Н.П. Максимова

молекулярная генетика

Сборник заданий и тестов

Учебное пособие для студентов

специальностей «Биология», «Биоэкология»,

«Биотехнология» высших учебных заведений

МИНСК

БГУ

2003УДК

ББК

М

рецензенты:

к.б.н., доцент кафедры микробиологии БГУ Р.А. Желдакова

член-корреспондент НАН Беларуси, д.б.н. О.Г. Давыденко

к.б.н., доцент кафедры биохимии Гродненского госуниверситета В.И. Резяпкин

Максимова Н.П.

М Молекулярная генетика. Сборник заданий и тестов: Учебное пособие. Мн.: БГУ, 2003. - 87 с.: ил.

Настоящее учебное пособие является сборником более 170 заданий и тестов по избранным разделам молекулярной генетики и молекулярной биологии гена. Рекомендуется для проведения семинарских и лабораторных занятий по курсам "Генетика", "Молекулярная биология гена", "Молекулярная генетика про- и эукариотических организмов", "Структурно-функциональная организация генома" и др., а также самостоятельной работы студентов. Цель пособия - углубить понимание и усвоение материала названных курсов, научиться планировать эксперимент и интерпретировать экспериментальные данные. Пособие предназначено для студентов, магистрантов и аспирантов биологических специальностей.

УДК

ББК

© Н.П. Максимова, 2003

© БГУ, 2003

ВВЕДЕНИЕ

Предлагаемый сборник вопросов, задач, тестов и заданий по избранным разделам молекулярной генетики и молекулярной биологии гена является первым отечественным изданием подобного рода. Рекомендуется в качестве дополнительного материала к лекционным курсам по генетике, а также вышеназванным дисциплинам и может быть использовано при проведении практических, лабораторных занятий, семинаров, а также для самостоятельной работы студентов и проверки их знаний. По этой причине в сборнике отсутствует перечень ответов.

Учебное пособие призвано углубить и закрепить знания студентов по такому важному разделу биологии, как структурно-функцио-нальная организация генов и геномов прокариотических и эукариотических организмов, привить им навыки творческого подхода к изучаемым дисциплинам, а также пробудить интерес к элементам самостоятельной работы.

Перечень использованной при подготовке сборника литературы приведен в конце издания. Кроме того, в сборнике дается список литературы, рекомендуемой автором для проработки материалов по той или иной теме, а также подготовки развернутых ответов на вопросы и задания, для решения задач и поиска верного ответа на тесты.

Раздел 1. СТРОЕНИЕ ДНК И РНК.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Вопросы и задачи

1. Фрагмент мРНК гена инсулина имеет следующее строение:

УУУ ГУУ ГАУ ЦАА ЦАЦ УУА УГУ ГГГ УЦА ЦАЦ

Определите соотношение (А+Т)/(Г+Ц) в молекуле ДНК, соответствующей данному фрагменту.

2. В табл. 1. представлены данные нуклеотидного состава ДНК и мРНК бактерий B. subtilis и E. coli.

Таблица 1

Нуклеотидный состав ДНК и мРНК исследуемых бактерий

Бактерии	ДНК (А+Т)/(Г+Ц)	мРНК (А+У)/(Г+Ц)	мРНК (А+Г)/(У+Ц)
B. subtilis	1,36	1,30	1,02
E. coli	1,00	0,98	0,80

А. Определите, одна или две нити молекулы ДНК используются для синтеза мРНК у этих двух организмов. Ответ поясните.

Б. Объясните, однонитчатой или двухнитчатой является мРНК.

3. РНК, выделенная из ВТМ (вируса табачной мозаики), содержит 20 % цитозина. Можно ли рассчитать процентное содержание аденина в этой РНК?

4. Из бактерий S. afermentans была выделена ДНК и определен ее нуклеотидный состав. Оказалось, что 37 % нуклеотидов содержит цитозин. Можно ли определить процентное содержание аденина в этой молекуле ДНК?

5. Если считать, что молекулярная масса одной аминокислоты в белке составляет примерно 100 Да, какое количество нуклеотидов содержится в мРНК, кодирующей полипептид, молекулярная масса которого равна 27 кДа?

6. Назовите основные отличия между молекулами ДНК и РНК. Какие изотопы обычно используются для их радиоактивного мечения, а также для мечения белковых молекул?

7. Если вирусная частица имеет двухнитчатую кольцевую молекулу ДНК размером 200 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.), сколько нуклеотидов находится в этой молекуле? Сколько полных витков приходится на эту молекулу ДНК? Сколько атомов фосфора содержится в каждой из нитей ДНК?

8. Если в молекуле ДНК содержится 56 % ГЦ пар, каков будет процент А, Т, Г и Ц, соответственно?

9. Укажите, какие из перечисленных ниже утверждений являются верными:

А. А + Т = Г + Ц.

Б. А = Г; Ц = Т.

В. А/Т = Ц/Г.

Г. Т/А = Ц/Г

Д. А + Г = Ц + Т.

Е. Г/Ц = 1.

Ж. А = Т в каждой из цепей.

З. Водородная связь обеспечивает стабильность двойной спирали.

И. Каждая из нитей двойной спирали ДНК идентична друг другу.

К. Если одно основание в цепи ДНК известно, то можно определить соответствующее ему основание в другой цепи.

Л. Каждая пара нуклеотидов содержит две фосфатные группы, две дезоксирибозы и два азотистых основания.

10. Препарат кольцевой плазмидной ДНК подвергли действию указанных в таблице ферментов, а затем с помощью электрофореза осуществили анализ полученных фрагментов. Используя представленную в таблице 2 информацию, постройте рестрикционную карту этой плазмидной ДНК.

Таблица 2

Рестрикционный анализ плазмидной ДНК

Фермент	Размеры фрагментов (в т. п. н.)
Xma I	20
Mbo I	10
Xma I и Mbo I	3, 7 и 10

11. Препарат линейной вирусной ДНК обработали указанными ниже ферментами и их комбинацией. Получившийся набор фрагментов рестрикции подвергли затем электрофорезу. На основании представленных в табл. 3 данных постройте рестрикционную карту вирусной ДНК.

Таблица 3

Рестрикционный анализ линейной вирусной ДНК

Фермент	Размеры фрагментов (в т. п. н.)
Bgl II	5 и 10
Hpa I	5 и 10
Sma I	2 и 13
Bgl II и Hpa I	5
Bgl II и Sma I	2; 5 и 8
Hpa I и Sma I	2; 3 и 10

12. Препарат линейной вирусной ДНК обработали рестриктазой Sma I до полного расщепления. Последующий электрофоретический анализ выявил присутствие ряда фрагментов следующих размеров (в т. п. н.): 10; 7; 6; 3 и 2. Параллельно была взята интактная вирусная ДНК и расщеплена частично той же рестриктазой. Полученные при неполном расщеплении пять фрагментов были обозначены в порядке убывания размеров буквами от А до Е. Затем каждый из этих фрагментов был обработан рестриктазой Sma I до полного расщепления и подвергнут электрофорезу. Полученные результаты представлены в табл. 4. Постройте карту рестрикции Sma I вирусной ДНК.

Таблица 4

Рестрикционный анализ линейной вирусной ДНК

Фрагменты, полученные при неполном расщеплении	Размер фрагментов после полного расщепления (в т. п. н.)
А	10; 6 и 2
B	7; 6 и 2
C	10 и 3
D	7 и 2
E	6 и 2

13. Препарат кольцевой плазмидной ДНК длиной 18 т. п. н. подвергли полной рестрикции ферментом Kut I. Последующий электрофоретический анализ позволил выявить наличие ряда фрагментов следующих размеров: 5,0; 4,0; 3,5; 3,0; 1,5 и 1,0. Неполная рестрикция исходной плазмидной ДНК с помощью той же рестриктазы показала наличие пяти фрагментов, обозначенных буквами от А до Е. Последующая полная рестрикция этих фрагментов той же рестриктазой представлена в табл. 5. Постройте рестрикционную карту кольцевой плазмидной ДНК.

таблица 5

Рестрикционный анализ плазмидной ДНК

Фрагменты, полученные при неполном расщеплении	Размер фрагментов после полного расщепления (в т. п. н.)
А	5,0; 3,0 и 1,0
B	3,5; 3,0 и 1,0
C	5,0 и 1,5
D	3,5 и 1,0
E	4,0; 3,5 и 1,5

14. Фрагмент ДНК длиной 10 п. н. пометили с 5'-конца радиоактивной меткой и затем приступили к определению нуклеотидной последовательности. Результаты этого анализа представлены на рис. 1. Какова нуклеотидная последовательность анализируемого фрагмента?

старт	Ц	Т	А	Г
			__
					__
		__
					__
		__
			__
				__
				__
					__
				__

Рис. 1. Электрофореграмма фрагментов ДНК, используемая

для определения нуклеотидной последовательности:

в первой колонке расщепление фрагмента по Ц, во второй - по Т,

в третьей - по А, а в четвертой - по Г

15. Фрагмент, полученный при расщеплении ДНК C.sativa рестриктазой Bgl II, клонирован в сайте Bam HI плазмиды pBR322. При попытке выделить этот участок из плазмидной ДНК оказалось, что ни Bam HI, ни Bgl II не вырезают фрагмент ДНК Cannabis sativa из плазмиды. Почему? Какую рестриктазу следует использовать, чтобы выделить этот фрагмент ДНК из рекомбинантной плазмиды? (Для решения этой задачи воспользуйтесь данными табл.3, Приложения 3).

16. Линейный фрагмент ДНК EcoR, имеющий длину 2,5 т. п. н. и единственный сайт рестрикции Hpa I, был клонирован в сайте EcoR1 плазмиды длиной 5 т. п. н. Карты рестрикции линейного фрагмента и кольцевой молекулы представлены на рис. 2.

Eco RI

Hpa I Hind III

2,0 0,5

а

б

Рис. 2. Рестрикционные карты линейного фрагмента (а)

и кольцевой молекулы (б) ДНК

Участок линейной ДНК может быть клонирован в обеих ориентациях. Ответьте на вопросы:

1. Каковы два способа ориентации?

2. Если совместная обработка рестриктазами Hind III и Hpa I дает фрагменты, длиной 1,0 и 6,5 т. п. н., какова ориентация клонированного фрагмента в этом случае?

17. Линейная ДНК фага была помечена с двух концов изотопом ³²P и обработана рестриктазами Eco RI и Bam HI. Результаты эксперимента представлены в табл. 6.

Таблица 6

Рестрикционный анализ линейной ДНК фага

Ферменты	Размеры фрагментов (т. п. н.)
Eco RI	2,9; 4,5; 6,2; 7,4 и 8,0
Bam HI	6,0; 10,1 и 12,9
Eco RI и Bam HI	1,0; 2,0; 2,9; 3,5; 6,0; 6,2 и 7,4

Радиоаутограмма электрофореграммы Eco RI-фрагментов показала радиоактивность только двух фрагментов - величиной 6,2 и 8,0 т. п. н. Аналогичная проверка Bam HI-фрагментов показала радиоактивность фрагментов 6,0 и 10,1 т. п. н. Изобразите рестрикционную карту анализируемого фрагмента ДНК.

Затем была проведена Саузерн-блот-гибридизация полученных независимо друг от друга Eco RI и Bam HI фрагментов с радиоактивной пробой фагового гена Х. Было установлено, что гибридизовался один Eco RI фрагмент величиной 4,5 т. п. н. и два Bam HI фрагмента величиной 10,1 и 12,9 т. п. н. Укажите место локализации гена Х на рестрикционной карте фага.

18. Фрагмент ДНК мыши, содержащий ген М длиной 8 т. п. н., имеет Eco RI концы. Этот фрагмент ДНК был включен в состав плазмиды pBR322 в Eco RI-сайт. Рекомбинантная плазмида затем была обработана отдельно рестриктазой Eco RI (I вариант), рестриктазой Bam HI (II вариант) и двумя рестриктазами совместно Eco RI + Bam HI (III вариант). Сведения о величине фрагментов в каждом варианте представлены на рис. 3.

Eco RI			Bam HI			Eco RI + Bam HI
	8 т. п. н.
	6 т. п. н.			5,5 т. п. н. 4,5 т. п. н. 4,0 т. п. н.
								4,0 т. п. н. 3,5 т. п. н. 3,0 т. п. н. 2,5 т. п. н. 1,0 т. п. н.

Рис. 3. Электрофореграммы плазмидной ДНК, полученные с

использованием ферментов Eco RI, Bam HI и их смесью

Гель третьего варианта был подвергнут Саузерн-блот-гибридизации с пробой ДНК плазмиды pBR322, меченной радиоактивным ³²P. Какие фрагменты этого геля будут гибридизоваться с ДНК плазмиды pBR322?

19. Вы имеете очищенную ДНК и хотите осуществить ее рестрикционное картирование. После использования фермента Eco RI ДНК была разрезана на четыре фрагмента: 1, 2, 3 и 4. При последующей обработке каждого фрагмента ферментом Hind II оказалось, что фрагмент 3 дает два субфрагмента (3-1 и 3-2), а фрагмент 2 дает три субфрагмента (2-1, 2-2 и 2-3). После обработки исходной молекулы ДНК рестриктазой Hind II образуется 4 фрагмента: А, В, С и D. Если эти фрагменты обработать рестриктазой Eco RI, фрагмент D дает два фрагмента, 1 и 3. Фрагмент A дает 3-2 и 2-1, а В дает 2-3 и 4. Фрагмент С оказался идентичным с 2-2. Изобразите рестрикционную карту рассматриваемой молекулы ДНК.

20. Вы выделили и затем клонировали фрагмент ДНК величиной 10 т. п. н. Затем 5'-концы ДНК пометили изотопом фосфора ³²P и обработали рестриктазой Eco RI. В результате были получены два меньших фрагмента: один величиной 8,5 т. п. н., а второй - 1,5 т. п. н. После этого проба, содержащая большой фрагмент, была разделена на две части, и одна из них была обработана ферментом Hae III, а другая - Hind II. Затем был произведен электрофорез и получена радиоаутограмма (рис. 4.). Изобразите рестрикционную карту анализируемого фрагмента ДНК.

	←старт→
Hind II		Hae III

Рис. 4. Электрофореграмма фрагмента 8,5 т. п. н.

после обработки ферментами Hind II и Hae III

21. Линейный фрагмент ДНК обработали независимо друг от друга двумя различными рестриктазами - Hind III и Sma I (пробы 1 и 2), а также двумя этими ферментами одновременно (проба 3). Были получены следующие результаты:

• рестриктаза Hind III дала 2 фрагмента - 2,5 и 5,0 т. п. н.;

• рестриктаза Sma I дала 2 фрагмента - 2,0 и 5,5 т. п. н.;

• рестриктазы Hind III и Sma I вместе дали 3 фрагмента -

2,5, 3,0 и 2,0 т. п. н.

Постройте рестрикционную карту этого фрагмента.

Затем смесь фрагментов из третьей пробы обработали еще раз ферментом Eco RI, в результате чего наблюдалось исчезновение полосы, соответствующей фрагменту 3 т. п. н., и появление новой полосы, соответствующей фрагменту 1,5 т. п. н. Обозначьте сайт Eco RI на рестрикционной карте фрагмента ДНК.

22. Ген Х находится на плазмиде размером 5,3 т. п. н. При обработке ДНК плазмиды рестриктазой Bam HI образуется 3 фрагмента: 1, 2 и 3 (рис. 5). Точки В обозначают места, где плазмида разрезается ферментом. Тандемная копия гена Х вмещается по своим размерам в один из Bam HI-фрагментов. Если ген Х кодирует белок величиной 400 аминокислот, в каком фрагменте находятся копии этого гена?

800 п. н.

В В

1

2 1 500 п.н.

3 000 п. н. 3

В

Рис. 5. Рестрикционная карта кольцевой плазмидной ДНК

размером 5,3 т. п. н.

Тесты*

23. Верно ли уравнение?

А + У А + Т

__ (в РНК) = __ (в ДНК).

Г + Ц Г + Ц

А. Да.

Б. Нет.

В. Нет, верными будут только две отдельные формулы:

А + У А + Т

___ = 1 (в РНК) и ___ = 1 (в ДНК).

Г + Ц Г + Ц

Г. Нет, верными будут только формулы:

А = У и Г = Ц (в РНК), а также А = Т и Г = Ц (в ДНК).

24. Геном ВТМ (вируса табачной мозаики) содержит 20 % цитозина. Каково будет процентное содержание урацила?

А. 30 %.

Б. 20 %.

B. ВТМ не содержит РНК.

Г. Определить невозможно.

Д. 80 %.

____________

* Все тесты в сборнике имеют только один правильный ответ.

25. Вы провели эксперимент по выделению нуклеиновой кислоты из бактериофага ϕХ 174 и изучили ее состав. Результаты эксперимента показали следующее содержание нуклеотидов:

А - 25 %; Г - 24 %;

Т - 33 %; Ц - 18 %.

Каким образом можно объяснить эти результаты? Найдите правильный ответ.

А. В геноме бактериофага ϕХ 174 имеется множество мутаций, что вызывает неправильное спаривание оснований А с Г, а Т с Ц.

Б. Геном ϕХ 174 представлен однонитчатой РНК, и в участках локализации мутаций происходит неправильное спаривание оснований.

В. Геном ϕХ 174 представлен кольцевой двухнитчатой ДНК, а для кольцевых геномов правило Чаргаффа не соблюдается.

Г. Геном ϕХ 174 представлен однонитчатой ДНК.

26. Среди молекул РНК наибольшие размеры имеет:

А. тРНК.

Б. мРНК.

В. рРНК.

Г. Размеры всех РНК одинаковы.

27. Археологи обнаружили тело мамонта во льду в зоне вечной мерзлоты. Возник вопрос: какова степень гомологии ДНК мамонта и ДНК ныне живущих индийских слонов? Ответ на него можно получить двумя способами: путем секвенирования (колонка I) и путем гибридизации (колонка II). Что необходимо сделать и в какой последовательности, чтобы ответить на поставленный вопрос?

1. Провести анализ кариотипа мамонта.

2. Осуществить гидролиз ДНК мамонта и слона кислотой или щелочью.

3. Произвести полимеразную цепную реакцию (ПЦР) ДНК мамонта.

4. Выделить из клеток мамонта и слона ДНК.

5. Определить значения Т_m (температура, при которой плавится 50 % молекул ДНК) для ДНК мамонта, слона, а также гибридной ДНК и сравнить их.

6. Произвести секвенирование определенных участков ДНК мамонта и слона.

7. Произвести обработку ДНК мамонта и слона рестриктазами.

8. Осуществить гибридизацию ДНК мамонта и слона.

9. Осуществить трансформацию ДНК мамонта в клетки слона.

10. Осуществить трансформацию ДНК слона в клетки мамонта.

11. Сравнить нуклеотидные последовательности ДНК мамонта и ДНК слона.

Найдите правильные ответы в колонке I и колонке II.

Колонка I А. 4, 2, 3, 6, 11 Б. 4, 3, 7, 2, 6 В. 4, 9, 2, 6, 11 Г. 4, 3, 7, 6, 11 Д. 1, 2, 3, 11

Колонка II А. 1, 7, 4, 5, 8 Б. 4, 9, 8, 5 В. 4, 7, 10, 8 Г. 4, 2, 5 Д. 4, 3, 8, 5

28. Имеются три препарата ДНК. Известно, что один из них получен из печени мыши (ДНК 1), другой из мышц мыши (ДНК 2), а третий из мышц лошади (ДНК 3). Этикетки на пробирках с препаратами ДНК 2 и ДНК 3 стерлись. Можно ли восстановить правильные надписи на пробирках?

А. Можно установить лишь приблизительно, проделав эксперимент по гибридизации известной ДНК 1 с остальными пробами.

Б. Можно установить точно, проделав предыдущий эксперимент. При этом ДНК 1 обязательно должна показать почти 100 %-ю гомологию с ДНК 2 и более низкий уровень с днк 3.

В. Нет, установить невозможно, так как ДНК 1 будет гибридизоваться одинаково как с ДНК 2, так и с ДНК 3, независимо от вида организма.

Г. Нет, установить невозможно, так как эксперимент по гибридизации ДНК вообще не получится. ДНК из разных тканей одного и того же организма не могут подвергнуться гибридизации между собой, так же как и ДНК из разных организмов.

Задание 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

НУКЛЕОТИДОВ В ОЛИГОНУКЛЕОТИДЕ

Олигорибонуклеотид Х был обработан фосфатазой (для удаления 3'- или 5'-терминальных фосфатов) и затем рибонуклеазой Т₁, которая разрывает по 5'-положению все фосфатные связи, находящиеся в 3'-положении у гуанозина. В результате были получены мелкие олигомеры L, M и N в одинаковых количествах. Каждый из них обработали фосфатазой, а затем подвергли щелочному гидролизу. Результаты приведены в табл. 7.

Таблица 7

Состав олигомеров, полученных из олигорибонуклеотида Х

после гидролиза рибонуклеазой Т₁

Олигонуклеотид	Состав, моль/моль олигонуклеотида
L	Уридинмонофосфат-1, Аденозинмонофосфат-1 Цитидинмонофосфат-1, Гуанозин-1
M	Аденозинмонофосфат-1, Цитидин-1
N	Цитидинмонофосфат-2, Гуанозин-1

Затем эксперимент был несколько модифицирован: олигорибонуклеотид Х после обработки фосфатазой гидролизовали панкреатической рибонуклеазой, которая разрывает по 5'-положению все фосфатные связи, находящиеся в 3'-положении у пиримидиновых нуклеозидов. Этот гидролиз позволил получить приблизительно в эквимолярных концентрациях пять остатков: уридинмонофосфат, цитидинмонофосфат и олигонуклеотиды P, Q и R. После разделения и щелочного гидролиза этих олигомеров были получены данные, приведенные в табл. 8.

Таблица 8

Состав олигомеров, полученных из олигорибонуклеотида Х

после гидролиза панкреатической рибонуклеазой

Олигонуклеотид	Состав, моль/моль олигонуклеотида
P	Гуанозинмонофосфат-1 Цитидинмонофосфат-1
Q	Гуанозинмонофосфат-1 Аденозинмонофосфат-1 Цитидин-1
R	Аденозинмонофосфат-1 Цитидинмонофосфат-1

Задача. Пользуясь представленными выше результатами, определите нуклеотидный состав олигомеров L, M и N, затем олигомеров P, Q и R и олигорибонуклеотида Х.

Задание 2. ИЗУЧЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОГО СОСТАВА

И ФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДНК

Из клеток различных бактерий, бактериофага Т2, а также ядер и митохондрий клеток печени кролика была выделена ДНК. Затем образцы ДНК поместили в раствор, содержащий 10^-2 моль/л NaCl и 10^-3 моль/л цитрата натрия (рН 8,0) и произвели измерение оптической плотности при 260 нм, повышая температуру раствора в кювете от 25 до 95 °С и затем медленно понижая ее до 40 °С (табл.9).

Таблица 9

Относительная оптическая плотность препаратов ДНК при 260нм

Температура, °С	Источник ДНК
		M.myсo-ides	E. coli	M. lyso-deikticus	Фаг Т2	Митохондрии клеток печени кролика	Ядра клеток печени кролика
1	2	3	4	5	6	7
25	1,000	1,000	1,000	1,000	1,000	1,000
35	1,000	1,000	-	1,000	1,000	1,000
45	1,005	1,000	-	1,000	1,000	1,000
50	1,015	1,000	1,000	1,010	1,000	1,000
55	1,075	1,000	-	1,075	1,020	1,000
57,5	1,150	1,000	-	1,110	1,030	1,000
60	1,250	1,000	1,000	1,130	1,056	1,005
62,5	1,290	1,015	-	1,170	1,075	1,025
65	1,300	1,050	1,000	1,200	1,110	1,050
67,5	1,302	1,080	1,000	1,235	1,150	1,090
70	1,305	1,110	1,000	1,265	1,200	1,120
72,5	1,302	1,135	1,010	1,300	1,240	1,145
75	1,302	1,175	1,025	1,335	1,265	1,175
77,5	1,302	1,225	1,045	1,365	1,290	1,200
80	1,302	1,250	1,065	1,390	1,295	1,225
82,5	1,302	1,270	1,100	1,400	1,300	1,235
85	1,305	1,275	1,130	1,402	1,300	1,250
87,5	1,300	1,275	1,165	1,400	1,300	1,250
90	1,302	1,275	1,185	-	-	-
95	1,302	-	1,200	-	-	1,250
85	1,300	1,270	-	-	1,300	1,240
80	1,300	1,270	-	1,400	1,300	1,235
75	1,300	1,270	-	1,390	1,300	1,230

Продолжение таблицы 9

Температура, °С	Источник ДНК
		M.myсo-ides	E. coli	M. lyso-deikticus	Фаг Т2	Митохондрии клеток печени кролика	Ядра клеток печени кролика
1	2	3	4	5	6	7
70	1,300	1,260	-	1,380	1,275	1,230
65	1,300	1,250	-	1,360	1,235	1,227
60	1,300	1,225	-	1,340	1,180	1,225
55	1,300	1,180	-	1,300	1,115	1,225
50	1,275	1,125	-	1,250	1,060	1,225
45	1,150	1,075	-	1,200	1,030	1,225
40	1,015	1,030	-	1,150	1,010	1,225

На следующем этапе работы произвели гидролиз образцов ДНК 100 %-ой муравьиной кислотой при 120 °С, полученный материал подвергли хроматографии на бумаге, после чего содержимое каждого пятна элюировали 10 мл воды. Далее определили оптическую плотность (А) элюатов при 260 нм. Результаты измерений приведены в табл. 10.

Таблица 10

Нуклеотидный состав препаратов ДНК

Основание	Коэффициент молярного поглоще- ния^1 ε⋅10^-3	Поглощение (А) растворов оснований, полученных из образцов ДНК
				Фага Т2	E. coli	M. lyso-deikticus	M. mycoides
Аденин	13,0	1,040	1,300	0,910	1,235
Гуанин	7,2	0,324	0,720	1,300	0,216
Цитозин	5,55	0	0,555	0,999	0,167
Оксиметилцитозин	4,4	0,198	0	0	0
Тимин	7,4	0,592	0,740	0,515	0,704
^1 Зависимость молярной концентрации с и поглощения А для кюветы с длиной оптического пути 1 см можно выразить соотношением А =ε⋅с.

Задача 1. Пользуясь результатами табл. 9, изобразите графически зависимость оптической плотности раствора при 260 нм (ось ординат) от температуры (ось абсцисс) для всех образцов ДНК. Определите величину (Т_m). Как изменяется оптическая плотность раствора ДНК при понижении температуры?

Задача 2. Пользуясь результатами табл. 10, определите концентрацию (в микромолях и процентах) каждого из оснований в имеющихся образцах ДНК.

Задача 3. Постройте график зависимости температуры плавления (Т_т) (ось абсцисс) от процентного содержания Г+Ц-пар (ось ординат) для ДНК бактериофага Т2 и изучаемых бактерий. Используя полученный график, определите содержание Г+Ц пар в ДНК кролика и ДНК митохондрий.

Раздел 2. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ

УЧАСТКОВ ГЕНОМА ПРО- И ЭУКАРИОТ

Вопросы и задачи

1. Известно, что геном хлоропластов намного меньше генома бактерий (например, E. coli). Однако по количеству ДНК хлоропласт значительно превосходит бактериальную клетку. Почему? Ответ подтвердите цифровыми данными.

2. В эксперименте была изолирована хромосомная ДНК, включающая ген А. Одна из двух комплементарных нитей этой молекулы ДНК затем была подвергнута гибридизации с мРНК, содержащей участок, соответствующий гену А. После гибридизации образовалась структура, приведенная на рис. 6.

Рис. 6. Структура молекулы после гибридизации ДНК и мРНК

Стрелками указаны границы гена А. Определите, какими структурами представлены обозначенные цифрами участки. Составьте таблицу по образцу табл. 11 и внесите в нее ответы.

Таблица 11

Строение гибридной молекулы

Тип структуры	Номер участка
Гибрид ДНК и РНК
Однонитчатая ДНК
Однонитчатая РНК
Двухнитчатая ДНК
Двухнитчатая РНК

3. Двое мужчин являются потенциальными отцами одного ребенка. Для выяснения отцовства использовали фингерпринт-анализ ДНК. На рис. 7 представлена электрофореграмма ДНК матери, ребенка и двух предполагаемых отцов.

Ответьте на следующие вопросы:

1. Кто является отцом ребенка?

2. Сколько полос на электрофореграмме ДНК сына и предполагаемого отца совпадает? Почему?

3. Имеются ли на электрофореграмме полосы, которые позволяют сомневаться в отцовстве?

4. Известно, что самцы муравьев гаплоидны (n), а самки (матки и рабочие особи) диплоидны (2n). Известно также, что в геноме эукариотических организмов имеется микросателлитная ДНК - короткие тандемные повторы (1-6 нуклеотидов), количество которых является определенным для конкретного организма и составляет аллель микросателлитного локуса. В эксперименте были исследованы микросателлитные фрагменты ДНК 10 рабочих муравьев из одного и того же муравейника, в котором есть только одна матка, и она может спариваться только с самцами из своего муравейника. Два микросателлитных локуса были подвергнуты амплификации с помощью полимеразной цепной реакции. Полученную ДНК затем пометили радиоактивной меткой и произвели электрофорез в полиакриламидном геле.

M P O1 O2

Рис. 7. Электрофореграмма ДНК матери (М), ребенка (Р) и предполагаемых отцов (О1 и О2)

После завершения электрофореза гель был помещен на радиоаутографическую пластинку, и те места, где находилась меченая ДНК, засветились. Ниже представлена радиоаутограмма описанного выше эксперимента.

Особи:	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Локус 1:	-	-	-		-	-		-	-	-
	-		-	-	-		-	-	-	-
Особи:	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Локус 2:		-	-			-	-	-
	-			-	-				-	-
	-	-			-	-			-

1. Сколько аллелей находится в каждом из двух локусов?

2. Определите по результатам анализа локуса 1, какое минимальное число самцов спаривалось с маткой?

3. Определите по результатам анализа локуса 2, какое минимальное число самцов спаривалось с маткой?

5. Какие генетические вопросы можно решить, используя следующие объекты: Zea mays, Drosophila melanоgaster, Saccharomyces сerevisiae, Escherichia coli, бактериофаг λ, прионы?

1. Получить генные мутации.

2. Получить хромосомные мутации.

3. Построить генетическую карту.

4. Изучить мейоз.

5. Изучить митоз.

6. Получить нехромосомные мутации.

7. Использовать Ti-плазмиду Agrobacterium tumefaciens для клонирования генов в данном объекте.

8. Осуществить трансформацию.

9. Изучить регуляцию Lac-оперона.

10. Изучить нуклеотидную последовательность ДНК.

Составьте таблицу по образцу (табл. 14) и внесите в нее ответы. Против наименования объектов укажите соответствующие цифровые обозначения.

Таблица 14

Таблица ответов

Объект	Цифровые обозначения
Zea mays
Drosophila melanоgaster
Saccharomyces cerevisiae
Escherichia coli
Бактериофаг λ
Прионы

6. При анализе факта изнасилования был проведен фингерпринт-анализ, где в качестве пробы была взята кровь жертвы (проба 1), семенная жидкость из ее тела (проба 2) и семенная жидкость трех подозреваемых (пробы 3, 4 и 5, соответственно). Результаты Саузерн-блот-гибридизации представлены на рис. 8.

Ответьте на вопросы: 1. 1. Имеется ли среди подозреваемых субъектов настоящий виновник?

2. Могут ли все подозреваемые быть освобождены от ответственности?

7. Предположим, что последовательность SINE у одного организма имеет длину 50 п. н. ДНК этого организма выделили и подвергли рестрикции ферментом, разрезающим ДНК на фрагменты 100 п. н. После этого провели тепловую денатурацию ДНК с последующим медленным охлаждением (quenching). Что можно увидеть при электронном микроскопировании полученных фрагментов?

8.Фингерпринт-анализ VNTR-повторов членов одной семьи дал следующую картину:

1 2 3 4 5

Рис. 8. Фингерпринт-анализ идентификации личности

———		———			———
	———			———	———
	———	———	———
———			———	———
	———	———			———
———		———	———
———				———	———
	———		———	———
1	2	3	4	5	6

Рис 9. Фингерпринт-анализ VNTR -повторов членов одной семьи.

Исходя из представленных данных, определите число VNTR-локусов, характер наследования, а также число аллелей в каждом локусе.

9. Предскажите возможные результаты гибридизации in situ (количество участков) на препарате хромосом человека при использовании в качестве пробы:

А. Копии какого-либо гена.

Б. Фрагмента теломерного конца хромосомы.

В. рДНК.

Г. SINE-последовательности.

Д. Сателлитной ДНК.

Тесты

10. В зоне ядрышкового организатора локализованы гены:

А. Всех типов рРНК.

Б. Только 5S рРНК.

В. 28S; 18S; 5,8S рРНК.

Г. Только 28S рРНК.

11. На рис. 10 представлены результаты электрофореза амплифицированных с помощью ПЦР фрагментов ДНК членов одной семьи (отец, мать и 9 детей). Отец и 6 детей (3, 5, 7, 8, 10, 11) в этой семье имеют симптомы наследственного заболевания хореей Гентингтона. У отца болезнь проявилась после 40 лет, возраст детей с первыми симптомами заболевания указан на рисунке возле соответствующих фрагментов ДНК. Какова вероятность заболевания 4, 6 и 9-го ребенка в этой семье?

А. 4 и 9-й ребенок здоровы и никогда не заболеют хореей Гентингтона, тогда как 6-й ребенок имеет высокую вероятность заболевания.

Б. 4, 6 и 9-й ребенок не имеют мутаций в геноме и никогда не заболеют хореей.

В. 4, 6 и 9-й ребенок имеют все шансы заболеть в более старшем возрасте, так как заболевание наследуется по доминантно-аутосомному типу.

Г. Двое из трех перечисленных выше детей могут заболеть в будущем, так как это заболевание аутосомно-доминантного

типа, однако представленные на рис. 10 данные не позволяют определить, кто из них заболеет конкретно.

Д. 4, 6 и 9-й ребенок могут быть от разных отцов, и они являются носителями мутации, вызывающей заболевание.

Рис. 10. Электрофоретический анализ фрагментов ДНК

членов семьи, больных хореей Гентингтона

12. Пользуясь информацией вопроса 11, определите, какое из нижеперечисленных заключений является верным.

А. Нет никакой корреляции между возрастом детей с симптомами заболевания и скоростью миграции амплифицированных ПЦР-фрагментов.

Б. Короткие ПЦР-фрагменты соответствуют проявлению заболевания в раннем возрасте.

В. Чем больше размеры амплифицированных ПЦР-фрагментов, тем раньше может проявиться заболевание.

Г. Хорея Гентингтона - это инфекционное заболевание, так как большая часть детей одной семьи заболевает.

Д. Это заболевание вообще не связано с анализируемыми ПЦР-фрагментами.

13. Какие из перечисленных ниже проблем невозможно решить с использованием методики Нозерн-блот-гибридизации?

1. Определение размеров мРНК.

2. Определение времени полужизни мРНК.

3. Идентификация участков ДНК, транскрибируемых в данную мРНК.

4. Определение аминокислотной последовательности белка, кодируемого данной мРНК.

5. Определение относительного содержания мРНК в различных типах тканей.

А. 4 и 5.

Б. 2 и 3.

В. 1 и 4.

Г. 2, 4 и 5.

Д. Можно решить только проблему 3.

14. Была поставлена задача клонировать бактериальный purB-ген. Для этого вначале получили библиотеку геномных фрагментов размером 10-15 т. п. н. путем частичной рестрикции ДНК ферментом EcoR1 и клонирования их в EcoR1-сайт плазмидного вектора. Для идентификации плазмиды, содержащей необходимый ген, было проведено два эксперимента. В первом случае из библиотеки было взято пять плазмид со вставками; которые были обработаны ферментом EcoR1 и подвергнуты электрофоретическому разделению (рис. 11). Во втором случае пять тех же самых плазмид были подвергнуты ПЦР с использованием в качестве праймера определенной последовательности purB-гена и затем осуществлено электрофоретическое разделение синтезированных фрагментов ДНК (рис. 12). Оба геля были обработаны этидиум-бромидом для визуализации ДНК-фрагментов.

1. В каких плазмидах имеется частичное перекрывание фрагментов ДНК?

Рис. 11. Электрофоретический анализ EcoR1-фрагментов

пяти проб плазмидной ДНК со вставками

А. Только в одной паре: плазмидах 3 и 4.

Б. Только в одной паре: плазмидах 3 и 5.

В. В двух парах: 1 и 2, а также 3 и 4.

Г. В двух парах: 1 и 3, а также 2 и 5.

Д. Во всех плазмидах вставки частично перекрываются.

Рис. 12. Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов

2. Какие из перечисленных ниже методов не могут быть использованы для идентификации плазмид, содержащих вставку с purB-геном?

А. Постановка теста на комплементацию с использованием purB-ауксотрофов.

Б. Секвенирование вставок.

В. Гибридизация плазмидной ДНК с пробами, комплементарными purB-гену.

Г. Рестрикционное картирование плазмид.

Д. Использование методики "футпринта".

3. В каких плазмидах находится область, комплементарная праймерам purB-гена?

А. Только во 2-ой.

Б. Только в 5-ой.

В. Только во 2-ой и 5-ой.

Г. Только в 1, 3 и 4-ой.

Д. Во всех тестируемых плазмидах.

15. Ниже перечислены генетические процессы, из которых вам необходимо выбрать тот, который не связан с перестройками генома.

А. Экспрессия иммуноглобулиновых генов у млекопитающих.

Б. Транспозиция бактериофага Mu.

В. Смена типа спаривания у дрожжей.

Г. Образование антигена у трипаносом.

Д. Сплайсинг у Ciliata.

16. Для чего используется инсерционный мутагенез при идентификации плазмид с клонированными генами?

А. Для получения мутантов.

Б. Для секвенирования ДНК рекомбинантных плазмид.

В. Для Саузерн-блот-гибридизации.

Г. Для ПЦР.

Д. Для получения рекомбинантных ДНК.

Е. Для картирования гена.

Задание 1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ

СИНТЕЗ ПИГМЕНТА У ДРОЖЖЕЙ

У гаплоидных дрожжей ген Q, кодирующий синтез белка, молекулярная масса которого равна 50 кДа, имеет следующую рестрикционную карту:

Рис. 13. Рестрикционная карта гена Q

Для изучения молекулярной организации этого гена было получено четыре различных мутации:

Мутация 1 вызвала делецию участка от 0,8 до 1,0 т. п. н., в результате чего был частично инактивирован промотор, что привело к 5-кратному снижению скорости транскрипции. Скорость трансляции мРНК гена Q осталась прежней.

Мутация 2 - точковая нонсенс-мутация, затрагивающая нуклеотид 2, 5 т. п. н.

Мутация 3 - точковая миссенс-мутация, затрагивающая нуклеотид 2,6 т. п. н. Эта мутация устранила сайт разрезания ДНК ферментом Eco R.

Мутация 4 вызвала делецию участка от 2, 0 до 2, 5 т. п. н.

Затем каждая из мутаций изучалась тремя различными методами:

1. Саузерн-блот-гибридизацией. Для этого геномную ДНК каждого мутанта обрабатывали рестриктазой Eco R1, проводили электрофоретическое разделение и денатурацию фрагментов, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с меченой пробой ДНК размером 4,8 т. п. н. Bam H1 фрагмента гена Q;

2. Норзен-блот-гибридизацией. Для этого РНК из клеток каждого мутанта подвергали электрофоретическому разделению, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и обрабатывали меченой пробой ДНК размером 4,8 т. п. н. Bam H1 фрагмента гена Q;

3. Вестерн-блот-гибридизацией. Для этого белки из клеток каждого мутантного штамма подвергали электрофоретическому разделению и обрабатывали меченой пробой анти-Q-антител.

Задание. Изобразите графически результаты гибридизации c применением трех методов для штамма дикого типа и для каждого мутанта отдельно. Для образца используйте рис. 15 (см. стр. 29).

Задание 2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ

СИНТЕЗ ПИГМЕНТА У РАСТЕНИЙ

Для идентификации генов, связанных с синтезом пигмента у растений, был использован метод Саузерн-блот-гибридизации. Использовали растения генотипа RR, у которых цветки окрашены в красный цвет, генотипа Rr с цветками, окрашенными в розовый цвет и генотипа rr с белыми цветками. Рестрикционная карта гена R представлена на рис. 14.

Е - EcoR 1; H - Hind III

Рис. 14. Рестрикционная карта гена R

На первом этапе работы выделяли геномную ДНК из всех трех вариантов растений (RR, Rr и rr), затем каждую пробу обрабатывали рестриктазами: Eco R1 (вариант 1), Hind III (вариант 2) и Eco R1 + Hind III (вариант 3). Полученные образцы подвергали электрофоретическому разделению и затем переносили на нитроцеллюлозный фильтр по известной методике. В качестве пробы для выявления искомых фрагментов ДНК использовали меченую кДНК R гена. Результаты радиоаутографического анализа представлены на рис. 15.

Задача. Предположим, что при постановке эксперимента был поочередно исключен каждый из перечисленных ниже этапов:

А. Обработка ДНК растений рестриктазами.

Б. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК.

В. Денатурация ДНК щелочью.

Г. Капиллярный перенос фрагментов ДНК.

Д. Стабилизация фрагментов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре.

Е. Добавление ДНК-пробы.

Ж. Промывание нитроцеллюлозного фильтра водой на заключительном этапе.

Рис. 15. Саузерн-блот-гибридизация ДНК из растений RR-,

Rr- и rr-генотипа и кДНК пробой R-гена

Определите, как изменился бы вид радиоаутограмм в трех вариантах опыта (растений RR-, Rr- и rr-генотипа) при постановке экспериментов с модификациями от А до Ж.

18

29

0,5

4,5

0,5

Вектор

т. п. н.

10

5

2

1

Плазмиды . .

1 2 3 4 5

Вектор

т. п. н.

1,75

1,5

1,25

1,2

1,0

0,95

0,65

0,55

0,3

0,05

красные цветки розовые цветки белые цветки

(RR) (Rr) (rr)

EcoR1 EcoR1 EcoR1

+ + +

EcoR1 HindIII HindIII EcoR1 HindIII HindIII EcoR1 HindIII HindIII

начало экзон 1 экзон 2

транскрипции интрон

0,2 0,1 0,3 0,4

1,0 0,66 0,56

Е Н Е Е Н Н Е Е

2

14

11

27

26

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

100

(ЦАГ)_п

30

Плазмиды .

1 2 3 4 5

10

5

2

1

---