174. Kinaza Wee1, CAK, Cdc25.

Wszystkie te enzymy uczestniczą w regulacji drożdżowego (S. pombe) MPF. U tych drożdży składa się on z ich jedynej CDK i cykliny Cdc2, odpowiednika ssaczej cykliny B (czyli mitotycznej). CDK z tego kompleksu może być fosforylowana na Y15 albo T161. Nieufosforylowany MPF jest nieaktywny. Pierwsze miejsce fosforylacji jest inhibitorowe, a drugie aktywatorowe. Kinaza Wee1 fosforyluje CDK w miejscu inhibitorowym, CAK - w miejscu aktywatorowym. Jednak taki podwójnie ufosforylowany MPF nie jest aktywny i wymaga fosfatazy Cdc25, która odcina resztę fosforanową z Y15. Dopiero takie białko posiada odpowiednie miejsce wiązania substratu.

175. Substraty fosforylacji przez MPF.

Jak już pisałem, MPF fosforyluje wiele białek odpowiedzialnych za rozpoczęcie mitozy (lub blokujących to rozpoczęcie). Przede wszystkim fosforyluje laminy, co rozprasza ich wzajemne oddziaływania i powoduje rozpad blaszki jądrowej. Fosforyluje także niektóre nukleoporyny, przez co NPC rozpadają się na podkompleksy. Fosforylowanych jest też wiele białek integralnych INM (wewnętrznej błony jądrowej) co powoduje osłabienie oddziaływań INM z chromatyną i blaszką, ułatwiając rozpad otoczki.

Fosforylacja SMC, składnika kompleksu kondensyny, powoduje, że kompleks ten zyskuje aktywność skręcania DNA w ciasne zwoje przyczyniając się do kondensacji chromatyny.

176. Geny wczesnej i późnej odpowiedzi na czynniki wzrostowe.

W odpowiedzi na czynniki wzrostowe komórki zatrzymane w fazie G0 aktywują ekspresję licznych genów i przygotowują się do podziału. Aktywowane geny dzielą się na geny wczesnej i późnej odpowiedzi. Aktywność produktów genów wczesnej odpowiedzi pojawia się już ok. 30 min po indukcji i nie jest blokowana inhibitorami translacji białek. Dzieje się tak dla tego, że białka będące produktami tych genów już są w komórce, ale są w stanie nieaktywnym (np. ufosforylowane lub związane z inhibitorami). Na skutek działanie szlaków przekazywania sygnałów indukowanych czynnikami wzrostowymi indukcja jest usuwana, co jest znacznie szybsze niż transkrypcja+translacja. Wśród genów wczesnej odpowiedzi znajdują się głównie czynniki transkrypcyjne promujące proliferację np. c-Jun i c-Fos.

Produkty genów późnej odpowiedzi pojawiają się po ok. 2h i jest to blokowane przez inhibitory translacji. Logiczne zatem, że są to produkty genów, których transkrypcja aktywowana jest produktami genów odpowiedzi wczesnej. Znajdują się wśród nich dodatkowe czynniki transkrypcyjne, ale też np. cykliny i CDK. Jeśli czynniki wzrostowe usunie się z medium przed przejściem przez punkt restrykcyjny (zanim komórka w całości poświęci się podziałowi, jak to się dzieje już było i będzie raz jeszcze) to synteza cyklin i CDK się zatrzymuje, a już wyprodukowane są degradowane i komórka wraca do fazy G0.

177. Przejcie przez punkt restrykcji.

Punkt restrykcji to punkt w cyklu komórkowym w którym zajście podziału jest już niezależne od mitogenów. U kręgowców jest to zwykle w późnej fazie G1 i polega na nagromadzeniu odpowiedniej ilości SPF (o którym już było). Kiedy SPF zacznie działać i pchanie komórkę do fazy S, komórka nie może już zatrzymać mitozy, ponieważ inhibitory cyklin zostały zdegradowane. Nawet jeśli odstawimy mitogeny i składniki odżywcze, komórka podzieli się (lub będzie usiłowała się podzielić. Bezpośrednim przejściem przez punkt restrykcji jest pojawienie się skutków działania SPF, takich jak aktywne cykliny S (było o tym). Do tego wszystkiego potrzebne jest usunięcie inhibitora - pRb, o którym niżej.

178. Funkcja białka Rb

Białko Rb jest inhibitorem przejścia z fazy G1 do S (punkt restrykcyjny). W swojej aktywnej, nieufosforylowanej formie wiąże i blokuje rodzinę czynników transkrypcyjnych E2F, które są kodowane przez geny odpowiedzi późnej. E2F aktywują wiele ważnych dla fazy S genów: geny związane z syntezą DNA i nukleotydów, cyklinę E i A oraz CDK2. Rb jest fosforylowane najpierw przez kompleks cyklina D-CDK4/6. Powoduje to częściową aktywację E2F i pojawienie się kompleksów cyklina E-CDK2, które jeszcze bardziej fosforylują Rb wzmagając jego inhibicję, mamy więc tu do czynienia z dodatnim sprzężeniem zwrotnym (bo produkt E2F wzmaga jego aktywność). Jeśli zakumuluje się wystarczająco dużo cyklina E-CDK2 to Rb jest ufosforylowane nawet kiedy nie ma cyklina D-CDK4/6. To jeden z mechanizmów przejścia przez punkt restrykcyjny (KONIECZNIE dodać do 177), bo aktywność genów przejścia do fazy S zostanie zachowana nawet jeśli ustanie sygnał mitogenny (który daje cyklinę D-CDK4/6).

Rb jest ważnym supresorem nowotworów. Utrata jego funkcji obserwowana jest w bardzo wielu ludzkich nowotworach, a przede wszystkim w retinoblastomie (siatkówczaku), od której to choroby pochodzi nazwa tego białka.

179. Inhibitory kinaz CDK

Inhibitory CDK związanych z cyklinami fazy S (CDK2 u ssaków) to białka z grupy CIP (hehe) - CDK inhibitory proteins. Należą do niej p27, p57 i p21. Hamują one aktywność S fazowych kompleksów cyklina-CDK aż komórka nie będzie gotowa do wejścia w fazę S. Wtedy fosforylowane są przez SPF, co powoduje ich ubikwitynację i degradację. Dodatkowo p21 pojawia się w komórce w odpowiedzi na uszkodzenia DNA i zapobiega proliferacji zmutowanej komórki co mogłoby prowadzić do transformacji nowotworowej. Także białka z grupy INK4 (inhibitory kinazy 4) mają zdolność inhibicji CDK, ale 4 i 6, czyli CDK fazy G1. Zatrzymują one komórkę w fazie G1 w odpowiedzi na uszkodzenie DNA albo na zewnętrzne czynniki hamujące proliferację np. TGF-β1. Inhibitory INK4 często są nieaktywne w ludzkich nowotworach.

U drożdży odpowiednik CIP (hehe) to Sic1.

180. Fosforylacja kompleksów prereplikacyjnych.

U eukariotów każdy chromosom posiada wiele miejsc inicjacji replikacji, a każde z tych miejsc jest odpalane tylko raz na cykl. Dzieje się tak dzięki aktywności cyklin i CDK fazy S. W fazie G1, kiedy ich aktywność jest znikoma lub jej nie ma na miejscach inicjacji replikacji składa się kompleks prereplikacyjny, który składa się z ORC (origin recognition complex - ten jest związany cały cykl) i wielu innych podjednostek, między innymi MCM. CDK związane z cyklinami fazy S fosforylują kompleks prereplikacyjny, powodując dysocjację ORC i start aktywności helikazowej MCMów. Zaczyna się replikacja. Kiedy tylko widełki odsuną się dalej, ORC natychmiast znów wiąże miejsce inicjacji. Jednak nie skalda się nowy kompleks prereplikacyjny, gdyż CDK i cykliny fazy S (a potem też mitotyczne) utrzymują jego podjednostki w stanie ufosforylowanym i podjednostki te nie mogą się wiązać. Dopiero na początku G1, kiedy cykliny i CDK mitotyczne są degradowane, następuje defosforylacja tych podjednostek i utworzenie nowego kompleksu prereplikacyjnego. W ten sposób fosforylacja kompleksu prereplikacyjnego odpowiada zarówno za start replikacji, jak i za zapobieganie kilkukrotnym replikacjom.

---