40. Ko-transport.

Ko-transport to rodzaj aktywnego transportu przez błonę za pomocą białkowych przenośników. Energia do przenoszenia jednych cząsteczek (głównie jonów) wbrew gradientowi elektrochemicznemu jest tutaj czerpana z jednoczesnego transportu drugich cząsteczek (też głównie jonów) zgodnie z gradientem stężeń (oczywiście dany transporter jest specyficzny wobec tego co i w którą stronę przenosi). Ko-transportery to inaczej transportery wtórne. Są dwa rodzaje ko-transportu: symport i antyport. W przypadku symportu obie przenoszone substancje poruszają się w tym samym kierunku, a w przypadku antyportu w przeciwnych.

Przykłady:

-symportery: transporter Na⁺/HCO₃^- używa gradientu jonów sodu do transportu jonów węglanowych, które w komórce reagują z wodą dając jony OH- utrzymujące zasadowe pH w komórce.

-anytportery: znana i lubiana pompa sodowo/potasowa; antyporter Na+/H+ korzysta z gradient sodu wypompowując protony i pomagając utrzymać pH fizjologiczne

41. Uniport, symport i antyport

Uniport, w przeciwieństwie do symportu i antyportu (opisanych w 40. i w kilku innych miejscach -.-) nie jest transportem aktywnym, a szczególnym przypadkiem dyfuzji ułatwionej zachodzącej przez nośnik a nie przez kanał jonowy czy por. Polega on na transporcie jednej cząsteczki substratu przez błonę w kierunku zgodnym z gradientem elektrochemicznym. W ten sposób np. komórki ludzkie pobierają z krwi glukozę, fruktozę i aminokwasy. Uniport charakteryzuje się typowa dla dyfuzji ułatwionej kinetyką hiperboliczną (tj. taką jak enzymy Michaelisa-Menten). Na obrazku uniport na przykładzie transportera glukozy GLUT1.

42. Kinetyka dyfuzji ułatwionej.

Szybkość dyfuzji ułatwionej, w przeciwieństwie do dyfuzji prostej (która zachodzi zgodnie z prawem Ficka, p. zag. 43.), cechuje się kinetyką hiperboliczną, podobnie jak nieallosteryczne enzymy. Dzieje się tak dlatego, że kanały lub transportery mogą transportować ograniczoną ilość substratów w jednostce czasu i w błonie występuj ich ograniczona ilość. Tak więc z czasem ulegają wysyceniu. Możemy zatem zapisać jak w Lodishu:

Gdzie środkowe wyrażenie to GLUT1 związany z glukozą w konformacji z miejscem wiązania na zewnątrz (i jest założone że początkowe stężenie wewnętrzne jest 0, czyli że różnica stężeń jest równa stężeniu zewnętrznemu). To równanie jest analogiczne do równania S+E=SE=E+P dla enzymów i da się z niego wyprowadzić takie samo równanie kinetyczne: V_tr = V_max / (1+K_m/C_out), gdzie V_tr to szybkość transportu, V_max to maksymalna szybkość z jaką może zachodzić transport przy danej ilości GLUT1 (zależna od ilości GLUT1 w błonie i od szybkości z jaką zmienia konformację i uwalnia glukozę), K_m to stała wiązania równa stężeniu glukozy na zewnątrz przy połowie szybkości, a C_out to stężenie glukozy na zewnątrz. Należy pamiętać o tym, że jeśli rozpatrujemy jakiś dowolny przypadek dyfuzji ułatwionej, to musimy sprawdzić w którą stronę zachodzi transport (czyli gdzie jest wyższe stężenie, lub w przypadku cząsteczek naładowanych - potencjał elektrochemiczny) i wstawić do równania różnicę wyższego i niższego stężenia (a nie zawsze zewnętrzne :P). Jeśli C<<Km to szybkość wzrasta liniowo ze stężeniem, jak przy dyfuzji prostej. Jeśli C>>km to szybkość transportu jest w przybliżeniu równa Vmax. Wykres porównujący kinetykę GLUT1 i 2 (hiperboliczną) i kinetykę dyfuzji prostej (liniową) pod spodem

Oczywiście, zaznaczona Vmax i Km odnoszą się do GLUT1.

43. Które substancje przechodzą przez błonę zgodnie z prawem Ficka, czyli dyfuzja prosta.

Wiem, że to trochę nie na temat, ale nie napisałem tego w poprzednich zagadnieniach, gdzie pojawiała się dyfuzja prosta, więc:

Prawo Ficka: J=-D dC/dx, czyli: strumień przepływającej substancji (ilość moli przepływająca przez daną powierzchnię w jednostce czasu [mol/(m² s)]) równy jest współczynnikowi dyfuzji razy zmiana stężenia po odległości.

To w przypadku dyfuzji w jednym wymiarze. Jeśli chodzi o przestrzeń n-wymiarową, prawo Ficka przyjmuje postać żartowałem :P.

Widzimy zatem, że szybkość dyfuzji prostej jest liniowo zależna od różnicy stężeń po dwóch stronach błony.

Jeśli chodzi o dyfuzje prostą przez błony, to o współczynniku dyfuzji decyduje głównie wielkość cząsteczki i jej hydrofobowość. Im mniejsza i bardziej hydrofobowa cząstka, tym szybciej przenika przez błonę.

Nie dziwota zatem, że najlepiej przez błonę przenikają niepolarne cząsteczki gazów: N2, CO2, O2. Również małe, niepolarne lub umiarkowanie polarne cząsteczki organiczne, jak benzen czy etanol (jak i metanol) łatwo przenikają przez błonę. Nieco gorzej jest z małymi i polarnymi jak woda czy mocznik, które przenikają przez błonę w ograniczonym zakresie. Dlatego np. woda, której szybki transport przez błony jest niezbędny dla życia komórki posiada specjalne kanały białkowe tylko dla siebie (akwaporyny), których w błonach jest całkiem sporo.

44. Jakimi parametrami można opisać kinetykę dyfuzji ułatwionej?

W kinetyce dyfuzji ułatwionej, która ma hiperboliczną postać analogiczną do kinetyki enzymatycznej Michaelisa-Menten, jest kilka parametrów istotnych dla szybkości transportu. Po pierwsze jest to szybkość maksymalna Vmax, zależna od ilości kanału/transportera w błonie i szybkości przepływu/zmian konformacyjnych. Po drugie jest to stała wiązania substratu Km, równa stężeniu substratu przy prędkości będącej połową maksymalnej. Jest ona wyrazem powinowactwa substancji transportowanej do nośnika (im mniejsza, tym większe powinowactwo). Jeśli mamy transporter o niepełnej specyficzności, porównanie Km dla różnych substratów pozwala określić względną specyficzność w stosunku do nich. Zmienną w równaniu kinetyki dyfuzji ułatwionej jest różnica stężeń (lub potencjałów elektrochemicznych) po obu stronach błony.

45. Przechodzenie wody przez błony.

Szybkie przechodzenie wody przez błony jest niezwykle istotne dla komórki. Komórka cały czas wydziela i zużywa wodę w reakcjach fizjologicznych. Poza tym wydziela i pobiera jony. Wszystko to prowadzi do niewielkich wahań w osmolarności komórki i naraża ją na liże osmotyczną nawet w teoretycznie izoosmotycznym środowisku. W pewnym stopniu radzą sobie z tym problemem transportery jonów (np. pompa sodowo/potasowa, która netto wypompowuje jeden jon jednowartościowy na zewnątrz). Jednak da zapewnienia idealnej (przynajmniej dopóki coś się nie popsuje) równowagi konieczna jest też szybka wymiana wody przez błonę.

Problem w tym, że woda, jak już wspomniano, dyfunduje przez błonę tylko w organicznym zakresie. Dlatego komórki zwierząt zawierają w swojej błonie specyficzne kanały wodne - akwaporyny. Akwaporyna to homotetreamer podjednostek o masie 28kDa. Każda podjednostka ma 6 transmembranowych helis, które tworzą por długi na 2nm i szeroki na 0,28nm (tzn. por jest w środku każdej podjednostki, czyli jedna cząsteczka akwaporyny ma 4 pory). Helisy eksponują hydrofobowe reszty do błony, a hydrofilowe do środka.

Specyficzność kanału jest zapewniana nie tylko przez wielkość, nieco tylko większą od średnicy cząsteczki wody, ale też przez kilka konserwatywnych reszt R, H i N w porach, które tworzą w porze kilka miejsc wiązania wody oddziaływaniami wodorowymi. Przez por przechodzi kilka cząsteczek wody naraz, każda po kolei zajmuje następne miejsce wiązania (jak w kolejce do sklepu). Nie wiem czy podpis pod obrazkiem jest w ogóle czytelny, ale inaczej nie umiem go wkleić.

Woda może też przenikać przez błonę za pomocą dużych porów (np. jądrowe, połączenia szczelinowe, bakteryjne poryny), albo w postaci związanej z jonami (otoczka hydratacyjna jonów) przez kanały jonowe.

46. Technika „patch-clamp”

To technika umożliwiająca pomiar przepływu jonów przez pojedynczy kanał jonowy.

W technice tej mierzy się natężenie prądu potrzebne do utrzymania stałego potencjału błonowego przy przepływie jonów prze mały fragment błony, który zawiera jeden lub tylko kilka kanałów. Stosuje się w tym cel mikropipetę o średnicy otworka około 0,5μm, wypełniona roztworem soli przewodzącym prąd i podłączoną pod napięcie elektryczne. Pipetę taką przykłada się do błony i lekko zasysa, co powoduje że mała łatka błony (stąd patch) szczelnie do niej przylega. Można zassać mocniej i wyrwać kawałek błony, umieścić w innym roztworze i tak prowadzić badania (o tym jaka to różnica będzie zaraz). Jednocześnie do cytozolu (lub roztworu testowego) wkłada się drugą elektrodę. Otwarcie kanałów i przepływ jonów między cytozolem a solanką w pipecie powoduje ruch elektronów w elektrodzie. Elektroda i mikropipeta są podłączone do elektronicznego urządzenia, które utrzymuje stały potencjał błonowy (stąd clamp) i liczy elektrony pobrane lub oddane elektrodzie cytozolowej (czyli prąd jaki przez nią płynie) aby taki potencjał utrzymać. W ten sposób można wyliczyć ilość jonów które przepłynęły przez kanał, jak długo był otwarty oraz co spowodowało jego otwarcie.

Tą ostatnią charakterystykę można badać pośrednio na całych komórkach tzn. jaki bodziec dla komórki otwiera kanały. Można badać na oderwanych łatkach zanurzonych stroną zewnętrzną w roztworze testowym, czyli badać jakie czynniki zewnątrzkomórkowe działają bezpośrednio na kanał. Można też badać łatki zwrócone cytozolową stroną do roztworu i sprawdzać jakie wewnątrzkomórkowe czynniki działają bezpośrednio na kanał.

Tym sposobem można też sprawdzać specyficzność kanałów. Jeśli np. kanał jest specyficzny dla sodu, to będzie dawał odczyt jeśli umieścimy w pipecie roztwór NaCl, ale jeśli damy KCl to już nie będzie żadnego odczytu, bo nie będzie jonów Na+.

To podpis to tego wyżej.

Można też w ten sposób charakteryzować białka, które uznano za potencjalne kanały jonowe w wyniku badania sekwencji genów w bibliotece genomowej. Wtedy cDNA takiego podejrzanego o bycie kanałem jonowym białka można poddać odwrotnej transkrypcji, a mRNA wstrzyknąć do jaja Xenopus (czyli takiej żaby). Po 24-48 godzinach na ekspresję i lokalizację można zrobić na jajach patch-clamp i scharakteryzować kanał. Mamy pewność, że badamy nasz kanał, bo jaja Xenopus nie mają własnych kanałów jonowych.

---