9.03.2004r.

Regulacja ekspresji genów.

• Spośród wielu tysięcy genów komórkowych wyróżnia się ten, który ma ulec ekspresji.

• Zakres różnic w ekspresji genów między różnymi typami komórek można oszacować przez porównanie składu białek w różnych tkankach.

• białka wspólne dla wszystkich komórek organizmów wielokomórkowych - uniwersalne, niezbędne do utrzymania metabolizmu komórkowego (geny kodujące to białko: housekeeping genes), np.:

- białka strukturalne cytoszkieletu i chromosomów;

- białka niezbędne do budowy retikulum, aparatu Golgiego, białka rybosomowe;

- enzymy podstawowych procesów metabolicznych;

• białka specyficzne, odpowiedzialne za wyróżniające cechy komórki np. u ssaków hemoglobina powstaje tylko retikulujących komórkach rozwijających się komórkach czerwonych i nie można jej wykryć w innych typach komórek, szacuje się że typowe różnicowanie komórki ssaka może syntetyzować ok.10 tys. różniących białka z kolekcji 50 tys. genów.

• ekspresja różnego typu genów powoduje .........................

Każda komórka może regulować wytworzeniu białek poprzez:

• kontrolowanie każdej; jak często dany gen ulega transkrypcji (najważniejsza kontrola ekspresji większości genów)

• kontrolowanie procesów składania (splicing), dojrzewania (processing) pierwotnego transkryptu RNAi i selekcjonowaniu mRNA i decydowanie, który z nich ma ulegać translacji na rybosomach, wybiórcza aktywacja lub inaktywacja białek po ich wytworzeniu.

DNA pierwotny transkrypt RNA mRNA mRNA

białko

kontrola transkrypcji, dojrzewanie RNA- jądro; kontrola translacji, aktywność białka-cytozol

Kontrola transkrypcji (na etapie inicjacji)

Najważniejsza kontrola większości genów, kontrola na tym poziomie zapobiega syntezie zbytecznych produktów pośrednich:

• promotory genów bakteryjnych i eukariotycznych zawierają miejsce inicjacji, w którym rozpoczyna się właściwa transkrypcja oraz sekwencja około 10 nukleotydów powyżej miejsca inicjacji, w której znajduje się miejsce potrzebne polimerazie RNA, aby mogła przyłączyć się do promotora

• geny oprócz promotora mają regulatorowe sekwencje DNA potrzebne do ich uporządkowanego włączenia i wyłączenia

• to czy gen ulega ekspresji, czy też nie, zależy od różnych czynników:

typu komórki, jej otoczenia, wieku i sygnału poza komórkowego.

Rozpoznawanie sekwencji regulatorowych DNA przez białka regulatorowe genów wiążące się z DNA:

• u bakterii krótkie sekwencje regulatorowe DNA, ok. 10 p.z. i działają jak puste przełączniki genu, odpowiedź jak pojedynczy sygnał.

• kombinacje sekwencji DNA i białka jak swoiste przełączniki kontrolujące transkrypcję.

• sekwencje regulatorowe DNA aby mogły działać muszą być rozpatrywane przez białko regulatorowe genów, wiążące się z DNA

• kombinacja sekwencji DNA i białka działa jak swoisty przełącznik kontrolujący transkrypcję

• u eukariotów sekwencje regulatorowe DNA długie, ponad 10 tys. P.z.

• odpowiadają na wiele sygnałów, które w sumie stanowią instrukcje określającą szybkość inicjacji transkrypcji.

Białka regulatorowe:

• rozpoznają specyficzne sekwencje DNA

• powinowactwo tych białek dopasowuje się do powinowactwa dsDNA w regionach regulatorowych (nie w eksonach)

• białka wnikają do większego rowka i tam kontaktują się z zasadami

• białko tworzy wiązania:

• hydrofobowe - wodorowe - z atomami eksponowanymi na krawędzi zasad bez zrywania wiązań wodorowych, które utrzymują zasady w porach. Nie są zrywane inne wiązania, które utrzymują zasady w porach.

• jonowe

• każde pojedyncze wiązania tego typu są słabe

• wiązania między DNA a białkiem są najsilniejsze w biologii i są specyficzne

• każdy przykład rozpoznawania cząsteczki DNA przez białko jest jedyny w swoim rodzaju, ale wiele białek zawiera jeden lub kilka stałych motywów pofałdowania cząsteczki, które dopasowują się do większego rowka

• najpierw białka tworzą dimery (parują się), dopiero później się łączą z helisą, dlatego są dwa razy mocniejsze

• pewien segment białka (domeny), które bezpośrednio łączą się z DNA jest to ....... podział białek

Białka regulatorowe DOMENY:

• helisa - zwrot - helisa

• palec cynkowy

• suwak leucynowy

• helisa - pętla - helisa

• helisa - skręt - helisa

Domena typu helisa - skręt - helisa:

• zbudowana jest z dwóch helis α oddzielonych skrętem w łańcuchu białkowym - I helisa α ze skrętem β

• umiejscawiają drugą helisę α na powierzchni β w taki sposób, że pasuje ona do większego rowka DNA

• struktura skrętu ma specyficzna konformację, zwaną skrętem β, składającym się z 4 aminokwasów

• II helisa α

Domena - palec cynkowy:

• poznano 6 różnych wersji - aminokwasy tworzą dwie struktury - spiralę β i następnie po niej helisę α, z których powstaje palec wystający z powierzchni białka

• niektóre białka mają 2 - 4 palce Zn

• palec cynkowy skład się z ok. 12 aminokwasów, 2 cystein i 2 histydyn

• aminokwasy tworzą strukturę harmonijki β (spinka β)

• helisa α jest tą częścią domen, które oddziałują w większym rowku DNA

Wstęga - helisa - wstęga:

• 2 nie rozpoznające, specyficzne oddziaływania DNA

• z większym rowkiem łączy się harmonijka β

• występują w bakteryjnych białkach regulatorowych

Oddziaływania między DNA i białkami:

• białka wiążą się z DNA wiązaniami niekowalencyjnymi

• w większym rowku DNA, zasady azotowe i grupy R aminokwasów

• struktury rozpoznające białka łączą się za pomocą wiązań wodorowych, w niektórych przypadkach tworzy się bezpośrednio z większym rowkiem lub przez wodę

• tworzą dimery, mają domeny HTH oraz z palcmi cynkowymi

• wiele białek, oprócz domeny wiążącej DNA, ma również charakterystyczne domeny łączące białko - białko i powstaje dimer - domena suwak leucynowy

• z jednej strony na powierzchni helisy α znajdują się reszty leucynowe, które łączą się z resztami leucynowymi drugiej cząsteczki białka tworząc dimer

Główne cechy regulacji genów eukariotycznych:

• 3 rodzaje polimeraz RNA

• polimerazy RNA I i III dokonuje transkrypcji genów kodujących rybosomowe, transportujące i małe RNA, które w komórkach odgrywają rolę strukturalną

• polimeraza RNA II transkrybuje ogromną większość genów eukariotycznych, w tym wszystkie geny kodujące białka

• eukariot. Polimerazy do rozpoczęcia transkrypcji potrzebują współdziałania dużej grupy białek, zwanych ogólnymi czynnikami transkrypcyjnymi, które przed rozpoczęciem transkrypcji muszą w miejscu promotorowym utworzyć kompleks z polimerazą

• białka regulatorowe genów mogą wpływać na inicjację transkrypcji, nawet gdy są związane z DNA, leżącym w odległości 1000 p.z. od promotora

- pojedynczy promotor może być kontrolowany nieograniczoną liczbą sekwencji regulatorowych rozrzuconych wzdłuż nici DNA

• inicjacja transkrypcji musi uwzględnić nawinięcia DNA na nukleosom (zwarte formy struktury chromatyny)

Czynniki transkrypcyjne dla polimeraz RNA (Eucaryota):

• białka aktywujące inicjację transkrypcji przez polimerazę RNA II i III

• białka te tworzą kompleksy na wszystkich promotorach transkrybowanych przez RNA II

• białka specyficzne wiążące się do konkretnych sekwencji DNA, mające za zadanie:

• usytuowania polimerazy RNA II na promotora

• wspomaganie rozdzielania 2 nici DNA, aby umożliwić rozpoczęcie transkrypcji

• uwolnienie polimerazy DNA z promotora, kiedy transkrypcja się rozpoczyna.

Składanie się ogólnych czynności transkrypcyjnych na promotora:

• związanie czynnika transkrypcyjnego TF II D do krótkirj dwuniciowej helisy DNA o sekwencji złożonej gł. Z nukleotydów T i A (sekwencja TATA jest kluczowym składnikiem wszystkich promotorów wykorzystywanych przez polimerazą RNA II)

• podczas wiązania do DNA TF II D powoduje silne wygięcie DNA, które staje się punktem orientacyjnym.

Eukariotyczne białka regulatorowe mogą kontrolować ekspresję oddzielonych genów:

• niemalże wszystkie promotory eukariot. Potrzebują białek regulatorowych, aby wspomóc proces łączenia się czynników transkrypcyjnych polimerazy RNA

• miejsca DNA, do których przyłączają się aktywatory genów eukariot., to sekwencje wzmacniające, ich obecność zwiększa (wzmacnia) tempo transkrypcji

• białka aktywatorowe mogą wiązać się sekwencjami oddalonymi tysiące p.z. od promotora

• aktywatory eukariot. Mogą wpływać na transkrypcję, geny wiążąc się do sekwencji położonej przed i za genem

• model działania na odległość: między sekwencjami wzmacniającymi a promotorem tworzy się pętla, która pozwala białka aktywatorowe związać z sekwencją wzmacniającą, kontaktować się z polimerazą RNA lub z jednym z czynników transkrypcyjnych, które zwiążą się z promotorem

• u eukariotów białka regulatorowe wiążą się z odległymi sekwencjami regulatorowymi, mogą zmniejszać i zwiększać aktywność polimerazy RNA przyłączanej do promotora

Upakowanie DNA a chromatyna (chromatyna - kompleks DNA i białek chromosomowych):

• od stopnia upakowania chromatyny w danym fragmencie chromosomu zależy, czy geny znajdujące się w tym regionie będą ulegać ekspresji, czy DNA jest dostępny dla białek regulatorowych, czynności transkrypcyjnych i polimerazy RNA

• wydaje się, że geny ulegające ekspresji występują w chromatynie rozproszonej, jednak DNA nadal nawinięty jest na nukleosomy

• nukleosomy mogą hamować inicjację transkrypcji, jeśli zajmują pozycję przed promotorem, prawdopodobnie uniemożliwiają wiązanie się ogólnych czynników transkrypcyjnych lub polimerazę RNA

• Eucaryota rozwinęły kilka mechanizmów, które umożliwiają transkrypcję DNA nawiniętego na nukleosomy (we wczesnym etapie poznania)

Geny eukariotyczne są regulowane przez kombinacje białek:

• Białka regulatorowe działają w zespołach

• Są niezbędne do zapoczątkowania ekspresji genów i decydują, czy ekspresja zachodzi we właściwej komórce, w odpowiednim czasie i na wymaganym poziomie

• Sekwencje kontrolujące ekspresję genów mogą rozciągać się wzdłuż długich obszarów DNA

• Kontrola kombinatoryczna - sposób współpracy grupy białek w ustaleniach ekspresji pojedynczego genu na zainicjonowanie transkrycji u eukariota ma wpływ wiele różnych białek wiążących się z sekwencją regulatorową

• Większość genów ma kontrolę regionu DNA, zawierającego liczne miejsca rozpoznawane przez białka aktywujące i hamujące ekspresję

Jedno białko może koordynować ekspresję różnych genów:

• Komórka eukariotyczna może szybko i rozstrzygająco włączać całe grupy genów poprzez uzupełnienia kombinacji niazbędnej do aktywacji lub represji genu pojedynczym białkiem regulatorowym (jak dodanie ostatniego numeru w zamku cyfrowym)

• To samo białko może uzupełnić kombinacje zespołu białek dla kilku różnych genów.

5

---