ZESPOŁU DOWNA:
Metody badań cytogenetycznych:
1. FISH - wykrywanie trisomii 21:
- kariotyp konstytucyjny (limfocyt T)
- 20 - 100 analizowanych metafaz
- badania molekularne: FISH, PCR
- region krytyczny zespoły Downa: 21q22.2 - 21q22.3
2.GTG - analiza prążkowa
Fenotyp zespołu Downa:
- opóźnienie umysłowe
- niski wzrost
- charakterystyczne cechy dysmorficzne: skośne ustawienie szpar powiekowych, fałd nakątny, niska nasada nosa, nisko osadzone małżowiny uszne, duży pobrużdżony język, poprzeczny fałd zgięciowy dłoni, krótka szyja, spłaszczona potylica, nadmiar skóry na karku, szeroki odstęp między paluchem a pozostałymi palcami stopy, szerokie krótkie dłonie i stopy.
W 10-15 % przypadków rozpoznanie kliniczne zespołu Downa jest fałszywie dodatnie.
- rozpoznanie zespołu genetycznego - jedynie na podstawie badania genetycznego
- możliwość rozpoznań fenotypowych fałszywie dodatnich lub błędnych
- konieczność ustalenia mechanizmu (prosta trisomia czy mozaika - wpływ na wielkość ryzyka genetycznego).
Występują również:
- wady wrodzone (wady serca - 40%, zwężenia przewodu pokarmowego 3-5%)
- niedoczynność tarczycy
- zaburzenia rozwoju cielesno - płciowego (kobiety płodne, mężczyźni - nie)
- przewodzeniowa utrata słuchu
- zaburzenia narządu wzroku
- objawy neurologiczne np. hipotonia mięśniowa
- przyspieszone starzenie się (szybsze skracania się telomerów + upośledzona naprawa DNA)
- niska odporność nieswoista: zwiększona aktywność SOD1 (rozkład nadtlenków komórek fagocytujących), zwiększona dawka białka S 100 β (zwiększone wiązanie Zn -> spadek aktywności grasicy i chemotaksji neutrofilów)
- niska odporność komórkowa - słaba aktywacja limf. T
- zwiększona podatność na nowotwory ukł krwiotwórczego: białaczki 40x, ostre białaczki limfoblastyczne, ostre białaczki megakarioblastyczne 400x
- ALE większa podatność na leczenie z powodu innego metabolizmu foliałów
- mniejsza podatność na nowotwory narządowe
Fenotyp behawioralny: leczenie objawowe, rehabilitacja ogólnorozwojowa, wczesne usprawnianie.
BADANIA CYTOGENETYCZNE
Kariogram - zestaw poukładanych parami chromosomów
Metody otrzymywania chromosomów większej rozdzielczości w stadium profazy i prometafazy:
1. naturalna - wyszukiwanie metafaz profazalnych i prometafazalnych
2. zapobieganie spiralizacji przez dodanie substancji interkalujących (bromek etydyny, aktynomycyna D), które hamują kondensację.
3. zablokowanie cyklu komórkowego przejściu G1-S - najczęściej stosowany metotreksat; synchronizacja hodowli za pomocą ametopteryny lub tymidyny w celu zwiększenia w hodowli liczby komórek w stadium profazy i wczesnej metafazy.
Techniki prążkowe - umożliwiają precyzyjną identyfikację każdego chromosomu, identyfikację brakującego lub dodatkowego mat.chromosomowego(o wielkości co najmniej 4Mb), wybarwienie konkretnych fragmentów:
- GTG (prążki G, trypsyna, Giemsa) - najczęściej stos. do oceny kariotypu ,tą metodą uzyskuje się 300-400 prążków ciemnych i jasnych charakt. dla każdej pary chrom. Prążki ciemne zawierają skondensowaną chromatynę = heterochromatynę (dostęp trypsyny do niej jest utrudniony), bogatą w pary zasad A-T, zawierającą stos. mało aktywnych genów. Jest to obszar wolnoreplikujący (replikuje się późno w fazie S) Prążki jasne zawierają euchromatynę, 80% aktywnych genów, dużo par C-G, obszary te replikują się wcześnie. Aby widoczne były mutacje musi być min. 400 prążków na kariotyp. W profazie i prometafazie rozdzielczość jest max.(wyst. Ok. 500-850 prążków na kariotyp-możliwe jest stwierdzenie mikromutacji).
- GTW (pr.G, trypsyna, b.Wrighta)
- CBG (prążki C, Ba(OH)2, Giemsa) - Ba(OH)2 wiąże się z heterochromatyną konstytucyjną (wyst. ona w centromerach wszystkich chromosomów, w ok. satelitarnych chr. akrocentrycznych-13,14,15,21,22, na końcu ramienia długiego chr.Y); dot. chr. 1,9,16
- QFQ (pr.Q, fluorochrom, quinakryna) - wybarwiają się ok. centromeru chr 3, ok. centromeru i regionu satelitarnego chr akrocentrycznych 13, 14, 15, 21, 22 oraz odc dystalnej ramion długich chr Y
- RHG (pr.R, hydroliza na ciepło, Giemsa) - prążki barwią się na odwrót niż w GTG, metoda ta może być użyteczna w badaniu aberracji w regionach telomerowych.
- AgNOR - organizatory jąderkowe traktowane azotanem srebra; stosowane przy białaczkach, bo występuje duża proliferacja i duże organizatory jąderkowe
Technika GTG - jeden chromosom z pary jest dłuższy i ma mniejszą odległości między prążkami (osoba zdrowa). Przy chromosomie 1, 9, 16 i akrocentrycznych może dojść do bloku heterochromatyny i wtedy należy wykonać CBG.
Grupy chromosomów:
A - 1, 2, 3 - duże metacentryczne
B - 4, 5 - duże submetacentryczne
C - 6 - 12, X - średnie submetacentryczne
D - 13 - 15 - duże akrocentryczne
E - 16 - 18 - małe submetacentryczne
F - 19 - 20 - najmniejsze submetacentryczne
G - 21 - 22, Y - małe akrocentryczne
Chromosom Y- heterochromatyna w długich ramionach
GENY HOMEOBOKSOWE
Geny homeotyczne u Drosophilia melanogaster:
HOM - 13 genów; są to geny, których mutacje powodują upodabnianie się segmentów jednej części ciała do segmentów innej.
Mutacje homeotyczne:
- mutacje, w których jeden schemat rozwojowy zostaje zamieniony innym
- narząd różnicuje się nieprawidłowo albo tworzy się narząd charakterystyczny dla danego przylegającego segmentu
Transformacja homeotyczna:
1. Typu utraty funkcji - przejęcie funkcji nadzorczej przez inny gen homeotyczny: rozwój w danym obszarze struktur typowych dla innego obszaru
2. Typu aktywującego - przejęcie przez dany gen sterowania częścią ciała, która prawidłowo nie leży w jego funkcji
Geny homeoboksowe:
I klasa - geny HOX/Hox - zlokalizowane w kompleksach np. HOX A9, HOX B3
II klasa - geny nie HOX/Hox - zlokalizowane poza głównymi kompleksami np. HOX 11
- zwane molekularnymi architektami
- przypisują komórkom w różnych częściach ciała konkretne przestrzenie wzdłuż osi przednio - tylnej
- w DNA wszystkich komórek, ale ich ekspresja zachodzi w tych, do których jest ten gen przypisany
- w danej tkance - specyficzna konstelacja ekspresji różnych genów HOX
HOMEOBOX - sekwencja homeotyczna z ok.180 nukleotydów
- decyduje o specyficzności genu
- koduje domenę homeotyczną ok.. 60 am odpowiedzialną za wiązanie z DNA
- zachowana w procesie ewolucji od wspólnego przodka muszki (HOM), myszy (Hox) i człowieka (HOX)
- poza obszarem homeotyczny geny na różnych obszarach są różne
Geny HOX:
- 36 genów, w 4 kompleksach (A, B, C, D) - wynik podwójnej duplikacji pierwotnego 13-genowego kompleksu
- stopniowa utrata niektórych genów - żaden z kompleksów nie zawiera wszystkich 13 genów kompleksu pierwotnego
- lokalizacja: 2, 7, 12 i 17 chr
- geny paralogiczne (ortologiczne) - zlokalizowane w tych samych miejscach różnych kompleksów
- linowy porządek genów (od 3' do 5')
Odzwierciedlenie:
- kolejność obszarów ciała wzdłuż osi przednio - tylnej określonych przez nie
- kolejność ich aktywacji i ekspresji w rozwoju zarodkowym
- stopnie ich wrażliwości na działanie kwasu retinowego
Geny paralogiczne
- geny znajdujące się w tych samych miejscach kompleksów u różnych gatunków
- bardziej zbliżone strukturalnie i czynnościowo niż kolejne geny w obrębie danego kompleksu
- pochodzą od wspólnego genowego przodka
- wymienność genów paralogicznych między gatunkami
Stosowane transformacje homeotyczne w myszy: stwierdzona patologia płodów i osobników dojrzałych -> porównanie z fenotypem wad wrodzonych u człowieka -> szukanie odpowiedniego genu HOX u człowieka
Zagadka HOX A3:
Sterowana mutacja homozygotyczne (Hox A3) u myszy:
- nieprawidłowości układu krążenia, głównie serca i dużych naczyń
- brak grasicy i przytarczyc
- anomalie bodowy tarczycy, kości i tkanki chrzęstnej
- zawiązki ww. narządów znajdują się w jednym obszarze ciała zarodka
Fenotyp podobny do fenotypu zespołu Di George'a, ale w regionie 22q11 nie stwierdzono obecności genu homeoboksowego
Homologia HOX A3 do Hox A3 (7p15)
Hipoteza: gen zlokalizowany w 22q11 moduluje funkcję HOX A3
GSCL
- organizacja struktur pochodzących z łuków i kieszonek skrzelowych (mózgo - i twarzoczaszka, grasica, przytarczyce, serce, dwa pnie naczyniowe)
locus 22q11.2 - najmniejszy region delecyjny (krytyczny) zespołu Di George'a
Kliniczne skutki mutacji genów homeoboksowych:
- geny HOX: HOX A13 - hand - foot genital, AD; HOX D13 - polisyndaktylia, AD
- geny nie - HOX: EMX 2 - rozszczepienie mózgowia; MSX 2 - nieprawidłowe zrastanie szwów czaszkowych.
Wyjątkowo rzadkie występowanie wad wrodzonych, spowodowanych mutacjami genu homeoboks, wynika z wysokiego stopnia homologii między genami paralogicznymi z różnych kompleksów (pełna lub prawie pełna kompensacja) oraz z letalności mutacji tych genów.
Geny PAX: homeobox: 360 nukleotydów, a homeodomena: 128 am.
PAX 2 - ubytki nerwu wzrokowego, dysplazje nerek
PAX 3 - ekspresja we wczesnej neurogenezie
- nieprawidłowa migracja komórek pochodzących z pierwotnej cewy nerwowej (+ zaburzenia funkcji N-CAM)
- zespół Waardenburga I - głuchota, wodoocze, hiperteloryzm, zaburzenia pigmentacji
PAX 6 - aniridia = brak tęczówki (heterozygota), anophtalmia = brak gałek ocznych (homozygota); leży w pobliżu WT1 (11p13) - mikrodelecja tego regionu -> zespół WAGR
Geny HOX a integryny
- lokalizacja genów e podobnych miejscach tych samych chr
- geny integryn są również paralogiczne
- równoległa ewolucja tych dwóch grup genów - łączna ewolucja informacji o planie budowy organizmu (geny HOX) z ewolucją informacji określającej integracje i migracje komórek wypełniających ten plan (geny integryn)
Geny homeoboksowe a nowotwory:
- geny te koordynują funkcję wielu genów biorących udział w patogenezie nowotworów
- nadmierna lub rozregulowana ekspresja tych genów (kodujących czynniki transkrypcyjne) - molekularne podstawy wielu nowotworów
- niektóre geny homeoboksowe = protoonkogeny
Geny homeoboksowe a przerzuty:
- tkanki transplantowane zachowują wzór ekspresji narządu, z którego pochodzą
- przerzuty nowotworowe - analogicznie (wzór guza pierwotnego i tkanki macierzystej). Nie zachodzi w niech ekspresja genów homeoboksowych charakterystycznych dla lokalizacji przerzutu
- konstelacja ekspresji genów homeoboksowych - wskaźnik histologicznego obrazu nowotworu
Komórki nowotworowe:
- wykazują wzór ekspresji genów homeoboksowych charakterystycznych dla tkanki, z której się wywodzą
- przemieszczają się zgodnie z pozycyjną informacją zawartą w tych genach (nieprzypadkowo), czyli tylko do zaprogramowanych tkanek i narządów.
DZIEDZICZENIE PŁCI
Cechy określające płeć: genetyczne, gonadalna, genitalne, somatyczne, fenotypowe, psychoseksualne, metrykalne, hormonalne.
Rozwój cielesno - płciowy na etapie embriogenezy:
- płeć zdeterminowana w momencie zapłodnienia
- plemnik decyduje, w którym kierunku rozwinie się płeć
- w 5 tyg. narządy są obojnacze, występ. przewody Wolffa i Mullera
- obecność genu SRY -> wytworzenie czynnika antymullerowskiego -> płeć męska
- brak genu SRY (brak chr Y) -> brak płodowego jądra -> rozwój przewodów Mullera, a zanik Wolffa -> płeć żeńska
- 46, XX -> gonada pierwotna (brak czyn AM) -> jajnik -> rozwój przewodów Mullera
- 46, XY -> gonada pierwotna -> jądro -> kom Sertolego (czyn AM) -> zanik p. Mullera
jądro -> kom Leydiga -> testosteron -> rozwój p. Wolffa + DHT -> AR -> wirylizacja zewn narządów płciowych
- rozwój p. Mullera - DAX 1, SOX 3 na chr 10; nadmiar DAX 1 u mężczyzn hamuje SRY
- SOX 9 - autosomalny, chr 17 - mutacja o etiologii dominującej - dysplazje kostno - stawowa, letalna, całkowite odwrócenie płci fenotypowej
- WT1 - chr 11 - brak tego genu powoduje tzw. WAGR (guz Willmsa, aniridia, zmiany w gonadach, upośledzenie)
Zaburzenia rozwoju cielesno - płciowego - brak lub zaburzenie rozwoju I- i II- rzędowych cech płciowych:
2. Zespół superkobiety (Jacobs) 1:500
- 47, XXX; 48,XXXX; 49,XXXIX
- najczęściej (90%) brak zaburzeń
- mogą wystąpić zaburzenia rozwoju II-rzędowych cech płciowych, trudności z zajściem w ciążę i poronienia
- wcześniejsze klimakterium
- może wystąpić upośledzenie umysłowe
- skłonność do chorób psychicznych
4. Kobiety 46,XY
- mutacja genu SOX9 (17q25) - odwrócenie płci
- mutacja genu AR (receptora androgenowego na Xq13)
- zespół niewrażliwości na androgeny = z. feminizujących jąder: brak owłosienia pachowego i łonowego, obecne płodowe jądro i kaskada antymullerowska, zanik p. Mullera, p. Wolffa też zanikają, a tka jądrowa pojawia się w różnych miejscach, obecna tylko dolna część pochwy
- mutacja w genie SRY -> jądra -> androgeny -> X tkanki docelowe
- recesywne sprzężenie z X
- duże ryzyko zezłośliwienia tkanki jądrowej
- brak jajników, brak miesiączkowania, niepłodne
- prawidłowy rozwój umysłowy
- przepuklina pachwinowa (obecność tkanki jądrowej)
- mutacja de novo lub od matki nosicielki (duże ryzyko w 2. ciąży); delecje i mikrodelecje w obrębie Y; delecje, mutacja genu SRY (Yp11.3)
- zespół Swyera - kariotyp 46, XY; fenotyp żeński oraz narządy płciowe żeńskie; obecność nieprawidłowej tkanki jądrowej, macicy, mogą pojawiać się sporadyczne krwawienia (ale nie miesiączkowe); dysgenetyczne gonady nie wydzielają testosteronu ani AMH; normalny wzrost
6. Mężczyźni 46,XX
- duplikacje genu DAX
- fenotyp: męski, spodziectwo, mikropenis, ginekomastia, prawidłowy wzrost i rozwój umysłowy, wnętrostwo
- różnicowanie z obojnactwem prawdziwym!
- diagnostyka z SRY - często jest on obecny na którymś z chromosomów i spełnia swoją funkcję
- hipogonadyzm hipergonadotropowy np. w zespole Tunera: gonady nie produkują hormonów, a przysadka produkuje w nadmiarze
7. Mężczyźni 47, XXY
- czynność jąder często prawidłowa
- zaburzenia spermatogenezy, ale płodność zachowana, duża agresja, wysoki wzrost, opóźniony rozwój mowy, predysponuje do białaczki, problemy wychowawcze oraz predyspozycje do samobójstw i chorób psychicznych, hipotonia
Zagrożenie nowotworzeniem:
- częsta dysgenezja gonad z chromosomem Y
- mieszana dysgenezja gonad
- dysgenetyczne obojnactwo rzekome męskie
- warianty zespołu Tunera z linią Y
- obojnactwo prawdziwe
- zespół niewrażliwości na androgeny
GENETYCZNE PODSTAWY KANCEROGENEZY
Związek rozwoju nowotworu z nieprawidłowego materiału genetycznego:
- „duże” zespoły chromosomowe np. z. Downa
- mikroaberracje np. retinoblastoma, guz Willmsa
- zespoły łamliwości chromosomów np. anemia Fanconiego, z. Blooma (fenotyp: łamliwość chromosomów) -> spowodow. uszkodzeniem aparatu naprawczego DNA
- nowotwory rodzinne (rodzinna agregacja nowotworów)
- nowotwory dziedziczne - znaleziono gen odpowiedzialny za mutację np. zespół dziedzicznego nowotwory piersi i jajnika + zmutowany gen BRCA; predyspozycja wynosi 80-90%
Mechanizm genetyczny i grupy genów zaangażowanych kancerogenezę:
1. Onkogeny
2. Geny supresji nowotworów - dbają o stabilność genomu
3. Geny mutatorowe - w wyniku ich mutacji dochodzi do niestabilności mikrosatelitarnej
4. Imprinting genomowy i jego zaburzenia np. w białaczce szpikowej chr 9 (zawsze od ojca) jest translokowany na chr 21
5. Apoptoza i starzenie się.
6. Aktywność telomerazy
7. Czynniki angiogenne - stymulacja genów neoangiogenzey
8. Przerzutowanie
Onkogeny
- aktywność w życiu płodowym
- „wycieszenie”/”wyłączenie” w miarę dojrzewania płodu
- funkcje fizjologiczne białkowych produktów onkogenów:
* stanowią czynniki wzrostu (sis -> PDGE, int - 1, 2)
* receptory dla czyn wzrostu (mas)
* kinazy tyrozynowe - białka błonowe, receptorowe GF (EGFR)
* niereceptorowe kinazy tyrozynowe (SRC, BCR/ABL)
* białka G (RAS)
* rodziny białek GEF
* kinazy seroninowo - treoninowe (mos, raf)
* regulatory cytoplazmatyczne (v - rck)
* rodzina białek jądrowych (MYC)
- geny dominujące, których mutacja/aktywacja może być punktem wyjścia do kancerogenezę
- w kom nowotworowych - nieprawidłowe produkty onkogenów albo zbyt duża ich ilość
Mechanizmy (re-)aktywacji protoonkogenów:
Protoonkogeny = geny w fazie uśpienia
1. przez retrowirusy szybkotransformujące
- stosunkowo prosta budowa, posiadają same egzony
- onc = aktywny Onkogeny
- tzw. „autostopowicze” - wbudowywały się w pobliże Onkogeny, potem wbudowując się zabierały ten Onkogeny
zatrzymanie obok c-onc -> porwanie -> przetworzenie (mutacja) -> v-onc -> ponowne wbudowanie -> transformacja nowotworowa
- badanie in vitro: transfekcje komórek NIH3T3 (cały wirus lub poszczególne geny); transformacje nowotworowe tylko gdy gen onc
2. przez retrowirusy wolnotransformujące
- wbudowują się w okolice genów odpowiedzialnych za obronę komórki przeciw nowotworom
- aktywacja przez sekwencje LTR
3. amplifikacja genów (zwielokrotnienie kopii onkogenów)
- HSR = Homogeneously Stained Regions; w nich wiele kopii jednolitego genu
- DMs = Double Minute Chromosomem np. c-myc
- wzrost liczby kopii N-myc w neuroblastoma oraz cERB B2 w raku piersi -> niekorzystny czynnik rokowiczy
4. mutacje punktowe np. RAS w raku pęcherza moczowego
5. translokacje chromosomowe
- powstawanie genów fuzyjnych (całkiem nowych, o nowej funkcji)
- np. przewlekła białaczka szpikowa - następuje fuzja genów BCR i ABL; punkty złamań przerywają ciągłość tych genów, powstają nowe geny, które kodują kinazę tyrozynową oraz chr Philadelphia (22q-Ph)
- np. chłoniak Burkitta - gen c-myc zostaje przemieszczony w pobliże aktywnych genów i w wyniku tego zostaje aktywowany (sąsiedztwo)
- ściśle ukierunkowana translokacja
6. translokacje, inne aberracje strukturalne
- nieprzypadkowe punkty złamań: tzw. fragile sites; loci onkogenów lub innych genów istotnych w cyklu życiowym komórki; swoiste dla określonych typów nowotworów
- ubytki chromosomu niedobór genów supresorowych
- nadmiar w chromosomie nadmiar onkogenów
Przykłady nowotworów narządowych:
- sarcoma Swing - FLI/EWS
- sarcome synoviale - SSX/SYT
- rhabdomyosarcoma alveolare - PAX3/FKHR
- liposarcoma myxoidum - CHOP/TLS
Przykłady nowotworów układowych:
- translokacje AML1 w białaczkach
Molekularne podstawy transformacji nowotworowej jelita grubego:
nabłonek prawidłowy (utrata APC, MCC, bMSH2 i hMLH1) stan przedrukowy gruczolak st.1 (utrata K-ras) gruczolak st.2 (utrata DCC) gruczolak st.3 (inaktywacja lub utrata TP53) gruczolakorak (utrata K-ras) przerzuty odległe
Geny supresji nowotworu
- geny recesywne na poziomie komórki, ale dominujące na poziomie organizmu
- ich dwualleliczna mutacja/delecja prowadzi do rozwoju nowotworu (bo na poziomie kom są genami recesywnymi)
- w komórkach nowotworowych brak produktów tych genów
- Teoria dwóch uderzeń Knudson'a (model: retinoblastoma RB1 - gen supresorowy)
* w nowotworze dziedzicznym:
I - mutacja terminalna w jednym allelu (mutacja dziedziczona) - występuje tylko podatność na rozwój nowotworu
II - mutacja somatyczna w drugim allelu (utrata heterozygotyczności = LOH) rozwój nowotworu złośliwego
* nowotworze sporadycznym
I - pierwsza mutacja somatyczna w jednym z alleli (obecna heterozygotyczność) w pojedynczych komórkach
II - druga mutacja somatyczna w drugim allelu utrata heterozygotyczności rozwój nowotworu złośliwego
Nowotwory takie są jednoogniskowe - występują tylko w jednym narządzie, jeśli jest parzysty; są rzadsze i występują później.
Nowotwory spowodowane mutacją w genach supresorowych:
- retinoblastoma - gen RB
- guz Willmsa - gen WT1 i WT2
- neurofibromatoza I (ch. Recklinghausena) - gen NF1
- dziedziczny rak jajnika i piersi - gen BRCA1
- dziedziczny rak piersi - gen BRCA2
- polipowatość jelit - gen APC
TP53 p53 GATEKEEPER
- komórki z uszkodzonym Dna G1/S: naprawa cykl komórkowy lub brak naprawy apoptoza (p53 aktywuje białka proapototyczne)
- funkcje p53:
* kontrola w G1/S i G2/M
* hamowanie BCl - 2 (gen antyapop)
* pobudza BAX (gen proapop)
* aktywacja genów naprawy DNA
- mutacje p53:
* występują w 50% przypadków wszystkich nowotworów
* nowotwór łagodny/złośliwy
- dziedziczna mutacja TP53 = zespół Li - Fraumeni (podatność na nowotwory różnych tkanek i narządów)
- implikacje kliniczne: mutacje p53 - nie należy stosować cytostatyków powodujących uszkodzenie DNA (leki alkilujące), bo spowodują dodatkowe złamania w prawidłowym DNA komórek. TASKANY - uszkodzenie wrzeciona kariokinetycznego.
RB1 (retinoblastoma) GATEKEEPER
- hodowla komórek Rb + transfekcja genu RB zahamowanie wzrostu
- gen RB, produkt: białko Rb, które wiąże się z DNA (może wpływać na aktywność innych genów)
- aktywny = nieufosforylowany hamowanie G1/S
- postępująca fosforyzacja (kinazy CDK 4 i 6) zwolnienie bloku proliferacja prawidłowych i nieprawidłowych komórek
- kompleksy z białkami wirusów onkogennych DNA (SV40, E7)
- nieufosforylowane białko Rb + large T antigen (SV40) nautralizacja Rb odblokowanie G1/S
- mutacje regionów wiążących białko Rb w tych wirusach utrata przez nie funkcji transformujących
Geny mutatorowe - mikrosatelitarna niestabilność DNA (MIN)
- ekspansja lub redukcja liczby powtórzeń dwunukleotydowych: poślizg polimerazy DNA oraz pętle matrycowej lub nowosyntetyzowanej nici dna
- marker mutacji genów naprawy DNA
- MISMATCH - REPAIR GENES (MMR) = geny opiekuńcze (CARETAKERS) = geny stabilności genomu: MSH2, MLH1, MSH3, PMS1, PMS2; ich mutacja fenotyp mutatorowe = niestabilność > 2 loci mikrosatelitarnych: spadek wierności replikacji (RER+), upośledzenie prawidłowego funkcjonowania wielu genów, interferencja z prawidłową transkrypcją, zmiana ramki odczytu
- dziedziczne mutacje genów MSH2, MLH1 zespół Lynch I i II (HNPCC - dziedziczny niepolipowaty rak jelita grubego)
- metylacja - zmniejszenie aktywności genów; hipometylacja - wzrost aktywności genów
Minimalna liczba zmian niezbędnych do transformacji nowotworowej:
- in vitro: mutacje RAS, transfekcja genu antygenu T wirusa SV40, uaktywnienie telomerazy
- in vivo: nawet 11 tys zmian, aby powstał nowotwór
Minimalne zmiany czynnościowe:
1. unikanie Apoptoza
2. brak zapotrzebowania na sygnały wzrostowe z zewnątrz
3. brak reakcji na zewnętrzne sygnały hamujące wzrost
4. nieograniczona zdolność do replikacji
5. zdolność do stymulacji angiogenezy
6. zdolność do inwazji i Przerzutowanie
TERAPIA GENOWA
Transfekcja - wbudowanie genu do komórki
Transdukcja - transfekcja przy pomocy wektorów wirusowych
Transgen - gen wszczepiony (transferowany)
Narzędzia:
1. wektory wirusowe:
- RV = retorowirusy - wirusy RNA z odwrotna transkryptazą; tylko do komórek proliferujących
- adenowirusy - mają powinowactwo do nabłonka dróg oddechowych; są dużymi cząsteczkami; wirusami DNA
- AA = wirusy skojarzone z adenowirusami - małe cząsteczki mogące wnikać do wielu tkanek i narządów
- możliwe powikłania:
* metageneza inercyjna - wirus może wbudowac się w pobliże genu lub w dany gen
* rekombinacje infekcja RV; zabezpiecznie: wektor + linia opakowująca
* zaburzenia immunologiczne (reakcja na białko wirusa)
* bezpośrednia toksyczność wirusa
2. rybozymy - krótkie odcinki RNA o właściwościach enzymatycznych (swoistość cięcia: GUU, GUA, GUC)
3. metody chemiczne: liposomy (transgen spłaszczony warstwą lipidowo - białkową) - kationowe, ukierunkowane; polimery kationowe; fosforan wapnia
4. metody fizyczne: elektroporacja
5. bezpośrednia podaż nagiego DNA do układu krążenia
6. mikromanipulacja: metoda 100% efektywna, ale mała wydajność
Materiał, który wprowadzamy to: cDNA, RNA, antysensy.
By - stander effect: działanie transgenu na inne sąsiednie geny
Podaż: in vitro, in vivo, ex vivo
Zastosowanie: tylko w chorobach monogenowych (wrodzonych lub nabytych); warunkiem użycia jest: rozpoznanie choroby, znalezienie genu odpowiedzialnego za chorobę oraz poznanie mechanizmu działania tego genu.
Strategie:
1. Wymiana - zabranie genu nieprawidłowego i wszczepienie prawidłowego
2. Korekcja - powodowanie mutagenezy, która zmieni pierwotną mutację lub przez powodowanie rekombinacji homologicznej z prawidłowym allele
3. Komplementacja (uzupełnianie) - wprowadzenie genu brakującego lub zmutowanego; jest to metoda ograniczona, gdy nieprawidłowy gen produkuje nieprawidłowe białko
Komórki docelowe:
1. Komórki macierzyste danej linii ≈ trwała ekspresja transgenu
- samoodtwarzają się
- dają komórki bardziej ukierunkowane
2. Komórki ukierunkowane - można je cofnąć do stadium komórek macierzystych
3. Komórki dojrzałe - mają przemijającą ekspresję np. w mukowiscydozie inhalacje z genem CFTR
4. Komórki macierzyste (pierwotne organizmu) - mogące zróżnicować się w różne tkanki; występują w niewielkich ilościach krążeniu
MIKROABERRACJE
- delecje, duplikacje kilku genów, których loci leżą w pobliżu siebie (tzw. zespoły genów sąsiadujących)
- patologia różnych oddal. od siebie narządów i układów.
- diagnostyka: chromosomy o wysokiej rozdzielczości prążków, molekularna: PCR, FISH; brak aktywności, ekspresji genów.
1. Zespół Pradera-Willego(PWS)
2. Zespół Angelmana(AS)
3. Zespół WAGR
4.Zespół Beckwith-Wiedemann 1:14000
- duplikacja chr 11p15 (bardzo ciężkie objawy); w części rodzin zaobserw. dziedziczenie AD o zmiennej ekspresji.
- jeśli rodzice są zdrowi to ryzyko ponown.wyst. u potomstwa małe, a diagnost. prenatalna pol.na przeprowadz. Serii dokł.badań USG płodu
- EMG: E=exomphalos (wytrzewienie)-braki w przedniej ścianie brzusznej (przepuklina pępowin.); M=macroglossia (90%); G=gigantyzm
- wcześniactwo, wielowodzie, rowki płatków usznych oraz przerost połowiczy ciała, duża masa urodzeniowa, noworodkowa hipoglikemia-gen insuliny!(może być przczyną upośledzenia umysłowego), guzy nowotworowe głównie guz Wilmsa, hepatoblastoma, rhabdomyosarcoma, guz kory nadnerczy, mikrocefalia, wisceromegalia, transpozycja, wady serca, nerek, narz.płc, niedorozwój umysłowy
* reg. piętnowanie (drobne różnice w zależ. czy poch. od ojca czy od matki)
5. Zespół Di Georga
- u 10-15% widoczne są mikrodelecje [del.(22)(q11.2); u pozost.istnienie del można wykazać przy użyciu sond DNA, del mogą być pochodz.matczynego lub ojcowskiego(brak dowodów na istn.napięt-nowania genomowego w tym regionie)
- objawy: spadek ruchl.płodu, drgawki u noworodka związ. z niedoczynnością przytarczyc(agenezja, aplazja, hipoplazja), noworodkowa śpiączka hipokalcemiczna, nawracajce infekcje wirusowe i grzybicze wtórne do aplazji lub hipoplazji grasicy, hiperteloryzm, skośne ustaw. Szpar powiek., krótka rynienka nosowa, mała żuchwa, rybie usta, nisko osadz .uszy, wady serca, głównych pni naczyn., brak przybier.na wadze
6. Zespół Wolfa-Hirschorna
- delecja krótkich ramion chr. 4 pary: 46,XX,4p-\46,XY,4p-
w niektórych przypadkach połączenie fragm.uszkodz., pozbawionych dystal. końców chr.4 pary prowadzi do utworzenia pierścienia 46,XXr4\46XY,r4
- objawy (widoczne bezp.po urodz.):niska masa urodz., małogłowie, poszerzenie nasady nosa, niedorozwój żuchwy, niedorozwój psychiczny i fiz.(obj.niestałe to zmarszczki nakątne, rozszczep podniebienia, niskie osadzenie małżowin usznych, wady serca), przeżycie okr. niemowlęcego jest rzadkie.
7. Zespół kociego krzyku - Cri du Chat
-delecja krótkich ramion chr.5 pary: 46,XX\XY , 5p-
-częstość: 1:50000-1:100000
-del może czasami wtórnie prowadzić do powst. pierścienia[46,XX,r5]
-w większości przypadków delecja powstaje de novo, a kariotypy rodzicielskie są prawidłowe
-czasem stwierdza się kariotyp z translokacją fragm.chr.5(gr B) przemieszcz. na jeden z chr.gr C lub G
-u ok.20% stwierdza się występowanie zrównoważonej translokacji u rodziców, co może być przyczyną urodz.się w rodzinie kilku chorych dzieci
- cecha charakterystyczna: płacz noworodka przypomin .miałczenie kota, + zniekształc. twarzoczaszki i nieprawidł. rozwój umysłowy. Cechy dysmorficzne głowy zmieniają się w zależn.od wieku , u niemowlęcia:małogłowie, okrągła twarz, szeroko rozst.oczy, zmarszczki nakątne, zez zbieżny, niedor.żuchwy, uszy małe, nisko osadz.o prawidł. budowie, rozw. psychomotor. opóźniony, śmiertelność mała.
DZIEDZICZENIE MONOGENOWE
Allele - różne formy genu, mogą powstać na skutek mutacji allelu normalnego
Homozygota - oba geny z pary homologicznej są identyczne
Heterozygota - geny z pary homologicznej są różne
Cecha dominująca - ujawnia się u heterozygoty
Cecha recesywna - ujawnia się u homozygoty
Cecha kodominująca - wpływy obu genów widoczne u heterozygoty
DZIEDZICZENIE DOMINUJĄCE SPRZĘŻONE Z CHROMOSOMEM X; chorują M i K, u M przebieg jest zawsze tak samo ciężki, u K różny przebieg związany z lionizacją; rodowód przypomina AD; nie ma przekazywania choroby od mężczyzn dominująca sprzężona z chr X mężczyzn
DZIEDZICZENIE KODOMINUJĄCE SPRZĘŻONE Z CHROMOSOMEM X; zdolność rozróżnienia każdego z alleli występującego u osobnika
CHOROBY MONOGENOWE
1. Achondroplazja - AD; mutacje pojedynczego genu, zlokalizowanego w chr 4p; prawidłowy rozwój intelektualny; niski wzrost (131 i 124 cm), karłowatość. Cechę można rozpoznać w życiu płodowym (100% penetracji); duża głowa, kolana szpotawe, krótka szyja, nadmierna lordoza, krótkie nasady kręgów, dysplastyczna kość biodrowa
2. Choroba von Recklinghausena (neurofibromatoza I) - 1/300; fibromatoza skórno - nerwowa; różna ekspresja objawów chorobowych (małe plamki po liczne nerwiakowłókniaki); gen NF1 kodujący naurofibrominę (antyonkogen); w przypadku metylacji - częstsze występowanie nowotworów; 3 typy zmian: skórne, podskórne i splotowate (uszkodzenie tkanki nerwowej); 30-50% zaburzenia kośćca - na skutek ucisku nerwików na otaczające tkanki, wykrzywienie boczne kręgosłupa, torbiele, padaczki, opóźnienie rozwoju psycho-ruchowego; 10-15% - glejaki nerwów wzrokowych, oponiaki, gwiaździaki. Rozpoznanie obejmuje 2 kryteria: stwierdzenie przynajmniej 5 przebarwień > 5 cm (u dorosłych) i >1,5 cm u dzieci o barwie kawy z mlekiem oraz zniekształcenia kości klinowej, licznych prę o średnicy 2-3 mm u okolicach pachwin i pach, stwierdzenie plamek Lischa w tęczówce.
3. Zespół Marfana - AD; mutacja genu dla fibryliny zlokalizowanego na 15q2; fibrylina jest głównym składnikiem macierzy międzykomórkowej; występują nieprawidłowości dużych naczyń, stawów, oczu, układu szkieletowego: rozluźnienie połączeń stawowych, pacjent wysoki, szczupły o długich kończynach, arachnodaktylia, osłabienie kręgosłupa, szewska klatka piersiowa, płaskostopie lub nadmierne wysklepienie stopy, wiotkie ścięgna rąk i stóp, silnie zaznaczone wały nadoczodołowe, podniebienie gotyckie, zwichnięcie soczewki, nieprawidłowa budowa ścian naczyń - w aorcie może dojść do rozwarstwienia ścian i powstawania tętniaków oraz pęknięć, defekty zastawek sercowych, rozwój umysłowy prawidłowy; dzieci często chore na zapalenie oskrzeli, płuc oraz astmę, a osoby starsze - osłabienie i rozciągnięcie opon; ciąża jest ogromnym ryzkiem dla pacjentek z z. Marfana
4. Chorba Huntingtona (HD) - AD; mutacje powielenia powtórzeń CAG w genie na chr 4p; ujawnia się w 4 - 5 dekadzie życia; od zachorowania do śmierci upływa < 10 lat; ruchy pląsawice, zmienna osobowość, utrudniony kontakt, otępienie; większe ryzyko odziedziczenia po ojcu, ale dla kobiet i mężczyzn jest równe; obumieranie neuronów w jądrze ogoniastym i skorupie - rejony te SA odpowiedzialne za emocje, kontrolę i postrzeganie; choroba doprowadza do niepełnosprawności.
6. Mukowiscydoza - nosicielstwo 1/20; przyczyną jest mutacja w genie CFTR - powoduje zaburzenie wydzielania elektrolitów i wody w nabłonkach (słony pot), zaleganie gęstej i lepkiej wydzieliny w oskrzelach; pacjent nie wchłania pokarmów biegunki tłuszczowe, ponieważ nie ma dopływu enzymów proteolitycznych z trzustki (zalegają one w kanalikach wydzielniczych niszcząc i upośledzając jej funkcje); jest to choroba ogólnoustrojowa, mogąca dotyczyć wszystkich narządów wydzielniczych; leczenie objawowe oraz terapia genowa - próby podawania genu do drzewa oskrzelowego z wykorzystaniem adenowirusów, które przenoszą prawidłowy gen (efekt jest nietrwały, ale skuteczny)
7. Zespół Retta - choroba neurologiczna uwarunkowana genetycznie, zaliczana do spektrum autystycznego. Jedna z najczęstszych przyczyn obniżenia poziomu rozwoju intelektualnego u dziewczynek; pojawia się u dziewczynek 1:10.000 do 1:23.000 żywych urodzeń, dla mężczyzn jest letalna i prowadzi do śmierci na etapie rozwoju płodowego, a jeżeli dziecko się urodzi jest bardzo upośledzone i umiera w niedługi czas po urodzeniu; mutacja genu MECP2 w chromosomie X, spontaniczna, tzn. zachodzi w narządach rozrodczych jednego z rodziców i nie występuje wcześniej wśród członków rodziny; białko kodowane przez MECP2 steruje pracą genów odpowiadających za produkcję mózgowego czynnika wzrostu nerwów (BDNF) oraz genów mitochondrialnych; objawy: normalny rozwój od urodzenia do 6-18 miesiąca życia, utrata sprawności manualnej i zdolności mówienia, demencja, ataksja, niski wzrost, małe ręce i głowa (wtórna mikrocefalia), stereotypowe ruchy rąk (klaskanie, stukanie, wkładanie do ust), zgrzytanie zębami, problemy z kontaktami społecznymi, ataki paniki, unikanie kontaktu wzrokowego, napady padaczkowe, problemy żołądkowo-jelitowe i oddechowe, boczne skrzywienie kręgosłupa, przykurcze mięśniowe.
8. Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) - choroba genetyczna powodująca postępującą dystrofię (zanik) mięśni; dziedziczona recesywnie, sprzężona z X; 1/3300-3500 urodzeń chłopców; ok. 1/3 przypadków - mutacja de novo; różne mutacje genu kodującego dystrofinę: delecje jednego lub więcej egzonu (60%), duplikacje (5-10%) i mutacje punktowe (30-35%); dystrofina włókna aktynowe z błoną komórkową, bierze udział w przekazywaniu sygnałów w komórkach, brak powoduje uszkodzenia błony komórkowej i nekrozę komórek mięśniowych; mutacje powodują przesunięcie ramki odczytu i całkowity brak dystrofiny w mięśniach; choroba ma charakter postępujący, pierwsze objawy występują w wieku 3-8 lat: opóźniony rozwoju ruchowy, kaczkowaty chód i kłopoty z bieganiem oraz chodzeniem po schodach, przy wstawaniu pomaganie sobie rękami (objaw Gowersa), pseudo-hipertrofia mięśni łydek i hiperlordoza lędźwiowa, może wystąpić upośledzenie umysłowe, kardiomiopatia.
9. Dystrofia mięśniowa Beckera - 3-6/100 000 urodzonych chłopców; obejmuje zarówno postać łagodniejszej dystrofii dosiebnej, jak też kardiomiopatii izolowanej lub współistniejącej z uszkodzeniem mięśni szkieletowych, kurczów mięśniowych, mialgii, a także zwiększonej aktywności kinazy kreatynowej jako jedynego objawu; objawy chorobowe zaczynają ok. 11r.ż choroba przebiega łagodniej, chorzy długo są sprawni ruchowo; jednym z pierwszych objawów jest przerost łydek i kurcze mięśniowe
10. Zespół łamliwego chr X - wydłużenie ciągów powtórzeń CGG genu FMR1; 3 podstawowe stany wydłużenia: normalny (50 tripletów) - inteligencja jest normalna, a długość taka sama w każdym pokoleniu; premutacje (50-200 tripletów) - inteligencja jest normalna, ale są różnice między generacjami o zwiększającym się nasileniu; pełne mutacje (>200) - są masywnymi, somatycznie niestabilnymi zmianami u chorych osobników; fenotyp: podłużna twarz z dużą żuchwą, duże i/lub odstające uszy, powiększone jądra, łagodne wielkogłowie i wzrost powyżej średniej w dzieciństwie, opóźnienie psychomotoryczne, IQ obniża się z wiekiem, mają opóźniony rozwój mowy i języka; fenotyp zachowania: hiperaktywność, unikanie towarzystwa i lęk, wymachiwanie rękami, gryzienie rąk, unikanie wzroku i obrona przed dotykiem, niezgrabny chód, hipotonia, zez, opadanie powiek, drgawki (u 25%)