1. Stała szybkości reakcji I i II rzędu.

2. Teoria Michaelisa.

3. Stała Michaelisa-Menten.

4. Graficzne wyznaczanie stałych szybkości reakcji.

5. Wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznych.

6. Optymalne warunki działania inwertazy, amylazy ślinowej, trypsyny itp.

7. Energia aktywacji, reguła van't Hoffa, współczynnik temperaturowy.

8. Rodzaje inhibitorów, przykłady różnych typów, mechanizmy inhibicji enzymów.

9. Metody określenia typów inhibicji.

10. Przykłady inhibitorów i ich wpływu na reakcje enzymatyczne w technologii żywności.

11. Stałe kinetyczne opisujące aktywność enzymów.

12. Właściwości i działanie enzymów amylolitycznych.

13. Mechanizmy aktywacji i inhibicji enzymów.

14. Rodzaje substancji aktywujących, ich wpływ na działanie odpowiednich enzymów.

15. Inwertaza i oksydaza glukozowa.

16. Izolacja i oczyszczanie enzymów.

17. Enzymy proteolityczne, amylolityczne i lipolityczne.

18. Preparaty enzymatyczne.

19. Zastosowanie enzymów w przemyśle spożywczym.

20. Metody badań aktywności enzymów.

21. Jednostki aktywności enzymów.

22. Metody oznaczania stężenia białka i produktów hydrolizy białka.

1. Stała szybkości reakcji I i II rzędu.

Miarą szybkości reakcji jest przyrost stężenia produktu lub ubytek stężenia substratu, jaki by nastąpił w jednostce czasu gdyby szybkość reakcji w tym czasie była niezmienna. Ze względu na to, że szybkość reakcji jednak się zmienia (maleje w miarę ubytku substratu), stężenia powinny być mierzone w nieskończenie krótkim czasie. W przypadku gdy substratem jest jeden rodzaj substancji szybkość reakcji opisuje równanie:

v =

gdy za stężenia podstawimy a otrzymamy:

k =
log

Jest to równanie reakcji I rzędu.

Okres połowicznej przemiany substratu jest wielkością stałą i nie jest zależny od początkowego stężenia substratu.

t
=

Więc wykres zależności log a/a-x od t jest linią prostą w przypadku reakcji I rzędu.

Szybkość reakcji, w której zmienia się stężenia dwóch substratów opisuje równanie kinetyczne reakcji II rzędu.

= k (a-x) (b-x)

A stałą szybkości reakcji można wyliczyć wg wzoru:

k =

Czas połowicznego rozłożenia substratu w reakcji II rzędu jest odwrotnie proporcjonalny do stężenia początkowego substratu.

t
=

Wykres zależności 1/a-x od t jest linią prostą w przypadku reakcji II rzędu.

Zatem badając wpływ zmiany stężenia początkowego na czas połowicznego rozpadu można odróżnić reakcje I i II rzędu.

W przypadku gdy stężenie substratu nie wpływa na szybkość reakcji a zależy ona np. od stężenia enzymu mówimy o reakcji zerowego rzędu.

Szybkość początkowa reakcji jest niezależna od rzędu reakcji, wskazuje ona przyrost produktów reakcji w dowolnym czasie, jaki by nastąpił gdyby stężenie substratu nie uległo zmianie. Reakcje enzymatyczne mogą w niektórych warunkach przebiegać ze stałą szybkością, niezależnie od zmian stężenia substratów.

2. Teoria Michaelisa.

Zasadniczym założeniem teorii Michaelisa-Menten jest konieczność wytworzenia odwracalnego kompleksu pomiędzy enzymem a substratem. Równanie Michaelisa-Menten opisuje wpływ stężenia substratu na aktywność wielu enzymów.

Ponieważ w porównaniu ze stężeniem substratu i produktu stężenie enzymu jest wielokrotnie mniejsze więc w przybliżeniu można przyjąć, że stężenie kompleksu ES jest stałe i zależy tylko od stężenia enzymu w roztworze.Im większe jest stężenie kompleksu ES tym więcej produktu powstanie w jednostce czasu.

Przy stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji enzymatycznej w pewnych granicach zależy od stężenia substratu.Przy małym stężeniu substratu w stosunku do stężenia enzymu zwiększenie szybkości reakcji wraz ze zwiększeniem stężenia substratu jest do niego w przybliżeniu wprost proporcjonalne i odpowiada kinetyce I rzędu. Natomiast przy dużym stężeniu substratu szybkość reakcji ma wartość maksymalną V i nie zależy od dalszego zwiększania jego stężenia. W tym przypadaku reakcja podlega kinetyce rzędu zerowego.

3. Stała Michaelisa-Menten.

Stała Michaelisa to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji jest równa połowie szybkości maksymalnej. Stała ta jest wyrażana w molach na dm³ i określa powinowactwo enzymu do substratu: im jest mniejsza, tym powinowactwo jest większe, natomiast duża wartość tej stałej mówi o małym powinowactwie enzymu do substratu.

Równanie Michaelisa-Menten opisuje zależność szybkości reakcji od stężenia substratu:

Postać K_m = [S] jest matematycznym zapisem definicji stałej Michaelisa.

Co wpływa na stałą Michaelisa:

• rodzaj i stężenie substratu

• pH

• temperatura

• siła jonowa

Stała K_m nie zależy od stężenia enzymu!

4. Graficzne wyznaczanie stałych szybkości reakcji.

Szybkości początkowe oraz stałe reakcji enzymatycznych można wyznaczyć, korzystając z odpowiednich wykresów.

a) Szybkość reakcji I rzędu można wyznaczyć, obliczając tangens kąta utworzonego przez styczną do krzywej w danym punkcie. b) Za pomocą wykresu zależności log
lub
od czasu można określić rząd reakcji - jeśli reakcja jest I rzędu wtedy pierwszy wykres będzie linią prostą, jeśli byłaby II rzędu, druga zależność dałaby linię prostą.

c) Stałe kinetyczne Vmax i KM dla reakcji enzymatycznych wyznacza się w początkowej fazie reakcji, używając oczyszczonych enzymów (wszystkie zanieczyszczenia mogą wpływać na wartość KM). Stałe te można wyznaczyć na kilka sposobów, z przekształconego równania Michaelisa-Menten.

v =

Stosując wykres zależności v od s i podstawiając v =
do równania, otrzyma się KM=[S], a wartość KM będzie równa odciętej odpowiadającej rzędnej równej
. Można również zastosować zależność v od PS. Odpowiada ona logarytmicznej formie równania Michaelisa-Menten.

pS = - log [S]

pS = pKM + log

Po podstawieniu v =
ostatnie wyrażenie równania będzie równe 0 wobec czego wartość pS w tym punkcie (środkowy punkt krzywej) będzie równa pKM. Ta metoda wymaga, niestety wyznaczania punktów eksperymentalnych przy wysokim stężeniu substratu, które musi zapewnić osiągnięcie maxymalnej szybkości.

d) Kolejną metodą jest przekształcenie równania Michaelisa-Mentan do postaci liniowej (wykres Lineweavera-Burka). Jest to tzw. metoda podwójnych odwrotności, gdyż wykreśla się zależność
od
która jest prostą i przecina oś odciętych (x) w punkcie -
, a oś rzędnych (y) w punkcie
.

Zależność tę opisuje równanie:

mnożąc przez [S] otrzymamy:

Zależność
od [S] również będzie linią prostą, będzie jednak przecinać oś x w punkcie -KM, a oś y w punkcie
. Nachylenie prostej będzie równe
.

e) Metoda Wolfa polega na wykreśleniu zależności v od
wg równania:

v = Vmax - KM

Wartość KM otrzymamy, dzieląc wartość, w której prosta przecina oś rzędnych przez wartość w punkcie przecięcia osi odciętych (czyli dzieląc długość odcinka na osi y przez długość odcinka na osi x).

Najczęściej stosowana jest metoda podwójnych odwrotności, pozwalająca w prosty sposób wyznaczyć KM oraz V max. Wykres Lineweavera-Burka ma też zastosowanie do określenia typu wiązania enzymu z inhibitorem. W obecności inhibitora kom petycyjnego wartość KM wzrasta, a Vmax nie ulega zmianie, natomiast w przypadku inhibicji niekompetycyjnej wartość KM pozostaje bez zmian, a Vmax maleje. Nachylenie krzywej ulega zmianie w obu przypadkach, przy czym w pierwszym zmenia się punkt przecięcia z osią x, a w drugim z osią y.

5. Wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznych.

Na szybkość przebiegu reakcji enzymatycznych mają zasadniczy wpływ różne czynniki:

• stężenie substratu,

• stężenie enzymu,

• temperatura,

• pH środowiska,

• obecność aktywatorów i inhibitorów.

Stężenie substratu/enzymu

Szybkość reakcji enzymatycznej w przypadku dużego stężenia substratu (wówczas stężenie substratu nie wpływa na szybkość reakcji) jest wprost proporcjonalna do stężenia enzymu (przy niezbyt dużych stężeniach enzymu). W przypadku małych stężeń substratu wzrasta wraz ze zwiększaniem stężenia enzymu, jednak nie jest to wzrost liniowy.

ph

Wpływ ph na białka enzymów zalezy od wielkości zmiany jego wartości. Skrajne wartości ph wpływają na nie denaturująco i nieodwracalnie hamują ich działanie, natomiast niewielkie odchylenia od wartości optymalnej (przy której obserwuje się największą szybkość katalizowania reakcji) mogą nieznacznie denaturować białko a mimo to wpływają na zmniejszenie szybkości reakcji. Aktywność enzymatyczna zmienia się w różnym zakresie pH ze względu na zmiany stopnia zjonizowania zarówno enzymu, jak i substratu oraz kompleksu substrat-enzym. Centrum aktywne enzymu wykazuje działanie katalityczne najczęściej tylko w jednej formie zjonizowania grup, podobnie zwykle tylko jedna forma substratu jest aktywna. Również przy tworzeniu kompleksu enzym-substrat ważne są ich ładunki, ponieważ mogą je łączyć wiązania elektrostatyczne. Optimum ph działania enzymu odpowiada zwykle odczynowi środowiska naturalnego jego syntezy i działania - dla większości mieści się w granicach 5-8, dla niektórych jednak odbiega znacznie od tych wartości. Optymalne wartości ph wybranych enzymów: pepsyna 1,8, trypsyna 8-11, arginaza 10, proteinaza kwaśna 3,5.

Rozrzut optymalnych wartości ph może być znaczny i zależny jest od pochodzenia oraz od substratu, gdy wykazują się szerszą specyficznością.

Temperatura

Optymalna temperatura enzymu to taka, przy której reakcja przebiega najszybciej, a jednocześnie białko enzymu nie ulega denaturacji (zwiększenie stężenia produktu jest proporcjonalne do czasu).Temp optymalna enzymów zależy od ich pochodzenia, dla enzymów zwierzęcych wartość bliska jest wartości temp ciała. natomiast enzymy roślinne mają duże zróżnicowanie temperatury optymalnej, podobnie jak enzymy pochodzenia bakteryjnego - nawet powyżej 90°C. W temp niskiej ok. 0°C enzymy działają Powoli ale wykazują dużą trwałość.

Większość enzymów traci aktywność po przekroczeniu 65^oC, nieliczne tylko wytrzymują krótkotrwałe gotowanie, np. trypsyna. Wyższą temperaturę wytrzymują enzymy suche, dlatego przechowywane są najczęściej w postaci liofilizowanej, aby zapobiegać inaktywacji. Optymalna temperatura zależy od długości inkubacji (gdy enzym ma działać kilka sekund, może być wysoka, gdy kilka dni - musi być niska, by długo zachował aktywność).

W temperaturze do ok. 37^oC (gdy nie grozi denaturacja cieplna enzymu) podniesienie temp. o 10^oC powoduje 2-krotne zwiększenie szybkości reakcji.

Obecność aktywatorów

Na szybkość przebiegu reakcji enzymatycznych mają zasadniczy wpływ różnego rodzaju aktywatory. Substancje te nie biorą udziału w reakcji, jednak aktywują lub zwiększają aktywność enzymów. Można je podzielić na trzy grupy:

1. kofaktory - koenzymy, grupy prostetyczne oraz jony niektórych metali, wbudowanych w cząsteczkę apoenzymu, a także niektóre aniony nieorganiczne

2. makrocząsteczki białkowe, odkrywające grupy czynne enzymu, przekształcające nieaktywną formę enzymu w aktywną - aktywacja proteolityczna

3. drobnocząsteczkowe połączenia organiczne, usuwające wpływ związków hamujących, redukujące potencjał oksydoredukcyjny środowiska

1) Organizm człowieka wymaga dostarczenia z pożywieniem niezbędnych mikroelementów, które są aktywatorami wielu enzymów. Zwykle są one częściami układu aktywującego, tzn. białko enzymatyczne jest niezdolne do aktywacji substratu, jeśli brakuje odpowiedniego jonu metalu. Metale są niezbędne do wytworzenia wiązania między enzymem a substratem lub między enzymem, koenzymem i substratem, albo wchodzą w skład centrum katalitycznego enzymu i warunkują jego działanie (bez nich enzym jest nieczynny).

Do kationów aktywujących niektóre enzymy (enzymy przenoszące elektrony - fosfatazy, dehydrogenazy, lipaza i inne) należą

Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Na⁺, K⁺.

Koenzymami są najczęściej witaminy i ich pochodne, odgrywają one rolę zwłaszcza w enzymach nieproteolitycznych.

W przypadku enzymów proteolitycznych zasadnicze znaczenie mają jony Ca²⁺ (stabilizują aminopeptydazy, proteinazy serynowe i tiolowe), Co²⁺ (aktywują aminopeptydazy), Mn²⁺ (wpływają na aktywność prolidazy) i Zn²⁺ (warunkuje aktywność karboksypeptydazy A). Metale ciężkie hamują działanie enzymów. Aniony wywierają niewielki wpływ na działanie enzymów, wyjątek stanowi aktywowanie amylazy oraz katepsyny C przez chlorki.

2) Niektóre enzymy wytwarzane są w postaci nieaktywnej, jako prekursory enzymów (proenzymy lub zymogen), a ich działanie pobudzane jest przez przekształcenie w wyniku aktywności innych enzymów, np. enterokinaza przekształca nieaktywny trypsynogen
w aktywną trypsynę. Następuje to najczęściej przez przecięcie łańcucha peptydowego proenzymu w określonym miejscu, co powoduje zmianę konformacji peptydu i odsłonięcie miejsca aktywnego.

3)Aktywatorami nazywamy także czynniki, które usuwają wpływ inhibitorów, ograniczających czasowo działanie enzymu. Aktywność wielu enzymów jest hamowana w obecności łagodnych środków utleniających, np. tlenu atmosferycznego, co jest katalizowane przez metale ciężkie, znajdujące się w śladowych ilościach w odczynnikach lub materiale badawczy, czy tez pochodzące z metalowych przedmiotów używanych podczas preparowania enzymów. Taka inhibicja jest często odwracalna, gdy np. zredukujemy grupę -S-S- za pomocą cysteiny, odtworzona zostanie aktywna grupa -SH, natomiast związki kompleksujące mogą związać metale ciężkie. Do enzymów, których aktywność zależy od obecności wolnych grup tiolowych należą katepsyny B, L i H.

Obecność inhibitorów

Substancje, które nie zmieniając sumarycznego procesu zmniejszają energię aktywacji nazywamy katalizatorami. Katalizator nie zużywa się podczas reakcji, dlatego nie występuje w równaniu stechiometrycznym.

Katalizatory ujemne, zmniejszają szybkość reakcji nazywamy inhibitorami.

Rolę katalizatora mogą pełnić pierwiastki i związki chemiczne (zwłaszcza metale grup pobocznych i ich tlenki oraz białka - enzymy - w reakcjach enzymatycznych), a także zanieczyszczenia i światło (w reakcjach fotochemicznych). Aktywność enzymów może być zakłócana przez działanie wielu substancji.

Inhibicja może być odwracalna i nieodwracalna, inhibicja odwracalna zaś może być kompetycyjna lub niekompetycyjna.

Nieodwracalna Związki, które tworzą wiązania kowalencyjne z resztą aminokwasu znajdującą się w centrum aktywnym enzymu (Ser lub Cys) lub w jego pobliżu, inaktywują enzym na stałe.

Odwracalna Inhibitorami kompetycyjnymi (współzawodniczącymi) mogą być związki strukturalnie podobne do normalnego substratu danego enzymu, które konkurują z nim o centrum aktywne. Enzym może wiązać albo cząsteczkę substratu, albo cząsteczkę inhibitora ale nie obie równocześnie. Hamowanie będzie tym większe im większe będzie stężenie inhibitora oraz wartość K_M oraz im mniejsze będzie stężenie inhibitora i wartość K_i (stała dysocjacji kompleksu enzymu z inhibitorem). Przy dużym stężeniu substratu, działanie jego skutecznie współzawodniczy z działaniem inhibitora, więc nie zmieni się wartość V_max, jednak wzrośnie wartość K_M (pozornie mniejsze powinowactwo enzymu do substratu).

Działanie inhibitora kompetycyjnego można rozpoznać po zastosowaniu równania Lineweavera-Burka - mierzy się szybkości początkowe v₀ przy różnych stężeniach substratu i stałym stężeniu inhibitora. Inhibicja kompetycyjna zmienia nachylenie prostej oraz punkt przecięcia z osią x (wzrasta K_M), natomiast punkt przecięcia z osią y pozostaje bez zmian (stała wartość V_max).

Inhibitorami niekompetycyjnymi są związki, które wiążą się z miejscem innym niż centrum aktywne enzymu i powodują zmianę przestrzennego kształtu enzymu, a przez to zmniejszenie jego aktywności katalitycznej. Mogą one wiązać się z wolnym enzymem lub z kompleksem enzym-substrat, a ich działanie nie zależy od stężenia substratu (wartość V_max zmniejsza się), a jedynie od stężenia inhibitora i jego wartości K_i, charakteryzującej powinowactwo inhibitora do enzymu. Powinowactwo substratu do enzymu nie ulega zmianie, dlatego wartość K_M pozostaje stała.

EI

±I ±S

E EIS E + P

±S ±I

ES

E+P

Działanie inhibitora niekompetycyjnego na wykresie Lineweavera-Burka można rozpoznać ze względu na zwiększenie nachylenia prostej oraz zmianę punktu przecięcia z osią y (maleje V_max), natomiast punkt przecięcia z osią x pozostaje bez zmian (stała wartość K_M).

Aktywność enzymatyczną hamuje niekompetycyjnie wiele związków, np. czynniki strącające białka, jak sole metali ciężkich w wyższych stężeniach czy odczynniki alkaloidowe. Wiele enzymów jest wrażliwych nawet na niskie stężenia metali ciężkich, co tłumaczy się katalizowaniem metalem utleniania np. grup -SH tlenem atmosferycznym. Działanie to jest odwracalne, można je cofnąć stosując nadmiar związków tiolowych, np. cysteiny, których grupy -SH będą konkurować z grupami enzymu o inhibitor.

Inhibitorami są również związki tworzące kompleksy z metalami będącymi częścią centrum aktywnego lub biorącymi bezpośredni udział w procesie katalitycznym, np. cyjanki, CO wpływają na oddychanie komórkowe, hamując oksydazy zawierające Fe lub Cu w grupie czynnej.

Typ hamowania można określić kilkoma metodami, np. za pomocą metody Dixona. Przy stałym stężeniu substratu oznacza się szybkość reakcji v przy różnych stężeniach inhibitora. Oznaczając szybkość v przy dwóch (lub więcej) stężeniach substratu, wyznacza się krzywe zależności 1/v od [I] i ustala typ hamowania (kompetycyjne - krzywe przecinają się, niekompetycyjne - krzywe zbiegają się na osi x) oraz oznacza wartość K_i (punkt przecięcia krzywych). Można również wykreślić krzywe zależności szybkości reakcji v₀ od stężenia substratu według Michaelisa-Menten lub też zależność 1/v od 1/[S] wg Lineweavera-Burka, w obecności i nieobecności inhibitora, z których można wyznaczyć wartości V_max i K_M i na tej podstawie określić typ inhibicji.

6. Optymalne warunki działania inwertazy, amylazy ślinowej, trypsyny itp.

Amylaza ślinowa - enzym białkowy występujący w ludzkiej ślinie. Jego rola polega na trawieniu trafiających tam węglowodanów. Rozcina on wiązanie 1,4-α-glikozydowe. Nie powstają jednak zwykle na tym etapie same oddzielne cząsteczki glukozy, trawienie to jest dopiero wstępne, kontynuowane zaś będzie w dalszej części przewodu pokarmowego.

Jest aktywny przy pH 4-11 przy optimum równym 6. Zachowuje działanie wyłącznie w obecności jonów chlorkowychhttp://pl.wikipedia.org/wiki/Amylaza_%C5%9Blinowa - cite_note-0. Największą aktywnością amylaza wykazuje się w temp. 40 stopni C. Najniższą zaś w temperaturze 0 stopni C. Po przekroczeniu 45 stopni, następuje denaturacja enzymu. Łącznie amylaza ślinowa trawi około 30% skrobi co wykazano badając pacjentów z niewydolnością trzustki.

Inwertaza (β-fruktofuranozydaza, β-fruktozydaza, sacharaza, EC 3.2.1.26) - enzym z klasy hydrolaz i podklasy glikozydaz, który katalizuje hydrolizę wiązania fruktofuranozydowe (+)-sacharozy z wytworzeniem (+)-glukozy i (−)-fruktozy. Procesowi towarzyszy zmiana kierunku skręcania płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego z dodatniej na ujemną, tzw. "inwersja sacharozy", co jest źródłem nazwy enzymu.

Optymalne pH działania inwertazy wynosi około 5, temperatura 60°C. Występuje głównie w komórkach roślinnych, gdzie związana jest ze ścianą komórkową. Wytwarzana jest też przez pszczoły, hydrolizując sacharozę podczas powstawania miodu. Produkty dostępne handlowo uzyskiwane są z drożdży.

Trypsyna (EC 3.4.21.4) - enzym trawienny wytwarzany przez część zewnątrzwydzielniczą trzustki. Jest wydzielany w postaci proenzymu - trypsynogenu, który wchodzi w skład soku trzustkowego. W dwunastnicy pod wpływem niewielkich nawet ilości innego enzymu - enterokinazy dochodzi do aktywacji trypsynogenu. Dzięki autokatalitycznej zdolności trypsyny szybko dochodzi do pełnego uczynnienia wydzielonego trypsynogenu.

Trypsyna należy do endopeptydaz. Katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych wewnątrz łańcucha polipeptydowego, w miejscach w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny. W centrum aktywnym trypsyny znajduje się seryna jako główny aminokwas kontaktowy, przez co trypsynę zalicza się do podpodklasy endopeptydaz serynowych. Optimum dla działania trypsyny wynosi ok. pH 8. Efektem jej działania na białko są peptydy o różnej długości łańcucha.

7. Energia aktywacji, reguła van't Hoffa, współczynnik temperaturowy.

Energia aktywacji

Wpływ temperatury na szybkość reakcji opisuje empiryczne równanie Arrheniusa

k - stała szybkości reakcji

A - stała Arrheniusa

E_A - energia aktywacji w J/mol

R - stała gazowa (8,319 J•mol^-1•K^-1)

T - temperatura w K

Stała Arrheniusa A jest maksymalną stałą szybkości reakcji w warunkach, gdy wszystkie zderzenia cząsteczek są efektywne.

Równanie w postaci logarytmicznej przedstawia liniową zależność między ln k a 1/T.

Stałą Arrheniusa A oraz energię aktywacji można łatwo wyznaczyć znając doświadczalne wartości stałych szybkości reakcji w kilku temperaturach.

Równanie Arrheniusa może służyć do określenia z

ależności między energią aktywacji
a temperaturą:

gdzie:

k₁ i k₂ - stałe szybkości reakcji w temperaturze T₁ i T₂

T₁ i T₂ - temperatury pomiarów w skali Kelwina

W reakcjach enzymatycznych szybkości V_max wyznaczone przy dużym nadmiarze substratu są wprost proporcjonalne do stałych szybkości, można więc wartości k₁ i k₂ zastąpić wartościami V_max1 i V_max2, wyznaczonymi dla dwóch temperatur.

Reguła van't Hoffa

wzrost temperatury o 10 °C powoduje 2-4-krotny wzrost szybkości reakcji.

TWSR (temperaturowy współczynnik szybkości reakcji)

Z regułą van't Hoffa wiąże się temperaturowy współczynnik szybkości reakcji (TWSR), wyznaczający stosunek szybkości reakcji chemicznej po zmianie temperatury do szybkości reakcji przed zmianą temperatury (wzrostem lub spadkiem).

ΔT = T₂ - T₁

γ - temperaturowy współczynnik szybkości reakcji (TWSR)

Liczbę określającą ile razy wzrośnie stała szybkości reakcji k (a więc i szybkość reakcji) nazywamy współczynnikiem temperaturowym *.

Wpływ temperatury we wzorach opisujących szybkość reakcji zawarty jest w stałej szybkości reakcji k.

12. Właściwości i działanie enzymów amylolitycznych.

Amylaza to ogólna nazwa enzymów hydrolizujących skrobię, do których zaliczamy α-amylazę, endoamylazę rozkładającą wiązania α-1,4-glikozydowe amylozy i amylopektyny; β-amylazę, rozkładającą skrobię od końca łańcucha, rozcinając wiązania α-1,4-glikozydowe oraz amyloglukozydazę i glukoamylazę, odcinające glukozę na końcu łańcucha skrobiowego, rozkładające zarówno wiązania α-1,4-glikozydowe, jak i α-1,6-glikozydowe. W wyniku działania α-amylazy powstają α-dekstryny o małej masie cząsteczkowej i niewielka ilość maltozy. W wyniku działania β-amylazy powstają duże amylodekstryny i znaczna ilość maltozy.

Z jodem skrobia daje zabarwienie niebieski, kolejne produkty pośrednie rozkładu skrobi dają odpowiednio barwę: niebieskofioletową (amylodekstryny), czerwoną (erytrodekstryny), czerwonobrunatną (achrodekstryny). Maltoza nie daje zabarwienia z jodem.

Optymalne warunki działania amylaz, to, w zależności od pochodzenia enzymu, pH lekko kwaśne (zbożowe) do obojętnego (zwierzęce), temperatura 50-65^oC (zbożowe) i 37^oC (zwierzęce), obecność jonów Cl^-.

13. Mechanizmy aktywacji i inhibicji enzymów.

Większość związków chemicznych, które mają małe strukturalne podobieństwo do substratów (lub nie mają go wcale) i przyłączają się do miejsca katalitycznego lub gdzie indziej działa jako niekompetycyjne inhibitory aktywności enzymatycznej.

Inhibitory kompetycyjne zwiększają Km ale nie mają wpływu na Vmax, natomiast inhibitory niekompetycyjne zmniejszają Vmax ale nie wpływają na Km. Inhibitory te można odróżnić mierząc aktywność enzymu w różnych stężeniach substratu w obecności i nieobecności inhibitora. Oba zestawy danych są wówczas przedstawiane w formie wykresu zależności 1/vi wzgldem 1/[s]. W klasycznym hamowaniu kom petycyjnym dwie linie przecinają się na osi y (tj. Vmax nie ulega zmianie), ale odcinek x (-1/Km) jest zmniejszony w obecności inhibitora (tj. Km wyraźnie wzrosła). Dla hamowania niekompetycyjnego odcinek y (1/Vmax) wzrasta w obecności inhibitora (tj.Vmax jest zredukowana) ale odcinek x jest niezmieniony.

15. Inwertaza i oksydaza glukozowa.

Inwertaza (E.C. 3.2.1.26) jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy. Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć sacharozę do łatwo przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza. U ludzi inwertaza, podobnie jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito cienkie. Inwertaza występuje też w ślinie pszczół i bierze udział w przetwarzaniu cukru z nektaru kwiatowego do cukrów prostych. Zastosowanie W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji czekoladek nadziewanych półpłynnym nadzieniem. Podczas produkcji nadzienie w postaci stałej (głównym składnikiem jest sacharoza) pokrywane jest czekoladą, a następnie w ciągu kilkutygodniowego „dojrzewania“ czekoladek w wyniku działania inwertazy dodanej w procesie produkcji, sacharoza rozkładana jest do fruktozy i glukozy, które chłonąc wilgoć ze środowiska powodują w efekcie upłynnienie nadzienia.

Oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4) - enzym z klasy oksydoreduktaz,katalizujący reakcję utleniania β-D-glukopiranozy (jednej z form glukozy) do kwasu glukonowego. Ubocznym produktem reakcji jest nadtlenek wodoru. Dostępna handlowo zazwyczaj jako preparat otrzymywany z grzybów Aspergillus niger. Zastosowanie Oksydaza glukozowa jest dimerycznym białkiem z centrum aktywnym zawierającym FAD głęboko schowany w jego strukturze. Ogromna specyficzność tego enzymu dla D-glukozy jest wykorzystywana do wytwarzania czujników (sensorów) enzymatycznych, które są m.in. używane do oznaczania zawartości glukozy w płynach ustrojowych. Stosowana jest także w przemyśle rolno-spożywczym.

16. Izolacja i oczyszczanie enzymów.

Źródłem enzymów mogą być tkanki roślinne, zwierzęce oraz komórki mikroorganizmów. Obecnie szerokie zastosowanie znajdują zwłaszcza enzymy pochodzenia mikrobiologicznego, ze względu na łatwość uzyskania dużych ilości homogennych enzymów.

Enzymy są przeważnie bardzo nietrwałe w środowisku o pH mniejszym niż 5 lub większym niż 9, łatwo ulegają też denaturacji cieplnej (powierzchniowej - podczas pienienia się roztworów) oraz są inaktywowane przez metale ciężkie. Izolowanie i oczyszczanie enzymów należy zatem przeprowadzać w taki sposób, aby zapobiegać utracie zdolności katalitycznych, tzn. w buforach o pH około 7, w niskiej temperaturze (najczęściej około 0^oC), stosując wodę podwójnie destylowaną oraz środki kompleksujące metale ciężkie, a w razie konieczności również związki tiulowe, zachowując wyjątkową czystość na stanowisku pracy.

Oczyszczanie enzymu polega na wyizolowaniu swoistego enzymu z surowego ekstraktu komórkowego, zawierającego wiele innych komponentów. Celem jest osiągnięcie maksymalnej swoistej aktywności (jednostki enzymu na miligram białka) z możliwie najlepszym odzyskiem początkowej aktywności.

Dla każdego enzymu powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania wykorzystujący jego własności fizykochemiczne.

a) Przeprowadzenie białek do roztworu - jest pierwszym krokiem przy ich oczyszczaniu, chyba że izolujemy je z płynnego źródła (np. z krwi, śliny itp.).

Stosuje się w tym celu techniki doprowadzające do zniszczenia ścian, błon komórkowych lub struktury całych komórek, takie jak:

* degradacja ścian komórkowych przez lizozym, * rozrywanie komórek pod wpływem ciśnienia osmotycznego, * sonifikacja (pękanie komórek pod wpływem wibracji wywołanych ultradźwiękami) oraz * homogenizacja, * rozcieranie z piaskiem lub perełkami szklanymi i inne metody mechaniczne.

Enzymy rozpuszczalne łatwo poddają się procesowi ekstrakcji wodą lub rozcieńczonymi roztworami soli i buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia roztworów detergentów lub rozpuszczalników organicznych, które rozpuszczają lipidy. Dalsze metody stosowane w celu otrzymania preparatu enzymatycznego są bardzo różnorodne i ich stosowanie zależy od aktualnego i pożądanego stopnia oczyszczenia enzymu.

Najczęściej stosowanymi wstępnymi procesami oczyszczania są:

- frakcjonowanie roztworami soli (np. siarczanem amonu)

- ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub eterem).

b) Jako kolejny etap otrzymywania enzymów, szerokie zastosowanie ma obecnie chromatografia, elektroforeza, ultrawirowanie, stosowana jest także krystalizacja. Duże znaczenie w procesach oczyszczania białek mają techniki elektroforetyczne. Podobnie jak metody chromatograficzne mają one zastosowanie w przypadku wykonywania badań analitycznych (np. określania stopnia czystości izolowanych enzymów) jak i badań preparatywnych, wykonywanych w celu oczyszczenia białka.

Ultrawirowanie wykorzystuje znacznie wyższe przeciążenia (nawet powyżej 600 000 x g). W przypadku stosowania ultrawirowania w celach preparatywnych zazwyczaj prowadzi się ten proces w obecności substancji, która pozwala na otrzymanie gradientu gęstości. W obecności CsCl lub sacharozy gęstość roztworu wzrasta od powierzchni do dna naczyń wirówkowych, co pozwala na zwiększenie wydajności rozdziałów prowadzonych metodami ultrawirowania.

Proces oczyszczania enzymów wymaga ciągłej kontroli zarówno jakościowej (wzrastająca czystość białka), jak i ilościowej (badanie stężenia interesującego enzymu i/lub jego aktywności). Kontrole jakościową wykonuje się wykorzystując techniki elektroforetyczne (zwłaszcza SDS-PAGE). Do oznaczania stężenia enzymów wykorzystywane są natomiast zazwyczaj techniki spektrofotometryczne, np. metoda Lowry'ego, metoda biuretowa. Oznaczanie aktywności enzymów wykonuje się w oparciu o ich zdolności katalityczne.

17.Enzymy amylolityczne, proteolityczne, lipolityczne.

Enzymy umożliwiają trawienie - proces fizjologiczny polegający na rozkładaniu złożonych wielkich cząsteczek (białek, tłuszczy, węglowodanów) na elementy prostsze. Rozbijanie to odbywa się za pomocą enzymów wytwarzanych przez odżywiający się organizm.
Odpowiednio do typu związków pokarmowych, odróżnia się:
    enzymy proteolityczne - rozszczepiające białka,
    enzymy amylolityczne - rozkładające skrobię i wiele innych węglowodanów
    enzymy lipolityczne - działające na tłuszcze.
 Zazwyczaj w organizmie występuje po kilka enzymów z każdej grupy, czynnych w różnych odczynach środowiska, co gwarantuje bardzo dokładny rozkład określonego związku.

Enzymy amylolityczne

Amylaza to ogólna nazwa enzymów hydrolizujących skrobię, do których zaliczamy α-amylazę, endoamylazę rozkładającą wiązania α-1,4-glikozydowe amylozy i amylopektyny; β-amylazę, rozkładającą skrobię od końca łańcucha, rozcinając wiązania α-1,4-glikozydowe oraz amyloglukozydazę i glukoamylazę, odcinające glukozę na końcu łańcucha skrobiowego, rozkładające zarówno wiązania α-1,4-glikozydowe, jak i α-1,6-glikozydowe. W wyniku działania α-amylazy powstają α-dekstryny o małej masie cząsteczkowej i niewielka ilość maltozy. W wyniku działania β-amylazy powstają duże amylodekstryny i znaczna ilość maltozy.

Z jodem skrobia daje zabarwienie niebieski, kolejne produkty pośrednie rozkładu skrobi dają odpowiednio barwę: niebieskofioletową (amylodekstryny), czerwoną (erytrodekstryny), czerwonobrunatną (achrodekstryny). Maltoza nie daje zabarwienia z jodem.

Optymalne warunki działania amylaz, to, w zależności od pochodzenia enzymu, pH lekko kwaśne (zbożowe) do obojętnego (zwierzęce), temperatura 50-65^oC (zbożowe) i 37^oC (zwierzęce), obecność jonów Cl^-.

Enzymy proteolityczne

są białkami wytwarzanymi w żywym organizmie , rozszczepiającymi wiązania peptydowe w białkach, Poli- i oligosacharydach.

W zależności od lokalizacji dzielimy: a)pozakomórkowe b)wewnątrzkomórkowe

a)pozakomórkowe enzymy trawienne, wydzielane do przewodu pokarmowego, gdzie pełnią zasadniczą rolę w rozkładzie pokarmu. Np. enzymy obecne w soku żołądkowym (pepsyna, podpuszczka) oraz enzymy soku trzustkowego (trypsyna, chymotrypsyna, karboksypeptydaza),enzymy występujące w cytozolu tkanki mięśniowej (kalpainy).Ich izolacja z tkanek nie wymaga niszczenia struktury komórkowej, a jedynie ekstrakcji.

b)wewnątrzkomórkowe znajdują się przeważnie w lizosomach. Ich rola polega na utrzymaniu równowagi między poziomem białek i produktów ich rozkładu wewnątrz komórki. Np. katepsyny występujące w dużych ilościach w komórkach nerek, śledziony, wątroby a także komórkach tkanki mięśniowej.

W zależności od pochodzenia dzielimy: a)pochodzenia zwierzęcego - pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna b)pochodzenia roślinnego - papaina, bromelaina, ficyna c)z drobnoustrojów - Alkalaza, Neutraza, Flavourzyme

W zależności od miejsca ataku enzymu w łańcuchu peptydowym: a)egzopeptydazy b)endoproteazy

Egzopeptydazy działają na wiązania peptydu przylegającego do C- lub N-końców łańcucha peptydowego odszczepiając w efekcie aminokwasy końcowe.Wykazują specyficzność w stosunku do sąsiedniego wolnego ładunku, występującego obok wiązania peptydowego. Wyróżniamy:

-aminopeptydazy (EC 3.4.11.-) -dipeptydazy (EC 3.4.13.-) -peptydylo-peptydazy (EC 3.4.14.-) -tripeptydylo-peptydazy (EC 3.4.14.-) -peptydylo-dipeptydazy (EC 3.4.15.-) -karboksypeptydazy : karboksypeptydazy serynowe, metalokarboksypeptydazy, karboksydazy cysteinowe

Endoproteazy rozszczepiają wiązania peptydowe w obrębie głównej struktury polipeptydowej w określonych miejscach natomiast brak im zdolności do atakowania końca łańcucha polipeptydowego. Głównie działają na białka i wyższe polipeptydy i dlatego są nazywane także proteinazami i proteazami. W zależności od rodzaju reszt aminokwasowych występujących w centrum aktywnym, wyróżnia się cztery grupy: a)proteinazy serynowe (EC 3.4.21.-) katalizują selektywnie hydrolizę wiązania peptydowego. Grupą reaktywną jest grupa hydroksylowa (-OH). Do proteaz serynowych należą m.in. chymotrypsyna, trypsyna, trombina, elastaza. Białka enzymatyczne tego rodzaju zawierają w centrum aktywnym serynę i histydynę będące dawcą ładunku dodatniego. b)proteinazy cysteinowe (tiolowe) (EC 3.4.22.-) mają w centrum aktywnym sulfhydrolową grupę cysteiny (Cys-25) i imidazolowi grupę histydyny (His-159).Główne proteinazy cysteinowe lizosomów: katepsyny B, L, H i S.Proteinazy cytosolowe: kapaliny, występujące w wielu tkankach zwierzęcych. Duże znaczenie w hydrolizie i modyfikacji białek mają proteinazy cysteinowe: papaina, bromelaina, ficyna. Papaina-pierwsza proteinaza cysteinowa-wg niej usystematyzowano całą grupę proteinaz cysteinowych. jako papainopodobnych. c)proteinazy aspartylowe (EC 3.4.23.-) inaczej karbosylowe lub kwasowe ponieważ w katalizie uczestniczy grupa karboksylowa kwasu asparginowego. Rozszczepiają łańcuch peptydowy tylko w środowisku kwaśnym (poniżej ph5).Np. katepsyna D, pepsyna, chymozyna. Typowym inhibitorem szczególnie katepsyny D jest pepstatyna A. d) metaloproteinazy (EC 3.4.24.-) w swoim składzie zawierają atom cynku (Zn²⁺), który pełni rolę katalityczną i strukturalną w cząsteczce enzymu. Syntetyzowane są w komórkach w formie preproenzymu i uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej jako proenzymy. Enzymy te syntetyzowane są w komórkach i uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej w formie nieaktywnej (proMMP). Aktywacja enzymu następuje przez proteolityczne cięcie w rejonie propeptydu. Aktywność metaloproteaz jest precyzyjnie regulowana na poziomie transkrypcji, translacji oraz poprzez endogenne inhibitory, takie jak α2-makroglobulina i tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMP).Do najważniejszych należą: karboksypeptydaza A i B, glicyno-glicyno dipeptydaza, leucylo-aminopeptydaza, termolizyna.

Enzymy lipolityczne

hydrolizują wiązania estrowe występujące pomiędzy glicerolem i kwasami tłuszczowymi w obrębie różnorodnej grupy lipidów. Są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, występują w nasionach i organach wielu roślin wegetatywnych, w niektórych mikroorganizmach oraz organizmach ludzi i zwierząt (trzustka, wątroba, ściana żołądka, jelit.). Katalizują hydrolizę nierozpuszczalnych w wodzie triagliceroli (TAG). Reakcja ta zachodzi na granicy faz a produktami są kw. tłuszczowe, diacyloglicerole (DAG) oraz glicerol. Lipazy katalizują również hydrolizę nierozpuszczalnych w wodzie krótkołańcuchowych estrów kw. karboksylowych (reakcja zachodzi bardzo powoli). Lipazy wykazują się większą aktywnością w stosunku do substratów nierozpuszczalnych w wodzie niż do rozpuszczalnych estrów co jest cechą odróżniającą lipazy od esteraz.

Hydroliza triacylogliceroli jest reakcją odwracalną. Kierunek reakcji jest zależny od środowiska, przy czym nadmiar wody wywołuje hydrolizę a jej niska zawartość estryfikację glicerolu-reakcja odwrotna.

Szybkość hydrolizy triacylogliceroli wzrasta z liczbą reszt kw. tłuszczowych, długością łańcucha oraz stopniem nienasycenia kw. tłuszczowych.

Reakcje katalizowane przez lipazy można prowadzić w rozpuszczalnikach organicznych oraz roztworach buforowych, możliwa jest wtedy kontrola zawartości wody (współczynnik aktywności wodnej).

Lipazy katalizują następujące typy reakcji:

• hydroliza - środowisko wodne z nadmiarem wody

• estryfikacja - środowisko z małym udziałem wody lub bezwodne

• transestryfikacja - wymiana kw. tłuszczowych w TAG: acydoliza- gr. acylowe pochodzą od wolnych kwasów interstryfikacja - wymiana gr. acylowych pomiędzy estrami alkoholiza - reakcja pomiędzy alkoholem i estrem-powstaje nowy alkohol i ester

Lipazy charakteryzuje specyficzność określana jako selektywność:

• regioselektywność sn-1,3-regloselektywnosc oraz brak selektywnosci

• selektywność w stosunku do kwasów tłuszczowych długołancuchowych polienowych kwasów tłuszczowych nasyconych kwasów tłuszczowych cis n-9

• selektywnosc w stosunku do acylogliceroli mono, di lub triacylogliceroli

Możliwe jest także rozróżnianie przez lipazy enacjomerow lipidów - stereoselektywność

niektóre lipazy wykazują mieszana selektywność.

Selektywność zależy od parametrów środowiska , rodzaj zastosowanego rozpuszczalnika, z jakiego pochodzą.

Strukturyzowane triacylogricerole sTGA- są to takie które posiadają odpowiednia strukturę i pozycje kwasów tłuszczowych , jest taki jaki oczekujemy : otrzymujemy metodami - enzymatycznymi (czyste) i chemicznymi (mieszanina TAG).

Enzymatyczna synteza sTAG - jedna i dwu stopniowa

• jednostopniowa polega na interestryfikacji dwóch triacylogliceroli ( więcej produktów ubocznych), acydoliza traicyloglicerolu z dwoma ekwiwalentami kwasów tłuszczowych ( więcej kwasów metoda bardziej wydajniejsza )

• metoda dwustopniowa - pierwszy alkoholiza - przebiega przy regioselektywnej lipazie, nastąpi wymiana ( monoacyoglicerol ) - rozdział odcięcie kwasów tłuszczowych a pozostaje grupa oh , następnie estryfikacja

Enzymy syntetyzujące wiązania glikozydowe należą do transferaz EC .x.x , zaś enzymy degradujące wiązania glikozydowe należą do hydrolaz EC 3.2.x.x i liaz EC 4.2.2.x.

18. Preparaty enzymatyczne.

W przemyśle spożywczym zastosowanie ma wiele preparatów enzymatycznych, zarówno pochodzenia zwierzęcego, roślinnego, jak i mikrobiologicznego. Do najczęściej stosowanych enzymów pochodzenia zwierzęcego należą: pepsyna, podpuszczka, trypsyna, chymotrypsyna, α-amylaza trzustkowa, pankreatyna. Spośród enzymów roślinnych najczęściej stosuje się papainę, bromelainę oraz α-amylazę słodową. Obecnie, ze względu na łatwość pozyskania, największe zastosowanie mają jednak enzymy pochodzenia mikrobiologicznego, np. Alkalaza, Flavourzyme, Neutraza, Protamex, Proteopol BP, Amylopol P.

PEPSYNA pH 1-2 aktywowana przez jony H+ kwasu solnego (aktywacja z pepsynogenu przez odszczepienie fragmentu zasłaniającego centrum aktywne). Składnik soku żołądkowego, endopeptydaza. Hydrolizuje wiąz. peptydowe w sąsiedztwie aa aromatycznych, leucyny i kwasu glutaminowego. W przemyśle spożywczym pepsyna wieprzowa i wołowa zastępują renninę przy produkcji serów. Pepsynę otrzymuje się z błony śluzowej żołądka świń lub bydła. W celu osiągnięcia jej stabilizacji, przechowuje się ją czasami w nasyconym roztworze siarczanu magnezu lub uciera z sacharozą albo laktozą (sproszkowana pepsyna).

RENNINA (podpuszczka) pH 5,5-7,0 w obecności jonów Ca2+. Endoproteinaza aspartylowa. Występuje w żołądku młodych ssaków.

Przekształca kazeinę w parakazeinian wapnia - ścina białka mleka, ułatwiając trawienie przez pepsynę. Preferuje rozszczepianie wiązań peptydowych utworzonych przez jedną lub dwie reszty leucyny. W technologii żywności stosowana do ścinania mleka „na słodko”, hydrolizuje także dalej frakcje kazeinowe w czasie dojrzewania sera, powodując ich częściowe doprowadzenie do stadium peptydów. Podpuszczka cielęca zastępowana jest pepsyną wołową i wieprzową, a ostatnio także enzymami pochodzenia mikrobiologicznego, głównie pleśniowego.

TRYPSYNA pH 7,9 (aktywacja z trypsynogenu). Składnik soku trzustkowego, endopeptydaza. Hydrolizuje wiąz. peptydowe utworzone przez lizynę i argininę we wszystkich białkach.

CHYMOTRYPSYNA pH 8,0 aktywowana przez trypsynę (aktywacja z chymotrypsynogenu). Składnik soku trzustkowego, endopeptydaza. Atakuje wiąz. peptydowe w sąsiedztwie aa aromat., leucyny i metioniny - aa hydrofobowych - powoduje powstawanie gorzkich peptydów.

PAPAINA pH 5-9, opt. 6-7, w zależności od substratu, endoproteza cysteinowa. Podczas hydrolizy może wchodzić w interakcje z produktami pośrednimi, dlatego niemożliwe jest prognozowanie składu produktów hydrolizy. Papainę otrzymuje się z zielonych owoców drzewa malonowego - papai (Carica papaya).

Papaina służy np. do produkcji odpornych na niskie temperatury gatunków piwa, do produkcji preparatów zmiękczających mięsa i w medycynie.

FICYNA pH 4,5-8,3, opt. 6,8, pod względem specyficznej aktywności podobna do papainy, również endopeptydaza cysteinowa, rozszczepiająca wiązania przy aminokwasach hydrofobowych i zasadowych, jednak rozcina inne wiązania w tym samym substracie (np.w insulinie). Ficynę otrzymuje się z mlecznego soku pewnych odmian drzew figowych.

BROMELAINA pH 6,8, endoproteaza cysteinowa, podobna do papainy, glikoproteina. Preferuje rozszczepianie wiązań peptydowych utworzonych przez Arg w przypadku małych cząsteczek lub reszty aminokwasów polarnych w przypadku białek. Bromelainy uzyskuje się z łodyg i z owoców ananasa, jest to kilka proteaz, z których 80-90% aktywności enzymatycznej przypada na główną endoproteazę, która determinuje właściwości preparatu.

PANKREATYNA jest mieszaniną różnych enzymów proteolitycznych (głównie trypsyny, chymotrypsyny i karboksypeptydazy), amylolitycznych oraz lipolitycznych i innych, produkowanych w trzustce. Otrzymywana jest ze świeżej trzustki wołowej lub wieprzowej. Hydrolizuje białka i polipeptydy, optymalnie w temp. Ok. 40^oC i pH 7-9. Wykorzystywana jest do produkcji serów i tenderyzacji mięsa.

Proteazy pochodzenia mikrobiologicznego

ALKALAZA jest preparatem endopeptydazy, produkowanej przez szczep Bacillus licheniformis. Jej głównym składnikiem jest gliceryna, w której rozpuszczona jest Subtylizyna A. Alkalaza jest enzymem stosunkowo termoopornym, optymalną aktywność wykazuje w temp. 60±5°C przy pH 7,5 do 8,5. Wraz ze spadkiem pH jej termoodporność maleje. Może ona równocześnie atakować siedem różnych typów wiązań, utworzonych zarówno przez reszty aminokwasów hydrofobowych (szczególnie od strony karboksylowej), jak i przez reszty aminokwasów obojętnych lub kwaśnych. Odszczepiając aminokwasy obojętne lub kwaśne prowadzi do powstania gorzkich peptydów, zaś peptydy powstające przy odszczepianiu aminokwasów hydrofobowych są mniej gorzkie. Z tego względu Alkalazę stosuje się najczęściej z innymi enzymami jako pierwszy etap hydrolizy.

FLAVOURZYME to mieszanka proteazy i peptydazy, otrzymywana za pomocą wybranych szczepów Aspergillus oryzae. Stosuje się ją do intensywnej hydrolizy białek (do 70% DH) i gorzkich hydrolizatów białkowych, w celu usunięcia z nich goryczki, w obojętnym lub lekko kwaśnym środowisku. Optymalne pH dla Flavourzyme mieści się w zakresie 5,0-7,0, przy czym dla egzopeptydazy wynosi ok. 7,0. Optymalna temp. to ok. 50°C, chociaż w temperaturze 30°C i 60°C Flavourzyme zachowuje 50-60% pierwotnej aktywności.

NEUTRAZA jest preparatem metaloendoproteaz wytwarzanych przez Bacillus amyloliquefaciens. Optymalne pH to ok. 6,5, przez co zaliczana jest do proteaz obojętnych. Optymalna temperatura hydrolizy wynosi od 45 do 55°C, lecz w praktyce lepiej jeśli nie przekracza 50°C. Jest ona mniej odporna na wysokie temperatury. Jak większość metaloproteinaz, jest stabilizowana przez jony Ca2+.

PROTAMEX jest kompleksem proteaz otrzymywanym ze szczepu bakterii Bacillus. Protamex umożliwia otrzymanie bezgoryczkowych hydrolizatów białkowych jeśli stopień hydrolizy nie jest zbyt wysoki. Optymalne warunki hydrolizy pod wpływem enzymu zachodzą przy pH 5,5-7,5, w temperaturze 35-60°C. Dla inaktywacji enzymu przy pH 4,0 niezbędne jest trzydziestominutowe ogrzewanie w temp. 50°C, jeżeli natomiast pH mieszaniny zostanie obniżone poniżej pH 4,0, inaktywacja enzymu zachodzi bez ogrzewania.

PROTEOPOL BP-S jest preparatem enzymatycznym zawierającym enzymy proteolityczne, otrzymywane w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu bakterii Bacillus subtilis. Enzymy te hydrolizują białka do polipeptydów, peptydów i aminokwasów w środowiskach o odczynie zbliżonym do obojętnego. Stosowany jest w produkcji pieczywa cukierniczego - do częściowej biodegradacji glutenu mąki przy wyrobie kruchych ciast cukierniczych (krakersy, wafle), gdzie umożliwia otrzymanie jednorodnej, kruchej, lekko łamliwej konsystencji wypieku, oraz w produkcji piwa, jako uzupełnienie enzymów proteolitycznych słodu lub ich częściowe zastąpienie przy przerobie zbożowych surowców niesłodowanych.

AMYLOPOL P jest skoncentrowanym preparatem enzymatycznym zawierającym kompleks enzymów amylolitycznych, proteolitycznych i celulolitycznych otrzymywanym w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu Aspergillus oryzae. Przeznaczony jest do likwidacji zmętnień skrobiowych, białkowych i śluzowych w surowych ekstraktach kawy zbożowej przed koncentracją i suszeniem oraz do wstępnej hydrolizy skrobi przy produkcji syropów ziemniaczanych. Stosowany jest do likwidacji zmętnień skrobiowych, białkowych i śluzowych w surowych ekstraktach kawy zbożowej przed koncentracją oraz do wstępnej hydrolizy skrobi zawartej w surowcach roślinnych (zboża, ziemniaki).

20. Metody badań aktywności enzymów.

Proces oczyszczania enzymów wymaga ciągłej kontroli zarówno jakościowej (wzrastająca czystość białka), jak i ilościowej (badanie stężenia interesującego enzymu i/lub jego aktywności). Kontrole jakościową wykonuje się wykorzystując techniki elektroforetyczne (zwłaszcza SDS-PAGE). Oznaczanie aktywności enzymów wykonuje się w oparciu o ich zdolności katalityczne.

Stosuje się metodę Ansona, która opiera się na procesie hydrolizy zdenaturowanej hemoglobiny jako substratu. Na podstawie różnicy ilości PBH (produktów hydrolizy białka) w przesączach, otrzymanych po strąceniu roztworów 10% TCA, określa się aktywność proteolityczną badanego enzymu.

19. Zastosowanie enzymów w przemyśle spożywczym.

Źródłami enzymów są tkanki roślinne, zwierzęce oraz komórki mikroorganizmów. Obecnie szerokie zastosowanie znajdują zwłaszcza enzymy pochodzenia mikrobiologicznego, ze względu na łatwość uzyskania dużych ilości homogennych enzymów.

Zastosowanie preparatów enzymowych jest duże gdyż obejmuje prawie wszystkie gałęzie przemysłu spożywczego.

• w przemyśle fermentacyjnym (spirytusowy, piwowarski)-otrzymywanie glukozy i maltozy jako substratów fermentacji alkoholowej

• piwowarskim, gorzelniczym - scukrzanie skrobi z udziałem amylaz ze słodu

• piekarskim, cukierniczym - dla fermentacyjnego poprawienia pulchności pieczywa, do rozluźniania glutenu

• cukierniczym i skrobiowym - otrzymywanie skrobi modyfikowanej, syropów, glukozy

• mięsnym - dojrzewanie mięsa po uboju z udziałem enzymów proteolitycznych zawartych w tkance mięśniowej

• mięsnym i rybnym - produkcja hydrolizatów (proteinazy rozkładające wiązania peptydowe)

• mleczarskim - wytrącanie masy serowej z użyciem podpuszczki, produkcja i dojrzewanie serów podpuszczkowych, jałowienie mleka (katalaza),hydroliza laktozy przy produkcji lodów i fermentacji serwatki (laktaza), renina w produkcji serów

• owocowo-warzywnym - macerowanie surowca, zwiększenie wydajności tłoczenia, klarowanie soków, przeciwdziałanie żelowaniu (pektynazy)

• jajczarskim - przeciwdziałanie ciemnieniu proszku jajczarskiego przy suszeniu (oksydaza glukozowa)

• produkcja preparatów mlekozastępczych, mleka dla niemowląt - alfa-lipaza, wytwarzany przez genetycznie modyfikowaną pleśń z rodzaju Aspergillus, dzięki jego działaniu powstaje naturalna postać kwasu palmitynowego

• produkty wegetariańskie - chymozyna

Enzymy mogą być wykorzystywane w celu biodegradacji odpadków powstających podczas produkcji żywności, które w rezultacie ponownie trafiają do obiegu w przyrodzie. Są wzorcowym przykładem tzw. zielonej technologii. Wykorzystanie organizmów genetycznie modyfikowanych cieszy się wielkim zainteresowaniem rolników i przemysłu spożywczego i jest związane z ich potencjałem ekonomicznym i ekologicznym. Takie produkty mogą mieć ważne znaczenie dla spełnienia zapotrzebowania ludzkości w przyszłości. Spełnienie zapotrzebowania na żywność dla ciągle  rosnącej populacji ludzi na ziemi wymaga zastosowania nowych rozwiązań. Jednym z takich rozwiązań jest wdrożenie produkcji roślin genetycznie modyfikowanych, co jest niedrogim i przyjaznym środowisku sposobem zwiększenia produkcji żywności. Jednak zastosowanie tych nowych sposób budzi pytania dotyczące bezpieczeństwa ich stosowania i braku szkodliwości.     

21. Jednostki aktywności enzymów.

Aktywność enzymów jest mierzona w różnych jednostkach, które są obecnie zunifikowane przez Międzynarodową Unię Biochemiczną (IUB). Gdy enzym katalizuje wytwarzanie produktu przy maksymalnej szybkości V, można przyjąć, że kompleks ES jest przekształcany w produkty zgodnie z równaniem:

= V = k[ES] = k

gdzie
oznacza sumę enzymu wolnego i związanego w kompleks ES.

Gdy stężenie substratu jest dostatecznie duże aby związać cały enzym w kompleks ES i gdy
jest wyrażone w molach centrów aktywnych na dm³ (co oznacza stężenie molowe pomnożone przez liczbę centrów aktywnych w cząsteczce), a czas wynosi 1 min, stała k jest określana jako aktywność molekularna (liczba obrotów) enzymu. Jest to więc liczba moli substratu, które mogą przereagować w czasie 1 min z 1 molem centrów aktywnych enzymu. Definicja została uściślona dalej dla temp 30°C i pozostałych warunków optymalnych dla enzymu. Aktywność molekularna może być oznaczana wyłącznie dla enzymów o znanej masie cząsteczkowej i budowie podjednostkowej cząsteczki białka.

Znacznie bardziej popularna jest uniwersalna jednostka międzynarodowa definiowana jako aktywność enzymu, która jest zdolna wytworzyć 1 µmol produktu w czasie 1 min, w temp 30°C i pozostałych warunkach optymalnych dla enzymu. Aktywność enzymu wyrażoną w stosunku do 1 mg białka nazywa się aktywnością właściwą.

Obecnie IUB zaleca nową jednostkę - 1 Katal; odpowiada ona aktywności enzymu, przy której jest on zdolny przekształcić 1 mol substratu w produkt w czasie 1 s w temp 30°C i pozostałych warunkach optymalnych. Stąd 1 Kat = 6

jednostek międzynarodowych, a 1 jednostka międzynarodowa = 16,67 nKat (nanokatali).

Dla znanych enzymów aktywność molekularna waha się od 1 do

; dla enzymów trawiennych chymotrypsyny i trypsyny wynosi ona ok.
, a najszybciej działającymi enzymami są: katalaza rozkładająca H₂O₂ do H₂O i O₂ oraz anhydroza węglanowa utrzymująca równowagę między H₂CO₃ i CO₂ ; dla tych enzymów aktywności te wynoszą 2

-

.

22. Metody oznaczania stężenia białka i produktów hydrolizy białka.

Badanie ilości produktów hydrolizy białka prowadzi się najczęściej metodą Lowry'ego. Jest to metoda kolorymetryczna, w której końcowa barwa jest wynikiem po pierwsze, reakcji biuretowej białka z jonami miedzi w środowisku zasadowym, czyli przyłączenia jonów miedzi do wiązań peptydowych, po drugie, redukcji odczynnika fosfomolibdeno-fosfowolframowego (odczynnik Folina-Ciocalteu) przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan (redukcję barwy powodują także związane już jony miedzi, natomiast barwa powstająca przy nieobecności jonów miedzi pochodzi tylko od aminokwasów).

Metoda biuretowa. Do kolbek odmierzyć po 0,5 cm³ kolejnych prób (do próby ślepej użyć wody destylowanej), dodać po 2 cm³ odczynnika miedziowego (wszystkie próby w 3 powtórzeniach). Po 30 min odczytać absorbancję przy długości fali 540 nm. Zawartość białka odczytać z krzywej wzorcowej (po uwzględnieniu zmętnienia), następnie zestawić wyniki, biorąc pod uwagę rozcieńczenie.

---