wrzącej łaźni wodnej dokładnie na 10 minut. Próby chłodzimy zimną wodą i odmierzamy do nich po 1ml odczynnika Nelsona. Dokładnie mieszamy aż do rozpuszczenia osadu tlenku miedzi (I) i ustania wydzielania pęcherzyków gazu (CO2). Próby następnie rozcieńczamy dodając po 7 ml wody destylowanej, mieszamy i po 10 minutach mierzymy w fotometrze absorbancję przy długości fali 520 nm wobec próby kontrolnej.
Badanie niektórych właściwości glikogenu
Do 4 czystych probówek pobieramy po 1 ml 1 M wodorotlenku sodowego, a do kolejnych czterech po 1 ml wody. Równolegle przygotowujemy próbę do hydrolizy glikogenu: do probówki odmierzamy po 10 ml roztworu glikogenu i 5 ml 2 M kwasu solnego, mieszamy i natychmiast pobieramy po 1 ml tej mieszaniny do pierwszych probówek serii z 1M NaOH oraz z wodą (będą to próby pobrane w czasie zerowym). Pozostałą część próby do hydrolizy umieszczamy we wrzącej łaźni wodnej i po 5, 10, 15 minutach pobieramy po 1ml mieszaniny do kolejnych probówek serii z NaOH i z wodą. Roztwory w probówkach z wodą po pobraniu próby natychmiast potraktować 2 kroplami roztworu jodu w jodku potasu. Następnie do tych probówek z NaOH i hydrolizatem glikogenu dodajemy po 1 ml odczynnika Benedicta. Po wymieszaniu wstawiamy na 2 minuty do wrzącej łaźni wodnej.
Wyniki i obliczenia:
Część pierwsza:
Otrzymana wartość absorbancji: 0,194
Wartość stężenia glukozy odczytana z wykresu: 62,5 μg
Otrzymana objętość glikogenu w kolbce: 2,5 ml
Współczynnik pozwalający na 0,9
obliczenie stężenia glikogenu
Wartość stężenia glikogenu po uwzględnieniu 56,25 μg
współczynnika
1 ml 56,25 μg
12 ml 675 μg
2 ml 675 μg
10 ml x
x = 3,375 mg glikogenu w kolbce
2,5 ml 3,375 mg
1000 ml y
y = 1350 mg = 1,35 g, co odpowiada zawartości glikogenu w 1000 ml przygotowanego roztworu glikogenu technicznego
w 1000 ml rozpuszczono 2 g glikogenu technicznego, więc:
2,0 g 100%
1,35 g z
z = 67,5 %
Czystość glikogenu wyniosła 67,5 %
Część druga:
W próbach z odczynnikiem Benedicta zaobserwowano stopniowy zanik ceglastego tlenku miedzi (I). W próbach z wodą destylowaną zaobserwowano stopniowy zanik barwy brunatno-czerwonej, charakterystycznej dla reakcji glikogenu z jodem. W obu próbach można zatem stwierdzić, że glikogen zaczął się stopniowo rozkładać.
1