Biologia molekularna, sylabus 2 bloku tematycznego

Molekularna organizacja informacji genetycznej i jej zaburzenia

Cytogenetyczna nomenklatura chromosomów człowieka

• klasyfikacja chromosomów człowieka (7 grup)

Za kryteria klasyfikacji przyjęto:

1. wielkość chromosomów

2. położenie centromeru

3. rozmieszczenie prążków w chromosomach

Na podstawie powyższych kryteriów wyodrębniono poszczególne pary homologicznych chromosomów somatycznych (autosomów) oznaczone numerami od 1 do 22. Chromosomy płci (heterochromosomy) wydzielono jako odrębną parę i oznaczono symbolami X i Y. Autosomy podzielono na 7 grup od A do G. Chromosom X jako najbardziej podobny do chromosomów 6 pary przydzielono do grupy C, a chromosom - do grupy G.

Do grupy A zaliczono pary 1-3. Chromosomy 1 i 3 to duże chromosomy metacentryczne. Chromosom 2 jest submetacentryczny.

Do grupy B zaliczono pary 4-5. Są to duże chromosomy submetacentryczne

Do grupy C zaliczono pary 6-12 i chromosom X. Wszystkie chromosomy w tej grupie są submetacentryczne, średniej wielkości i odróżnienie poszczególnych par i chromosomu X w barwieniu rutynowym jest niemożliwe.

Do grupy D zaliczono pary 13-15. Są to duże chromosomy akrocentryczne, mogą posiadać nitki satelitonośne i satelity.

Do grupy E zaliczono pary 16-18. Para 16 to chromosomy małe, prawie metacentryczne. Para 17 i 18 to małe chromosomy submetacentryczne.

Do grupy F zaliczono pary 19 i 20. Są to najmniejsze chromosomy metacentryczne.

Do grupy G zaliczono pary 21 i 22. Są to małe chromosomy akrocentryczne, mogą posiadać nitki satelitonośne i satelity. Chromosomy pary 21 są mniejsze niż chromosomy pary 22. Chromosom Y zaś nigdy nie posiada satelitów. W barwieniu rutynowym można go odróżnić od chromosomów pary 21 i 22 charakterystycznym równoległym ułożeniu ramion długich.

chromosomy metacentryczne- gdy centromer jest w środku chromosomu i ramiona górne są równe dolnym

chromosomy submetacentryczne- gdy centromer jest przesunięty bliżej jednego końca i ramiona górne są krótsze od dolnych

chromosomy akrocentryczne- gdy centromer jest położony blisko jednego końca i ramiona górne są bardzo krótkie, a dolne bardzo długie

chromosomy teocentryczne - gdy centromer znajduje się na samym końcu chromosomu i wtedy brak jest ramion górnych, a obecne są tylko ramiona długie. U człowieka chromosomy teocentryczne nie występują, ale występują one u myszy.

Ideogram - wykres obrazujący różnice w wielkościach danego parametru za pomocą wielu takich samych obrazków.

histogram

kariotyp - zestaw chromosomów występujących w komórce somatycznej, właściwy każdemu organizmowi, o charakterystycznej liczbie i morfologii.

zapis wyników badań cytogenetycznych (numeracja prążków, wykaz skrótów, zapis aberracji chromosomowych, zapis loci genów);

Polimorfizm genetyczny

Polimorfizm - w genetyce oznacza występowanie różnic w DNA populacji. Polimorfizmem nie określa się jednak zmian rzadkich. Kryterium zaliczenia do tej kategorii jest, aby dana zmiana była częstsza niż 1% (innymi słowy zbyt częsta, by można było mówić o mutacji).

Polimorfizm można podzielić na:

- SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism) - polimorfizm pojedynczego nukleotydu;

- polimorfizm sekwencji mini - i mikrosatelitarnych.

Polimorfizm może odnosić się do sekwencji kodujących lub niekodujących. Polimorfizm genowy oznacza występowanie różnorodnych odmian danego genu, co w konsekwencji może prowadzić do różnic w budowie i działaniu białka kodowanego przez ten gen. Przykładem jest podatność na działanie alkoholu etylowego wśród rasy azjatyckiej, związana z różnicą w budowie enzymu dehydrogenazy alkoholowej. Natomiast zmiany w sekwencjach niekodujących mogą prowadzić do zmiany ekspresji białek.

Zjawisko polimorfizmu pojedynczych nukleotydów wykorzystuje się w technice RFLP (ang. Restriction Fragments Lenght Polymorphism).

SSLP - polimorfizm długości prostych sekwencji.

SSLP są powtórzeniami prostych sekwencji, przejawiają różnicę w długości, a więc różnymi allelami zawierającymi różną liczbę jednostek powtarzalnych. SSLP może być wieloallelowe, w odróżnieniu od RLFP, bo każdy SSLP może mieć wiele wariantów długości. Istnieją dwa typy SSLP:

• polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych [STRP = short tandem repeat polymorphism], znane również jako proste powtórzenia tandemowe, w których powtórzeniami są znacznie krótsze jednostki, przeważnie 2-,3- lub 4-nukleotydowe.

• polimorfizm sekwencji minisatelitarnych [VNTR = variable number tandem repeats]

znane także jako zmienna ilość powtórzeń tandemowych, w którym jednostka powtarzalna ma kilkadziesiąt nukleotydów długości.

Jako markery mikrosatelity są o wiele bardziej popularne niż minisatelity z 2 powodów.

> Po pierwsze, minisatelity nie są równo rozprzestrzenione w genomie, lecz częściej znajduje się je bliżej końców chromosomów. Mikrosatelity są dogodniej rozmieszczone w genomie.

>Po drugie. Najszybszym sposobem oznaczania polimorfizmów długości jest reakcja PCR, a za jej pomocą znacznie szybciej i dokładniej oznacza się sekwencje krótsze niż 300 bp. Większość alleli minisatelitarnych jest dłuższa, gdyż jednostki powtarzalne są stosunkowo długie i często jest ich wiele w jednym ciągu. Typowy mikrosatelita zawiera 10-30 kopii powtarzalnej sekwencji nie dłuższej niż cztery bp, i dlatego lepiej nadaje się do oznaczenia w reakcji PCR. Dotychczas w genomie człowieka znaleziono około 10 000 mikrosatelitów, ale prawdopodobnie jest ich znacznie więcej.

• polimorfizm pojedynczych nukleotydów [SNP = single nucleotide polymorphism] - zwane inaczej polimorfizmami punktowymi. Stanowią bardzo licznie występujące w genomie pojedyncze mutacje punktowe. Niektóre równocześnie prowadzą do RFLP, choć nie większość, ponieważ sekwencji, w obrębie których leżą SNP, nie rozpoznaje żaden enzym restrykcyjny. Uważa się, że w genomie człowieka jest ponad 20 000 SNP położonych w genach i prawdopodobnie dziesięć razy tyle, a możę i więcej w DNA pozagenowym. Każdy SNP ma tylko 2 allele, zatem z punktu widzenia mapowania genów człowieka ma te same wady co RFLP, istnieje duże prawdopodobieństwo, że wszyscy członkowie rodziny będą homozygotyczni pod względem pojedynczego SNP. Zaletą SNP jest ich olbrzymia liczba i możliwość oznaczania metodami nie wymagającymi elektroforezy w żelu. Jest to istotne dlatego, że elektroforeza w żelu jest trudna do zautomatyzowania, więc każda metoda detekcji na niej oparta będzie stosunkowo powolna i pracochłonna. Wykrywanie SNP jest szybkie, gdyż opiera się na analizie hybrydyzacji z oligonukleotydami. Oligonukleotyd to krótka, syntetyzowana chemicznie, jednoniciowa cząsteczka DNA, zwykle krótsza niż 50 nukleotydów. Jeśli warunki są odpowiednie, oligonukleotyd będzie hybrydyzował z inną cząsteczką DNA tylko wtedy, gdy na całej swojej długości utworzy z nią pary nukleotydów. Jeśli pojawi się jednonukleotydowa różnica, jedna pozycja oligonukleotydu nie utworzy pary i hybrydyzacja nie zachodzi. Hybrydyzacja z polinukleotydami pozwala rozróżnić dwa allele SNP. Strategia poszukiwania obejmuje następujące sposoby:

• Technologię „chip” DNA

• Dynamiczną hybrydyzację specyficzną dla allelu (DASH)

Metodyka analiz cytogenetycznych: techniki hodowli komórkowych - limfocytów, fibroblastów, amniocytów, komórek trofoblastu, indukowana transformacja blastyczna

• fitohemaglutynina (faseolina) - stymulator wzrostu do namnażania komórek z pobranego materiału w hodowli in vitro

• kolchicyna - alkaloid wytwarzany przez zimowit jesienny, działa niszcząco na wrzeciono kariokinetyczne w czasie mitozy lub mejozy oraz na cytoszkielet komórki, poprzez uniemożliwianie polimeryzacji mikrotubul. Prowadzi to do nierozdzielenia chromosomów do komórek potomnych i zwiększenia u nich liczby chromosomów. Kolchicyna wykorzystywana jest w rolnictwie do wytwarzania poliploidów. Poza tym jest silną trucizną.

• Kolcemid - używany w cytogenetyce jest pochodną kolchicyny, ale jest mniej toksyczny. Depolimeryzuje mikrotubule i ogranicza ich formowanie, co zatrzymuje komórki w metafazie.

• szok hipotoniczny (chlorek sodu) - jest to roztwór 0,075 M NaCl. Jego działaniu poddawane są preparowane komórki w celu uzyskania rozproszenia chromosomów. (Następnie komórki są utrwalane w mieszaninie lodowatego kwasu octowego i metanolu).

• Kariogram - graficzne przedstawienie zestawu chromosomów danej komórki.

Kariogram sporządza się, wykonując mikrofotografię wybarwionych prążkowo płytek metafazowych, a następnie z otrzymanych odbitek fotograficznych wycina sięchromosomy i układa w pary homologiczne, stosując kryteria wielkości, położenia centromeru oraz wzorów prążkowych.

Zasady sporządzania kariogramu opracowano na międzynarodowej konferencji cytogenetycznej w Paryżu w 1971 r.

• uzyskiwanie amniocytów przez amniopunkcję - komórki płynu owodniowego (Amniocyty) uzyskiwane są przez amniopunkcję między 15-18 tygodniem ciąży. Czas badania wynosi około 10-21 dni.

• otrzymywanie komórek trofoblastu metodą aspiracji - komórki trofoblastu otrzymuje się drogą aspiracji przez powłoki brzuszne lub przez szyjkę macicy między 10-14 tyg. ciąży

Metody analizy chromosomów - barwienia: GTG, HRT, QFQ, RHG, CBG, technika Ag-NOR

Barwienie GTG - wykrywanie prążków G

Barwienie QFQ - wykrywanie prążków Q

Barwienie RBA - wykrywanie prążków R

Barwienie CBG - wykrywanie prążków C

Barwienie HRT (High Resolution Technique) - metoda uzyskiwania chromosomów o zwiększonej rozdzielczości obrazu prążkowego (chromosomy prometafazowe i profazowe).

• prążki G - wybarwia się je najczęściej traktując preparaty chromosomowe enzymami proteolitycznymi, np. trypsyną i barwi barwnikiem Giemsy. Otrzymujemy wówczas chromosomy wybarwione na prążki ciemne i na prążki jasne. Ciemne prążki G odpowiadają regionom o dużej zawartości par zasad A-T z późno replikującym DNA. Regiony te zawierają heterochromatynę z nielicznymi aktywnymi genami. Od prążków jasnych różnią się także zawartością i składem białek. Ta heterochromatyna bogata jest w mostki siarczkowe S-S. Duża ilość wiązań zawierają białka niehistonowe.

Prążki jasne odpowiadają regionom o dużej zawartości par zasad G-C i jest to wcześnie replikująca euchromatyna.

Wzór prążków G jest unikatowy dla każdej pary homologów. Prążki obrazują odmienną kondensację chromatyny co umożliwia identyfikację każdego chromosomu z pary homologicznej.

• prążki Q - do ich wybarwiania używa się 2 rodzajów fluorochromów:

1. mających zdolność do jonowego wiązania DNA i zdolność do interakcji między płaszczyznę jego zasad, np. oranż akrydynowy

2. fluorochromy interkalujące do podwójnego łańcucha DNA i wykazujące powinowactwo do pewnych zasad, np. atebryna (Q) i jej pochodne oraz iperyt akrychinowy (QM)

Silnie fluoryzujące prążki ujawniają regiony DNA bogate w pary A-T, wygaszanie fluorescencji - pary G-C.

Niektóre części chromosomów człowieka wykazują bardzo silną fluorescencję, np:

• Okolice centromeru chromosomu 3 z grupy A

• Satelity chromosomów akrocentrycznych

• Dystalne odcinki ramion długich chromosomu Y

• prążki R - stanowią odwrotność prążków G (rejony w prążkach G zabarwione na ciemno w prążkach R są jasne i na odwrót)

Ciemne prążki R - rejony chromosomów zawierające DNA bogaty w pary C-G, jasne prążki zaś - A-T. Wzór prążków R może być uzyskiwany różnymi technikami (RHG, RBA, RBG). Barwienie to ujawnia drobne aberracje niedostrzegalne przy wybarwianiu prążków G lub C.

• prążki C - przy pomocy wybarwiania prążków C wykrywa się heterochromatynę konstytutywną. Prążki C wybarwiają się barwnikiem Giemsy w obszarze heterochromatyny centromerowej i przycentromerowej chromosomów po uprzedniej ich inkubacji w roztworze wodorotlenku baru. Rejony te zbudowane są z powtarzających się sekwencji satDNA związanego silnie ze specyficznymi białkami niehistonowymi, które chronią DNA.

Barwienie chromosomów człowieka na obecność prążków C ujawnia wybarwione na ciemno regiony centromerów i okolice przycentromerowe (przewężenia wtórne). Co ciekawe, u człowieka wielkość przewężeń wtórnych chromosomów par 1,9 i 16 jest cechą polimorficzną.

Barwienie metodą AgNOR - jest to barwienie organizatorów jąderkowych.

Organizatory jąderka zlokalizowane są w nitkach satelitonośnych chromosomów akrocentrycznych. Zawierają geny rybosomalne dla 18S i 28S rRNA. Organizatory w których odbywa się transkrypcja rRNA są wybarwiane azotanem srebra.

Ta metoda barwienia służy do badania polimorfizmu nitek satelitonośnych i satelitów oraz aberracji ramion krótkich chromosomów akrocentrycznych.

Ponadto metoda AgNOR jest również stosowana do identyfikacji chromosomów markerowych, które często są utworzone z ramion krótkich chromosomów akrocentrycznych.

• heterochromatyna konstytutywna - to heterochromatyna z bardzo ciasno upakowanym DNA, który w większości nie bierze udziału w procesie transkrypcji i występuje w taki sam sposób we wszystkich komórkach organizmu, niezależnie od ich stopnia specjalizacji. W komórkach ssaków znajdowana jest głównie wokół centromeru i przy końcach chromosomów. Heterochromatyna konstytutywna to heterochromatyna obecna w tych samych miejscach w chromosomach homologicznych. Replikuje się w późnej fazie S cyklu komórkowego.

• regiony jąderkotwórcze - Organizator jąderka (NOR z ang. nucleolus organizer region) jest to fragment genomu zawierający powtarzające się sekwencje kodujące cząsteczki 18S i 28SrRNA, podzielone intronami. Po zakończeniu podziału komórkowego i odtworzeniu normalnej struktury jądra komórkowego ten odcinek chromosomu znajdzie się wewnątrz jąderka.

Metoda hybrydyzacji in situ i jej pochodne

M-FISH (wielokolorowa FISH)

Zasada: Technika polega na jednoczesnym wybarwieniu wszystkich chromosomów na różne kolory (każda sonda specyficzna dla danego chromosomu znakowana kombinacją jednego lub kilku barwników fluorescencyjnych). Sondy malujące tak przygotowane, aby nie wiązały się z sekwencjami powtarzalnymi i chromosomowo niespecyficznymi (zablokowane sekwencje centromerowe i regiony heterochromatyny).

Zastosowanie:

- diagnostyka aberracji strukturalnych chromosomów - zwłaszcza złożonych translokacji (z udziałem kilku chromosomów lub niewidocznych w analizie prążkowej tzw. Ukrytych translokacji - obejmujących fragmenty o identycznym wzorze prążkowym)

- identyfikacja chromosomów markerowych, neocentrycznych chromosomów markerowych (NMC) lub dodatkowego materiału nieznanego pochodzenia znajdującego się w którymkolwiek z chromosomów

- diagnostyka cytogenetyczna komórek nowotworowych (identyfikacja licznych i złożonych aberracji liczbowych i strukturalnych chromosomów - często analiza na podstawie barwień klasycznych niemożliwa ze względu na niską rozdzielczość prążków i małą liczbę metafaz)

M-FISH a chromosomy markerowe:

→ zastosowanie przy nietypowym wyglądzie chromosomu markerowego (aby ustalić jego pochodzenie)

uwaga!

małe odcinki euchromatyny mogą zostać niewykryte; również chromosom markerowy zawierający jedynie sekwencje centromerowe (zablokowane sekwencje powtarzalne) może zostać niezdiagnozowa - rozwiązanie cenM-FISH (Centromere-specific multi-color FISH) - pozwala na identyfikację centromerów z wykorzystaniem znakowanego centromerowego DNA jako sondy; technika użyteczna w charakterystyce małych nadliczbowych chromosomów markerowych pozbawionych lub z niewielką ilością euchromatyny

M-FISH (Multiplet In situ hybridization) - metoda, w której wykorzystano fluorescencyjne znaczniki DNA. Znaczniki te łączą dużą czułość z dobrą rozdzielczością i są idealne do hybrydyzacji In situ. Udało się wymyślić znaczniki fluorescencyjne o różnym kolorze emisji (ok. 24 kolory), co umożliwia hybrydyzowanie wielu różnych sond do jednego chromosomu i rozróżnianie poszczególnych sygnałów hybrydyzacji, pozwalając zmapować względne pozycje sekwencji sond. (Aby zmaksymalizować czułość, sonda powinna być wyznakowana najsilniej, jak to jest możliwe, co w przeszłości oznaczało, że musi być nią całkiem długa cząsteczka DNA, przeważnie sklonowany fragment DNA o długości co najmniej 40kb, jak na przykład klon kosmidowy. Wymaganie to jest obecnie mniej istotne, gdyż powstały techniki umożliwiające silne wyznakowanie krótszych cząsteczek.)

Hybrydyzacja M-FISH podzielona jest na trzy etapy:

1. Znakowanie wszystkich chromosomów w genomie różną liczbą odmiennych fluorochormów w odpowiedniej kombinacji, tak, że każda homologiczna para w genomie jest unikalnie oznaczona.

2. Obserwacja mikroskopowa i cyfrowe pozyskiwanie danych każdego fluorochromu, używając specyficznych filtrów i przeznaczonego oprogramowania. Pozyskane obrazy są nakładane zezwalając każdemu chromosomowi na bycie zaklasyfikowanym dzięki odpowiednim rozpoznaniu go za pomocą odpowiadającego mu koloru fluorochromu

3. Szczegółowa analiza cyfrowo otrzymanych i przetworzonych obrazów do zdiagnozowania submikroskopowych aberracji chromosomowych, identyfikacji złożonych aberracji struktury chromosomów, identyfikacja dodatkowego materiału chromosomowego, chromosomów markerowych czy diagnostyka aneuploidii chromosomowych.

FIBER-FISH

• Hybrydyzacja do włókien chromatynowych - wykorzystuje chemiczne i fizyczne działania na chromosomach interfazowych rozluźniające i prostujące włókna chromatyny tak, że obrazowane mogą być pojedyncze pętle DNA

• Możliwe odróżnienie sond leżących w odległości kilku kpz od siebie

Analizując wynik hybrydyzacji zwracamy uwagę na:

1. liczbę sygnałów na danym włóknie, które obejmuje zazwyczaj loci o znanej lokalizacji

2. wzajemne położenie tych loci

Uwaga: kiedy kolejność testowanych loci na włóknie znana - przedstawiamy je w porządku pter do qter

• Wykorzystuje chemiczne i fizyczne działania na chromosomach interfazalnych, rozluźniające i prostujące włókna chromatyny, obrazowane mogą być pojedyncze pojedyncze pętle DNA (ok.100 000 pz).

• Można odróżnić sondy oddalone od siebie o kilka kpz.

• Widmowa analiza chromosomowa

Porównawcza hybrydyzacja genomów (CGH)

Technika umożliwia mapowanie zmian liczby kopii określonych sekwencji DNA w chromosomach bez uprzedniej wiedzy o ich istnieniu, czy też znajomości ich umiejscowienia w genomie.

Główne założenie:

jednoczesna i kompetytywna hybrydyzacja dwu znakowanych różnymi fluorochromami izolatów DNA uzyskanych z komórek pacjenta oraz komórek prawidłowych (sondy) do normalnej płytki metafazowej (DNA znakowany jest przede wszystkim w reakcji nick-translacji)

Co jest potrzebne: preparat cytogenetyczny (chromosomy osoby o prawidłowym kariotypie), DNA osoby badanej wyznakowany jednym fluorochromem (np. fluorescencja zielona), DNA kontrolny - prawidłowy DNA wyznakowany innym fluorochromem (np.fluorescencja czerwona), Cot1 DNA do wysycenia regionów zawierających sekwencje wysoko powtarzające się.

Przebieg analizy: Po przeprowadzeniu hybrydyzacji do płytek metafazowych mieszaniny DNA znakowanego odpowiednio na zielono (DNA pacjenta) i na czerwono (DNA referencyjny otrzymany z prawidłowych komórek dawcy) [sondy konkurują o DNA chromosomu] podlegają dalszej analizie z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego i kamery CCD podłączonej do komputera.

Analiza wyników: Po ułożeniu kariotypu - analiza stosunku fluorescencji na całej długości chromosomów dzięki zastosowaniu specjalistycznego programu komputerowego; najczęściej analizuje się 10 - 16 chromosomów dla każdego przypadku; wyniki analizy w postaci profili intensywności fluorescencji w obu kolorach oraz wartości stosunku „zieleń : czerwień” wzdłuż każdego chromosomu. Wartość >1 lub <1 w określonym regionie danego chromosomu oznacza odpowiednio zwiększenie lub zmniejszenie w DNA nowotworowym liczby kopii sekwencji DNA specyficznej dla tego regionu ; nieprawidłowe regiony chromosomów (wykazujące delecje, duplikacje) można charakteryzować wykorzystując specyficzne sondy i klasyczną technikę FISH. Odchylenia od osi pionowej (stosunek równy 1) w kierunku czerwieni świadczą o delecji materiału genetycznego w danym regionie chromosomu u pacjenta, w kierunku zieleni o amplifikacji lub duplikacji tego regionu.

ZALETY:

• możliwość analizy aberracji w obrębie wszystkich chromosomów przy wykorzystaniu pojedynczej hybrydyzacji oraz uniknięcie często niemożliwych do wykonania badań opartych na cytogenetyce klasycznej

• możliwość zastosowania na tkankach, z których nie uzyskano dzielących się komórek

• możliwe badanie komórek nowotworowych

WADY:

• nie jest wiarygodne rozpatrywanie delecji czy addycji chromosomowych w obszarach centromeru i telomerów

• utrudniona diagnostyka mozaikowości

• brak możliwości wykrywania aberracji zrównoważonych (translokacja, inwersja)

Co możemy wykryć dzięki CGH

• pojawienie się dodatkowych chromosomów lub utratę całych chromosomów

• duplikacje i delecje fragmentów chromosomów

• translokacje niezrównoważone

Czego nie możemy wykryć dzięki CGH

• inwersji

• translokacji zrównoważonych

MICROARRAY CGH

Zasada metody: Taka sama jak dla CGH (tzn. DNA kontrolny i DNA badany wyznakowane różnymi fluorochromami), ale sekwencja docelowa to małe odcinki DNA umieszczone na mikromacierzy; mikromacierz może zawierać klony DNA pokrywające tylko jeden chromosom, wybrane regiony odpowiedzialne za zespoły genetyczne lub cały genom. Umożliwia analizę całego genomu, fragmentów chromosomów lub określonych chromosomów z rozdzielczością zależną tylko od liczby zastosowanych klonów. Ocenę niezrównoważenia kariotypu przeprowadza się przez określenie profilu fluorescencji - zielony/czerwony uzyskanego w poszczególnych parach chromosomów homologicznych i analizie ilościowej ich wzajemnego stosunku. Statystyczna analiza polega na uśrednieniu wyników uzyskanych dla 10-20 płytek metafazowych; termin „częściowa aneuploidia” używany do określenia aberracji wykrytej tą metodą - niemożliwe określenie, czy nadwyżkowy materiał jest duplikacją, czy chromosomem markerowym, wiadomo jedynie, że dany segment DNA występuje w nieprawidłowej ilości

ZALETY:

• bardzo wysoka rozdzielczość badania

• możliwość wykrywania bardzo małych delecji

WADY:

• niemożliwe wykrywanie aberracji zrównoważonych

• wysoki koszt badania

• utrudniona diagnostyka mozaikowości

• sonda molekularna - stosuje się ją w badaniach cytogenetycznych. Może rozpoznawać regiony centromerowe poszczególnych par chromosomów somatycznych i chromosomów płci w płytkach metarazowych lub jądrach interfazowych. Zastosowanie specyficznych sond molekularnych wykrywających inne niż centromerowe regiony chromosomów może posłużyć do wykrywania aberracji strukturalnych i liczbowych chromosomów w stadium metafazy, a także w jądrach interfazowych.

• Fluorochrom - znacznik sond molekularnych.

• FISH - fluorescencyjna hybrydyzacja In situ  (ang. fluorescent in situ hybridization) jest techniką cytogenetyczną, służącą do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA ( np. biotyny lub dioksygeniny). W celu analizy badanego materiału konieczne jest użycie mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza chromosomów w cytometrze przepływowym

• histogram - wykres zawartości DNA w poszczególnych populacjach komórek, sporządzany na podstawie wyników odczytywanych na monitorze mikrokomputera.

• ocena zawartości DNA - w cytometrii przepływowej oceny takiej dokonuje się na podstawie pomiarów intensywności fluorescencji w specjalnym aparacie zwanym cytometrem przepływowym.

• ocena stosunku par AT/GC w poszczególnych chromosomach - w metodzie cytometrii wykorzystuje się w tym celu pomiar ugięcia I rozproszenia światła i wzbudzenie fluorescencji w zawiesinie komórkowej. (?)

Aberracje chromosomalne strukturalne (translokacje, insercje, inwersje, izochromosomy, delecje, duplikacje, chromosomy koliste i dicentryczne)

• fuzja centryczna = translokacja robertsonowska

Translokacja robertsonowska (fuzja centryczna) polega na połączeniu ramion długich dwóch chromosomów niehomologicznych (akrocentrycznych lub telocentrycznych), miejscem pęknięcia są okolice centromeru. Tracona jest niewielka ilość materiału genetycznego zawarta w ramionach krótkich, a liczba chromosomów zmniejsza się o jeden. U człowieka fuzja centryczna najczęściej dotyczy par 13 i 14 oraz 14 i 21.

• inwersja pericentryczna (eucentryczna) -  chromosom ulega pęknięciu w dwóch miejscach, a powstały swobodny fragment ulega przed ponownym wbudowaniem do chromosomu odwróceniu o 180°. Odwrócony fragment zawiera centromer.

• inwersja paracentryczna (acentryczna) -  chromosom ulega pęknięciu w dwóch miejscach, a powstały swobodny fragment ulega przed ponownym wbudowaniem do chromosomu odwróceniu o 180°. Odwrócony fragment nie zawiera centromeru.

• delecja (deficjencja) terminalna i interstycjalna

Delecja - zmiana polegająca na utracie fragmentu chromosomu, wielkość utraconego odcinka może być różna. Osobnik traci jakąś część informacji genetycznej, dlatego zbyt duże delecje stanowiące ok. 3 % genomu są letalne nawet w stanie heterozygotycznym. W zależności od tego, jaki fragment chromosomu jest tracony wyróżniamy:

- delecję terminalną, inaczej deficjencję (pojedyncze miejsce pęknięcia, utracona zostaje dystalna cześć chromosomu)

- delecję interstycjalną (chromosom pęka w dwóch miejscach i tracona jest jego środkowa część)

• następstwa aberracji chromosomowych strukturalnych,

• translokacja inercyjna - przeniesienie fragmentu jednego chromosomu na inny chromosom

• translokacje zrównoważone i niezrównoważone

Translokacja

mutacja (aberracja) chromosomowa polegająca na przeniesieniu fragmentu jednego bądź większej liczby chromosomów na inne chromosomy. Wyróżnia się dwa zasadnicze typy translokacji:

1) ZRÓWNOWAŻONA - kiedy ilość materiału genetycznego pozostaje bez zmian, ale następuje jego zmiana rozmieszczenia w genomie. Taka mutacja może nie objawiać się fenotypowo, jednak może być przekazana potomstwu.

2) NIEZRÓWNOWAŻONA - dochodzi do zmiany ilości materiału dziedzicznego. Objawia się fenotypowo.

• translokacja wzajemna - wzajemne przeniesienie fragmentów z jednego chromosomu na drugi i vice-versa.

Aberracje liczbowe (euploidia, aneuploidia)

• aneuploidie (trisomie, monosomie, tetrasomie, nullisomie) - mutacje powstające w wyniku zwiększenia lub zmniejszenia diploidalnej liczby chromosomów o pojedyncze chromosomy, a nie o całe genomy. Mutacje tego typu powstają zazwyczaj na skutek nierozejścia się pary chromosomów w mejozie, czyli tzw. Nondysjunkcji albo utraty chromosomu w anafazie.

Aneuploidy

• euploidie (poliploidie): autopoliploidie, allopoliploidie - następuje zwielokrotnienie całego genomu (3n, 4n, 5n), powstają organizmy o poliploidalnej liczbie chromosomów. Przyczyną powstawania poliploidów jest brak rozdziału chromosomów w mitozie, dzięki czemu powstaje jądro o podwojonej liczbie chromosomów; również, jeśli w mejozie chromosomy nie zostaną rozdzielone, powstają gamety o niezredukowanej liczbie chromosomów z połączenia 2 gamet o 2n chromosomów powstanie tetraploid 4n, jeśli tylko jedna gameta będzie zawierała 2n, a druga będzie normalna - powstanie triploid 3n.

Euploidy (poliploidy)

• kariotypy aneuploidii

• kariotypy euploidii,

Przykłady aneuploidii w genetyce

• nullisomia (2n-2) - brak jednej pary chromosomów,

• monosomia (2n-1) - jedna kopia danego chromosomu,

• disomia (2n) - dwie kopie danego chromosomu (stan naturalny w komórkach somatycznych),

• trisomia (2n+1) - trzy kopie jednego chromosomu.

Przyczyną tej mutacji jest nondysjunkcja polegająca na niewłaściwym rozejściu się (braku rozejścia) chromosomów w czasie mejozy. Konkretnie dzieje się to w procesie anafazy. Główną przyczyną nondysjunkcji jest nieprawidłowo wykształcone wrzeciono podziałowe. Czynnikiem mutagennym chemicznym, który prowadzi do zaburzeń w prawidłowym wytwarzaniu wrzeciona podziałowego jest przede wszystkim kolchicyna.

Skutkami mutacji genomowej z nondysjunkcją jest powstanie chorób genetycznych wynikających z zaburzenia prawidłowej liczby chromosomów:

• Zespół Downa - trisomia 21 pary chromosomów. Objawami są niedorozwój umysłowy, mały wzrost, nieprawidłowe proporcje ciała, zbyt duży język, wady narządów wewnętrznych.

• Zespół Edwardsa - trisomia 18 pary chromosomów. Objawami są głęboki niedorozwój umysłowy, wady rozwojowe.

• Zespół Pataua - trisomia 13 pary chromosomów

• Zespół Warkany'ego 2 - trisomia 8 pary chromosomów

• Trisomia chromosomu X

• Tetrasomia chromosomu X

• Zespół Turnera - monosomia chromosomów płci X. Występuje tylko u kobiet. Objawami są bezpłodność, niedorozwój jajników, mały wzrost, krępa budowa ciała.

• Zespół Klinefeltera - Występuje tylko u mężczyzn (XXY). Objawami są: bezpłodność, niedorozwój jąder, zmienione proporcje ciała, cechy kobiece w wyglądzie. Bywają anomalie seksualne.

• Zespół XYY - disomia chromosomu Y. Mężczyźni charakteryzują się wysokim wzrostem, zwiększoną pobudliwością emocjonalną, są płodni.

Lionizacja - losowa inaktywacja jednego z heterosomów, czyli chromosomów płci, na której polega mechanizm kompensacyjny determinacji płci somatycznej osobnika u człowieka i innych ssaków.

Molekularne podłoże mutagenezy

Mutacje spontaniczne i indukowane

• definicja mutagenu, klasy mutagenów, mutagenne działanie: promieniowania UV i o wysokiej energii, kwasu azotowego (deaminacja), metanosulfonianu metylu (metylacja), benzopirenu (tworzenie adduktów), bromku urydyny (interkalacja), psorolenów (indukowanie kowalencyjnych połączeń pomiędzy niciami polinukleotydowymi i w obrębie pojedynczej nici) i analogów zasad;

Mutacje punktowe

• insercja, delecja, substytucja, inwersja sekwencji DNA w obrębie genu, mutacje w obrębie promotora genu;

Mutacje dynamiczne

• zespół łamliwego chromosomu X (=FRAXA), FMR1, FMRP^*

• dystrofia miotoniczna (=DM), kinaza proteinowa dystrofii mięśniowej, DMPK^*

• pląsawica Huntingtona, HD, huntingtonina;^*

Mutacje miejsc cięcia na granicy intron-egzon

• sekwencje miejsce rozpoznawania, akceptorowego;

Insercja transpozonów

Przyczyny mutacji sekwencji aminokwasowych produkowanego polipeptydu

• mutacje zmiany sensu = missense

• nonsensowne = nonsense

• zmiany ramki odczytu = frame shift mutations

• ciche = silent mutations (w sensie mutacje synonimowe) ;

Mechanizmy naprawcze:

• bezpośrednie usunięcie uszkodzenia

• naprawa z wycięciem nukleotydu (nucleotide excision repair = NER)

• naprawa z wycięciem zasady (base excision repair = BER)

• naprawa błędnie sparowanych zasad (mismatch repair = MMR)

• naprawa pęknięć dwuniciowych

Niestabilność genomu (chromosomal instability)

Zaburzenia chromosomowe (zespoły)^*

• Pradera-Williego

• Angelmana

• Di George'a

• Williamsa-Beurena

• Wolfa-Hirschorna,

• Cri du chat

• Downa

• Edwardsa

• Pataua

• Turnera

• Klinefeltera

• 47,XXX

• 47,XYY

• mężczyźni 46,XX

• imprinting genomowy (rodzicielskie piętno genomowe);

Elementy biotechnologii

Rekombinowanie i klonowanie DNA

• bakteriofagi, enzymy restrykcyjne, klonowanie cDNA, klonowanie genów, kosmidy, plazmidy, sekwencje palindromowwe, wektory do klonowania, wektor do ekspresji;

Analiza i zastosowania klonowanego DNA

• elektroforeza kwasów nukleinowych;

Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR)

• RT-PCR (reverse transcriptase PCR)

• PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR)

• Multiplex PCR

• RFLP PCR

• gniazdowy PCR, zagnieżdżony PCR (nested PCR);

Sekwencjonowanie kwasów nukleinowych

• metoda Sangera

• metoda Maxama-Gilberta

• pirosekwencjonowanie;

Organizmy modyfikowane genetycznie (GMO)

• rośliny transgeniczne, zwierzęta transgeniczne,

• ochrona środowiska przed genetycznie modyfikowanymi organizmami;

Metody wykrywania mutacji

• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

• SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

• ASO (Allele Specific Oligonucleotide hybridization)

• heterodupleksy: HA (lub HET = Heteroduplex Analysis, CMC = Chemical Mismatch Cleavage)

• DGGE ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

• mikromacierze DNA ( oligonukleotydowe, cDNA)

• Southern Blot (Southern Blotting)

• Western Blot (Western Blotting)

• Northern Blot (Northern Blotting);

Komórki macierzyste

• komórki totipotentne, pluripotentne, multipotentne, unipotentne, embrionalne komórki macierzyste, somatyczne komórki macierzyste, kliniczne zastosowania komórek macierzystych;

Terapia genowa

• podaż genu terapeutycznego, wektory - wirusowe i syntetyczne, strategie ex vivo i in vivo, komplementacja defektu genetycznego, hamowanie ekspresji zmutowanego genu, korekta zmutowanego genu, antysensy, rybozymy, siRNAs, naprawa mutacji z udziałem oligonukleotydów/fragmentów DNA, eliminacja niepożądanych komórek (metody eliminacji bezpośredniej i pośredniej), modyfikacja genetyczna komórek; kliniczne zastosowania terapii genowej.

Poziomy komunikacji międzykomórkowej

• ligand, receptor, receptory błonowe, białka G, transbłonowe receptorowe kinazy treoninowe, receptory śródplazmatyczne, wtórne przekaźniki (second messengers), czynniki transkrypcyjne, ścieżki sygnalizacyjne, autokrynia, parakrynia, endokrynia, justykrynia, crosstalk;

Ścieżka sygnalizacyjna Wnt/WNT

• Lrp 5/6, Axin, Apc, Gsk3, Frizzled, Tcf/Lef, Dsh = Dishevelled, Kremen1, Kremen2, Dkk, kanoniczna ścieżka Wnt i jej niekanoniczne warianty;

• FAP (ang. Familial Adenematous Polyposis Coli, rodzinna gruczolakowatość jelita grubego^*);

Ścieżka sygnalizacyjna Shh/SHH

• SHH (IHH, DHH), 25 kDa SHH-C, 20 kDa SHH-N, PATCHED, Smoothened, białka GLI, Dickkppfs, sFrps;

• nowotwory (PATCHED), polidaktylia (SHH, GLI2, GLI3, PATCHED);

Ścieżka sygnalizacyjna TGFβ

• BMPs, BMPR I, BMPR II, SMADs, SARA, HGS;

• nowotwory, nadciśnienie w zbiorniku płucnym (BMPR II);

hipoaneuploidy

hiperaneuploidy

2n - 1 - monosomiki

2n - 2 - nullisomiki

2n + 1 - trisomiki

2n + 2 - tetrasomiki

Trisomiki są bardziej żywotne niż monosomiki. W populacji ludzkiej nie spotyka się nullisomików i tetrasomików. Są one letalne.

Autopoliploidy

Zwielokrotnieniu ulegają genomy tego samego gatunku, dzięki czemu zwielokrotnione chromosomy są ściśle homologiczne. Praktyczne wykorzystywane w uprawie roślin

Allopoliploidy (amfiploidy)

Zwielokrotnieniu ulegają genomy pochodzące od różnych gatunków.

Powstają mieszańce o niehomologicznych chromosomach, które nie wytwarzają funkcjonalnych gamet. Jednak amfiploid 2n1 + 2n2 jest praktycznie nowym gatuniem zdolnym do rozrodu płciowego

* UWAGA - w stosunku do opisanych w sylabusie schorzeń/zespołów chorobowych obowiązuje wyłącznie znajomość ich podłoża dziedzicznego, ewentualnie molekularnego, jakość obrazu klinicznego nie będzie wymagana. Uwaga ta dotyczy wad rozwojowych i schorzeń genetycznych, które zostały zanaczone gwiazdkami, w przypadku schorzeń pasożytniczych (3 blok tematyczny) obowiązuje znajomość oznak/objawów w zakresie podstawowym.

---