POSZUKIWANIA REWERANTÓW Metoda ta ma dwa cele: 1. Poszukuje się szczepów (komórek), które zatraciły zdolność do syntezy danego produktu. Izoluje się tę kolonię, poddaje się ponownie mutagenizacji. Pozytywne mutanty będą miały zmieniony metabolizm i mogą być bardzo dobrymi producentami wybranych metabolitów. 2. Celem jest poszukiwanie auksotrofów, następnie kolonii prototroficznych i detekcji ponownej auksotrofii. W wyniku takiego postępowania uzyskuje się mutanty, które wykształciły dodatkowe elementy szlaków metabolicznych i mogą być bardzo cennymi producentami zarówno metabolitów centralnych jak i peryferyjnych. Doświadczenia te wykonuje się metodą tzw. welwetowego stempla. Metoda umożliwia detekcję auksotrofii lub prototrofii poprzez przeniesienie na stemplu kolonii wyrosłych na podłożu zwierającym wszystkie niezbędne składniki na podłoża pozbawione wybranych aminokwasów, witamin czy kofaktorów. GŁÓWNE KRYTERIA SKRININGU POŚREDNIEGO MUTANTÓW- SZCZEPÓW PRZEMYSŁOWYCH: Poszukiwanie mutantów konstytutywnych o obniżonym stopniu inhibicji produktem końcowym. O obniżonym wpływie katabolicznej represji. O zwiększonej oporności w stosunku do toksycznych pośredników przemian. O zwiększonej aktywności detoksykacyjnej. O obniżonej wrażliwości w stosunku do wybranych składników pożywek i prekursorów. O korzystnej morfologii. O zwiększonej przepuszczalności ściany komórkowej. Mutanty konstytutywne o obniżonym stopniu inhibicji .Terminem mutanty konstytutywne określane są szczepy u których mutagenizacja wywołała niezależną od obecności inhibitora ekspresję genów związanych z biosyntezą wybranego enzymu ( maltodekstryny pobudzają Bacillus subtilis do wytwarzania α- amylzay). -Mutanty konstytutywne izoluje się w warunkach hodowli ciągłej (chemostat), gdzie substratem limitującym jest induktor syntezy enzymów, użyty w stężeniu znacznie niższym od tego jakie jest wymagane dla indukcji syntezy enzymu.- Przemienne posiewy populacji na podłoża z dodatkiem/ bez dodatku inhibitora; - poszukiwanie nowych substratów, które będą pełniły rolę słabego induktora produkcji określonego białka.- Selekcja mutantów o obniżonej wrażliwości na obecność produktu końcowego: Zastosowanie tej formy skriningu polega na wprowadzeniu do podłoża selekcyjnego produktu o odpowiednio wysokim stężeniu. Zdać sobie należy sprawę, że taka forma skriningu może sprzyjać nie tylko znalezieniu szczepów mniej wrażliwych na obecność produktów ale i indukcje enzymów, które będą rozkładały wytworzony wcześniej produkt. Dlatego też skrining ten prowadzi się dodając do podłoża nie produkt ale jego analog. Analogami są substancje o strukturze chemicznej bardzo podobnej do produktu- substancji wyjściowej. Analog jest odczytywany przez enzym jako właściwy substrat, nie może jednak dojść do reakcji ze względu na różnice w strukturze. selekcja w kierunku obniżenia katabolicznej represjiCelem tej selekcji jest wyizolowanie mutantów zachowujących zdolność do syntezy enzymu mimo obecności w podłożu łatwo przyswajalnego źródła węgla, czyli w warunkach sprzyjających przede wszystkim obfitemu wzrostowi, a nie nadprodukcji metabolitów. Podstawową metodą selekcji jest wysiew populacji na podłoża zawierające łatwo przyswajalne źródło węgla (glukoza) w dużych stężeniach danego enzymu. Selekcję prowadzi się najczęściej w warunkach homeostatu, typowym przykładem jest hodowla w obecności glukozy i deseryny spowodowała wyselekcjonowanie cennych szczepów E. coli produkujących deaminazę serynową. selekcja mutantów opornych na toksyczne analogi metabolitów pośrednich Selekcja ta ma na celu ułatwienie wyizolowania mutantów regulatorowych, u których zakłócony jest lub wyeliminowany system kontroli metabolicznej działającej na zasadzie sprzężenia zwrotnego. Chodzi o uzyskanie szczepów nie rozpoznających konkretnych inhibitorów przemian, a tym samym wykazujących stałą derepresję syntezy enzymów danego szlaku. Selekcja prowadzona jest najczęściej w warunkach homeostatu, a do podłoża dodaje się wybrane aminokwasy lub nukleotydy, które pełnią rolę tych inhibitorów. W badaniach tych wskazane jest aby do podłoża selekcyjnego dodawać analogi tychże aminokwasów, a nie substancje podstawowe. Likwidacja tego systemu kontrolnego okazała się bardzo skuteczna dla szczepów produkujących antybiotyki i tak skrining w obecności analogu tryptofanu pozwolił zwiększyć wydajność kandycydyny. Skrining w obecności analogu metioniny pozwolił zwiększyć wydajność produkcji cefalosporyn. Zwiększona aktywność detoksykacyjna Skrining pod kątem selekcji mutantów wykazujących zdolność do neutralizacji związków toksycznych jest bardzo często stosowany. Powiązanie mechanizmów nabywania przez szczepy podwyższonej aktywności detoksykacyjnej z produktywnością jest często trudne do wyjaśnienia i różne w zależności od szczepu i typu biosyntezy. Skrining polega na wprowadzeniu do podłoża danej substancji toksycznej w najmniejszym stężeniu hamującym wzrost, a następnie izolowanie klonów wykazujących wzrost mimo jej obecności. Przykłady: zwiększenie produkcji penicyliny uzyskano dzięki wprowadzeniu do podłoża selekcyjnego hydroksyloaminy, imidazolu, jonów metali ciężkich. Szczepy Bacillus produkowały więcej amylazy po wprowadzeniu do podłoża selekcyjnego antybiotyków: tunikamycyna, streptomycyna, amplimycyna, d-cykloseryna. Skrining w kierunku obniżenia wrażliwości szczepów na określone składniki pożywek. Klasycznym przykładem tej formy skriningu jest selekcja mutantów Streptomyces w obecności jonów fosforanowych (homeostat). Szczepy te generalnie produkują streptomycynę tylko w obecności bardzo niskich stężeń jonów fosforanowych. Częsta zmiana składu wody, powoduje ograniczenie produkcji. Skrining ten dobrze jest prowadzić nie w obecności i nie z zastosowaniem samych fosforanów ale ich analogów arsenianów lub wanadanów. Dobre efekty dla produkcji penicyliny dała również selekcja w obecności prekursora kwasu fenylooctowego. Zwiększenie tolerancji na stężenie prekursora pozwoliło w znacznym stopniu podwyższyć produkcję antybiotyku. Korzystną formą skriningu są również hodowle przy ograniczonym natlenieniu. Tlen jest zwykle najdroższą pożywką w procesach biosyntezy, tak więc wyizolowanie klonów zachowujących zdolność do syntezy produktów mimo deficytu tlenu może przynieść duże oszczędności. Selekcja mutantów o korzystnej morfologii Problem dotyczy głównie hodowli grzybów strzępkowych i drożdży. W hodowli ciągłej (wgłębnej) grzyby strzępkowe mogą tworzyć pulpę luźnych strzępek grzybów. Zawiesina taka ma charakter nie Newtonowski i trudno zabezpieczyć dla takiego płynu jednolite warunki mieszania i napowietrzania. Stąd koniecznym jest selekcjonowanie mutantów, które będą miały naturalną skłonność do tworzenia kuleczek- pellets o średnicy od 0,5 do 1,5mm i tak rosnąca w warunkach wgłębnych grzybnia może być w wystarczającym stopniu zaopatrzona w pożywki i natleniona. Niekorzystnym jest również tworzenie dużych kłębuszków o średnicy ok.3mm, ze względu na ograniczony transport pożywek i metabolitów do ich wnętrza. W przypadku drożdży ważną cechą technologiczną jest szybkość ich koagulacji i osadzania się ( piwa górnej i dolnej fermentacji). Zbyt słabe osadzanie się komórek utrudnia procesy filtracji i ultrafiltracji. W przypadku drożdży gorzelniczych pozostałe w płynie drożdże po fermentacji mogą mieć negatywny wpływa na jakość produktu po destylacji. Szybko osadzające się drożdże gorzelnicze wykorzystano w technologii produkcji etanolu metodą, którą się określa przy wysokim stężeniu biomasy. zwiększona przepuszczalność ściany komórkowej Jak wynika z danych literaturowych, czynnikiem ograniczającym wydajność biosyntezy jest niewystarczająca szybkość transportu bioproduktu przez membranę cytoplazmatyczną lub okrywę zewnętrzną (ścianę komórkową). Spowodowanie mutacji powodujących zmiany struktury błon komórkowych nie gwarantuje wzrostu szybkości wydzielania bioprodktu, zwiększa jednak prawdopodobieństwo tego zjawiska. W badaniach nad tym zagadnieniem wykorzystuje się wpływ biotyny jako czynnika modyfikującego ścianę komórkową. Skrining w obecności biotyny pozwolił na zwiększenie szybkości wydzielania kwasu glutamionowego. Zaobserwowano również, że skrining prowadzony w podłożach z dodatkiem antybiotyków może powodować zmiany w przepuszczalności membrany cytoplazmatycznej. BAKTERIE METYLOTROFICZNE Metanogenne- tworzą metan, wykorzystywane do produkcji biogazu. Metylotroficzne- metan i metanol jako źródło węgla 1) Odkrycie tych bakterii stało się poważnym przełomem w biotechnologiii wykorzystuje się je do produkcji SCP. 2) otrzymywanie tlenków alkilenowych, nienasyconych węglowodorów ( tlenek etylenu, propylenu- tworzywo sztuczne). 3) otrzymywanie optycznie czynnych epoksydów, 4) do degradacji pochodnych etylenu- biodegradacja rozpuszczalników. 5) usuwanie metanu z pokładów węgla. Metylotrofy to mikroorganizmy wykazujące zdolność do wykorzystywania związków jędnowęglowych tj.: metan, metanol, formaldehyd, kwas mrówkowy, metyloamina oraz wielowęglowych tj.: (CH3)2NH, (CH3)3N, CH3OCH3 zawierających w swej budowie grupę metylenową, nie zawierają jednak wiązania węgiel- węgiel. Bakterie te bytują zarówno w wodzie jak i w glebie. Wyróżniają się szczególnym ułożeniem błon komórkowych (struktury grzebieniaste), wytwarzają przetrwalniki. System (geneza) powstawania przetrwalników jest inna niż u bakterii rodzaju Bacillus. Tutaj cała komórka przekształca się w przetrwalnik. Bakterie te dzieli się na 2 grupy: Metylotrofy bezwzględne, Metylotrofy względne. Kryterium podziału- wykorzystanie jako źródła węgla metanu i innych źródeł węgla np.; węglowodanów. Metylotrofy bezwzględne wykorzystują metan i metanol (częściej tylko metan). Typowe gatunki to: Methylobacillus, Methylococcus, Methylomonas, Methylophilus. Metylotrofy względne oprócz wymienionych związków metanu i metanolu wykazują zdolność do wzrostu w obecności wielu kompleksowych związków organicznych, nie są jednak zdolne do wykorzystania samego metanu. Muszą być obecne w podłożu jego pochodne: mrówczan, metanol, metyloamina. Typowe gatunki względnych to: Corynebacterium, Flavobacterium, Achromobacter, Bacillus, Micrococcu, Pseudomonas, Vibrio, Brevibacterium. Większość z tych bakterii jest gram ujemnych. Błoniaste grzebieniaste struktury biorą bezpośredni udział w przyswajaniu metanu i metanolu. Występują szczególnie licznie u bezwzględnych metylotrofów. Przyswajanie tych surowców wymaga uaktywnienia szczególnych szlaków metabolicznych i jest to: szlak rybolozomonofosforanowy (RMP) i szlak serynowy. Cykl Krebsa u bakterii metylotroficznych bezwzględnych jest niekompletny i przyswajanie metanu (metanolu) zachodzi dzięki funkcjonowaniu szlaku RMP. U bakterii względnych asymilacja metanu przebiega według szlaku serynowego i cykl Krebsa jest kompletny. Proces całkowitego utlenienia metanu przebiega według typowej reakcji charakterystycznej dla degradacji alkanów:CH₄
CH₃OH
HCOH
HCOOH
CO₂ ( metanol>formaldehyd>kwas mrówkowy). Przemiana formaldehydu do kw. mrówkowego i kwasu masłowego do CO₂ przebiega z włączeniem kofaktora NAD-u. W ramach szlaku RMP mrówczan zostaje włączony do rybulozo-5-fosforanem tworząc cząsteczkę heksulozo-6-fosforanu i ten związek może ulegać przemianom zbliżonym ( podobnym ) do EMP i HMP i być rozłożonym do fosfotrioz (fosfoenolopirogronianiu) i włączony do przemian centralnych. U metylotrofów względnych funkcjonuje szlak serynowy i substratem który łączy utlenienie metanu z przemianami centralnymi jest podobnie jak w RMP formaldehyd. W szlaku serynowym dzięki enzymowi transferazie hydroksymetylowej formaldehyd włączony jest do glicyny w następstwie czego powstaje seryna i ten aminokwas w wyniku kilku przekształceń ( reakcji) przekształcany jest do fosfoendopirogronianu. Dzięki reakcji anaplerotycznej do fosfoendopirogrinianu włączona zostaje cząsteczka CO₂ (reakcja karboksylacji) i powstaje szczawiooctan. Szczawiooctan stawowi punkt wejścia do cyklu Krebsa. Porównując obie drogi metaboliczne RMP i szlak serynowy można stwierdzić, że o wiele więcej gatunków przyswaja metan/metanol według szlaku RMP. Wydajność produkcji biomasy z wykorzystaniem szlaku RMP wynosi 60%, według serynowego 40% w stosunku do ilości użytego substratu. Poważnym mankamentem hodowli prowadzonych z wykorzystaniem metanu/metanolu jest to, że są one w wyższym stężeniu toksyczne dla komórek. Szczególnie dotyczy to metanolu jako dobrze rozpuszczalnego w wodzie. Dla większości metylotrofów stężenie metanolu nie powinno przekraczać 1%. Dlatego też substrat w tych hodowlach musi być precyzyjnie dozowany. Jeszcze bardziej toksyczny jest formaldehyd w stężeniu 1g/l ( 10krotnie mniejszym) hamuje całkowicie wzrost metylotrofów (środek bakteriobójczy). WYKORZYSTANIE PRZEMYSŁOWE BAKTERII METYLOTROFICZNYCH: SCP Do tej technologii wykorzystuje się zarówno metan jak i metanol. Cena metanu jest bardzo niska (niskie koszty wydobycia i transportu,) choć wygodniejszym do transport na większe odległości jest metanol. Dlatego też część wydobywanego metanu utleniana jest chemicznie do metanolu by obniżyć koszty transportu. Technologie produkcji SCP z metanu i metanolu są stosowane powszechnie przez koncern Shell zarówno w Afryce jak i Ameryce Południowej. Zakłady te lokalizowane są głównie przy miejscach wydobycia ropy naftowej w celu ograniczenia kosztów transportu. Proces jest tak zorganizowany by ciepło tworzące się podczas chemicznego utleniania metanu do metanolu wykorzystać do sterylizacji aparatury w fabryce. Białko otrzymywane z metanolu jest niesłychanie czyste, biomasa jest łatwa do oddzielenia, a wydajność biomasy w stosunku do substratu metanolu w skali przemysłowej utrzymuje się na poziomie 50%. tlenek propylenu/etylenuTo ważny surowiec dla przemysłu chemicznego, powstaje w wyniku utlenienia etylenu/propenu (reakcja biotransformacji). Do tego procesu wykorzystuje się komórki szczepów Methylosinus. Komórki są zwykle immobilizowane w kulkach z porowatego szkła, stanowią one wypełnienie reaktora kolumnowego. Propen/eten nasycany wodą przetłacza się przez tę kolumnę, temperatura utrzymywana jest na poziomie 45^oC. Mniej więcej po 12h katalizator (unieruchomione komórki) przestają być aktywne, wyczerpana została jego energia i musi być on poddany regeneracji polegającej na umieszczeniu komórek w pożywce z metanolem, który jest dobrym substratem. Utlenienie propenu lub etylenu zachodzi dzięki monooksygenazie metanowej. Reakcja przebiega w kilku etapach: wiązania, tworzenia kompleksu enzym-substrat, następnie włącza się kofaktor NADH, dzięki któremu dochodzi do przeniesienia elektronów i regeneracja enzymów. otrzymywanie optycznie czynnych epoksydówW ostatnich latach otrzymuje się duzy wzrost zainteresowania epoksydami, bowiem ujawniono, ze otrzymywane na drodze mikrobiologicznej posiadaja optyczna aktywność. Alkeny zbudowane z trzech i większej ilości atomow wegla posiadaja asymetryczne centrum, a przeprowadzenie reakcji epoksydacji prowadzi do otrzymania dwoch stereo izomerycznych form optycznych (R,S). W roku 1988 ukazala się praca, w której scharakteryzowano 11 szczepow metylotroficznych zdolnych tworzyc tlenki alkilenowe z gazopochodnych alkenow. Badając zestaw powstałych tlenkow stwierdzono, ze bakterie przyswajające eten, propen i butadien tworząc R-formy 1,2-epoksypropanu i 1,2-epoksubutanu. Podczas wzrostu na etanie tworza racemiczne 1,2-epokstpropan. Otrzymane wyniki potwierdzily, ze odpowiednie szczepy bakterii metylotroficznych mogą tworzyc rozmaite monooksygenazy o różnorodnej specyficzności substratowej. Rezultaty spowodowaly podjecie badan w dwoch następujących kierunkach: nad otrzymaniem optycznie czynnych epoksydow z uzyciem mikroorganizmow oraz biotransformacji izomerow lub epoksydow do porzadanej formy optycznej (R,S) (izomeracja przy uzyciu drobnoustrojow). Optycznie aktywne izomery znajduja coraz to szersze zastosowanie do otrzymywania biologicznie czynnych związków, glownie lekow. Japońscy naukowcy wymieniaja dane 31 zwiazkow epoksydowych, które mogą yc uzyte jako cenne medyczne preparaty lub jako pośrednie związki w syntezie plynnych kryształów. degradacja pochodnych etylenu Wskutek intensywnego rozwoju przemyslu chemicznego związanego z synteza roznych polimerow, obrobka ropy naftowej itp do środowiska przedostaje się wiele toksycznych substancji niebezpiecznych dla zdrowia człowieka, otaczającego środowiska i całości ekosystemu. Ekologiczna sytuacja wielu regionow kraju jest katastrofalna. Szczególnie toksyczne sa chloropochodne węglowodorów, wykorzystywane w przemysle w charakterze rozpuszczalnikow. Powolny rozklad trichloroetylenu za pomoca mikroorganizmow prowadzi do powstania dichloroetylenu i chlorowinylu, które odznaczaja się jeszcze wieksza toksycznością niż ich wyjściowe związki. Badania specyficzności substratowej monooksygenaz pozwolily wyodrębnić kilka mikroorganizmow, których enzymatyczny system zdolny jest katalizowac rozklad chloropochodnych etylenu. Tak np. rozpuszczalna forma monooksygenazy szczepu Methylosinus trichosporium może rozkładać trichloroetylen z szybkością 1,2 mola na godzine/1g suchej substancji, a także inne pochodne chloroetylenu. Proces rozkładu trichloroetylenu badano wykorzystując komorki Methylosinus trichosporium. Pokazano, ze degradacja tego związku wymaga obecności kosubstratu, którego role może pelnic aldehyd mrowkowy. Reakcja zachodzi tylko w obecności tlenu, co udowadnia udzial w tym procesie metanomonooksygenazy. Wiele ciekawych gatunkow drobnoustrojow zdolnych do rozkładu trichloroetylenu wyodebnili japońscy naukowcy. Jeden z wyselekcjonowanych przez nich szczepow był zdolny rozkładać nie tylko trichloroetyleny, ale także alkeny i alkany. Chloropochodne alkenow i alkanow nie w pelni podlegaja rozkładowi. Związki, w których jeden atom wegla zastapiony jest atomem halogenku nie mogą być dalej rozkladane. Podczas badan rozkładu trichloroetylenu udowodniono, ze jego degradacja jest dokonywana przez epoksyd pod wpływem monooksygenazy metanowej. Epoksyd spontanicznie rozklada się z wytworzeniem kwasu glioksalowego i jednoweglowych produktow lub z wytworzeniem kwasu tri- i dichlorooctowego. W ten sposób podczas rozkładu trichloroetylenu przez bakterie asymilujące, gazopochodne węglowodory, nie ma nawarstwiania pośrednich produktow stwarzających niebezpieczeństwo dla otaczającego środowiska. usuwanie metanu z pokładów wegla Metan z pokładów wegla usuwany jest glownie metodami fizycznymi, które w większości przypadkow umożliwiają usuniecie tego gazu. Trwaja wiec badania nad wykorzystaniem do tych celow bakterii metylotroficznych. Podejmuje się proby bezpośredniej hodowli tych drobnoustrojow na pokladach wegla. BIOSYNTEZA DEKSTRANU Dekstran jest jednym z polisacharydów syntetyzowanych przez drobnoustroje. Mogą one występować jako materiał zapasowy, substancja szkieletowa lub są wydzielane przez komórki na zewnątrz. Do najważniejszych polisacharydów syntetyzowanych przez drobnoustroje należą: dekstran, celuloza, pululan, ksantanelan, skleroglukan. Stosowane są one głównie w przemyśle spożywczym jako zagęszczacze i stabilizatory żywności, substancje żelujące i powlekające. Dekstran stosowany jest głównie jako środek zastępczy osocza krwi. Dekstran jest polisacharydem zbudowanym z jednostek a-D-glukopiranozy połączonych wiązaniami a-1,6- glikozydowymi. W nielicznych punktach rozgałęzień mogą również występować wiązania a-1,4 i a-1,3, których liczba zależy od gatunku szczepu-producenta.Dekstran syntetyzowany jest przez bakterie Leuconostoc mesenteroides z sacharozy przy udziale enzymu — dakstranosacharazy zgodnie z reakcją:

Dekstranosacharaza

[a-l,6-glukozyl]_n + sacharoza (a-l,6-glukozyI)_n+1 + fruktoza

Mechanizm tej reakcji jest inny, niż w przypadku syntezy większości polisacharydów, wymagających aktywnej formy glukozy - urydynodifosforanowej pochodnej - UDPG i glikozylotransferaz katalizujących reakcję przenoszenia glukozy z UDPG i wydłużenia łańcucha polimeru. W konwersji sacharozy do dekstranu i fruktozy, energia potrzebna do wytworzenia wiązań glikozydowych w polimerze pochodzi z rozszczepienia cząsteczek sacharozy. Reakcja rozpoczyna się od wytworzenia kompleksu enzymu z akceptorem reszty glukozowej, której dawca jest wyłącznie sacharoza. Najsilniejszymi akceptorami są cząsteczki a-1,6 glukozylu, od stopnia polimeryzacja których zależy wielkość cząsteczek wytworzonego dekstranu. FITOREMEDIACJA polega na zastosowaniu roślin, które są zdolne do wzrostu w zanieczyszczonym środowisku i oddziałują biologicznie, chemicznie i fizycznie na ksenobiotyki powodując ich usunięcie ze środowiska przyrodniczego. Rośliny stosowane w tych procesach powinny się charakteryzować dużą tolerancją na stężenia ksenobiotyków oraz wysokim stopniem kumulacji i transformacji, biodegradacji zanieczyszczeń. Ponadto powinny charakteryzować się szybkim wzrostem i odpornością na choroby i szkodniki. Ich dobroczynne działanie powinno ujawniać się zarówno przy bardzo wysokich i niskich stężeniach substancji zanieczyszczających. Sposób oddziaływania roślin na substancje toksyczne może być różnoraki. Może to być: Fitoekstrakcja, Fitotransformacja = Fitodegradacja, Fitostabilizacja, Ryzofiltracja, Fitoewaporacja (odparowanie). Fitoekstrakcja Zdolność tą wykorzystuje się wykorzystuje się stosunkowo często w oczyszczalni gleb i osadów (w tym osadów czynnych) zanieczyszczonych substancjami nieorganicznymi: metalami ciężkimi i substancjami radioaktywnymi. Zdolność ta polega na pobieraniu przez roślinę dużej ilości ksenobiotyku z podłoża. Substancje te są następnie transportowane do poszczególnych tkanek rośliny, gdzie są kumulowane. Tolerancja różnych gatunków roślin na podwyższone stężenie ksenobiotyków jest różna i największe zdolności kumulacyjne posiadają wybrane gatunki: trzciny, wierzby, traw, gorczycy. Najczęściej ksenobiotyki gromadzone są w wakuolach, bądź cytoplazmie, gdzie wchodzą w reakcje z występującymi tam związkami. Najlepiej poznaną reakcją zachodzącą w cytoplazmie jest chelatowanie metali przez kwasy organiczne: cytrynian, jabłczan oraz substancje syntetyzowane w komórce specjalnie do tych celów zwane fitochelatynami które wiążą jony metali. Tą drugą związane zostają takie pierwiastki jak: chrom, miedź, cynk, kadm, ołów i nikiel. Proces fitoekstrakcji jest intensywnie badany i dziś wiadomo, że przebiega on szczególnie intensywnie w określonej fazie wzrostu roślin i poszukuje się również takich roślin, u których ta kumulacja zachodzi w części nadziemnej rośliny by w określonym momencie wegetacji można było zebrać przy najniższych kosztach i pracochłonności fragmenty roślin (liście, łodygi), których koncentracja metali jest największa. Fitotransformacja/Fitodegradacja Proces polega na wykorzystaniu zdolności wybranych gatunków roślin do pobierania zanieczyszczeń i ich transformacji z udziałem enzymów do substancji mniej szkodliwych lub pełnej degradacji do CO2 i H2O. Fitodegradacja może zachodzić zarówno w wewnątrz rośliny jak i na zewnątrz w strefie korzeniowej dzięki enzymom pozakomórkowym wytwarzanym przez roślinę. Z udziałem roślin i enzymów przykorzeniowych degradowane są węglowodory: parafiny do C15, alkohole, fenole, aminy, chlorowane węglowodory, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, pochodne tiazyny, pestycydy (w niezadowalającym stopniu). Enzymami zaangażowanymi w te procesy są: dehalogenazy (oddzielają atomy chloru), nitroreduktazy (rozkład materiałów wybuchowych), peroksydazy (rozkład związków fenolowych), fosfatazy (rozkład pestycydów fosfoorganicznych), oksygenazy, hydrolazy, liazy. Fitostabilizacja Rośliny mogą wywierać wpływ na fizyczne i chemiczne właściwości zanieczyszczeń powodują ich unieruchomienie w glebie. Zjawisko to dotyczy głównie metali ciężkich i immobilizacja ta zachodzi na skutek: absorpcji i akumulacji metali w korzeniach roślin, adsorpcji na powierzchni korzeni, wytrącenia jonów metali ciężkich w strefie ryzosfery.Zjawiska te zachodzą dzięki związkom organicznym produkowanym przez rośliny i wydzielanym do ryzosfery, które mogą zmieniać pH gleby i wpływać na jej potencjał oksydoredukcyjny jak również redukować jony toksycznych metali do form mniej dostępnych dla rośliny. Duże znaczenie ma tutaj wytrącanie metali w postaci nierozpuszczalnych soli. Wytrącone związki (unieruchomione) mają ograniczoną zdolność do przemieszczania się w głąb profilu glebowego i wód gruntowych co stanowi zabezpieczenie przed dalszą degradacją terenu. Ryzofiltracja (rośliny wodne) Niektóre z roślin wodnych posiadają zdolność do absorpcji lub wytrącania zanieczyszczeń na powierzchni korzeni i kumulacji szkodliwych związków w tkankach korzenia. Zdolność tą wykorzystuje się do usuwania jonów metali ciężkich i substancji radioaktywnych występujących zarówno w wysokich jak i bardzo niskich stężeniach w wodach stojących. Metoda ryzofiltracji sprawdza się szczególnie przy usuwaniu jonów ołowiu i usuwaniu jonów arsenu. Jak wynika z badań procesy kumulacji zachodzą również w martwej tkance korzeniowej. Mimo, że zjawisko ryzofiltracji odkryto u roślin wodnych to okazuje się, że ta właściwość może zachodzić również u roślin lądowych, przy czym proces oczyszczania musiałby być prowadzony w kulturach hydrobłonicznych i znaleziono już rośliny lądowe zdecydowanie bardziej efektywne w zakresie ryzofiltracji od roślin wodnych. Ryzoewaporacja Zjawisko to polega na pobieraniu zanieczyszczeń przez roślinę ich transpiracji (przekształcenia w związek lotny), a następnie odparowaniu z tkanki rośliny już w zmienionej formie. Mechanizm ten został odkryty i zbadany dla środowisk wodnych oraz gruntów zanieczyszczonych selenem, późniejsze badania dotyczyły rtęci i arsenu. Wiadomo już, że fitoodparowaniu mogą ulegać także niektóre związki organiczne takie jak: trichloroetylen, benzen, nitrobenzen, fenol, atrazyna. Selen w środowiskach wodnych i gruncie występuje najczęściej w postaci selenianu lub seleninu. Szybkość pobierania związków selenu zależy od chemicznej jego formy oraz od stężenia siarczanów (jony te współzawodniczą z selenianami). Pobrany przez roślinę selen w chloroplastach redukowany do dimetyloselenidu i substancja ta jako lotna uwalniana jest do atmosfery. Istotne jest to, że dimetyloselenid ma toksyczność 500-700 razy niższą niż selen w formie nieorganicznej. Podobny mechanizm reakcji ma miejsce w przypadku rtęci przekształconej do metylortęci (zjawisko takie obserwuje się również u mikroorganizmów i wykorzystywane jest w również w procesie bioremediacji). Technika fitoodparowania jest szczególnie cenna przy oczyszczaniu środowisk wodnych. Znane są rośliny zdolne do pobierania i akumulacji rtęci i późniejszego jej odparowania. Stopień zanieczyszczenia tymi pierwiastkami wymaga intensyfikacji tych procesów i myśli się tutaj o wprowadzeniu roślin transgenicznych prowadzących proces ewaporacji ze zwiększoną efektywnością. Zalety i ograniczenia fitoremediacji. Fitoremediacja może być stosowana „in situ” (miejsca skażenia) bezpiecznie bez dodatków substancji chemicznych np. ekstrahentów, powstaje bardzo mało zanieczyszczeń wtórnych. Rozwój roślin zwiększa aktywność mikroorganizmów glebowych, podwyższa żyzność gleby i poprawia jej strukturę. Jest metodą tanią i zdecydowanie najlepszą w zakresie usuwania jonów metali. Posiada pewne walory estetyczne. Ograniczenia - długi okres oczyszczania w przypadku jonów metali ciężkich np. ołów - trwa 30 lat. Efektywność procesu zależy od klimatu (wegetacja rośliny), rodzaju gleby i pH. Z tymi czynnikami związana jest odporność na choroby i szkodniki. Oczyszczanie zachodzi tylko na taką głębokość jak głęboki jest system korzeniowy - 30cm- -50cm, rzadziej ponad 1m. W przypadku drzew nawet do 10m. Nie wystarczający poziom wiedzy na temat skutków przemian, wywolanych aktywnością rośliny. Nie znamy wszystkich niebezpieczeństw tworzenia się metabolitow o znacznie większej toksyczności niż substancja wyjsciowa. Związki kumulowane w tkankach roślin mogą przedostawac się do dalszych ogniw łańcucha pokarmowego, na skutek zjadania ich przez zwierzęta dzikie. Nie wystarczajaca ilość znanych gatunkow roślin o wysokiej tolerancji na obecność zanieczyszczen. METODY ENZYMATYCZNE BADANIA ZBIOROWOŚCI MIKROORGANIZMÓW W ZANIECZYSZCZONYCH GRUNTACH. Monitorowanie procesu oczyszczania:

Podstawowym parametrem kontroli przebiegu procesu bioremediacji gruntu zanieczyszczonego substancjami organicznymi jest monitorowanie poziomu zanieczyszczeń podczas procesu oczyszczania (chromatografia gazowa). Jednakże równolegle należy kontrolować liczebność i aktywność metaboliczną mikroflory bytującej w zanieczyszczonym środowisku. Problemem tych badań jest to, że w laboratorium potrafimy wyhodować bardzo niewielką ilość mikroorganizmów funkcjonujących w gruncie. Tak więc trwają starania o opracowania metod pośrednich, które by dostarczyły więcej informacji o liczebności i różnorodności mikroflory zanieczyszczonego środowiska. W ostatnich 6 latach obserwuje się intensywny rozwój metod enzymatycznych i molekularnych (przedmiotem naszego zainteresowania jest metoda enzymatyczna). Enzymy glebowe są biokatalizatorami ważnych procesów metabolicznych w tym rozkładu substancji organicznej i detoksykacji ksenobiotyków (pestycydów). Degradacja związków organicznych do CO₂ i H₂O wymaga wielu reakcji chemicznych w które zaangażowane są białka katalityczne. Dlatego też, aktywność tych enzymów może być cennym narzędziem w monitorowaniu bioremediacji gruntów zanieczyszczonych związkami ropopochodnymi i innymi substancjami toksycznymi. Najważniejszymi enzymami, których aktywność może dostarczać istotnej informacji o poziomie zanieczyszczeń są: oksygenazy (zaczynają proces biodegradacji, włączają O₂ ), lipazy, dehydrogenazy, katalazy, ureazy, proteazy, fosfatazy, β-glukozydazy (rozkład związków celulozowych). Poza tymi enzymami oznacza się również poziom zawartości ATP. Analiza poziomu ATP ATP jest obecny we wszystkich żywych organizmach i działa tam jako koenzym i substrat. Charakterystycznym jest to, że w komórkach nieżywych jest szybko degradowany. Dlatego też ATP traktowane jest jako podstawowy parametr do oceny aktywności biologicznej żywej biomasy. ATP z próbki gleby poddanej sonifikacji (dźwięki) ekstrahuje się kwasem fosforowym, mocznikiem, DMSO i EDTA. Oznaczenie prowadzi się metodą luminescencyjną. Z dotychczasowych obserwacji wynika, że w intensywnej fazie degradacji zanieczyszczeń poziom ATP jest kilkakrotnie wyższy w porównaniu z poziomem przed zanieczyszczeniem i po zakończeniu oczyszczania.

Badanie aktywności oddechowej gruntu (aktywność oksygenaz) Oddychanie mikrobiologiczne stanowi sumę wielu procesów metabolicznych powodujących powstawanie CO₂ i jest to wynik wykorzystywania tlenu przez mikroorganizmy bytujące w glebie. Aktywność oddechowa gruntu określana również aktywnością oksygenaz- enzymów z klasy oksydoreduktaz, katalizujących proces wbudowania O₂ w cząsteczkę substratu. Enzmy te uważana są za kluczowe dla procesu biodegradacji takich związków jak węglowodory - składające się tylko z C i H. Tak więc oznaczenia aktywności oddechowej są miarą mineralizacji węgla organicznego oraz miarą oceny dynamiki rozkładu związków organicznych. Oznaczenia te wykonuje się 2 metodami: -mierząc ilość pobranego tlenu (analizatory tlenu), -mierząc ilość wydzielonego CO₂.

Oznaczenie wykonuje się metodą miareczkową roztworu KOH do którego przepuszczone zostaje gaz z powietrzem nad pojemnikiem w którym prowadzona była bioremediacja w ciągu 1godziny bez dostępu tlenu. Zwykle przebieg zmian aktywności oddechowej podczas procesu bioremediacji jest zbliżony do tego jak dla ATP. Aktywność dehydrogenaz Biologiczne utlenianie jest w dużym stopniu związane z reakcjami odwodornienia, prowadzonym przez enzymy z klasy dehydrogenaz. Enzymy te zostały jako pierwsze włączone w schemat monitorowania przebiegu bioremediacji. Aktywność tych enzymów ulega podobnym zmianom w czasie procesu oczyszczania jak oksygenazy, przy czym są one bardzo wrażliwe na obecność substancji toksycznych, np.: fenoli. Często przez długi czas obserwuje się obniżony poziom aktywności tych enzymów. Aktywność tą oznacza się używając jako substrat chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu. Charakterystyczna jest niska powtarzalność wyników dotyczących aktywności tego enzymu i niedoskonałość samej metody oznaczania. Aktywność lipaz Hydrolazy acyloglicerolowe (lipazy) prowadzą reakcje hydrolizy estrów glicerolu i wyższych kwasów tłuszczowych. Odgrywają istotną rolę w przemianach lipidów u mikroorganizmów, roślin, zwierząt. Jeszcze do nie dawna uważano, że ze względu na oddziaływanie z niepolarnymi substratami lipazy mogą działać jedynie z nierozpuszczalnymi w wodzie substratami i zawdzięczają to występowaniu tzw. miejsc hydrofobowych w cząsteczce enzymu. Dziś widomo, że mogą działać w środowiskach hydrofilowym i hydrofobowym, charakteryzują się stosunkowo niską specyficznością substratową i mogą brać udział w wielu reakcjach enzymatycznych. Oznacza się je kolorymetrycznie z użyciem jako substratu paranitrofenylomaślanu. Charakterystyczny przebieg aktywności tego enzymu podczas procesu bioremediacji jest następujący:

W początkowej fazie procesu bioremediacji obserwuje się stosunkowo niski poziom aktywności, a następnie stopniowy wzrost aktywności lipaz, któremu towarzyszy jednoczesny spadek stężenia węglowodorów. W końcowej fazie bioremediacji obserwuje się ustabilizowany poziom aktywności tego enzymu. Dla niektórych substancji zakażających obserwuje się w ciągu całego procesu stopniowy wzrost aktywności tego enzymu przez cały czas oczyszczania. Uważa się, że aktywność lipazy ze względu na swą prostotę i szybkość analizy może być doskonałym wskaźnikiem dla monitorowania procesów oczyszczania. Moment stabilizacji aktywności może informować o fazie końcowej procesu rozkładu zanieczyszczeń. Aktywność katalazy Katalaza jest to oksydoreduktaza, odpowiada za rozkład nadtlenku wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego. Nadtlenek wodoru jest produktem ubocznym powstającym w wyniku działania innych oksydoreduktaz, (np. dysmutazy nadtlenkowej), wytwarzany jest w cytoplazmie i peroksyzomach. Katalaza zabezpiecza przed toksycznym działaniem nadtlenku wodoru niszczącym struktury komórkowe. Katalazę oznacza się metodą miareczkową z nadmanganianem potasu. Zmiany tej aktywności w czasie procesu oczyszczania są podobne jak w przypadku oksygenaz i dehydrogenaz. Aktywność ureazy (rozkład mocznika z uwolnieniem amoniaku) Aktywność tego enzymu związana jest z wykorzystaniem źródeł azotu w oczyszczanym środowisku. Aktywność tego enzymu oznacza się dokonując pomiaru ilości uwolnionego amoniaku stosując jako substrat mocznik. Pomiar ten daje nam informacje o ogólnej aktywności „życiowej” mikroorganizmów. Główną obserwacją dotyczącą tego pomiaru jest to, że korelacje między wykorzystanym stopniem degradacji zanieczyszczeń, a aktywnością ureazy obserwuje się tylko w początkowym stadium procesu biodegradacji. Analogiczną ocenę i zadania ma oznaczenie aktywności proteazy. Aktywność fosfatazy Fosfataza to enzym katalizujący przemiany fosforu organicznego do fosforanów. Jest to enzym typowy dla środowiska glebowego, występuje w korzeniach roślin, grzybach, promieniowcach i innych mikroorganizmach glebowych. Odgrywa poważną rolę w przemianie substancji humusowych i jego aktywność jest ściśle związana ze stężeniem fosforanów w oczyszczanym środowisku. Jest dobrym wskaźnikiem mineralizacji substancji zanieczyszczających, zawierających związki fosforu i mało przydatnym wskaźnikiem w przypadku zanieczyszczeń węglowodorami. PULULAN Producent: Pullularia pullulans ( czarne drożdże) z Ascomycetes rodziny Dothideales, mimo że jego forma doskonała nie jest dotąd znana. Cechy: najbardziej rozpowszechniony w strefie umiarkowanej , wyst. na pow. roślin i owoców, w glebie, wodach słodkich i słonych, ściekach i na żywych organizmach. Duży polimorfizm: zależnie od wrunków i czasu wzrostu: okrągłe formy drożdżopodobne, wydłużone formy mIcelarne, chlamydospory (produkują barwniki), Produkcja ciemnych barwników melaninowych. Pululan to obojętny poliglukan zbudowany z liniowych łańcuchów. Reszty D-glukopiranozy połączone są wiązaniami a-1,6-glikozydowymi oraz a-1,4. po 2 kolejnych wiązaniach a-1,4 następuje a-1,6. Właściwości: -wysuszony, bezbarwny proszek bez smaku i zapachu, niehigroskopijny, -dobrze rozpuszcza się w wodzie, tworząc lepkie, obojętne roztwory, trwałe przy wysokich stężeniach soli. Przy wyższych stężeniach pullulanu roztwór wykazuje pseudoplastyczność, -odparowując wodę z roztworu można otrzymać:a)błonę o dobrych właściwościach mechanicznych, odporną na oleje mineralne i tłuszcze b)cienkie folie polimeru c)włókna polisacharydu o dobrych wł. Mech.-sproszkowany połączony z niewielką ilością wody i wytłaczany daje materiał przypominający polistyren, ale bardziej elastyczny.-nie rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych- aceton i metanol są wykorzystywane do wytrącania polisacharydu z roztworów wodnych, -odporny na działanie zasad i słabych kwasów, -wolne grupy w pullulanie mogą być częściowo lub całkowicie zestryfikowane, co zmniejsza lub znosi rozpuszczalność rozpuszczalników w wodzie; uwodornienie zwiększa jego odporność na wysoką temp. -pullulan może wywołać odpowiedź immunologiczną -pullulan nie jest trawiony przez enzymy pokarmowe człowieka, -nie wywołuje alergii Hydroliza enzymatyczna pullulanu Pullulanaza- enzym pozakomórkowy wytwarzany przez: Aerobacter aerogenes, Bacillus sp., Streptomyces flavochromogenes. Hydrolizują tylko wiązania a-1,6-glikozydowe dając cząsteczki maltotriozy. Izopululanaza wytwarzana przez Aspergillus niger. Hydrolizuje tylko wiązania a-1,4-glikozydowe łączące tylko tę resztę glukozy, która w pozycji C6 łączy się wiązaniem a-1,6 z resztą glukozy w kolejnej maltotriozie. Neopululanaza- rozrywa drugie z obecnych w reszcie maltotriozowej wiązań a-1,4. Modyfikowany chemicznie pululan:1.estryfikowany pululan- uzyskuje się różne stopnie rozpuszczalności, 2.eteryfikowany pululan- podobne cechy, 3.hydrogenowany (uwodorniony)- wysoka odporność termiczna, brak przep. tlenu przez folie. 4.siarczany pululanu i ich sole- lek na wrzody żołądka 5.karboksylowany- wysoka rozp. W zimnej wodzie 6.usieciowany- otrzymuje się hydrofilowe żele, 7.dialdehydowany- nieprzepuszczalność wody, 8.aminoalkiloeteryfikowany- kationowy polimer o różnym zastosowaniu, 9.cyjanoetylowany- wysoka odporność termiczna, nierozp. w wodzie, wysoka stała dielektryczna. Glukoza, sacharoza, fruktoza, maltoza, ksyloza, laktoza, galaktoza, arabinoza, rafinoza- cukry na których prowadzona jest fermentacja. Najefektywniejsza jest sacharoza w ilości 70%. Sole: fosforan potasu, azotan sodu, siarczan magnezu, chlorek żelaza, tiamina, ekstrakt drożdżowy. Optymalna temp. 25-28st. pH 4,5-7. Biosynteza wymaga bardzo intensywnego natlenienia i mieszania. Najwyższą wydajność procesu otrzymuje się po długim czasie, nawet do 120h. Metoda wsadowa- jednorazowe wprowadzenie pożywki ze wszystkimi składnikami. Metoda wsadowa z dożywianiem- uzupełnia się składniki pokarmowe, zwłaszcza źródło węgla. Metoda ciągła- ciągłe odbieranie płynu hodowlanego, z równoczesnym uzupełnieniem fermentora świeżą pożywką. Ograniczeniem hodowli jest wytwarzanie przez szczep barwników melaninowych. Problem zabarwienia pululanu melaninami rozwiązany jest przez wykorzystywanie mutantów oraz dobieranie składu pożywki. Korzystny jest wysoki stosunek węgla do azotu. Najefektywniejsze są komórki drożdżopodobne- aby się one namnożyły jako źródło węgla dodano olej sojowy, a jako źródło azotu kwas glutaminowy. Po namnożeniu biomasy jako źródła węgla dodaje się sacharozę, a nie stosuje się już źródła azotu. W ten sposób można otrzymać całkowicie biały pululan. Zastosowanie pululanu: -pakowanie lub pokrywanie żywności- tworzenie cienkich błon, -dodatek do żywności niskokalorycznej jako wypełniacz zastępujący skrobię oraz nośnik witamin, -otrzymywanie niskokalorycznego środka słodzącego zawierającego produkty hydrolizy pululanu przez neopululanaze, -pokrywanie i kapsułkowanie leków, -otrzymywanie płynów zastępujących plazmę krwi, -nośnik antygenów i wirusów w produkcji przeciwciał i szczepionek przeciwwirusowych-nośnik leków antynowotworowych (cholesterolopululan- hydrofobowy), interferonu, -kremy, pudry, maści. Mechanizm biosyntezy Glukoza jest przekształcona w kilku typowych reakcjach do UDPG. Polimeryzacja UDPG do pululanu zachodzi w zewnętrznej części błony komórkowej. UDPG jest transportowane do cytoplazmy przez hydrofobową cząsteczkę- ufosforylowany lipid, albo pirofosforan lipidowo- cukrowy. Powstaje pirofosforan lipidowo- glukozowy, którego łańcuch polisacharydowy wydłuża się w wyniku reakcji z kolejnymi cząstkami UDPG. W rezultacie tworzy się pirofosforan lipidu związany z pululanem jako resztę cukrową. Biosynteza biosurfaktantów: Biosurfaktanty to związki powierzchniowo-czynne, wytwarzane przez dużą liczbę mikroorganizmów u roślin (np. saponiny) oraz organizmy zwierzęce i przez organizm ludzki (np. kwasy żółciowe). Substancje te mogą być wydzielane poza komórką, pozostawać z nią związanym na powierzchni komórki lub w jej wnętrzu. Celem podst.syntezy tych związków jest ułatwianie wzrostu mikroorganizmom na substratach nie mieszających się z H₂O i trudnotransportowanych do wnętrza komórki. Podstawową rolą tych związków jest zmniejszenie napięcia powierzchniowego na granicy faz. W wielu przypadkach towarzyszy temu tworzenie emulsji z nierozpuszczalnych substratów (oleje), które w formie zemulgowanej mogą łatwiej dostać się do komórki oraz dzięki temu, że powierzchnia kontaktu drobinek emulsji z komórkami ulega istotnemu zwiększeniu. Biosurfaktanty to substancje o złożonej budowie, zawierające w swej cząsteczce grupę hydrofilową (rozpuszczalną w H₂O) i hydrofobową (nierozpuszczalną w H₂O). Raminolipid - najlepiej poznany drobnoustrojowy biosurfaktant. Biosurfaktanty produkowane są głównie przez mikroorganizmy tlenowe. Najlepiej zbadana jest ich synteza w podłożach płynnych jednakże jak wskazują wyniki badań są one równie intensywnie wytwarzane w warunkach hodowli w stałym złożu i przez mikroorganizmy bytujące w glebie. W obecności substratów hydrofobowych, czyli związków ropopochodnych, olejów roślinnych, gliceroli; jeśli chodzi o źródło azotu dane na ten temat są niejednoznaczne. Wiele prac wskazuje, że syntezie tych związków sprzyja limitacja związków azotowych tj. jony amonowe czy mocznik. Inne badania wskazują, że stężenie tych substratów nie ma większego wpływu, a o syntezie biosurfaktantów decyduje obecność wybranych aminokwasów tj. kw. glutaminowy, tyrozyna. Surfaktanty mogą być syntetyzowane w fazie wzrostu oraz stacjonarnej. W fazie wzrostu zachodzenie tej syntezy jest zrozumiałe ponieważ jest indukowane obecnością hydrofobowego substratu, a więc przyspiesza wzrost mikroorganizmów. Syntezą tych związków w fazie stacjonarnej tłumaczy się natomiast ułatwianiem transportu do wnętrza komórki. Substratem trudniejszym do przyswojenia niezbędnych jednak do wydłużenia czasu życia komórki. Spośród znanych i zbadanych ponad 100 związków powierzchniowo-czynnych na skalę przemysłową produkowane są 3:- Ramindipid;- Emulsan;- Allasan. Pierwszy z nich należy do grupy surfaktantów niskocząsteczkowych, dwa następne do surfaktanów wysokocząsteczkowych.Podział surfaktantów na nisko i wysokocząsteczkowe wynika z faktu ich zróżnicowanej roli w hodowli mikroorganizmów. Surfaktanty niskocząsteczkowe zmniejszają napięcie powierzchniowe. Są stosunkowo słabymi emulgatorami. Wysokocząsteczkowe natomiast powodują zwykle tworzenie trwałych emulsji i zwiększenie rozpuszczalności pozornej związków hydrofobowych w wodzie. Ze względu na te zróżnicowane funkcje, przemysł zainteresowany jest obydwoma rodzajami. Niskocząsteczkowe to: - glikolipidy (trechalolipidy, soforolipidy, celobiolipidy); -lipopeptydy i lipoproteiny (gramicydyna, polimiksyna);- kw.tłuszczowe, lipidy, fosfolipidy. Wysokocząsteczkowe to: - lipoproteiny i lipopeptydy (subtylizyna); - glikolipidy (emulsan, allusan, liposan); - złożone. Wykorzystanie biosurfaktantów: - przemysł rolniczy - przy produkcji nawozów fosforowych; - przem.żywności i napojów - przy produkcji lodów; - przem.skórzany - przyspieszają proces odtłuszczania; - przem.metalurgiczny - regulują procesy zwilżania i natłuszczania powierzchni metalowych;- przy krystalizacji cukrów - przyspieszają; - przem.papierniczy - przy wytw.pulp papieru; - przem.barwników - w celu lepszego równomiernego rozproszenia barwników i lepszej ich adhezji do barwionej powierzchni. WYKORZYSTANIE POSZCZEGÓLNYCH GRUP MIKROORGANIZMÓW W PROCESACH BIOSYNTEZY: Termin mikroorganizmy nie jest jednoznaczny, do tej grupy zalicza się bakterie, liczne grzyby, niektóre glony (algi), pierwotniaki. Odrębną grupę stanowią wirusy, które stanowią przedmiot zainteresowania biotechnologów, a są to niekompletne jednostki z pogranicza życia i materii nieożywionej. Cechy bakterii tj. nie posiadają jądra (nukleoid), różnice w barwieniu Gramma i wynikające z tego istotne różnice w budowie ściany komórkowej, oraz zdolność do przetrwalnikowania, determinują przydatność poszczególnych grup bakterii do określonych dziedzin w biotechnologii. Bakterie nieprzetrwalnikujące stosowane są do produkcji metabolitów niskocząsteczkowych. Wśród najczęściej wykorzystywanych są: - bakterie kwasu glutaminowego; - bakterie kwasu mlekowego - Lenconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, które tworzą również antybiotyki; - bakterie kwasu octowego - Acetobacter, Glukonobacter. Wśród bakterii Gram ujemnych na szczególną uwagę zasługuje E.coli. Znamy ją jako mikroorganizm zasiedlający nasze jelita i wytwarzający w naszym organizmie szereg witamin, które możemy wykorzystywać. Bakterie Escherichia coli wykorzystywane są do produkcji Acylazy penicylinowej (enzym służący do produkcji półsyntetycznych penicylin). Ponadto E.coli zasłużyła się w biotechnologii jako doskonały biorca obcego DNA. Kolejne wykorzystanie tych bakterii to diagnostyka mikrobiologiczna do oznaczania tzw. miana coli. O wiele szersze zastosowanie znalazły bakterie przetrwalnikujące Gram dodatnie. Dzięki szczególnej budowie ściany komórkowej tych bakterii (przewaga peptydoglukanu oraz brak przestrzeni periplazmatycznej) mogą one wydzielać poza komórkę mnóstwo substancji, w tym również wysokocząsteczkowe np. enzymy. Szczególne zastosowanie w biotechnologii znalazły szczepy z rodzaju Bacillus. Mogą one wydzielać poza komórkę enzymy, antybiotyki oraz insektycydy. Antybiotyki: - Utoryzyna; - Gramicydyny; - Polimyksyny; - Bacytracyna, Są to antybiotyki polipeptydowe, które w większości przypadków stosowane są jako dodatki do pasz w celu ich stabilizacji. Enzymy: - Acylaza penicylinowa - do produkcji antybiotyków półsyntetycznych; - α-amylaza - produkowana przez bakterie oraz grzyby strzępkowe. Stosowana w przemyśle włókienniczym, owocowym i pralniczym. α-amylazy bakteryjne są zwykle bardziej stabilne termostabilne niż amylazy grzybowe; - β-amylaza; - izoamylazy - również wykorzystywane do hydrolizy skrobi; - α i β-glukanaza - stosowana do hydrolizy polisacharydów (poza skrobią); - β-galaktozydaza - do hydrolizy laktozy; - izomeraza glukozowa - konwertuje glukozę do fruktozy (wilgotne wypieki); - Penicylinaza - do pasz. Enzymy proteolityczne: - proteaza alkaliczna i obojętna - mogą być wykorzystywane w przemyśle pralniczym, gdzie jest podwyższone pH; - proteazy kwaśne; - pullulanaza - rozkład wiązania α-1,6 w skrobii ;- termolizyna - służy do produkcji aspartanu. Bioinsektycydy: - szczep Bacillus Turingensis - chroni rośliny przed insektami; - bakterie Clostridium. Szczepy rodzaju Bacillus należą do tlenowców, jednakże mogą rozwijać się w stosunkowo szerokim zakresie pH i wiele z gatunków należących do tego rodzaju, nie ma kompletnego cyklu Krebsa. W zależności od poziomu natlenienia intensyfikowany lub ograniczany jest etap tworzenia przetrwalników i wydzielania metabolitów. Przedmiotem dużego zainteresowania biotechnologów są bakterie z rodzaju Clostridium należące do grupy beztlenowców, co powoduje, że wiele metabolitów może być uzyskanych w warunkach deficytu tlenu, a tlen stanowi zwykle najdroższą pożywkę w procesach biosyntezy. Szczepy Clostridium wydzielają poza komórkę enzymy hydrolizujące skrobię, celulozę, peptyny i białka. Cechą wyróżniającą jest to, że szczepy te fermentują heksozy jak i pentozy, wytwarzają duże ilości alkoholi (etanol, butanol), oraz kwasów organicznych i ketonów. Wśród bakterii Clostridium jest wiele gatunków termofilnych, co stwarza szanse uzyskania, z udziełem tych szczepów, enzymów o wysokiej termostabilności. Wykorzystanie promieniowców w biotechnologii: Głównymi cechami wyróżniającymi promieniowce jest ich budowa komórki podobna do bakterii i morfologia zbliżona do grzybów. Promieniowce są blisko spokrewnione z takimi bakteriami jak: Corynebacterium, Brevibacterium, Micrococcus, Mycobacterium. Największe znaczenie biotechnologiczne ma rodzaj Streptomyces. Większość antybiotyków stosowanych w lecznictwie wytwarzanych jest przez te promieniowce 2/3 spośród poznanych dotychczas antybiotyków wytwarzane jest przez Streptomyces. Antybiotyki wytwarzane przez promieniowce:- aktynomycyna; - erytromycyna; - kanamycyna; - nystatyna; - oksytetracyklina; - polifungina; - streptomycyna; - tetracyklina; - gentramycyna; - wiomycyna; - neomycyna. ~Actinomyces bovis i Actinomyces isrealii - szczepy wytwarzające bardzo silne toksyny. Szczepy Streptomyces wykorzystywane są również do produkcji inhibitorów enzymów oraz do produkcji witaminy B₁₂ czyli kobalaminy. Wykorzystanie grzybów strzępkowych w biotechnologii: Grzyby strzępkowe są w zasadzie organizmami tlenowymi, jednakże mogą się rozwijać również w warunkach silnego deficytu tlenu. Wykorzystują zarówno nieorganiczne jak i organiczne źródła azotu. Mają intensywną przemianę materii i ogromną tolerancję na zmieniające się warunki otoczenia. Rozwijają się bardzo szybko na powierzchni większości produktów spożywczych. Zwykle są to organizmy mezofilne, jednakże chętnie rozwijają się również w temperaturze kilku stC (lodówki). Znoszą przez długi okres czasu niewystarczającą wilgotność i w miarę możliwy wzrost obserwuje się jeszcze przy wilgotności 11-14%. Preferowane pH 3-5, a mogą rozwijać się i do 11. Główne znaczenie biotechnologiczne to zdolność do wytwarzania enzymów i innych związków np. kwasów organicznych, które są stosowane w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym (kwas glukonowy) , w oczyszczalniach ścieków i przetwórstwie żywności. Z punktu widzenia przyrodniczego współdziałając z bakteriami uczestniczą w rozkładzie materii organicznej, umożliwiając tym samym kolejne okresy wegetacji. Potężną siłą w tym aspekcie jest wytwarzanie przez grzyby enzymów rozkładających celulozę i kompleks lignino-celulozowy. Negatywne stany funkcjonowania grzybów to: - straty spowodowane pleśnieniem produktów spożywczych, tkanin, skór, drewna, papieru i różnych materiałów technicznych; - alergie, wywołane przez ich zarodniki; - zdolność do obfitej produkcji toksyn. Najważniejsze antybiotyki wytwarzane przez grzyby: - cefalosporyna; - cyklosporyna; - fumagilina; - penicylina; - wariotyna. Najważniejsze enzymy wytwarzane w dużej skali przez grzyby: - Amylazy (enzymy amylolityczne); α-amylazy pleśniowe są aktywne już przy pH 4-5 (optimum zwykle do 5). Mają niższą temperaturę optymalną - około 45stC w porównaniu z bakteriami - około 60stC. Nie wymagają destabilizacji jonów węgla. Przemysł owocowo-warzywny korzysta głównie z α-amylaz pleśniowych. - enzymy pektynolityczne (przemysł owocowo-warzywny); - enzymy celulolityczne; - dekstranaza; - katalaza; - oksydaza glukozowa. Do produkcji tych enzymów są wykorzystywane głównie Aspergillus i Penicillium. Wykorzystanie glonów w biotechnologii: Zalicza się je umownie do mikroorganizmów ze względu na możliwość ich wykorzystania do produkcji specyficznych produktów tj: - agar-agar; - karagenan; - alginian. Ponadto glony wykorzystywane są w krajach o cieplejszym klimacie jako pasza dla zwierząt i nawóz. Szczególnym zainteresowaniem cieszy się glon Chlorella, który wykazuje szczególną zdolność wykorzystywania energii słonecznej do wzrostu. Aż 20% energii wymaganej dla rozwoju tego glonu pobierane jest z energii słonecznej. Typowe rośliny lądowe mają wiele niższą sprawność w tym zakresie i zaledwie 2% tej energii czerpane jest ze słońca. Plony Chorelli są 20-sto krotnie wyższe z danej powierzchni uprawy w porównaniu z typowymi roślinami. Tak więc w klimacie tropikalnym, gdzie jest dużo zbiorników wodnych produkcja tych glonów prowadzona jest na szeroką skalę. Przedmiotem zainteresowania jeżeli chodzi o glony, są również liczne substancje biologicznie czynne, korzystne dla naszego zdrowia. Tak więc trwają liczne prace nad ich wykorzystaniem w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym.

---