Pojedyncza immunodyfuzja płytkowa (metoda MANCINIEGO= radialna) ZAST do oceny białek w surowicy i innych plynach ustrojowych .Ozn się nia poziom innunoglobulin gł M G E ,stezenie podklas IgG ,stezenie składowych dopełniacza . Przeciwciała o danej swoistości w odpowiednio dobranym stężeniu miesza się z z plynnym agarem i wylewa na płytkę . po zastygnieciu podłoza wycia się w nim zbiorniczki i wypełnia roztworem badanego białka (antygenu) Antygen dyfunduje ze studzienki do agaru i tworzy z przeciwcia lami kompleksy immunologiczne .W pobliżu studzienek gdzie stez. Antygenu jest duze tworzy on z przeciwciałem kompleksy rozpuszczalne .W miare dalszej jego dyfuzji jego stezenie maleje i w strefie ekwiwalencji molarnej obu reagentow tworza się nierozpuszczalne kompleksy .Sa one widoczne jako pierścieniowate strefy precypitacji wokół studzienek .Srednica tych pierścieni przy stałym stężeniu przeciwciał w podłozu jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu. Stężenie badanego białka wylicza się na podstawie wykonanej rownolegle krzywej kalibracyjnej z białkami standardowymi o znanym stężeniu. diag alergologiczna - test CAST - ELISA Stos jest do ilościowej oceny w badanym materiale antygenu lub przeciwciała. Jest on szybki. ZAST: 1 wykrywania obecności w płynach biologicznych antygenów i przeciwciał w ch. zakaźnych i pasożytniczych 2 oceny stężenia wielu hormonów 3 wykrywania obecności autoantygenów. Wykonuje się go na gotowych mikropłytkach z dołkami. Pow dołków opłaszcza się danym antygenem i po odpłukaniu nadmiaru reagentu dodaje się do dołków surowicę, w której poszukujemy przeciwciał, w kolejnych rozcieńczeniach. Po inkubacji w temp 37C przez 1h płytkę przepłukuje się i dodaje się przeciwciała wyznakowane enzymem, mające zdolność wiązania się z Ig. Po inkubacji płytkę znowu się płucze, dodaje nadtlenek wodoru i chromagen. Po pewnym czasie dodaje się HCl - zatrzymanie reakcji enzymatycznej. Równolegle wykonuje się próby kontrolne: 1 z surowicami ujemnymi ( nie zawierającymi szukanego przeciwciała ) 2 dodatnie (krzywa kalibracyjna - dane przeciwciała w kolejnych znanych rozcieńczeniach ) Wynik na podstawie natężenia barwy roztworu mierzonego metodą spektofluorymetryczną. Gdy w badanym materiale szukamy antygenu powierzchnia dołków jest spłaszczana swoistymi przeciwciałami. Po inkubacji z kolejnymi rozcieńczeniami badanego materiału do układu dodaje się przeciwciała homologiczne ( o tej samej swoistości co przeciwciała spłaszczające płytkę ) wyznakowane enzymem i przeprowadza reakcję enzymatyczną Od flokulacyjny (test VDRL) w diagnostyce kiły. ZAS jest r-a przeciwciał obecnych w surowicy chorego z antygenem kariolipinowym. Powstałe precypitaty wytrącają się z r-ru w postaci luźnych dobrze widocznych kłaczków. WYK: 1 inaktywacja surowicy chorego-niezbędna 2 zinaktywowaną surowicę nakraplamy do zagłębienia szkiełka Lindera (szkiełko z tezką) 3dodajemy świeżo przygotowana zawiesinę antygenu kardiolipinowego 4 szkiełka intensywnie wytrząsamy ręcznie lub w wyrztrząsarce 5 po 4 min odczytujemy wynik najlepiej pod mikroskopem (pow 30 40 x) WYN : dodatni- gdy widoczne są wyraźne skupiska kłaczków w przeźroczystym płynie słabo dodatni- drobne skupiska kłaczków ujemny- cząst. antygenu są równomiernie rozproszone w polu widzenia Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników -1.RAST do ilosciowej oceny stezenia przeciwciał kl IgE przeciwko alergnowi. Oczyszczony alergen jest wiazany z nosnikiem(np. krazki bibuły), inkubowany z surowicą, odpłukujemy, dodajemy przeciwciała anty IgE znakowane jodem . Stezenie swoistych przeciwciał IgE w surowicy oceniamy na podst. Pommiaru zwiazanej radioaktywnosci w kolejnych próbkachw porownaniu z radioaktywnoscia prób kontrolnych- 2.RIST do oceny ilosciowej poziomu całkowitejIgE w surowicy. Nosnik jest opłaszczony przeciwciałami anty IgE, dodajemy kolejne rozcienczenia surowicyi inkubujemy, dodajemy anty-IgE znakowane jodem. Słuzy tez do ilosciowej oceny poziomu IgG w surowicy(wówczas zamiast znakowanych jodem przeciwciał anty IgE dodajemy znakowane białko A wiazące fragment Fc IgG),w diagnozowaniu niedoborow odpornosci-zesp.Joba, diagnozy i monit. leczenia aspergillozy płucnej. 3.ELISA sluzy do ilosciowej oceny w badanym materiale antygenu lub przeciwciała ( w chorobach zakaznych i pasozytniczych, do ilosciowej oceny stezenia wielu hormonów do wykrywania autoantygenów). Test na gotowych mikropłytkach, z dołkami (opłaszcza się je antygenem) do nich surowicę, w ktorej poszukujemy przeciwciał w kolejnych rozcienczeniach, inkubacja, płukanie, dodac znakowane enzymy, inkubacja, plukanie, dodacH2O2 i chromagen, potem HCl. Równolegle próbę kontrolną z surowicami ujemnymi i kontrolne próby dodatnie. Wynik ocenia się wg barwy r-ru mierzonego metodą spektrofluorometryczną w specjalnym czytniku. OD ANTYGLOBULINOWY - COOMBSA Wykrywa obecność przeciwciał niekompletnych tj. przeciwciał, które wiążą się z antygenami występującymi na powierzchni komórki ale nie powodują aglutynacji erytrocytów (mają one mały kąta rozwarcia w regionie zawiasowym). Przeciwciała niekompletne wykrywa się za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko gammaglobulinie ludzkiej (tzw. Przeciwciał antyglobulinowych). 1.Odczyn bezpośredni - pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych spłaszczonych in vivo na erytrocytach. Do zawiesiny badanych erytrocytów dodajemy przeciwciała antyglobulinowe. Stosowany jest on do: 1 Wykrywania na erytrocytach obecności przeciwciał przeciwko antygenowi D ukł Rh (ch hemolityczna noworodków). 2 W diagnostyce niedokrwistości autoimmunohemolityczynch. Na szkiełko przedmiotowe nakraplamy surowicę anyglobulinową i + zawiesinę badanych erytrocytów. Dokładnie mieszamy. Inkubujemy w wilgotnej komorze przez 10 minut. Równolegle wykonujemy próby kontrolne. 1 0,85 % roztwór NaCl + zawiesina badanych erytrocytów. 2 zawiesina krwonek gr 0 Rh + uprzednio opłaszczonych przeciwciałami anty D + surowica antyglobulinowa. 3 Zawiesina krwinek gr 0 Rh + + plus surowica antyglobulinowa. Wynik odczytuje się mikroskopowo oceniając wystąpienie lub nie hemaglutynacji erytrocytów. 2.Odczyn pośredni pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych w surowicy. Najpierw spłaszczamy erytrocyty wzorcowe badaną surowicą a następnie + przeciwciała antyglobulinowe. ZAST: 1. Do wyrywania obecności przeciwciał anty D ukł Rh w surowicy matki w przypadku podejrzenia o konflikt serologiczny. 2. Do wykrywania obecności innych przeciwciał niekompletnych w surowicy np. przeciwko tyreoglobulinie lub globulinom. Wykonujemy go w dwóch etapach. 1 etap : w próbówce badaną surowicę inkubujemy wstępnie z erytrocytami wzorcowymi (grpa 0 Rh +) gdy przeciwciała anty D są obecne w surowicy to zachodzi opłaszczenie krwinek wzorcowych tymi przeciwciałami. Równolegle inkubujemy próby kontrolne: 1 erytrocyty gr 0 Rh + + surowica anty D 2 Erytrocyty gr 0 Rh - + surowica anty D 2 Etap: na szkiełka przedmiotowe skraplamy:1 surowicę antyglobulinową + zawiesinę erytrocytów wzorcowych inkubowanych wstępnie z badaną surowicą - próba właściwa. Surowicę antyglobulinową - + zawiesinę erytrocytów gr 0 Rh + inkubowaną wstępnie z surowicą anty D - próba kontrolna (hemaglutynacja) 2 surowice antyglobulinową + zawiesinę erytrocytów grupy 0 Rh - inkubowana wstępnie z surowicą anty D - próba kontrolna ( brak hemaglutynacji) 3 0, 85% roztwór NaCl + zawiesina erytrocytów wzorcowych inkubowanych wstępnie z badana surowicą - próba kontrolna (Brak hemaglutynacji) Wynik odczytujemy makroskopowo po 2min OD WIĄZANIA DOPEŁNIACZA (OWD) Jego podstawą jest zj hemolizy immunologicznej. Kompleksy immunologiczne antygen- przeciwciało kl IgM lub IgG mają zdolność wiązania dopełniacza. Związanie dopełniacza do kompleksu antygen - przeciwciało jest niewidoczne. Gdy antygenem tej r-i jest antygen powierzchniowy erytrocytu lub antygen spłaszczony biernie na bł erytrocytu to związanie dopełniacza przez kompleks antygen związany z erytrocytem - przeciwciało powoduje lizę erytrocytów. Jest to tzw hemoliza immunologiczna. ZASA do wykrywania w badanym materiale - obecności antygenów (gdy mamy swoiste przeciwciała) - obecności przeciwciał (gdy mamy dany antygen) jest to b. czuły test. Można go wykonać jako test ilościowy - określenie miana antygenu lub przeciwciał w badanym materiale. ZAST w diagnostyce mikrobiologicznej zakażeń bakteryjnych, grzybiczych i wirusowych. Do wykonania odczynu trzeba przygotować: 1 inaktywowaną surowicę badaną 2 przeciwciała antyerytrocytarne 3 spłaszczone przeciwciałami antyerytrocytarnymi erytrocyty barana 4 dopełniacz OdCZYN wykonuje się dwuetapowo. 1 etap: inkubujemy badaną surowicę ze: - znanym antygenem ( gdy szukamy w niej przeciwciał) - znana surowicą odpornościową ( gdy szukamy w niej antygenów) Następnie dodajemy dopełniacz. Jeśli utworzy się kompleks immunologiczny to zwiąże on dopełniacz a jeżeli nie to dopełniacz pozostanie niezwiązany w roztworze 2 etap: dodajemy do ukł tzw układ wskaźnikowy - erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami antyerytrocytarnymi. Gdy w ukł: 1 dopełniacz jest związany to nie nastąpi hemoliza erytrocytów (wynik dodatni - w badanym materiale jest badany składnik) 2 dopełniacz jest nie związany to przyłączy się on do kompleksu erytrocyt - przeciwciało antyerytrocytarne i nastąpi hemoliza krwinek (wynik ujemny - w badanym materiale nie ma poszukiwanego składnika) Równolegle wykonujemy próby kontrolne: 1 badana surowica + dopełniacz + zawiesina opłaszconych erytrocytów - hemoliza 2 reagent znany (antygen lub przeciwciało) + dopełniacz + zawiesina opłaszczonych erytrocytów - hemoliza 3 dopełniacz + zawiesina opłąszczonych erytrocytów - hemoliza 4 erytrocyty barana nieopłaszczone - hemoliza. Ilościowy odczyn wiązania dopełniacza wykonuje się w szeregu próbówek + stałe objętości każdego ze składników r-i: reagentu znanego (antygenu lub przeciwciała), dopełniacza, zawiesiny spłaszczonych erytrocytów barana. Badana surowicę podaje się w kolejnych rozcieńczeniach. Wynik jako miano surowicy - odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, które spowodowało zahamowanie hemolizy w ukł wskaźnikowym. OZN ANTYSTREPTOLIZYNY 0 (odczyn ASO) Antystreptolizyna 0 to przeciwciała wytwarzane w organizmie w odp na zakażenia paciorkowcami beta - hemolizującymi gr. A. Jest ona swoiście skierowana przeciwko streptolizynie 0 (hemolizynie produkowanej przez paciorkowce mające zdolność hemolizy erytrocytów) ZAST:1 diagnozowaniu trwających lub przebytych zakażeń paciorkowcami 2 Różnicowaniu chorób reumatycznych ZAS oznaczania poziomu antystreptolizyny 0 w surowicy opiera się na hamowaniu zj hemolizy erytrocytów pod wpływem streptolizyny 0 po jej ilościowym związaniu przez antystreptolizynę 0. Gdy w surowicy: 1 znajdują się przeciwciała przeciwko streptolizynie 0 to wiążą one wzorcową streptolizynę 0. Powstaje kompleks streptolizyna 0 - antystreptolizyna 0 i w drugim etapie erytrocyty wzorcowe nie ulęgają hemolizie - wynik dodatni 2 nie ma przeciwciał przeciwko streptolizynie 0 to wzorcowa streptolizyna pozostaje niezwiązana w roztworze i w drugim etapie spowoduje hemolizę erytrocytów wskaźnikowych - wynik ujemny Odczyn probówkowy: Odczyn ASO wykonujemy w szeregu próbówek do których dodaje się kolejne rozcieńczenia badanej surowicy i wzorcowy roztwór streptolizyny 0. Inkubujemy 15 minut w temperaturze 37 stopni C. Następnie do każdej próbówki dodajemy taką samą obj 5%zawiesiny erytrocytów królika i ponownie inkubujemy w temp 37 stopni C przez 60 min. Wynik odczytujemy makroskopowo oceniając występowanie lub nie hemolizy erytrocytów i podajemy go jako miano surowicy - odwrotność największego rozcieńczenia badanej surowicy, przy którym hemoliza erytrocytów jeszcze nie występuje. Równolegle wykonujemy próby kontrolne: 1 erytrocyty wskaźnikowe + 0,85% roztw. NaCl - brak hemolizy 2 erytrocyty wskaźnikowe + badana surowica nierozcieńczone - brak hemolizy 3 erytrocyty wskaźnikowe + wskaźnikowa streptolizyna 0 - hemoliza Odczyn lateksowy: Wykorzystuje się tu gotowy odczynnik lateksowy (zawiesinę cząsteczek lateksu spłaszczinych streptolizyną zero z hodowli paciorkowców beta-hemoloizujących gr A). Badaną surowicę rozcieńczamy w buforze glicerynowym w stosunku 1:20. Następnie na gotowy jednorazowy kartonik nakładamy w 3 miejsca: -kroplę rozcieńczonej surowicy badane OD PRECYPITACJI PIERŚCIENIOWEJ- najprostszy typ r-i wiązania się antygenu ze swoistymi przeciwciałami w warunkach in vitro. Biorą w niej udział: -antygeny białkowe (pełnowartościowe i resztkowe) rozpuszczalne w wodzie. Są one wielowartościowe (mają wiele determinant antygenowych) -przeciwciała (precypityny) ZAST wykrywaniu: - danego antygenu w badanym materiale ( gdy mamy surowicę zawierającą swoiste dla niego przeciwciała) -obecność swoistych przeciwciał (gdy mamy dany antygen) IMMUNOELEKTROFOREZA WG ScCHEIDEGGERA- metoda łącząca elektroforezę w żelu agarowym i podwójną immunodyfuzję. Najpierw mieszanina białek jest wstępnie rozdzielona w polu elektrycznym a następnie prowadzi się immunodyfuzję tych białek (antygenów) i odpowiednich przeciwciał. ZAST do oceny skł białek surowicy ludzkiej. Pozwala wykryć niedobory odpornościowe i nadprodukcję niektórych białek. Stosuje się ją do identyfikacji białek Bence-Jonesa w przebiegu szpiczaka mnogiego WESTERN BLOOTING- technika immunoelektroforezy+ metoda immunologiczna z zastosowaniem znaczników. Identyfikujemy każdy antygen. Badany materiał poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym w obecności siarczanu sodowego dodecylu (SDS). Po zakończeniu elektroforezy frakcje białkowe przenosi się z żelu na filtr nitrocelulozowy. Wolne miejsca na bł nitrocelulozowej wysyca się nadmiarem obojętnego białka i przeprowadza inkubację ze specyficznymi przeciwciałami. Powstałe kompleksy identyfikuje się za pomocą przeciwciał antyglobulinowych znakowanych enzymami met immunoenzymatyczna Aglutynacja czynna 1.MET PROBÓWKOWA- r-ja zlepiania się elementów upostaciowanych (tzw. zglutynogenów) pod wpływem swoistych przeciwciał (aglurynin) skierowanych przeciwko antygenom znajdującym się na ich pow. Aglutynogenami mogą być erytrocyty, grzyby, leukocyty, bakterie noszące na swojej powierzchni antygen własny lub obcy uprzednio spłaszczony na ich pow. Aglutyniny gł przeciwciała z klasy IgM: Aglutynacja przebiega dwuetapowo. Met probówkowa aglutynacji bezpośredniej pozwala określić miano danych przeciwciał w badanej surowicy (met. półilościowa) W szeregu probowek przygotowuje się kolejne rozcieńczenia badanej surowicy. Do probowki kontrolnej doaje się roztw. NaCl . Do każdej probowki dodane się nastepnie taka sama obj. Zawiesiny aglutynogenu, miesza i inkubuje.WYN odczytuje makroskopowo W probie kontrolnej aglutynogen winien pozostac jako jednorodna zawiesina .Wystapienie i stopien aglutynacja jest zal od stezenia przeciwciał Miano przeciwciał podaje się jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy przy którym wystapiła jeszcze aglutynacja. Odczyn aglutynacji czynnej metodą probówkową ma zastos. w diagnostyce mikrobiol. -odczyn Widala- stos. w diagnostyce duru brzusznego. - odczyn Weil -Felixa - stos. w diagnostyce duru plamistego. -odczyn Wrightz- stos. w diagnostyce brucelozy . W odczynach aglutynacyjnych, w których aglutynogenem są bakterie przebieg aglutynacji zależy od antygenu pow bakterii. Są 3 typy aglutynacji bakterii: a)-A. H (rzęskowa) wyst u bakterii mających antygen rzęskowy H. W obecności swoistych przeciwciał bakterie zlepiają się rzęskami- powst. delikatny strąt. b)-A. O (grudkowa) wyst u bakterii mających antygen rzęskowy O. W obecności swoistych przeciwciał bakterie zlepiają się biegunami tworząc siatkę. Powst. aglutynaty tworzą grudki i osądzają się na dnie próbówki. c)A. Vi -wyst u bakterii mających antygen rzęskowy Vi. W obecności swoistych przeciwciał bakterie przylegają do siebie całą pow. Powst. drobne aglutynaty osądzają się na dnie i ścianach bocznych próbówki.2.MET SZKIEŁKOWA: na szkiełku przedmiotowym umieszcza się krople zawiesiny badanego aglutynogenu i krople surowicy ze swoistymi przeciwciałami. Rownolegle wykonuje się probe kontrolna .Wynik odczytuje się makroskopowo lub pod lupa. Aglutynaty powstałe tworza na dnie kropli wyrazny strat. Met jako do identyfikacji antygenow powierzchniowych kom . za pomoca swoistych surowic odpornościowych do szybkiej identyfikacji szczepu bakteryjnego wyizolowanego od pacjeta .do oznaczania grup krwi w zakresie układu ABO Aglutynacja bierna: 1.ODCZYN LATEKSOWY- b. szybki i czuły test służący do wykrywania w materiale biologicznym obecności przeciwciał przeciwko antygenom rozpuszczalnym. Jest b. dokładny niż precypitacja. Cząst. lateksu opłaszczone danym antygenem inkubuje się z badaną surowicą i makroskopowo ocenia się wyst. aglutynacji Może być wykonywany jako test jakościowy lub półilościowy. test jakościowy wykonujemy na gotowych jednorazowych podłożach kartonowych z ciemnym tłem. na kartoniku umieszczamy krople badanej surowicy i dodajemy odczynnik lateksowy. (czast. lateksu opłaszczone odp. antygenem) mieszamy bagietka szklana. jednocześnie wykonujemy próby kontrolne:1 odczynnik lateksowy- surowica + zaw. dane przeciwciała. 2 odczynnik lateksowy- surowica ujemna. wyst aglutynacji oceniamy makroskopowo po upływie 2 min test półilościowy wykonujemy z kolejnymi rozcieńczeniami surowicy badanej, a wynik podajemy jako miano surowicy- odwrotność ostatniego rozcieńczenia surowicy dającego wynik pozytywny. ZAST do wykrywania obecności : czynnika reumatoidalnego w diagnozowaniu reumatoidalnego zapalenia stawów( czynnik reumatoidalny kl. IgM) - czynnika LE w diagnozowaniu układowego tłocznia trzewnego -antystreptolizyny O w diagnozowaniu trwających i przebytych zakażeń paciorkowcowych. 2.ODCZYN HEMAGLUTYNACJI- opiera się na zjawisku aglutynacji erytrocytów opłaszczonych uprzednio danym antygenem w obecności przeciwciał (hemaglutynin) skierowanych przeciwko temu antygenowi. jest to b.czuly odczyn immunologiczny. ZAST do wykrywania w badanym materiale obecności przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom rozpuszczalnym. w odczynie hemaglutynacji erytrocyty są nośnikiem antygenu. Stosujemy tu erytrocyty barana lub erytrocyty ludzkie gr. 0 Rh-. Najpierw opłaszczamy erytrocyty danym antygenem. odczyn hemaglutynacji wykonujemy w probówkach serologicznych lub na płytkach z zagłębieniami. Do szeregu próbówek dodajemy równe obj. kolejnych rozcieńczeń badanej surowicy wcześniej zinaktywowanej a następnie równe obj. Opłaszczonych antygenem erytrocytów. inkubujemy 2h w temp pokojowej następnie odczytujemy wynik oceniając makroskopowo wyst (lub nie) aglumentacji. Gdy: 1.dno próbówki jest równomiernie pokryte krwinkami lub osad krwinek tworzy pierścień- wynik dodatni. 2. na dnie próbówki jest zbity „guziczek” z erytrocytów- wynik ujemny. określamy miano przeciwciał w surowicy badanej- odwrotność największego rozcieńczenia, które powoduje jeszcze aglumentacje. jednocześnie wykonujemy próby kontrolne 1. surowica badana+ krwinki nieopłaszczone- kontrola ujemna 2.surowica kontrolna dodatnia+ krwinki opłaszczone- kontrola dodatnia 3. rozcieńczalnik+ krwinki opłaszczone- kontrola ujemna Ozn aktywności hemolitycznej DOPEŁNIACZA CH50- do oceny poziomu dopełniacza w surowicy. Informuje o całk. przebiegu klasycznej drogi aktywacji. Zasada tej metody opiera się na ustaleniu ilości surowicy wywołującej w standardowych warunkach 50% Lizę erytrocytów barana opłaszczonych amboceptorem (przeciwciała królika skierowane przeciwko erytrocytom barana). Do oceny aktywności hemolitycznej dopełniacza wykonuj krzywą- mierzymy absorbancję. TEST LIMFOCYTOTOKSYCZNY - test mikrolimfocytotoksyczny Do przeprowadzenia testu potrzebne jest: 1 zawiesina limfocytów pacjenta izolowanych z krwi obwodowej 2 swoiste surowice odpornościowe skierowane przeciwko antygenom HLA 3 dopełniacza króliczego Test ten przeprowadza się na płytkach z zagłębieniami. Najpierw wszystkie zagłębienia w płytce wypełnia się olejem parafinowym. Następnie do każdego zagłębienia pod parafinę wprowadza się surowicę anty - HLA o znanej swoistości oraz zawiesinę badanych limfocytów. Po inkubacji płytek w temp 37C w czasie 30 min do każdego zagłębienia dodaje się dopełniacz i znowu inkubuje w temp 37C przez godzinę. Po tym czasie dodaje się barwnik i po kilku min formalinę. Płytkę pozostawia się w temp pokojowej na godzinę. Wynik odczytuje się oceniając w mikroskopie wygląd komórek i obliczając odsetek komórek martwych. ZASA inkubacja w odpowiednich warunkach badanych komórek efektorowych i docelowych a następnie ocena liczby uszkodzonych komórek docelowych. Metody izolacji komórek -1. wirowanie na gradientach gęstości Zasada: różnice pomiędzy gęstością względną użytego gradientu a wielkością i masą izolowanych komórek. W celu izolacji komórek w gradiencie gęstości na przygotowany odpowiednio gradient nawarstwia się ostrożnie zawiesinę komórkową i wiruje. Po odwirowaniu poszczególne populace komórkowe są rozdzielone wzdłuż gradientu. Daną populację komórek ostrożnie zbiera się i dokładnie odpłukuje. 2. metody adherencyjne Oparte są na zdolności przylegania niektórych komórek, zwłaszcza szeregu monocytów do szkła lub plastiku. Oczyszczanie danej populacji komórek z wykorzystaniem zjawiska adherencji prowadzi się w kolumnach. Zawiesinę komórek inkubuje się na płytkach lub w kolumnie ( 30 - 60 min w temp 37C ) i następnie przepłukuje podłoże odpowiednim środowiskiem. Komórki nie przylegające do danego podłoża są wypłukiwane. Aby uzyskac zawiesinę komórek zaadsorbowanych do podłoża, należy następnie wypłukać podłoże 50% roztw. FCS 3. metoda szoku osmotycznego Ma na celu usunięcie z danej zawiesiny komórkowej erytrocytów. Do zawiesiny kom dodaje się wodę destylowaną albo roztwór chlorku amonu buforowany trisem 4. metody z zastos immunoadsorbentów Immunoadsorbenty są to kulki szklane, plastikowe opłaszczone przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom pow danej populacji kom. Immunoadsorbenty umieszcza się w szklanej kolumnie. Podczas inkubacji zawiesiny komórkowej z immunoadsorbentem następuje wiązanie się do opłaszczonych cząsteczek nośnika jedynie tych kom , które reagują swoiście z danymi przeciwciałami. Aby odzyskać komórki, przepłukuje się kolumnę dużą ilością odpowiedniego środowiska. ZASTjest do izolacji poszczególnych subpopulacji limfocytów . 5. metoda izolacji magnetycznej Paramagnetyczne cząsteczki polistyrenu SA opłaszczone przeciwciałami. Następnie miesza się je z zawiesiną komórek i inkubuje. W trakcie inkubacji następuje wiązanie między przeciwciałami opłaszczonymi na nośniku a komórkami mającymi na powierzchni odpowiedni antygen. Komórki związane z cząsteczkami jośnika usuwa się z zawiesiny za pomocą magnesu 6. metoda rozetowa E-met. ilosciowa oparta na spontanicznym wiazaniu erytrocytów barana z limf.T człowieka. Tworzą trwałe wiazanie (antygen CD2) tzw rozety E->inkubacja, wirowanie. Sporzadzenie preparatu-liczenie kom tworzących rozety (min.3 przyłączone krwinki)
Techniki oceny fenotypu limfocytów - technika immunofluorescencji z zastos. przeciwciał monoklonalnych.To met.roznicowania populacji i subpopulacji limf. Oparte sa na identyfikacji charakt.elementów pow.kom tzw antygenów róznicowania CD Nanosimy zawiesine żywych komórek lub osad komórkowy na zagłębienia szkiełek Multitest->inkubacja 30min->płukanie płynem hodowlanym->->utrwalić. Wprowadzamy przeciwciała monoklonalne, inkubujemy 20min i płuczemy. Dodajemy przeciwciała przeciwko IgG znakowane fluoresceiną, inkubujemy 20 min, płuczemy, wypełniamy50% glicerolem-Ocenę transform. Blastycznej limf. Można przepr.2 metodaami: -morfologiczną:rozmaz, preparat, obserwacja pod mikr. Obliczenie indeksu blastycznegox=liczba blastow przypadająca na 500 lub 1000 kom./liczba limf w prepx100% -met.rozetowa:ilosc wbudowanych prekursorow można oznaczyc przez pomiar radioaktywności Met oceny sprawnosci czynności fagocytów (neutrofilów) -metody oceny adherencji fagocytów stosujemy kolumny z watą nylonową (bezposr. zaliczanie w mikroskopie niezaadherowanych kom) lub sefadeksem, plastikowe naczynia hodowlane (+barwnik MTT, komorki adherujące przekształcaja barwnik w niebieski farmazan- liczymy je, metoda ilosciowa) lub pow. Szklane -metody badania migracji fagocytów *test migracji fagocytów w komórkach Boydena- met.ilosciowa, komora Boydena składa się z 2 przedziałow rozdzielonych filtrem miliporowym nitrocelulozowym(dla neutrofili otwory 2-3um, bla monocytów 5um) Na gorze badane komorki, na dole czynnik chemotaktyczny->inkubacja->wybarwienie błony->badanie dystansu przebytego przez kom. *test migracji fagocytów pod agarozą w zelu agarowym na płytce Petriego wycinamy 3 studzienki, w srodkowej zawiesina badanych komórek, prawej czynnik chemotaktyczny a w lewej płyn hodowlany-> inkubacja-> utrwalenie-> barwienie-> pomiar drogi komorek do czynnika chemotakt. W stosunku do migracji swobodnej. Wynik podajemy indeks chemotaktyczny(IC) -metody badania fagocytozy (indeks fagocytarny IF)do probowki zawiesinę badanych kom. i cząstek fagocytarnych (np. bakterii, erytrocytow, lateksu) w proporcji 1:6, mieszamy, inkubujemy, odwirowac i zrobic rozmaz, utrwalić, wybarwic-pod powiekszenie 1000x,liczymy IF=liczba cząsteg sfagocytowanych /liczba komorek fagocytujących, metoda jest czasochłonna dlatego czesciej stosujemy czastki fagocytarne znakowane fluoresceiną lub pierw. promieniotwórczym, lub ocena na podstawie pomiaru ciepła produkowanego przez fagocytujące granulocyty -metody oceny metabolizmu wewnątrzkom fagocytów *test pochłaniania i redukcji NBT-odczynnik NBT= błękit nitrotetrazolinowy w r-rze o barwie zołtej. Łatwo przenika do komórki w trakcie fagocytozy i redukuje się do ciemnogranatowego farmazanu.W zawiesinie kom niepobudzonych odsetek kom redukujacych NBT wynosi 7-8% a pobudzonych 85%. R-ę oceniamy mikroskopowo lub met spektrofluorometryczną. ZAST. w diagnostyce przewlekłej choroby ziarniakowej *tech chemiluminescencji-oparta na pomiarze emisji swiatła przez fagocyty w czasie wybuchu tlenowego,metoda droga,rzadko stosowana Test transformacji blastycznej limfocytów Transf. blastyczna to przechodzenie limfocytów dojrzałych w formy niedojrzałe(blasty) pod wpływem stymulacji (in vivo antygenem, in vitro antygenem lub lektynami) Najcześciej stosuje się oczyszczoną tuberkulinę, anatoksyne tężcową/błoniczą, LPS, surowice antylimfocytarne i antyimmunoglobulinowe, spośród lektyn:fitohemaglutyninę, konkanawalinę A(proliferacja limf.B i T) i mitogen szkarłatki(transformacja limf.B).In vitro stos. do oceny funkcji limf.B iT, pozwala określić ogolny stan czynnościowy limfocytów i wykryć ogolne defekty ukł.immunolog. zaleznie od wad jego komórek. Przeprowadza się go w izolowanej frakcji limfocytów. Zawiesinę limfocytów inkubujemy w srodowisku lektyny, jednoczesnie hodowle kontrolne bez czynnika mitogennego. Ocena odsetka komórek transformujących metodą -morfologiczną- barwiony rozmaz ogladamy pod mikroskopem, kom.blastyczne są 2-4xwieksze od limfocytów i maja duze wyrazne jądro o luznej strukturze chromatynowej,oceniamy liczbę blastów na 500 lub 1000kolejnych komórek i obliczamy indeks blastyczny wg wzoru: x=a/b x 100%. W kontroli odsetek kom. niestymulowanych to max 7% - izotopową: czuła i dokładniejsza, oparta na pomiarze inkorporacji radioaktywnie znakowanych prekurosrow kw. nukleinowego (np. tymidyny) lub białek (np. leucyny)->pomiar radioaktywnosci/ met autoradiografii. Zawiesina limfocytów+czynnik mitogeny->inkubacja, rownolegle kontrola. Do obu dodajemy znakowaną tymidynę-> inkubacja_> przeniesienie hodowli na krążki bibuły->suszymy-> przeniesc do płynu scyntylacyjny i obliczamy indeks stymulacji wg wzoru IS=c.p.m w hodowli stymulowanej/ c.p.m w hod.niestymulowanej Tech immunomorfologiczne pozwalają wykryć obecnosc przeciwciała lub antygenu zwiaz. bezposr. b kom lub tkanką. Zast:wykrywanie obecnosci antygenow nowotw. na kom, antygenow pasozytow w zakazeniach, antygenow bakterii i wirusow w zak,okresleniu typu Ig i antygenow roznicowania kom. imfoidalnych w zesp.limfoproliferacyjnych, roznicowanie nowotworow o niejasnym pochodzeniu- techniki immunofluorescencyjne (IMF)nie wymaga utrwalenia materiału, do znakowania reagentu stosuje się barwniki fluorescencyjne(FITC lub RITC) Znakowane przeciwciała inkubuje się z badanym materiałem-ogladamy preparat w mikr.fluorescencyjnym (met.jakościowa) lub mierzy intensywnosc fluorescencji (met.ilosciowa). IMF można przeprowadzić w reakcji: bezpośredniej / posredniej(b.czuła) / dwubarwnej immunofluorescencji tech immunoenzymatyczne (EIA) 1*PAP reakcja peroksydaza-antyperoksydaza: b czuła i często stosowana, jakosciowa do wykrycia obecnosci roznych antygenów w tkankach. Wykonanie:inkubacja materiału z przeciwciałami-tworzenie kompleksu antygen-przeciwciało, przyłączenie kompleksu peroksydaza-antyperoksydaza za pomocą tzw mostka. Dodac H2O2 i chromagen-oceniamy poszukiwany antygen 2*APAAP reakcja fosfataza alkaliczna- antyfosfataza alkaliczna, wykonanie podobnie jak PAP ale dla zahamowania reakcji fosfatazy endogennej dodajemy lewamizol . DO wykrywania antygenów w tkankach, złogi barwnego produktu są drobnoziarniste i dobrze obecne w mikr.świetlnym 3*ABC reakcja kompleksu antygen tkankowy- przeciwciało pierwotne-przeciwciało wtórne biotynylowane z kompleksem awidyna-biotynylowana peroksydaza. Jest ostatnim etapem reakcji przy uzyciu układu biotyna-awidyna. Przebieg reakcji ocenia się na podstawie aktywnosci peroksydazy w reakcji enzymatycznej. Metoda jakosciowa do wykrywania obecnosci antygenow tkankowych Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) w biologii molekularnej do sekwencjonowania, mapowania DNA i w filogenetyce molekularnej. Zasada: DNA+polimerazy termostabilne+ startery->do termocyklerow tu pod wpływem zmian temp nastepuje rozplatanie ici DNA, przylączaie starterow i namnazanie tego DNA, podobnie z RNA Cytofluorymetria przepływowa nowoczesna technika badawcza służąca do wieloparametrowej oceny komórek znajdujących się w zawiesinie. Rownoczenie można je sortowac na frakcje. Dzięki niej można okreslic:liczebnosc poszczegolnych populacji komórek w badanym materiale,cechy morfologiczne badanych komórek,stan czynnosciowy komórek. Np. przy monitorowaniu stanu ukł.immunol. w trakcie choroby i leczenia. Dokładna i wieloparametrowa.
CYTOKINY- białka, polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej, odpow za komunikację między kom i narządami. IL, chemokiny, interferony, TNF, czynnik wzrostu. Sposób działania: jedna cytokiny może być produkowana przez wiele typów komorek, dana cytokina może być produkowana przez dana kornorke w odpowiedzi na rozne sygnaly, dany bodziec może indukować synteze roznych cytokin, dana cytokina działa na rozne kom i wywołuje rozne efekty (PLEJOTROPIA), rozne cytokiny, działając na ta sama kom, wywolują taki sam efekt (Redundancja), odpowiedz kom na dana cytokine zalezy od jej stanu czynnościowego, odpowiedz kom na dana cytokine zalezy od stężenia cytokiny, cytokiny działają wspolnie (synergistycznie lub antagonistycznie), cytokiny działają autokrynowo IL-1 reguluje przebieg odp immunologicznej i reakcji zapalnej, źródło: wszystkie kom; czynniki indukujące: LPS, egzotoksyny, peptydoglikany, wirusy, grzyby, IFNy,TNF,C5a, działanie: granulopoeza (kom pnia), synteza przeciwciał (limf B), proliferacja (limf T), synteza cytokin (limf T), chemotaksja (neutrofile) IL-6 gł cytokina regulująca mechanizmy obronne: odpowiedz immunologiczna, reakcja zapalna; krwiotworzenie; Czynniki indukujące: IL-1, TNF, IFN, wirusy; działa na: kom pnia (stymulacja krwiotworzenia), hepatocyty (synteza baiłek ostrej fazy), limf B (synteza przeciwcial), keratynocyt (proliferacja), limf T (powst limf Tc); silny induktor hepatocytów do syntezy białek ostrej fazy.TNF (kachektyna) cytokina regulująca odpowiedz zapalna i immunologiczna; czynnik indukujący: LPS; dziala na: kom nowotworowe indukując apoptoze, hepatocyty (synteza białek ostrej fazy), makrofagi (synteza cytokin, chemotaksja), NK (wzrost cytotoksyczności), kom tłuszczowe (hamowanie lipazy lipoproteinowej i syntezy lipidów), limf T (synteza cytokin), limf B (proliferacja i różnicowanie) interferony: αβκω prod przez leukocyty, fibroblasty i keratynocyty; γ- prod przez limf T i kom NK; bodziec-Zakazenia wirusowe! Dzialanie: przeciwwirusowe, aktywacja kom NK i limfocytow Tc, wzmaganie cytotoksyczności makrofagów, wzmaganie zdolności fagocytarnej makrofagów, wzmaganie ekspresji czasteczek MHC, indukcja syntezy wielu cytokin, IL-8 reguluje funkcje neutrofilów, chemotaksja, wzmaga procesy oddechowe, powoduje degranulacje, aktywuje uwolnienie enzymów lizosomalnych, wzmaga ekspresje receptorów dla składników dopełniacza, wzmaga działanie cytotoksyczne, Chemokiny- małe cytokiny, rola: działąnie chemotaktyczne, działaja na: neutrofile, eozynofile, bazofile, monocyty, makrofagi, kom tuczne, limf T i B. regulują ekspresję cząsteczek adhezyjnych i w ten sposób wpływają na kolejnosć napływu kom do miejsca zapalenia FAGOCYTOZA- neutofile, makrofagi, kom tuczne. Rozpoczyna się od rozpoznania patogenu, nastepnie napływ kom fagocytujących. Czynniki chemotaktyczne dla neutrofili i makrofagów: c5a c3a, IL-8, TNF, LTB4, PAF, defensyny, fMLP czynniki dla kom tucznych- c5a c3a IL-8 defensyny RANTES. Następuje aktywacja kom cz.endogenne: IFN TNF IL8, cz.egzo: LPS, dipeptyd muramylowy, fMLP. Nastepuje związanie patogenu w tym związanie igG c3b. nastepuje pochłonięcie patogenu endocytoza z wytworzeniem gfagolizosomu. Nastepuje zabijanie wewkom 1.tlenowe- : wybuch tlenowy: synteza RFT: mech.tlenowe: anionorodnik ponadtlenowy, nadtlenek wodoru, rodnik hydroksylowy, tlen singletowy Aktywnosc mieloperoksydazy: kw.podchlorawy i chloraminy 2. Pozatlenowe- enzymy degradujace białka (elastaza, proteaza),enzymy degradujące lipidy (lipazy,fosfolipazy), defensyny, lizozym, laktoferryna skuteczność fagocytozy- unikanie rozpoznania np. osłonka paciorkowców, unikanie związania np. białko A S.aureus wiaze przeciwcialo fr.Fc, hamowanie fuzji fagosomu i lizosomunp Salmonella, ucieczka z fagolizosomu np. Listeria Defekty fagocytozy: zespół LADI i LADII (ograniczona migracja) zespół Chediaka i Higashiego (ograniczona zdolnosc do zabijania wewkom), przewlekła choroba ziarniakowa (jw.) SZCZEPIONKI: immunomodulacja i jej rodzaje 1.immunostymulacja: prewencja i leczenie chorób zakaźnych (szczepienia), leczenie chorób nowotworowych, leczenie niedoborów odporności. 2.Immunosupresja: przeszczepy, leczenie chorób autoimmunologicznych cele szczepienia: wytworzenie indywidualnej odporności wobec określonego drobnoustroju, wyelimionowanie drobnoustroju ze środow w którym żyje człowiek, ochronny efekt szczepień: wywołanie fizjolooicznej odpowiedzi immunologicznej z wytworzeniem: odpo humoralnej, odporności kom, kom pamięci (B i T) inaktywacja- zabicie patogenu, adiuwant: sub o właściwościach nieswoistego modulatora: sole glinu i wapnia, toksoid czyli nieaktywna forma toksyny (anatoksyna) anatoksyna (toksoid): nieaktywna forma toksyny rodzaje: swoiste- Stymulują trwałą odpowiedź immunologiczną przeciw określonemu. Nieswoiste- stymulujące niespecyficzną odporność w nawracających lub przewlekłych zakażeniach o różnej etiologii (np. autoszczepionki) podział szczepionek swoistych: 1.ze wzg na ilość gatunków lub typów antygenów: monowalentne (jednoważne), poliwalentne (wieloważne)- kilka typów tego samego gat patogenu, np. grypa, skojarzone- kilka gat patogenu np. DIPERTE-> błonnica, krztusiec, tężec. 2.ze wzg na rodzaj antygenów: a)zawierające żywe drobnoustroje: naturalne- poch od zwierząt np. BCG-prątek gruźlicy; atenuowane- świnka, różyczka, odra. b)zaw martwe drobnoustroje: bakterie (dur brzuszny, krztusiec, holera); wirusy (WZW A, wścieklizna). c)zaw izolowane antygeny kom: polisacharydy otoczkowe (pneumokoki, meningokoki); antygen powierzchniowy (WZW B); neuraminidaza i hemaglutynina (grypa). d)zaw toksoid: toksoid tężcowy, błonniczy, krztuśćcowy (szczepionka bezkom) szczepionki zawierające żywe atenuowane drobnoustroje: przejściowe namnażanie się żywych drobnoustrojów, zwiększona dawka i wydłużony czas obecności antygenów, szeroki zakres odpowiedzi komórkowej i humoralnej, zwykle wystarcza pojedyńcza dawka, możliwość powrotu drobnoustrojów do formy w pełni zjadliwej szczepionki zawierające inaktywowane (martwe) drobnoustroje: mniejsza immunogenność (zdolność do wywołania swoistej odpowiedzi immunologicznej), zwykle większa liczba dawek, bezpieczniejsza, PWSK do szczepień: stan obniżonej odporności, leczenie immunosupresyjne po przeszczepie, defekty immunologiczne preparaty immunoglubulinowe: gotowe przeciwciała, zwykle klasy IgG, podawane dożylnie, domięśniowo, antytoksyna preparat immunoglobulin skierowanych przeciwko danej toksynie, np antytoksyna błonicza, tęzcowa, otulinowa, jadu węża, probiotyki - żywe organizmy, które mogą wywierać korzystny wpływ na organizm poprzez poprawę równowagi mikroflory jelitowej np. L. acidophilus, L.casei, Bifidobacterium (bifidum) działanie: konkurowanie z bakteriami patogennymi o receptory na komórkach nabłonkowych, wytwarzanie związków o działaniu przeciwbakteryjnym i przeciwwirusowym, współzawodniczenie z innymi mikroorganizmami o składniki odżywcze, zakwaszenie treści jelitowej przez co hamowany jest wzrost niektórych bakterii chorobotwórczych, wzmacnianie mechanizmów odporności w obrębie błon śluzowych, BCG (atenuowany szczep prątka bydlęcego gruźlicy) jako immunostymulator; Działanie- aktywacja monocytów i makrofagów, Zastosowanie- terapia raka pęcherza moczowego, Broncho-vaxom -Lizaty bakteryjne (m.in. Streptococcus pneumoniae, pyogens) -Działanie- pobudzenie odpowiedzi nieswoistej, -Zastosowanie- przewlekłe zakażenia górnych i dolnych dróg oddechowych, Echinacea Wyciąg z jeżówki, Pobudzenie makrofagów, Zast: profilaktyka i terapia wspomagana infekcji górnych dróg oddechowych, hormony grasicy; peptydy grasice,- dojrzewanie limfocytów T, zastosowanie w przewlekłym WZW B. niedoborach odpo Immunosupres glikokortykosteroidy (GS) zw przeciwzapalne syntetyzowane pi-zez kore nadnerczy, działanie: upośledzenie prezentacji APC, hamowanie aktywności fagocytarnej i bakteriobójczej makrofagów, zastosowanie: choroby autoimmunizacyjne. zapobieganie odrzucaniu przeszczepów, cyklosporyna (CsA) antybiotyk, działanie- hamuje proliferacje limfocytów T, pośrednio hamuje wytwarzanie przeciwciał i aktywacje makrofagów, zastosowanie- odrzucanie przeszczepów, przeciwciała blokujące struktury pow kom anty-CD3, anty-CD4, anty-CD 18, działanie- blokowanie struktur powierzchniowych komórek immunologcznych, co uniemożliwia ich wzajemne interakcje, zastosowanie: leczenie ostrego odrzucanie przeszczepu, AUTOIMMUNIZACJA przełamanie tolerancji na własne antygeny. Autoantygeny: struktury błonowe własnych kom, elementy cytoplazmatyczne jądra kom, substancje wytwarzane i wydzielane przez własne kom. Czynniki pow zniesienie autotolerancji 1. Czynniki endogenne: cząst MHC, nadprodukcja cytokin (IL 12, 15, 18), hormony płciowe. 2. egzogenne: uraz fizyczny, termiczny, zapalny (destrukcja narządów, tkanek, kom, masowe wyrzucanie składników kom, autoimmunizacja) infekcje wirusowe i bakteryjne (reakcje krzyżowe - wirus, bakteria miał składniki kom podobne do naszych własnych antygenów, powstają przeciwciała, efekt adjuwantowy- nadmierne częste infekcje, pobudzony układ imm) Rola IFN w autoimmunizacji: wzrost ekspresji cząst MHC1 MHC2, stymulacja wytwarzania IgG, akt kom NK, akt APC do wytw IL 12, akt limfocytów CD8+, obróbka i prezentacja antygenu przez APC, wzrost akt proteaz wewkom, aktywacja makrofagów i fagocytozy. Mechanizmy efektorowe w ch. autom. Humoralne (przeciwciała), komórkowe (Th1, Tc, makrofagi, kom dendrytyczne). Podział ch. Autom. Ze wzg na umiejscowienie antygenu: narządowo - swoiste (cukrzyca typu 1, ch. Hashimoto) układowe (toczeń układowy rumieniowaty) NIEDOBORY ODPORNOŚCI: wzrastają predyspozycje do zakażeń bakt., wirusowych, grzybiczych i nowot, wzrost częstości ch. Autom. 1. SCID - ciężki złożony niedobór odporności, 1 : 50 000, brak lub znaczny niedobór limf T, rzadziej brak limf T i B, długotrwałe infekcje trudne do leczenia 2. Zaburzenia ekspresji cząst MHC, zespół nagich limf, obniżona ekspresja lub brak cząst MHC II rzadziej MHC I, brak odpowiedzi swoistej, leczenie przeszczep szpiku 3. CVID - pospolite zmienny niedobór odb, 1:10 000, upośledzone przekazywanie sygnału z limf T do limf B, brak produkcji przeciwciał, często ujawnia się w 2 - 3 dekadzie życia. 4. Niedobór IgA, 1:500, zaburzone przełączanie klas w limf B, zmieniona odporność w obrębie bł. Śluzowych, ciągłe pleśniawki, afty, inf. Bakteryjne, bakteryjne choroby płuc. 5. Zespoły LAD, 1:100 000 LAD I - dysfunkcja integryn, LAD II - dysfunkcja selekty, upośledzenie przechodzenia kom z naczyń do tkanek, częste zapalenie dziąseł. 6. Zespół hiper - IgE, zespół Joba, defekt limfocytów Th1, zaburzone wytw IFN, normalnie wzrost stężenia IgE( alergie ,robaczyce), cecha charakterystyczna (późniejsze wypad zz mlecznych, przewlekłe kanddozy jamy ustnej) 7.niedobory składowych dopełniacza, niedobór C3. 8. Przewlekła kandydoza śluzowo - skórna, znacznie spada odpowiedź limf Tna C. Albicans 9. Przewlekła ch. Ziarnieniakowa, zaburzony mech zabijania wew kom 10. Nabyty zespół niedoboru odporności AIDS, receptorem dla wirusa HIV jest struktura CD4, niszczenie limf Th NOWOTWORY - funkcja nadzorcza niszczenie kom, które mogą być źródłem powstawania nowotworu, układ odp działa gdy kom patologiczne już są. Częstość nowotworów wzrasta u: osób z niedoborami odporności, poddanych przewlekłej immunosupresji, nosicieli wirusa HIV układ odp rozpoznaje kom patologiczną przez: zmienioną ekspresję cząst MHC I, obecność antygenów związanych z nowotworem - TAA - poziom wyższy niż w wart fizjologicznych, obecność antygenów nowotworowych swoistych - TSA - fizjologicznie nie występują TAA 1. Antygen karcyno - embrionalny CEA, rak j. grubego, trzustki, żołądka, wątroby, płuc. 2. Antygen CA 125, rak jajnika, trzustki, płuc 3. Antygen swoisty dla gruczołu krokowego PSA, rak gruczołu krokowego 4. Alfa - feto proteina - AFP, rak wątroby, jądra mechanizmy obronne: kom NK, swoiste p-ciała anty-TAA, limf Tc, Th1, makrofagi, neutrofile, eozyno file. Inne mech dział w trakcie obrony p-now: stymulacja proliferacji fibroblastów, stymulacja proliferacji kom nowotworowych, stymulacja i hamowanie andiogenezy mech ułatwiające rozwój now: selekcja immunologiczna (kom nowotworowe rozpoznawane są przez układ odpornościowy, ale niszczone są te słabe, te silniejsze pozostają, dochodzi do ich rozplenu, tworzy się klon kom now, które nie są już rozpoznawane przez ukł odp) ułatwienie immunologiczne ( 1.blokowanie limf efektorowych przez wolne TAA, limf nie działają na kom now bo zablokowane są one przez TAAi limf nie ma jak się przyłączyć 2. Mostkowanie TAA na kom now przez przeciw ciała nie wiążące dopełniacza, przeciwciała wiążą się z TAA ale nie aktywują dopełnia cza i blokują przyłączenie przeciwciał, które aktywują dopełniacz) funkcja homostatyczna współpraca i współzależność układów odp, nerwowego, endokrynnego. Komórki biorące udział w mech obronnych mają receptory dla neuroprzekaźników i neuromediatorów, dotyczy to gł limf T. zakończenia nerwowe tworzą synapsy z niektórymi kom biorącymi udział w reakcjach odp (limf, makrofagi, kom tuczne). Limf makrofagi w pewnych warunkach wydzielają opioidy. Cytokiny wywierają efekt na kom OUN regulując jego funkcje. Nuropeptydy wpływają i regulują funkcje kom aktywych w procesach obronnych. Funkcja obronna : 1. Skierowana przeciwko wirusom, leczenie tylko objawowe, chorujemy tak długo dopóki ukł odp nie zeżre wirusa. 2. Bakteriom - zależy od rodzaju, zjadliwości, drogi wniknięcia bakterii, stosujemy antybiotyki bo ukł odp nie zwalczy nam bakterii. 3. Grzybom - ukł odp rozwija odporność przeciw grzybom ale jest ona mało skuteczna bo grzyby mają bardzo grubą ścianę kom i kompleks MAC nie niszczy kom grzyba. Rysunek 1. NK, TCR - pierwsza linia obrony, niszczą na drodze cytotoksyczności kom przy pomocy perforyny, granzyny. Gdy kom patologiczne rozpoznane są wcześnie i jest ich mało to ten mech wystarcza do ich neutralizacji 2. TAA w płynie ustrojowym - te antygeny mogą być prezentowane przez APC w kontekście MHC1, wytworzenia efektorowych Tc, zabicie kom now na drodze cyt kom. 3. Limfo Th2 kooperują z limf B - powstające przeciwciała anty-TAA wiążą się z błoną kom nowotworowych, powstaje kompleks immunologiczny: a) dopełniacz - MAC - zniszczenie kom now b) kompleks imm + NK , makrofagi eozyno file - ADCC c) kompleks imm + makrofagi, neutrofile - fagocytoza lub frustracja - wytwarzanie enzymów przez neutrofile - liza kom now 4. Rozwój efektorowych limf Th1 - produkcja IL2 - silna aktywacja kom NK i limf Tc IFN aktywuje kom NK, aktywuje przejście limf Th w Th1, hamuje powstawanie limf Th2, aktywuje makrofagi, neutrofile do wyrzucenia enzymów i reaktywnych form tlenu - zabijanie kom now WIRUSY bariery anatomiczno fizjologiczne, działanie interferonów nie zabijają wirusów, hamują replikację wirusa, aktywują w kom nie zaktywowanych stan gotowości przeciw wirusowej, wzmagają aktywność cytotoksyczną kom NK, wzmagają aktywność cytotoksyczną i fagocytarną makrofagów, stymulują wytwarzanie przez makrofagi NO, zwiększają ekspresję cząsteczek MHC1 i 2, wzmagają aktywność cytotoksyczną limf Tc mechanizmy nieswoiste kom NK (wzbudzone IFN, liza kom zakażonej wirusem) lim TCR (niszczą kom na drodze cytotoksyczności) dopełniacz (droga alternatywna, niszczenie kom zakażonej wirusem) mechanizmy swoiste 1 limf Th1 aktywują makrofagi do fagocytozy i cytotoksycznośći (ROS i NO) - odp kom późna, 2 limf Tc - zwiększona ekspresja cząst MHC1 (IFN) powstanie limf Tc - zabicie na drodze cyt kom, 3 wzrost ekspresji cząst MHC2, 4 prezentacja antygenów wirusowych, 5 produkcja przeciwciał rola przeciwciał 1 tworzenie kompleksów z wolnymi przeciwciałami, efekt blokowania wiązania wirusa do kom 2. Aktywacja dopełniacza prze kompleks wirus - przeciwciało, uszkodzenie otoczki wirusa 3. Przeciwciałą wiążą się do epitopów wirusa na błonie kom, aktywacja dopełniacza drogą klasyczną lub uruchomienie reakcji ADCC liza kom zakażonej wirusem obrona wirusów przed rozpoznaniem i zniszczeniem: zmienność antygenowa, wytwarzanie białek hamujących transport cząst MHC1 z ap Golgiego na błonę kom - nie ma odpowiedzi kom i powstania lim TC, hamowanie aktywności interferonu przy pomocy produkcji pewnych enzymów - wirus opryszczki.
immunoglob: -4łańcuchy 2 lekkie(L) i2ciężkia(H) połączone wiąz. dwusiarczokwymi -Część zmienna łańcucha (V) lezy w odcinku N-koncowym(gr.aminowe) i czesc stała© w odcinku C-koncowym -Fragmenty: Fab(2,zaw.miejsca wiazace antygen-paratop dopasowany przestrzennie do determinanty antygenowej czyli epitopu) i Fc (aktywacja dopelniacza i wiazanie z komorkowymi rec.dla przeciwciał) - W sumie domeny VL,CL i VH CH1 CH2 CH3(czasem CH4)+dodatkowy ogonek(w IgA igD IgM) -Region zawiasowy z wiac.dwusiarczkowym(brak u IgE), odp.za ruchliwosc ramion Fab i ich ustawienie pod roznym katew względem siebvie i fr. Fc Immunoglobuliny jako receptory kom-są integralną czescią dziewiczych limf.B zakotwiczone w blone i cytopl. Stanowia rec.antygenowy limf B np.IgM IgD IgD -monomer do1%w surowicy, łancuch ciezki typu δ (Cδ1 Cδ2 Cδ3)+ogonek sporo reszt cukrowych, jest rec na limf.B dziewiczych, dlugi region zawiasowy; jest rec kom limf B (BCR) bierze udział w rozpoznaniu antygenu w rozwoju swoistej odp. humoralnej IgE rola w mech.obrony p/pasozytniczej, łanc.ciezki typu ε, domeny ε1,2,3,4 odp.za nadwrazliwosc typu 1(nadmierna aktywnosc ukl. odpornosciowego, jej nadprodukcja, brak jej w surwicy) receptory dla niej na kom. Tucznych, mały region zawiasowy IgG az 80%, zawsze monomer, lancuch ciezki typu γ 1,2,3 (roznia się tez regionem zawiasowym analogicznie 2,4,11, 2 wiazania dwusiarczkowe) przechodzi przez łozysko, syntet. W odp. Na zak. bakteryjne, wirusowe i grzybicze; ulatwia fagocytozę, aktywuje dopełniacz, indukuje reakcję ADCC IgM pentamer, heksamer (w zak bakteryjnych) lub monomer w limf Tc, łancuch H ma 4 domeny (Cμ1,2,3,4)+łancuch jonizujący J(brak go w formie heksametru), w chorobach- toczen trzewny, jest rec w limf.B (syntetyzowana w odpowiedzi na zak bakteryjne,grzyb i wir.), silniej reaktywuje od IgG, do tej klasy naleza przeciwciała A,B,0 IgA w surowicy 13%; org syntetyzuje jej 3x więcej niż IgG; wyst w mleku matki, wydzielinach ukł rodnego, ślinie, pocie, łzach; monomer, dimer, tetramer; 2 podklasy IgA1- b.długi region zawiasowy, enzymy proteolityczne niszczą region zawiasowy, IgA2- krótszy region zawiasowy; w surowicy gł IgA2-dimer, łańcuch wiążący I, fragment wydzielniczy który wiaze 2 podjednostki ułatwia przechodzenie przez nabłonek umożliwia przyczepianie się do bł śluzowej tej IgA2; IgA odpowiada za odporność przeciwbakteryjną, przeciwwirusową o przeciwgrzybiczną w obszarze bł śluzowej i płynów ustrojowych (ślina) Pierwotne niedobory odpornosci z przewagą zaburzen biosyntezy Ig-wrodzone zaburzenia w okresie dojrzewania i roznicowania limfB Ukł dopełniacza-to element odpornosci wrodzonej humoralnej,stanowi dopełnienie roli przeciwciał, w jego skład wchodzi ok. 30 białek Cz aktywujące droge klasyczną -kompleksy antygen-przeciwciało Ag-Ab (IgM i IgG1-3), niektóre bakterie,wirusy, białko CRP, składowa C1q Kompleks MAC-kompleks atakujący błonę i prowadzący do lizy kom C5b678(9)2, tworzy kanał o ok9nm Cz aktywujace droge lektynową-niezalezna od przeciwciał, białko ostrtej fazy MBL (aktyna wiążąca mannozę, z tej samej rodziny co C1q,reaguje z mikroorganizmami i proteinazami MASP1 i 2 Cz aktywujace droge alternatywną bakterie G- i G+, pierwotniaki, wir i kom zak.wirusami, grzyby, pasozyty, kom nowotworowe, niezalezna od przeciwciał Niedobór C3: wzrost podatnosci na zak. Bakteriami otoczkowymi (np. H.influenzae), współistnienie chorób o podłozu autoimmunizacyjnym (np. kłebuszkowe zap.nerek Kom NK naturalna cytotoksycznosc kom, populacja duzych ziarnistych limf. (LGL), duze jądro,duzo ziarnistosci cyt.(perforyna i granzymy) markery CD3- CD16+ CD56+ lokalizacja: krew, watroba, sledziona, wezły chłonne. ↑aktywnosci:IL2 IFNα IfNβ IL12, wysiłek fiz. Dieta beztłuszczowa. ↓aktywnosci:PgE2, oddawanie krwi, stres. Etapy reakcji nat.cytotoksyczności komorkowej: rozpoznanie kom docelowej przez kom NK, aktywacja kom.NK i programowanie do lizy, degranulacja kom NK,niszczenie kom docelowej Rozpoznanie kom to 1etap reakcji naturalnej cytotoksycznosci kom, kom zaraznona lub patologiczna nie wykazuje ekspresji czasteczek MHC I-rec hamujący nie spotyka swojego ligandu (MHCI), przewaga aktywacji, zblizenie ziarnistosci, degranulacja perforyni granzymow proces cytotoksyczności kom z udzialem perforyny zawartość ziarnistości kom NK (razem z granzymami) rola granzymów proteazy serynowe, rozkładają proenzymy z rodziny kapsaz- indukcja apoptozy komorki, reakcja ADCC cytotoksyczność kom zależna od przeciwciał; na pograniczu wrodzonej i nabytej,1.kom NK, makrofagi, monocyty, neutrofile eozynofile, trombocyty, subpopulacja limfocytów T,2. receptor Fc dla Ig:FcyR- IgG (IgGI i IgG3)FceR II- dla IgE (eozynofile, trombocyty, makrofagi) odp nabytej 1. mech humoralne- przeciwciała klas (G, M, A, E), mechanizmy komórkowe- limf. T (Tc i Th) i B 2. etapy rozwoju odporności nabytej: a ) rozpoznanie wroga i jego prezentacja (cząsteczki MHC- obecne w błonie komórek organizmu) b) przekaz inf. o wrogu (receptor TCR- obecny w błonie limfocytów) c) decyzja o kierunku odpowiedzi swoistej (typ cząsteczki MHC- populacja e) limfocyt T- cytokiny i cząsteczki adhezyjne) f) rozwój odp. swoistej (pobudzenie limf. B-+ produkcja przeciwciał; powstanie limf. T (Tc, Th) 3 rozwija się powoli (z udzialem limf B, T i APC) 4 jeden główny mech 5 może prowadzić do autoagresji, 6 niezwykle skuteczna 7 pamięć immunologiczna rodzaje odp humoralna (z udziałem swoistych przeciwciał), komórkowa i z udzialem limfocytów Tc, odpowiedź z udzialem limf Th (pózna) rozwój i dojrzewanie limf B- w szpiku kostnym! 1 w ich rozwoju bierze udział IL-2 2. dojrzewanie: powstanie limf proB-> ekspresja cząsteczek MHCII i CDI9-->w cytoplazmie pojawia się ciężki łańcuch pi -->niedojrzały limf. B (posiada receptor błonowy IgM)- dojrzały, limfocyt B (MHCII, CD19, CD21*, CD23*, receptor błonowy IgM i IgD) 3. *CD21 i CD23 określają dojrzałość limfocytów B .rec BCR receptor immunoglobulinowy limfocytów B; związanie go z antygenem stanowi I sygnał w aktywacji limfocytów B- ma kluczową rolę w rozwoju odpowiedzi nabytej, limf B pamięci długo żyją , liczne, maja więcej cząsteczek MHC II, łatwiej ulegają aktywacji charakterystyka limfocytow TCR γ,δ ( subpopulacja CD4-, CD8- ) rozpoznanają antygeny bez udziału czasteczek MHC, wykazują zdolność cytotoksyczności komórkowej naturalnej i z udziałem przeciwciał ( ADCC ), biorą udział w odporności p/bakteryjnej, wirusowej i nowotw. subpopulacja, rola limfocytów Th1 Th2 Th1 ( udział w odp typu komótkowego, późnego ) Th2 ( typu humoralnego, wspomaganie limf B ) Tc ( udział w odp typu komórkowego, cytotoksycznego ) gł rola cz MHC główny kompleks antygenów zgodności tkankowej, wybitny polimorfizm genów w obrębie MHC, wiązanie i prezentowanie antygenów limfocytom T, podzial cz MHC na klasy: klasa 1- na pow. wszystkich kom. jądrzastych (w niewielkiej ilości również na erytrocytach); klasa II- na limfocytach B, makrofagach, kom dendrytycznych,Langerhansa, nabłonkowych grasicy, Lokalizacja kom cz MHC I na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych (w niewielkiej ilości również na erytrocytach), zakotwiczone w błonie komórkowej, lokalizacja cz MHC II TRADYCYJNE KOM APC limfocyty B, makrofagi; kom dendrytyczne; w wyniku aktywacji IFNy pojawiają się również na innych kom: neutrofile, monocyty, 'kom tuczne; kom nabłonka, kom śródbłonka, zakotwiczone w błonie komórkowej, budowa cz MHC' klasy 1: 2 łancuchy: lekki (a, składa się z 3 domen-al, a2, a3 tworzących pętle, cechuje je duża zmienność) i ciężki (B2mikrogłobulina. identyczna we wszystkich cząsteczkach tego typu), połączone niekowalencyjnie, Lańcuchy układają się, tworząc rowek, którego dno stanowi struktura pofałdowanej kartki, który jest miejscem lokowania się prezentowanych limf. T antygenów, budowa rowka wiążącego antygen: 8 pasm B tworzy dno rowka, Od góry 2 helisy a, Kieszonki kotwiczące antygen, do których przyłączają się aminokwasy- 6(A-F; BiE najważniejsze)- w nich zakotwiczony jest antygen, budowa cz M HC klasy 11: 2 łańcuchy a i B połączone ze sobą niekowalencyjnie, mające podobną budowę, Domeny zewnętrzne (a1 i B1 ) obydwu łańcuchów tworzą rowek, Dno rowka: 8 przeciwbieżnie ułożonych pasm (B, a jego brzegi) i przez 2 helisy a, 6 kieszonek, antygeny od kilkunastu do ponad 20 aminokwasów antygeny prezentowane przez cz klasy I antygenu kilku-aminokwasowe: 8-11, endogenne (z wnętrza kom APC) przetwarzanie antygenów endogennych przetwarzanie antygenu w połączeniu z MHC I; bakteria-> endocytoza-> fagosom-> fagolizosom-> degradacja antygeny prezentowane przez cz klasy II antygeny 12-25 aminokwasów (dłuższe niż MI-IC 1), egzogenne cząst CD1 budowa podobna do MHC l, rowek wiążący antygen jest hydrofobowy, występują na tradycyjnych APC, prezentują antygeny o charakterze lipidów i glikolipidów, przetwarzają endogenny antygen z udziałem endosomów, HLA ukł wybitnie polomorficzny, geny kodujące HLA -chromosom 6 koduje cząsteczki MHC I i II rodzaje cz HLA klasy 1 HLA-(A-G) rodzaje cz HLA klasy II HLA-DP, -DQ,-DR cz H LA klasy III obejmuje skł dopełniacza: C2, C4 i czynnik B, HLA a wystepowanie chorób u człowieka: ryzyko wzrostu rozwoju choroby: Zesztywniające zapalenie stawówka kręgosłupa HLA-B27, Celiakia HLA-DR3 , łuszczyca HLA-B13, RZS HLA-DR4 ryzyko spadku zachorowania na: RZS HLA-DRB 1, Malaria HLA-B53, Rak jądra HLA-B8 polimorfizm HLA wybitnie polimorficzny układ, kompleks genów w 6 chromos. obejmuje ponad 4 mln par zasad i 100 genów, słabe antygeny zgodności tkankowej heterogenna grupa peptydów, kodujące je geny rozrzucone po całym genomie, indukują silną odp. transplantacyjną, antygeny zgodności tkankowej nie kodowane przez MHC, etapy rozwoju odp nabytej: rozpoznanie wroga i jego prezentacja, (cz MHC), przekaz informacji o wrogu (receptor TCR w błonie limf T), decyzja o kierunku odp swoistej, rozwój odp swoistej (pobudzenie limf B-produ kcja przeciwciał i limf T->powstanie limf Tc i Th charakterystyka odpowiedzi nabytej humoralnej końcowym celem odp humoralnej jest wytworzenie swoistych przeciwciał, współuczestniczą APC, limfocyty Th2, limfocyty B, a w końcowym etapie kom plazmatyczne, przebieg aktywacji iimfocytów B I sygnał: związanie antygenu przez receptory immunoglobulinowe limf. B (BCR), II sygnał wvmiana sygnałów (kostymutacja) z limfocytem Th2 zaktywowanym III sygnał: oddziaływanie cytokin wydzielanych przez zaktywowany limfocyt Th2 powstawanie kom. plazmatycznych: pod wpływem cytokin następuje proliferacja limf. B i ich różnicowanie w kierunku kom plazmat. produkujących przeciwciała; proces ten zachodzi w centrach rozrodczych, rola cytokin w indukcji syntezy przeciwciał- cytokiny limf. Th2 determinują klasę syntetyzowanych przeciwciał: Równowaga 1L-4, -5, -6, -13-> synteza przeciwciał klas G i M, Przewaga IL4->klasy E(IgE), Przewaga IL5-> synteza IgA rola przeciwciał w mech obronnych wiązanie patogenów i tworzenie kompleksów immunologicznych, (małe kompleksy usuwane są w nerkach i wątrobie, duże eliminowane przez kom żerne, natomiast średnie są patologiczne); wiązanie (neutralizacja) egzotoksyn; wiązanie struktur powierzchniowych patogenów odp za przyleganie do kom gospodarza,; ułatwianie fagocytozy (immunofagocytoza),; aktywacja dopełniacza drogą klasyczną; udział w r-i ADCC, rola odpowiedzi humoralnej w mech. obronnych: odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi p/bakteryjnej, p/wirusowej, p/wnowotworowej, odporności p/grzybicznej i odpi skierowanej przeciwko pasożytom, przebieg aktywacji spoczynkowych limf. Tc- I sygnał- rozpoznanie antygenu prezentowanego w kontekście MHC I, II sygnał-aktywacja przez zaktywowany limf. Th 1 (IL-2) oraz cytokiny syntetyzowanie wydzielane przez APC (kom dendrytczne, mieloidalne lub makrofagi- w tej reakcji oczywiście), rola limf. Th1 w dojrzewaniu limf. CTL Th1 po aktywacji wydzielają IL-2, która aktywuje limfocyty Tc -> proliferacja i aktywacja -> zaktywowany Tc = CTL cechy limfocytów CTL w ich ziarnistościach perforyny i granzymy, rozpoznaje „wroga" bez aktywacji i współpracy z limf Th 1, rola odp kom z udziałem limf. Tc w mech obronnych- zabicie: kom z wirusem/ z bakterią / nowotworowych, przebieg odp kom późnej: (prowadzi do patologii) przebiega z udziałem APC (makrofag, kom dendrytyczna- głownie kom Langerhansa) i limf. Th 1, kom efektorową jest makrofag, fagocytoza, zabijanie wewnątrzkomórkowe, cytokiny, rola limf. Th w odp nabytej: uczestniczą w aktywacji limf B w przebiegu odpowiedzi humoralnej (Th2), biorą udział w aktywacji Tc i powstaniu limf. CLT (Th 1), biorą udział w rozwoju odpowiedzi kom późnej i powstaniu aktywowanych („gniewnych") makrofagów (Th 1) rola makrofagów w ob wrodzonej i nabytej: fagoctoza i zabijanie wewnątrzkomórkowe, prezentacja antygenów w kontekście MHC I i MHC II, centralna rola w odpowiedzi komórkowej typu późnego, odp immunologiczna pierwotna i wtórna: pierwotna- pierwszy kontakt z antygenem, wytwarzanie przeciwciał, limfocytów CLT i kom pamięci (B i T), zabicie bakterii z udziałem przeciwciał, efekt limfocytów Tc wobec kom zakażonych przez patogeny. Wtórna- większa liczebność limfocytów Tc, szybszy wzrost stężenia przeciwciał, większe stężenie przeciwciał