WYKŁAD 1 BIOTECHNOLOGIA
Kształtowanie procesu biotechnologicznego. Selekcja i doskonalenie szczepów mikroorganizmów. Przechowywanie szczepów, namnażanie materiału posiewowego, typy hodowli, dobór procesów jednostkowych. Zasady technologiczne. Przegląd podstawowych technologii biochemicznych. Produkcja biomasy mikroorganizmów. Fermentacja etanolowa, produkcja kwasów organicznych. Biotechnologie farmaceutyczne - antybiotyki, surowice, szczepionki, biotransfarmacja, biohydrometalurgia.
Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie.
Biotechnologia i chemia antybiotyków
Podstawy biotechnologii przemysłowej.
Streptomyces - promieniowce - bogata gama metabolitów wtórnych. Pochodzą z nich antybiotyki.
Screening - poszukiwanie nowych antybiotyków.
Screening może być biologiczny i chemiczny.
Screening biologiczny - każda z próbek gleby musi zostać uwodniona. Dodajemy płynu fizjologicznego. Zbuforowany PBS.
Z tego wysiewamy mikroby na szalki Petriego z jakimś podłożem. Najczęściej jest to podłoże Hintona (czyżby Mueller-Hintona?) lub agar odżywczy.
Kolonie przesiać do podłoża płynnego i tym razem badamy ich aktywność biologiczną. Każdy ze szczepów będzie miał większą lub mniejszą aktywność antybiotykową. Testuje się ją na szczepach testowych - sprawdzamy, czy szczep produkuje antybiotyki.
Nasącza się krążki bibuły nadsączem z hodowli szczepu wyizolowanego krążki bibuły, na którym wcześniej jest wysiana murawa szczepu wskaźnikowego. Bakterie wskaźnikowe - subtilis, coli itd.
Tam, gdzie Streptomyces działa przeciwko szczepowi wskaźnikowemu będzie występowało przejaśnienie.
Grubość agaru musi być standardowa i jest ważna, bo od grubości agaru zależy szybkość dyfuzji.
Płytka musi mieć zawsze tę samą średnicę. Jeśli płytki będą różne, jedna ilość płynu nic nie pomoże.
W kilku przypadkach powstają strefy zahamowania wzrostu szczepów wskaźnikowych. Znaczy to, szczepy są gotowe do dalszej analizy. A więc robiąc screening, wybieramy szczepy bakteriobójcze.
Screening chemiczny - wstępnie oceniamy, jakie substancje mogą się znajdować w supernatancie, czy wydzielinach bakterii. Supernatant poddajemy analizie. Metodą, którą się stosuje jest chromatografia TLC (cienkowarstwowa chromatografia cieczowa, ang. thin layer chromatography) .
Polega na tym, że na płyty szklane powleczone nośnikami - np. żel silikonowy, ksyluloza, nanosi się w postaci plam na jednej wspólnej linii startowej substancję, która jest supernatantem w hodowli badanego szczepu.
Należy wstawić je do kamery szklanej (szklane pudło z przykrywką) i wstawiamy to do układu rozpuszczalników z dwoma fazami - faza organiczna i nieorganiczna - np. mieszanina woda-metanol-chloroform. Na zasadzie dyfuzji faza rozpuszczalników unosi się. Gdy osiągnie czoło, kończymy proces podnoszenia się rozpuszczalników. Fazą nośną jest zwykle substancja organiczna, fazą stałą woda. Substancje, które tam były, przeniosą się do góry płytki. W efekcie po wybarwieniu płyty uzyskamy plamy, które będą przechodzić z niezależnych związków organicznych. Takich rozdziałów równolegle powinniśmy zrobić 3, czy 4 - powtórzyć je, a wybarwić płyty trzema różnymi odczynnikami w kierunku cukrów, tłuszczów i białek.
Wśród tych substancji będziemy szukać nowych substancji, których nie było w profilu znanych już szczepów Streptomyces.
Trzeba przerobić około 1000 próbek gleby, aby znaleźć szczep, który ma metabolit o aktywności mikrobiologicznej.
Robi się też HPLC - gdy dostaniemy nowy pik we wzorze danego szczepu w porównaniu do innych, możemy pokusić się (mając informację o silnej aktywności mikrobiologicznej związku) o izolację związku - namnażamy naszą wyjściową kolonię, ale kolejna hodowla musi być hodowlą najtańszą. Jeżeli myśli się o produkcie, myśli się o najtańszych rozwiązaniach. Gdy produkt będzie drogi, to nikt tego pomysłu nie kupi.
Startujemy na najtańszych podłożach, jakie się da. Najtańsze podłoże to woda kranowa, czysta, mączka sojowa (źródło węgla) oraz mannitol. Najlepiej, gdy szczep potrafi rosnąć na samej kranówie + mączce. Wstępną hodowlę prowadzi się w kolbach Erlenmeyera , które mają od denka kolby blendy. Po wypełnieniu kolbek podłożem w kolbach 300 może być maksymalnie 100 ml podłoża.
W trakcie ruchu obrotowego w wytrząsarkach podłoże będzie się pienić i to grozi wylaniem.
Zaszczepiamy kolbkę z podłożem naszym szczepem. Hodowlę prowadzimy w kolbkach z jednym, dwoma, czterema uzębieniami (blendami). Kolbka będzie wrzucona do wytrząsarki (najlepsze są wytrząsarki albo zamknięte z napływem powietrza, albo wodne, gdzie temperatura wody podnosi temperaturę pożywki), gdzie potrzebny jest ruch rotacyjny. Te kolbki są wstawione do wytrząsarki. Temperatura hodowli wynosi zazwyczaj 37*. Różne szczepy będą rosły w różnych temperaturach, więc można je puścić do różnych temperatur.
W ruchu rotacyjnym kolbki ciecz wiruje i rozbija się o wystające do środka blendy. Im ich więcej, tym hodowla bardziej rozbijana i więcej powietrza dostaje się do hodowli. Pobierając potem po dwóch dniach hodowli płyn hodowlany, musimy znowu wrócić do tej samej analizy - HPLC i zbadać produkty w każdej z czterech kolbek.
Okaże się, że kolbce z jednym tylko blendem będzie mały poziom piku, a w innych większy. A więc poziom substancji będzie zależał od napowietrzenia.
Okazuje się, że przy 4 blendach mamy pik.
Następnym etapem jest zmiana skali - przejście na małe fermentory o pojemności 10l. Zwykle fermentory obsługiwane przez biostaty. Te biostaty mogą prowadzić hodowlę w stałej temperaturze, ze stałym utrzymywaniem pH. Można prowadzić hodowlę ciągłą z dodawaniem substancji odżywczych do hodowli. Zapewniamy stałe napowietrzanie i temperaturę. Procesy, które zachodzą, są monitorowane przez czujniki i komputer poddaje hodowlę analizie - nawet kontrolowane przez komputer wytwarzanie piany.
Biostat to rura szklana Są tam czujniki odprowadzające dane do komputera. Głównym elementem tego instrumentu jest mieszadło. Bez mieszadła nie byłoby procesu. Przy mieszaniu powstaje piana.
Po przeprowadzeniu HPLC preparatywnego izolujemy minimalną ilość czystej substancji i dajemy chemikom do analizy.
Aby zrobić ten etap, musimy mieć pewność, że jest to nowa, nieznana substancja.
Jeżeli substancja jest nowa nazywamy ją JAKOŚ :>
Jeżeli uda nam się uzyskać któryś z wariantów, jest szansa na to, że przejście do wyższej skali pozwoli nam uzyskać ten pik.
W tym momencie są największe schody. Przejście z małej skali do skali dużej najczęściej się nie udaje. Panują tam ogromne ciśnienia, zmieniają się parametry.
Jeżeli na skalę przemysłową uzyskamy ogromny pik i jesteśmy hepi - mamy nowy antybiotyk i nową linię produkcyjną.
Później z kolei może się okazać, że przy próbach na zwierzętach związek jest toksyczny.
Antybiotyk odkryty dzisiaj wejdzie za 10 lat. Najszybciej udało się wprowadzić antybiotyk po 7 latach.
Biotechnologia: biała, czerwona, zielona
Biotechnologia biała: wykorzystuje komórki, np. pleśnie, drożdże, bakterie oraz enzymy do wytwarzania nowych produktów lub procesów przetwórczych. Wykorzystuje mikroby, często ulepszone przy zastosowaniu inżynierii genetycznej w celu wytwarzania antybiotyków, witamin, szczepionek i białek na użytek medycyny
ulepszone komórki mikroorganizmów pracują jako jednokomórkowe fabryki, produkując także liczne enzymy, główne dla przemysłu chemicznego - proszki do prania
enzymy - odgrywają także pierwszoplanową rolę w degradacji substancji odnawialnych i przetwarzaniu ich na substancje chemiczne, pestycydy, biodegradowalny plastik itd.
Biotechnologia czerwona - dział biotechnologii medycznej. Związany z ochroną zdrowia zwierząt człowieka. Powstawanie nowych leków. Np. nowotwory, gruźlica, cukrzyca.
Czerwona związana jest z medycyną, ochroną zdrowia. Nowe możliwości medycyny uzyskiwane dzięki biotechnologii - powstanie odrębnych dziedzin nauki, jak farmakogenetyka - bada wpływ, który mogą mieć geny n indywidualną reakcję organizmu na lekarstwo (i całkowicie nowych narzędzi oddawanych do dyspozycji lekarzy i np. testy genetyczne - służące przewidywaniu odziedziczalności chorób i podatności na inne, szczególnie w przypadku rzadkich chorób.
Zielona biotechnologia
Ma szansę wyżywić świat.
Biotechnologia, wykład I, strona 3