ROZDZIAŁ 5. METABOLIZM KOMÓRKOWY

Pojęcia wprowadzające

Metabolizm to całokształt przemian materii i energii zachodzących w żywej komórce. Wszystkie procesy metaboliczne łączą się w komórce w całość i wzajemnie się uzupełniają. Na metabolizm składają się głównie procesy kataboliczne (szlaki kataboliczne) i anaboliczne (szlaki anaboliczne). W toku tych przemian energia uzyskana z rozkładu jednych związków organicznych, użyta zostaje do syntezy innych związków. W komórkach mogą jednak równocześnie przebiegać inne reakcje czy nawet długie szlaki o charakterze biochemicznym np.: biodegradacyjne, peryferyjne, anaplerotyczne czy amfiboliczne.

Katabolizm to ogół reakcji rozkładu złożonych związków organicznych na produkty proste, zawierające mniejszą ilość energii swobodnej aniżeli wyjściowe substraty. Uwalniana energia chemiczna, przetwarzana jest w wysokoenergetyczne związki typu ATP. Szlaki kataboliczne to ciągi reakcji enzymatycznych, w których następuje rozkład dużych i skomplikowanych związków organicznych na mniejsze.

Można przyjąć, że głównym celem przemian katabolicznych jest pozyskanie energii ze „spalenia enzymatycznego” związków organicznych, które dają się „spalić” w komórce. Przykładowo, u człowieka będzie to rozkład sacharozy lub tłuszczów, a u bakterii metylotroficznych wykorzystanie metanu lub innych n-alkanów.

Pełny katabolizm można rozpatrywać w kategorii mineralizacji: w tym układzie końcowe produkty reakcji katabolicznych są związkami nieorganicznymi (m.in. CO₂, H₂O, NH₄⁺, SO₄^2-, itp.).

Według autora: w definicji katabolizmu lepiej unikać pojęcia „biodegradacja”. Termin biodegradacja został zarezerwowany dla innych procesów (patrz poniżej - Biodegradacja).

Anabolizm (szlaki anaboliczne). To zespół reakcji, w których są syntetyzowane składniki budulcowe komórki o skomplikowanych strukturach, ze związków o prostej budowie, doprowadzanych do komórki z zewnątrz lub powstających podczas katabolizmu komórkowego. Reakcje syntezy wymagają energii i stąd nazywane są endoergicznymi. Przykładem reakcji anabolicznych jest: synteza enzymów, składników ściany komórkowej drobnoustrojów, itp.

Biodegradacja (szlaki biodegradacyjne). To enzymatyczny rozkład złożonych, najczęściej sztucznie wyprodukowanych przez człowieka związków organicznych, zaliczanych do kategorii ksenobiotyków (czyli substancji obcych dla środowiska naturalnego), na prostsze składniki chemiczne przez bakterie, grzyby, pierwotniaki i glony. O ile to możliwe komórki Prokaryota mineralizują ksenobiotyki z wykorzystaniem energii swobodnej w nich zawartej. Celem biodegradacji jest usunięcie tych związków ze środowiska, gdyż są potencjalnym zagrożeniem dla żywej komórki.

Niektóre z tych szlaków mogą być nawet kilkunastoetapowe (np. biodegradacja antracenu lub fenantrenu). Może się zdarzyć, że niektóre z enzymów występujących w tych szlakach są kodowane w plazmidach.

Procesem pokrewnym do biodegradacji jest detoksykacja. Mianem tym określa się procesy, w wyniku których toksyczne dla środowiska (a w zasadzie, dla żywej komórki) substancje chemiczne są przekształcane w związki nietoksyczne, które z kolei dalej są biodegradowane, mineralizowane, asymilowane lub w ostateczności odkładane poza komórką.

Szlaki amfiboliczne - wielofunkcyjne. Przebiegają one niejako w poprzek innych szlaków. Ich metabolity pośrednie występują i są wykorzystywane w innych szlakach. Można uznać, że stanowią one „skrzyżowanie wielu dróg” metabolicznych, łącząc między sobą inne szlaki (anabolityczne, katabolityczne i biodegradacyjne). Najlepszym przykładem tego typu szlaków jest cykl Krebsa (a wśród wspomnianych metabolitów pośrednich: jabłczan, α-ketoglutaran czy bursztynylo~SCoA).

Reakcje (szlaki) anaplerotyczne. W tym przypadku, poprawne jest użycie pojęcia „reakcje anaplerotyczne” (aczkolwiek w literaturze mówi się często „szlaki anaplerotyczne”). Z reguły są to jednoetapowe (rzadko dwuetapowe) reakcje enzymatyczne, których zadaniem jest uzupełnienie w komórce pewnych ważnych, dla całości metabolizmu, związków chemicznych. Reakcje te dostarczają deficytowych substratów, m.in. do cyklu Krebsa, do intradiolowego szlaku katecholowego, itp.

Szlaki peryferyjne. W zasadzie, szlaki peryferyjne można zaliczyć do kategorii szlaków anabolicznych - w efekcie ich przebiegu powstają związki chemiczne zwane w „Ekologii Biochemicznej” metabolitami wtórnymi. Jednakże szlaki te, wyróżniają się tym, że przebiegają na poboczu (peryferiach) głównych szlaków metabolicznych - niejako w ich „cieniu”. Część enzymów występujących w tych szlakach, bywa kodowana w plazmidach.

Metabolity wtórne to substancje o różnorodnej budowie chemicznej wytwarzane podczas metabolizmu komórkowego i wydzielane przez żywe organizmy do środowiska w niewielkich ilościach, nie będące dla nich źródłem energii ani składnikiem strukturalnym, a odgrywające głównie rolę nośników informacji lub regulatorów procesów ekologicznych, w tym w oddziaływaniach pomiędzy żywymi organizmami.

5.1. Bioenergetyka procesów metabolicznych

Bioenergetyka (inaczej termodynamika biochemiczna) zajmuje się badaniem zmian energetycznych podczas reakcji biochemicznych. M.in. podaje reguły pozwalające określić, które reakcje enzymatyczne mogą zajść, które reakcje enzymatyczne są odwracalne, itp.

Każdy organizm do syntezy własnych związków (enzymów, kwasów nukleinowych, elementów strukturalnych komórki, itp.) oprócz podstawowych składników budulcowych potrzebuje znacznych ilości energii. W procesach metabolicznych kluczową rolę, jako nośnik energii chemicznej, odgrywa ATP, choć w wielu przypadkach zastąpiony może być przez któryś z innych nukleotydotrifosforanów (GTP, UTP, ITP lub CTP).

W komórkach podczas metabolizmu pojawiają się także związki wysokoenergetyczne nienukleotydowe.

5.1.1. Związki makroergiczne

Energia swobodna ΔG  uwalniana podczas hydrolizy większości wiązań (oczywiście tych, które hydrolizie mogą ulec) nie przekracza -16 kJ/mol. Między innymi do takich wiązań należą: wiązanie amidowe (w tym peptydowe) ─CO-¦-NH─, glikozydowe -CH₂-¦-OR, estrowe ─CO-¦-OR, itp. Energia swobodna ich hydrolizy mieści się w zakresie od -16 do -9 kJ/mol. Wyjątkowo hydroliza niektórych wiązań fosforanoestrowych R─O-¦-PO₃^2- prowadzić może do uwolnienia nieco większych ilości energii swobodnej, np. hydroliza glukozo-1-fosforanu wyzwala -21 kJ/mol. Związki chemiczne, które nie zawierają wiązań makroergicznych zaliczane są do związków niskoenergetycznych lub krótko mówiąc zwykłych.

Nie należy mylić energii swobodnej uwolnionej podczas hydrolizy wiązań z energią wiązań chemicznych. Ta druga jest ilością energii niezbędnej do rozerwania wiązania kowalencyjnego między dwoma atomami. Oscyluje ona wokół 350kJ/mol, np. energia wiązania C-O wynosi 352kJ/mol.

Związki makroergiczne (wysokoenergetyczne, zwane też w niektórych publikacjach niepoprawnie „bogatymi w energię”) to takie, które zawierają przynajmniej jedno wiązanie makroergiczne. Dla przypomnienia: dolną wartością energii swobodnej hydrolizy, która decyduje o zaliczeniu wiązania do makroergicznego jest ΔG = −25 kJ/mol (porównaj: str.84). Wiązania makroergiczne występują w pirofosforanach (m.in. w nukleotydodi- i trifosforanach - patrz str.84), w acylofosforanach, w enolofosforanach, w połączeniach guanidyny i jej pochodnych z resztą fosforanową, w tioestrach i ponadto w acylowanych pochodnych tiazolu.

Związki wysokoenergetyczne odgrywają podstawową rolę w przemianie energii żywych organizmów. Ich funkcja w procesach metabolicznych związana jest bezpośrednio z obecnością wiązania makroergicznego. Wiązanie takie decyduje o dużej aktywności związku. Ulega ono łatwo rozerwaniu a oderwane fragmenty (np. reszta fosforanowa, pirofosforanowa, glikozydowa, acetylowa, CoAS~ lub inna) może być przenoszona na różne substraty, tym łatwiej, iż rozkład tych związków jednocześnie dostarcza energii swobodnej niezbędnej dla takich reakcji. Związki tego rodzaju uczestniczą również w różnych reakcjach syntez (reakcjach endoergicznych) jako kofaktory - pośredniki wyzwalające energię swobodną zawartą w makroergicznym wiązaniu potrzebną do powstania nowego wiązania. Ponadto, są nośnikiem energii z jednego miejsca komórki do drugiego (np. z mitochondriów do rybosomów).

Reasumując; uwalniana energia w reakcjach rozkładu wiązania makroergicznego wykorzystywana może być do:

1. W reakcjach anabolicznych (endoergicznych), do syntezy związków złożonych (w tym własnych składników strukturalnych komórki) z niskocząsteczkowych komponentów,

2. Aktywnego transportu różnych związków do lub poza komórkę,

3. Pracy narządów ruchu,

4. Utrzymania odpowiedniej temperatury ciała (zamiany na ciepło).

Nie należy utożsamiać związków wysokoenergetycznych ze związkami zasobnymi w energię. Za miarę ilości energii w przemianach biochemicznych uważa się liczbę powstających lub zużywanych cząsteczek ATP. Wszystkie związki chemiczne uczestniczące w metabolizmie charakteryzują się określonym potencjałem energetyczno-chemicznym. Potencjał ten mówi ile energii w postaci ATP zostanie uwolnione w warunkach tlenowych w wyniku pełnego katabolizmu lub całkowitej biodegradacji (czyli mineralizacji, tzn. całkowitego biologicznego utlenienia do CO₂ i H₂O) danego związku. Prosta reguła mówi, że im więcej związek zawiera atomów H, tym jest bardziej zasobny energetycznie. W tabeli 4.1. podano potencjał chemiczny niektórych związków. Warto zwrócić uwagę, że acetylo~SCoA, pomimo iż jest związkiem wysokoenergetycznym, zalicza się do związków ubogich w energię.

Tabela 5.1. Potencjał energetyczno-chemiczny niektórych związków

Nazwa związku	Uwagi	Ilość wytworzonych cząstek ATP	Związek energetycznie
Metan	pełny katabolizm u metylotrofów	~5	bardzo ubogi
Acetylo~SCoA	cykl Krebsa	11	ubogi
Etanol	pełny katabolizm u Candida	~15	ubogi
Heksan	mineralizacja u Bacillus	~43	średnio zasobny
Glukoza	Glikoliza	~35	średnio zasobny
Benzen	mineralizacja u Pseudomonas	~30	średnio zasobny
Kwas palmitynowy	β-oksydacja	~124	zasobny

W przypadku skrobi, tłuszczów i innych wysoce zasobnych energetycznie związków narzuca się określenie, że są to związki bogate w energię (bogate energetycznie). Niestety, Lipmann nieopatrznie w latach 50-tych ubiegłego wieku dla związków wysokoenergetycznych (m.in. dla ATP) wprowadził pojęcie „fosforany bogatoenergetyczne”, które później w literaturze fachowej zostało przemianowane na „związki bogate w energię”. Podobnie wiązanie makroergiczne bywa w literaturze biochemicznej niepoprawnie zwane „wiązaniem bogatoenergetycznym”, pomimo że w chemii fizycznej od lat o wiązaniach chemicznych mówi się, że mają wysoki lub niski potencjał energetyczny. W związku z powyższym w podręczniku unika się pojęcia „związki bogate w energię”, natomiast wprowadzono pojęcie „związki zasobne w energię”, dla określenia takich związków, jak kwas palmitynowy i podobnych.

5.1.2. Powstawanie związków wysokoenergetycznych w procesach biochemicznych

Wszystkie związki wysokoenergetyczne pojawiające się podczas metabolizmu są endogennego pochodzenia, co oznacza, że nie są dostarczane do komórki z zewnątrz. Wytwarzane są jednym z trzech zasadniczych sposobów:

1. Tworzenie wysokoenergetycznych związków typu nukleotydotrifosforanów odbywa się poprzez przyłączenie reszty kwasu fosforowego do odpowiedniego nukleotydodifosforanu (np. w przypadku ATP, do ADP). Następuje to na drodze procesu, zwanego fosforylacją. Szczegóły dotyczące fosforylacji opisano w rozdziale 5.2.

2. Powstawanie wysokoenergetycznych związków następuje kosztem energii wiązań makroergicznych innych związków wysokoenergetycznych obecnych w komórce.

3. Związki wysokoenergetyczne powstają ze związków niskoenergetycznych w specyficznych ciągach reakcji enzymatycznych występujących w szlakach katabolicznych lub biodegradacyjnych (np. podczas glikolizy, w cyklu Krebsa, w intradiolowym szlaku katecholowym, itp.).

5.1.2.1. Powstawanie wysokoenergetycznych związków kosztem energii wiązań makroergicznych innych związków wysokoenergetycznych

W trakcie metabolizmu komórkowego ten sposób powstawania wysokoenergetycznych związków spotyka się bardzo często. Można wyróżnić 4 podtypy tego sposobu:

1) Następuje przeniesienie ~P, czyli energii i fosforanu z ATP lub innego nukleotydotrifosforanu na zwykły związek chemiczny, który może stać się dzięki temu związkiem wysokoenergetycznym. Proces ten nazywa się ufosforylowaniem. Z uwagi na jego zasadnicze znaczenie w metabolizmie komórkowym zostanie omówiony oddzielnie w rozdziale 5.1.3.

2) Od ATP lub innego nukleotydotrifosforanu zostaje enzymatycznie odszczepiony PP_i (pirofosforan), a powstały nukleotydo-5'-fosforan zostaje przeniesiony na ufosforylowany wcześniej substrat: w efekcie powstaje związek wysokoenergetyczny. Proces ten nazywany bywa adenylacją. Przykładem tego typu procesu jest powstawanie „aktywnej glukozy”, czyli UDPG (porównaj: str.86). Innym przykładem może być powstawanie „aktywnej choliny”, czyli CDP-choliny (cytydylilodifosfocholiny). Reakcja katalizowana jest przez cytydylilotransferazę fosfocholinową (EC 2.7.7.15).

3) Tworzenie wysokoenergetycznych związków w reakcjach syntez, z wykorzystaniem ATP jako donora energii. Przykładem może być synteza acetylo~SCoA opisana na str. 81 i 86. Innym przykładem może być uaktywnienie kwasu benzoesowego przez przyłączenie CoASH. W wyniku syntezy powstaje benzoilo~SCoA. Reakcję katalizuje ligaza benzoesan-CoA (EC 6.2.1.25).

4) Przeniesienie wiązania makroergicznego ze związku wysokoenergetycznego na związek zwykły (niskoenergetyczny) z jednoczesną zamianą ich potencjału energetycznego. Przykładem może być przeniesienie CoAS~ z bursztynylo~SCoA na 3-ketoadypinian - reakcję katalizuje CoA-transferaza 3-ketoadypinianowa (EC 2.8.3.6. - rysunek powyżej).

5.1.2.2. Powstawanie związków wysokoenergetycznych ze związków niskoenergetycznych w specyficznych ciągach reakcji enzymatycznych występujących w szlakach katabolicznych lub biodegradacyjnych

Z punktu widzenia „komórki” jest to niezwykle istotny sposób pozyskiwania związków wysokoenergetycznych, które w następnych etapach katabolizmu lub biodegradacji są wykorzystywane do syntez lub otrzymywania ATP oraz innych nukleotydotrifosforanów (np. w procesie fosforylacji substratowej).

Istnieje kilka charakterystycznych typów reakcji enzymatycznych, dzięki którym tą drogą powstają związki wysokoenergetyczne:

1) Dekarboksylacja oksydacyjna (α-ODC). Procesowi temu ulegają α-ketokwasy: pirogronian i α-ketoglutaran w szlakach katabolicznych oraz kilka α-ketokwasów w szlakach biodegradacyjnych. Charakterystyczną cechą tego procesu jest to, że w jego przebiegu bierze udział zorganizowany układ wieloenzymatyczny, sprzężony w stabilny kompleks złożony z 3 podjednostek enzymatycznych i pięciu koenzymów. Istotnym elementem tego układu jest lipoamid. Jako przykład podano dekarboksylację oksydacyjną pirogronianu (α-ODCP) do acetylo~SCoA, katalizowaną przez dehydrogenazę pirogronianową (przenoszącą acetyl) - EC 1.2.4.1. Szczegółowy przebieg tego procesu opisano w rozdz.5.3. na str. ..

Sumaryczny zapis dekarboksylacji oksydacyjnej

2) Tioliza β-ketokwasów. W tym przypadku niskoenergetyczne substraty wyjściowe (np. n-alkany o ilości C>3, wyższe kwasy tłuszczowe czy katechol) w specyficznych reakcjach enzymatycznych szlaków katabolicznych lub biodegradacyjnych zostają przekształcone w 3 -ketoacylo~SCoA. Pod działaniem C-acylotransferazy acetylo-CoA (EC 2.3.1.16.) następuje tioliza 3 -ketoacylo~SCoA pomiędzy 2 a 3 atomem węgla i pojawiają się dwa związki wysokoenergetyczne, z których jednym zawsze jest acetylo~SCoA a drugim jakiś acylo~SCoA. Reakcja jest w pełni odwracalna i wykorzystywana przez komórki np. w procesie elongacji (wydłużania) łańcucha kwasów tłuszczowych.

3) Ufosforylowanie oksydacyjne. W wyniku tej reakcji następuje przyłączenie nieorganicznego fosforanu do aldehydu 3-fosfoglicerynowego.

Reakcję katalizuje dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa (fosforylująca) - EC 1.2.1.12. Reakcja ta ma miejsce w glikolizie. W następnym etapie glikolizy następuje przeniesienie ~P na ADP (czyli fosforylacja substratowa) i uwolniony zostaje 3-fosfoglicerynian. Tak na marginesie tej przemiany, u roślin występuje dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa (NADP) - EC 1.2.1.9, która bezpośrednio utlenia aldehyd 3-fosfoglicerynowy do 3-fosfoglicerynianu, bez pojawienia się ~P.

4) β-Enolizacja. Reakcja polega na odszczepieniu cząsteczki wody od 2-fosfoglicerynianu (lub podobnych związków) z jednoczesnym utlenieniem atomu C-2 kosztem redukcji atomu C-3. W wyniku powstaje wysokoenergetyczny fosfoenolopirogronian. Reakcję katalizuje hydrataza fosfopirogronianowa - EC 4.2.1.11., a występuje ona w glikolizie

5.1.3. Ufosforylowanie

Jest to proces, w którym do określonego metabolitu (zawiązku chemicznego pojawiającego się podczas metabolizmu komórkowego) zostaje przyłączona reszta fosforanowa.

Nie należy mylić pojęcia „ufosforylowanie” z procesem fosforylacji, czyli wytwarzaniem ATP przez przyłączenie fosforanu do ADP - patrz: rozdz. 5.2.

Znane są dwa typy ufosforylowania:

1. z powstaniem wiązania chemicznego ubogiego w energię (ΔG około -16 kJ/mol),

2. z powstaniem wiązania makroergicznego (ΔG < -25kJ/mol).

Pierwszy typ reakcji jest praktycznie nieodwracalny; po prawej stronie równania brakuje związku wysokoenergetycznego, który zrekompensowałby stratę energii po przejściu ATP w ADP. Reakcje takie występują, gdy reszta kwasu fosforowego przenoszona jest przez odpowiednią kinazę z ATP na grupę hydroksylową jakiegoś związku chemicznego W efekcie powstaje wiązanie fosforanoestrowe. Przykładem związków z grupą -OH, do której może się przyłączyć reszta fosforanowa są monosacharydy. Kinazy katalizujące te reakcje należą do pod-podklasy EC 2.7.1. Przykładem tego typu reakcji jest ufosforylowanie glukozy, katalizowane przez heksokinazę (EC 2.7.1.1).

Powstający glukozo-6-fosforan nie jest związkiem wysokoenergetycznym, jednakże jego hydroliza dostarcza ΔG = -13 kJ/mol. Stad związek ten jest wzbogaconą w energię glukozą (uaktywniona metabolicznie forma glukozy), dzięki czemu glukoza może być m.in. łatwo włączana w szlaki kataboliczne.

Nie należy mylić „uaktywnionej glukozy” lub inaczej „wzbogaconej energetycznie glukozy”, czyli glukozo-6-fosforanu z „aktywną glukozą” lub inaczej „reaktywna glukozą”, czyli UDPG.

Drugi typ reakcji ufosforylowania jest odwracalny; zarówno po lewej jak i po prawej stronie równania występują związki wysokoenergetyczne o przybliżonych zasobach energetycznych. Reakcje takie występują, gdy reszta kwasu fosforowego przenoszona jest przez odpowiednią kinazę z ATP na grupę karboksylową (powstałe wiązanie nazywa się wtedy acylofosforanowym, a kinazy należą do pod-podklasy EC 2.7.2.) lub na azot związków, w których N występuje (np. na azot reszty guanidynowej; wiązanie takie nazywa się guanidynofosforanowym, a kinazy należą do pod-podklasy EC 2.7.3.).

Przykładem tego typu reakcji może być ufosforylowanie octanu^*, katalizowane przez kinazę octanową (EC 2.7.2.1.) lub ufosforylowanie kreatyny^* przez kinazę kreatynową (EC 2.7.3.2.).

Fosfokreatyna jest zapasową formą wysokoenergetycznych fosforanów w komórkach kręgowców. U bezkręgowców identyczną rolę pełni fosfoarginina. Oba związki zwane są fosfagenami. Ponieważ reakcje ufosforylowania kreatyny i argininy są odwracalne, w przypadku niedoboru ATP w komórce w krótkim czasie z powrotem jest otrzymywany z fosfagenów.

5.2. Fosforylacja.

Fosforylacją nazywa się powstawanie ATP (lub innych nukleotydotrifosforanów) przez przyłączenie reszty kwasu fosforowego do ADP (lub odpowiednio do innych nukleotydodifosforanów). Przemiana taka wymaga dostarczenia energii swobodnej równej co najmniej 29kJ/mol (powstałe wiązanie należy oczywiście do kategorii wysokoenergetycznych). U większości żywych organizmów energia ta pochodzi ze szlaków katabolicznych, stąd proces fosforylacji kojarzony bywa z katabolizmem komórkowym. U organizmów fotosyntetyzujących jest to energia świetlna (dostarczana do komórki w postaci kwantów światła). Autotrofy wykorzystują zaś energię pochodzącą z utlenienia np. Fe²⁺ → Fe³⁺.

Można wyróżnić trzy rodzaje fosforylacji.

Mówiąc o fosforylacji należy unikać pojęcia biosynteza ATP. Biosynteza oznacza proces zachodzący w komórce de novo. Biosynteza ATP to proces, w którym po kolei są wytwarzane: adenina, ryboza, adenozyna, itd. Mówiąc o fosforylacji poprawnie jest użyć pojęcia powstawanie lub tworzenie ATP.

5.2.1. Fosforylacja substratowa.

Jest to tworzenie ATP przez enzymatyczne przeniesieniu reszty fosforanowej z jakiegoś metabolitu zawierającego taką resztę lub z fosforanu nieorganicznego (Pi) na ADP. Energia potrzebna do powstania ATP pochodzi ze związku wysokoenergetycznego, biorącego udział w takiej reakcji, który musi ją oddać, sam przechodząc z wyższego poziomu energetycznego na niższy.

Substraty wysokoenergetyczne wykorzystywane do fosforylacji substratowej powstają w trakcie katabolizmu komórkowego lub w szlakach biodegradacyjnych, a sposób ich powstawania został opisany w rozdziale 4.1.2.2.

Konkretne przykłady fosforylacji substratowej przedstawione zostaną przy omawianiu poszczególnych szlaków katabolicznych.

5.2.2. Fosforylacja oksydacyjna

W trakcie różnorodnych przemian katabolicznych lub biodegradacyjnych - na przykład podczas glikolizy, cyklu Krebsa, β-oksydacji, biodegradacji rozmaitych ksenobiotyków - zostają od substratów enzymatycznie oderwane atomy wodoru, które są bezpośrednio przenoszone na koenzymy dehydrogenaz, głównie NAD^* i FAD (i niekiedy Q), powodując ich redukcję do NADH, FADH₂ (QH₂). Te zredukowane formy koenzymów regenerowane (utleniane) są w łańcuchu oddechowym, a ich utlenianiu towarzyszy fosforylacja, czyli powstawanie ATP z ADP i P_i.

Nieprawdą jest, co głosi się w wielu podręcznikach dla kierunków medycznych, że fosforylacja oksydacyjna jest charakterystyczna wyłącznie dla organizmów tlenowych. Obok typowego oddychania tlenowego, liczne Prokaryota „oddychają” beztlenowo, i też w trakcie ich metabolizmu zachodzi fosforylacja oksydacyjna (patrz dalej w tekście tego rozdziału).

Typowa tlenowa fosforylacja oksydacyjna polega na powstawaniu ATP z ADP i P_i w sprzężeniu z łańcuchem oddechowym, którego przedostatnim ogniwem jest oksydaza cytochromu c przekazująca oderwane z substratów elektrony na tlen. Rzeczywiście, taki sposób wytwarzania ATP występuje jedynie u organizmów oddychających tlenowo. W takim procesie fosforylacji oksydacyjnej, wyzwolona energia swobodna ΔG przenoszenia elektronów poprzez łańcuch oddechowy, umożliwia wychwycenie jej znacznej części (lub całości u Prokariota) przez cząsteczki ADP.

Udowodniono, że przeniesienie 2 elektronów z atomów wodoru na tlen wyzwala 238 kJ/mol energii. W żywych komórkach, podczas transportu elektronów z NADH na tlen, wyzwolona energia jest równa 221 kJ/mol. Z energii tej wytwarzane są wysokoenergetyczne wiązania w ATP. Nie związana w ATP energia wykorzystywana jest jako energia cieplna na utrzymanie temperatury ciała zwierząt stałocieplnych.

Doświadczenia przeprowadzone na oddychających tlenem organizmach wskazują, że podczas przenoszenia elektronów w łańcuchu oddechowym rozpoczynającym się od dehydrogenaz współdziałających z NADH, a kończących na oksydazie cytochromu c (lub precyzyjniej 1/2 O₂) są zużywane 3 mole fosforanów nieorganicznych (P_i). Jeśli jednak proces rozpoczyna się od dehydrogenaz flawoproteidowych, zużycie fosforanów nieorganicznych (P_i) na tą samą ilość tlenu wynosi 2 mole. Wskazuje to, że gdy łańcuch oddechowy rozpoczyna się od zredukowanego NADH, przy wykorzystaniu 1/2 O₂ są syntetyzowane 3 cząsteczki ATP (w rzeczywistości 8/3 - patrz poniżej), natomiast jeśli rozpoczyna się od flawoprotein, powstają tylko 2 cząsteczki ATP.

Na poniższym rysunku przedstawiono schemat łańcucha oddechowego, który zaproponowano w 1964 roku i który w naukach przyrodniczych obowiązywał do roku 1998. Obecnie schemat ten ma jedynie znaczenia historyczne.

Rys. 5.2.1. Kolejność podstawowych podjednostek składowych łańcucha oddechowego w ujęciu według wiedzy z lat 1964-1998

Zanim szczegółowo omówiony zostanie łańcuch oddechowy (a ściśle biorąc: łańcuch transportujący elektrony), niezbędne są pewne ogólne ustalenia i wyjaśnienia:

1. U eukariotów transport elektronów i fosforylacja oksydacyjna zachodzą w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, u prokariotów zaś procesy te przebiegają w membranie komórkowej.

2. U eukariotów część szlaków katabolicznych zlokalizowana jest we wnętrzu mitochondriów (matrixie) - m.in. tak ważne szlaki, jak: cykl Krebsa i β-oksydacja.

3. U eukariotów cząsteczki zredukowanego NADH nie są równocenne z punktu widzenia miejsca ich powstawania,. Na przykład glikoliza przebiega w cytoplazmie, i stamtąd protony ze zredukowanego NADH muszą zostać przetransportowane do matrixu.

4. U prokariota, w zależności od rodzaju i gatunku organizmu, łańcuch transportujący elektrony bywa bardzo zróżnicowany (patrz dalej w tekście).

5.2.2.1. Łańcuch oddechowy chemoorganotrofów prokariotycznych

Kierunek przenoszenia elektronów w łańcuchu oddechowym jest wyznaczony przez różnicę potencjałów oksydoredukcyjnych. Transport elektronów odbywa się od układów o wyższych wartościach ujemnych do układów o wyższych wartościach dodatnich. W przenoszeniu protonów i elektronów od substratów do tlenu uczestniczą dehydrogenazy, współdziałające z NAD, NADP, FAD lipoamidem i niekiedy Q, a poza tym: metaloflawoproteidy pośredniczące, ubichinon oraz układ cytochromów. Schemat łańcucha oddechowego u chemoorganotrofów prokariotycznych przedstawiono na poniższym rysunku (z minimalnymi odchyleniami, podobny łańcuch oddechowy występuje w błonie mitochondrialnej Eukariota).

Rys. 5.2.2. Uproszczony schemat łańcucha oddechowego u chemoorganotrofów prokariotycznych

Podjednostki składowe łańcucha oddechowego

Znaczną część podjednostek składowych łańcucha oddechowego, czyli NAD, NADP, FAD, FMN, lipoamid oraz ubichinon omówiono już w podrozdziale „Koenzymy i grupy prostetyczne oksydoreduktaz” na stronach 75-80.

Ten fragment należy traktować jako rozszerzenie wcześniejszej wiedzy.

Dehydrogenazy współdziałające z flawinami. Koenzymy tych dehydrogenaz - FAD i FMN - są względnie trwale z związane z apoenzymami. Niekiedy ich podjednostkami są białka żelazowo-siarkowe. Do tego typu dehydrogenaz należy: dehydrogenaza bursztynianowa, cholinowa lub acylo-CoA; wszystkie zawierają FAD. Również dehydrogenazy współdziałające z lipoamidem (wchodzące w skład kompleksów wieloenzymatycznych oksydacyjnej dekarboksylacji α-ketokwasów (α-OCD) zawierają FAD. W Kompleksie I u Prokariota występuje FAD, a u Eukariota FMN.

Flawoproteidy pośredniczące (fp). Występują one w komórkach poza wymienionymi już wyżej dehydrogenazami flawinowymi. Zawierają one barwniki flawinowe, bardzo często żelazo niehemowe, białka żelazowo-siarkowe, a niekiedy cynk. Metaloflawoproteidy fp pośredniczą często w przekazywania protonów i elektronów z dehydrogenaz sprzężonych z NADH, powodując ich utlenienie. Niektóre dehydrogenazy współdziałające z nukleotydami flawinowymi, jak np. dehydrogenaza acylo-CoA, współdziałają także z flawoproteidami przenoszącymi elektrony (ETF).

Ubichinon (koenzym Q). Ubichinon stanowi ostatnie ogniwo łańcucha oddechowego, do którego dochodzą atomy wodoru. Dalej przenoszone są już tylko elektrony. W łańcuchu oddechowym występuje on w ilości znacznie większej od innych składników łańcucha oddechowego. Ubichinon jest ruchomym elementem łańcucha. Krąży w membranie komórkowej (lub wewnętrznej błonie mitochondrialnej) pomiędzy Kompleksem I, Kompleksem II i cytochromami.

W łańcuchu oddechowym u niektórych Prokariota w okolicach działania ubichinonu mogą występować związki towarzyszące temu koenzymowi: witaminy K oraz witaminy E.

Białka żelazowo-siarkowe (Fe_n-S_n) stanowią jednoelektronowe układy oksydoredukcyjne. Współpracują one zarówno z flawoproteidami, jak i cytochromem b. Szczegóły dotyczące ich budowy opisano w rozdziale 1.3. na str. 13.

Cytochromy. Stanowią grupę białek transbłonowych uczestniczących w transporcie elektronów. Każdy cytochrom zawiera grupę heminową z umieszczonym w centrum atomem żelaza, który w trakcie przyjmowania elektronu przechodzi ze stanu Fe³⁺ do stanu Fe²⁺. Po oddaniu elektronu do następnego przenośnika atom żelaza powraca do stanu Fe³⁺.

Cytochromy rodzaju b. Ich masa cząsteczkowej waha się w granicach 28 kDa. Istnieje kilka odmian tego typu cytochromów: np. cytochrom b₅₅₈ jest składnikiem Kompleksu II, cytochromy b₅₅₆ i b₅₆₂ są składnikami kompleksu III a cytochrom b₅₅₉ odgrywa ważną rolę w ochronie fotosystemu PSII.

Cytochrom c1 jest lipoproteiną o masie cząsteczkowej około 360 kDa, zawierającą po 1 atomie żelaza na każdą podjednostką budulcową.

Cytochrom c; najlepiej poznany ze wszystkich cytochromów. Masa jego cząsteczki wynosi 13 kDa. Zawiera on 104 reszty aminokwasowe, znany jest jego skład aminokwasowy oraz struktura przestrzenna. Cytochrom c jest jedynym cytochromem rozpuszczalnym i podobnie jak ubichinon jest ruchomym składnikiem łańcucha oddechowego, łączącym jego kompleksy funkcyjne.

Cytochromy a i a₃. Są one elementem składowym Kompleksu IV, czyli oksydazy cytochromu c. W skład tego enzymu wchodzą dwa układy żelazoporfirynowe, z których każdy oprócz żelaza zawiera atom miedzi. Podczas przenoszenia elektronów atomy miedzi oscylują między stanem Cu²⁺ a stanem Cu¹⁺. Oksydaza cytochromu c ma niezwykle duże powinowactwo do tlenu. Reakcja, którą enzym ten katalizuje, jest nieodwracalna.

Główne elementy składowe łańcucha oddechowego i mechanizm ich działania

Kompleks I, czyli dehydrogenaza NADH (ubichinon) - EC 1.6.5.3. Duży kompleks białkowy, składający się z 45 podjednostek, zawierający FAD (u prokariota) lub FMN (u eukariota) i dwa typy centrów żelazowo-siarkowych Fe₂-S₂ i Fe₄-S₄ w białkach żelazowo-siarkowych. Jego podjednostką składową jest dehydrogenaza NAD (EC 1.6.99.3.).

Rys. 5.2.3. Kompleksy I i II

Zredukowany NADH, pochodzący z wielu procesów katabolicznych, dostarcza jon wodorkowy (H^- - proton i dwa elektrony) do Kompleksu I. FAD (lub u Eukaryota - FMN) przejmuje ten jon i jednocześnie z cytoplazmy dobiera brakujący proton (H⁺). Następnie, w dwóch kolejnych krokach, po jednym, elektrony zostają przekazane do centrum Fe₂-S₂, gdzie atomy żelaza odbierają je, oscylując między stanem Fe³⁺ a stanem Fe²⁺. W dwóch kolejnych krokach elektrony te zostają przetransportowane do centrum białka Fe₄-S₄. Stamtąd, znowu pojedynczo, zostają przekazane na ubichinon, który ulega redukcji i jednocześnie pobiera protony z cytoplazmy przechodząc po drodze w semiubichinol, aby na końcu ulec redukcji do ubichinolu (QH₂). Ubichinol jest wolnym składnikiem membrany komórkowej (lub u Eukariota, wewnętrznej błony mitochondrialnej) i przenosi te dwa protony i elektrony do kompleksu III. W tym samym czasie, ze zredukowanego FAD-u dwa pozostające tam protony zostają przetransportowane do przestrzeni periplazmatycznej. Tak więc Kompleks I, pełni dodatkowo rolę pierwotnej pompy protonowej.

Kompleks II, czyli dehydrogenaza bursztynianowa (ubichinon) - EC 1.3.5.1. Jest to zakotwiczony w membranie komórkowej większości Prokariota (lub w wewnętrznej błonie mitochondrium u Eukariota) enzym związany z cyklem Krebsa, którego podjednostką jest dehydrogenaza bursztynianowa sprzężona z FAD - EC 1.3.99.1. U Eukariota i większości Prokariota w skład tego kompleksu wchodzą trzy białka żelazo-siarkowe Fe₂-S₂, Fe₄-S₄ i Fe₃-S₄ (drugie i trzecie z wyjątkiem E.coli i chemolitotrofów). Ubichinon, który odbiera elektrony i protony ze zredukowanego FADH₂ zakotwiczony jest w membranie komórkowej (lub w błonie mitochondrialnej) izoprenowym ogonem i tylko właściwy człon koenzymu (ugrupowanie chinonowe) ma dostęp do wnętrza kompleksu II. Zredukowany w kompleksie II ubichinol (QH₂) transportuje elektrony i protony z kompleksu II do kompleksu III.

Mechanizm działania Kompleksu II ma kilka cech wspólnych z mechanizmem działania Kompleksu I. FAD, będący zasadniczym elementem tego enzymu (w tej reakcji pełni rolę kofaktora), odrywa od bursztynianu dwa wodory (2H⁺ i 2e^-). W dwóch kolejnych krokach, elektrony są przekazywane poprzez centrum Fe₂-S₂ i cytochrom b₅₅₈ na ubichinon, który w międzyczasie odbiera od zredukowanego FADH₂ brakujące protony. Istotna różnica pomiędzy Kompleksami I i II polega na tym, że ten drugi nie jest pompą protonową (nie transportuje protonów do przestrzeni periplazmatycznej).

Kompleks III, czyli reduktaza ubichinol-cytochrom c - EC 1.10.2.2.

Rys. 5.2.4. Kompleks III

c₁  to cytochrom c₁, b_L to cytochrom b₅₅₆, b_H tocytochrom b₅₆₂

Kompleks III zbudowany jest z trzech dużych subjednostek (u Eukaryota jest ich 9). W jego skład wchodzą: cytochrom c₁, cytochrom b₅₅₆ i cytochromu b₅₆₂ oraz białko żelezowo-siarkowe Fe₂S₂.

Biochemiczne szczegóły dotyczące mechanizmu działania Kompleksu III, a zwłaszcza przebieg cyklu Q zostały dopracowane dopiero niedawno (2003).

Ubichinol (QH₂) transportuje z Kompleksu I i z Kompleksu II 2 wodory i 2 elektrony. W pobliżu Kompleksu III przyłącza się do niego druga cząsteczka QH₂, wydalona z Kompleksu III. Obie cząsteczki QH₂ kolejno wiążą się wiązaniem wodorowym z miejscem q₀ umiejscowionym w kompleksie III i tam zostają utlenione do ubichinonu Q. Miejsce q₀ sprzężone jest z białkiem Rieske z klasterem żelazowo-siarkowym Fe₂-S₂. Jedna z cząsteczek utlenionego ubichinonu Q zawracana jest do przestrzeni membranowej (wędruje więc z powrotem do kompleksu I), druga zaś jest wiązana w miejscu q₁ cytochromu b. W tym samym czasie 4 elektrony pochodzące z utlenionego ubichinolu są rozdzielane: 2 z nich są transportowane przez układ heminowy podjednostki b_L cytochromu b poprzez podjednostkę b_H do miejsca q₁. Tam ubichinon Q jest redukowany do ubichinolu QH₂. Protony niezbędne do tej reakcji czerpane są z przestrzeni periplazmatycznej. Zredukowany ubichinol (QH₂) zamyka cykl i przyłącza się do kolejnej cząsteczki QH₂ wędrującej z kompleksu I. Pozostałe dwa elektrony z miejsca q₀ są transportowane poprzez ISP na cytochrom c₁ i dalej na cząsteczki cytochromu c, który ulega redukcji i może zostać utleniony w Kompleksie IV. Najważniejszy efekt tego cyklu; 4 protony dostarczone z QH₂ (2 z kompleksu I lub Kompleksu II i 2 z przestrzeni periplazmatycznej) z miejsca q₀ są wyrzucane do cytoplazmy.

Kompleks IV, czyli oksydaza cytochromu c - EC 1.9.3.1. Złożony jest z kilku grup prostetycznych opartych na metalach (2 hemy- a i a3, 2 centra miedziowe - CuA i CuB) oraz 13 podjednostek białkowych (u ssaków 10 z nich kodowanych jest jądrowo, a 3 przez genom mitochondrialny mtDNA). Właściwa reakcja redukcji tlenu zachodzi przy wspólnym udziale hemu a3 i centrum CuB, jakkolwiek jej dokładny mechanizm wciąż jest przedmiotem badań.

Kompleks ten przekazuje nie tylko elektrony na tlen, ale również działa jak pierwotna pompa protonowa transportując dwa protony, specjalnym kanałem, do przestrzeni periplazmatycznej (lub u Eukariota - do matrixu).

Rys. 5.2.5. Kompleks IV

Kompleks V, czyli H(+)-transportująca dwu-sektorowa ATP-aza - EC 3.6.3.14. (dawniej :syntaza ATP). Funkcja kompleksu V polega na syntezie ATP z ADP i P_i. Syntaza ATP, transportująca H⁺, działa jako wtórna pompa protonowa, przemieszczająca protony H⁺ w kierunku odwrotnym do działania pomp pierwotnych, tj. do wewnątrz cytoplazmy (u Eukariota do wnętrza mitochondrium - matrixu).

Kompleks V składa się z dwóch komponentów białkowych: F₁ i F₀. Element F₀ (rotor), jest zakotwiczony w membranie komórkowej (u Eukariota w błonie mitochondrialnej) - pokazanej schematycznie na poniższym rysunku jako szary pas - i zasilany jest przez strumień protonów. Przepływające protony wprawiają rotor w ruch wirowy. Ten białkowy rotor jest połączony z drugim elementem Kompleksu V - określanym jako F₁ - poprzez białkowy statecznik. Kiedy pod wpływem przepływających protonów zaczyna się obracać rotor (F₀), również obraca się część F₁. Pełnemu obrotowi elementu F₁ (czyli 360°) towarzyszy wytworzenie 3 cząsteczek ATP. Do pełnego obrotu elementu F₁, potrzeba 9 H⁺ przepływających przez rotor. Tak więc, przepływ 3 protonów przez Kompleks V powoduje wytworzenie 1 cząsteczki ATP.

Rys. 5.2.6. Kompleks V

Opisany w podręczniku sposób działania łańcucha oddechowego oparty jest o model chemiosmotyczny, który został zaproponowany w 1961 r. przez Peter'a Mitchell'a. W 1978 autor otrzymał za tę pracę Nagrodę Nobla.

W 1997 roku Paul  Boyer i John  Walker otrzymali Nagrodę Nobla za badania nad syntazą ATP - enzymem, katalizującym powstanie ATP z ADP i Pi.

Od 2006 roku obowiązuje model łańcucha oddechowego przedstawiony w podręczniku. Duży wkład w jego rozpowszechnienie miał David Goodsell, który opublikował dane na temat „ATP Synthase”.

Reasumując, regeneracja (utlenienie) 1 cząsteczki zredukowanego NADH w łańcuchu oddechowym u chemoorganotrofów przysparza komórce 8/3 ATP, regeneracja zaś (utlenienie) 1 cząsteczki FADH₂ lub QH₂ dostarcza komórce 2 cząsteczek ATP.

5.2.2.2. Odmiany łańcucha transportującego elektrony u różnych rodzajów organizmów

W poprzednim rozdziale omówiono łańcuch oddechowy chemoorganotrofów prokariotycznych. Jak już wspomniano w łańcuchu oddechowym (a ściśle biorąc: łańcuchu przenoszącym elektrony) innych organizmów mogą występować różnice, u niektórych mikroorganizmów nawet bardzo duże w porównaniu do omówionego wcześniej schematu. Poniżej przedstawiono kilka przykładów.

Eukariota.

U Eukariota błona mitochondrialna oddziela wnętrze mitochondrium (czyli matrix) od cytoplazmy. W matrixie zachodzą m.in. reakcje cyklu Krebsa i β-oksydacji. Błona zewnętrzna mitochondrium jest przepuszczalna dla większości metabolitów, natomiast przepuszczalność błony wewnętrznej jest bardzo ograniczona. Dehydrogenazy z FAD, jako akceptorem atomów wodoru - jak np. dehydrogenaza bursztynianowa - znajdują się w matrixie i bez przeszkód oddają atomy wodoru na ubichinon (w Kompleksie II), z pominięciem Kompleksu I.

Błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna dla zredukowanego NADH, który wytwarzany jest m.in. podczas glikolizy zachodzącej w cytozolu. Dlatego wodory z NADH przekazywane są do Matrixu poprzez dwukierunkowe przenośniki substratowe (tzw. mostki substratowe). Ich rolę pełni glicerolo-3-fosforan w połączeniu z dehydrogenazą glicerolo-3-fosforanowa (NAD(+)) - EC 1.1.1.8 lub bardziej skomplikowany mostek substratowy, ale za to bardzo skuteczny: przenośnik jabłczano-asparaginianowy sprzężony ponadto m.in. ze szczawiooctanem, α-ketoglutaranem i z dehydrogenazą jabłczanową - EC 1.1.1.37 (enzymem z cyklu Krebsa).

Innym problemem u Eukariota jest przenoszenie wodoru ze zredukowanego NADH na NADP. Enzym, który katalizuje tę reakcję - transhydrogenaza NAD(P)(+) (B-specyficzna) - EC 1.6.1.1, podczas transportu wodoru z NADH na NADP, pobiera proton z przestrzeni mitochondrialnej i przenosi go do matrixu, co oczywiście obniża pulę protonów, których transport przez Kompleks V jest niezbędny do fosforylacji oksydacyjnej (wytwarzania ATP z ADP i P_i).

Również transport nieorganicznego fosforanu P_i z przestrzeni mitochondrialnej do matrixu sprzężony jest z równoczesnym przeniesieniem jednego protonu.

Prokariota.

U bakterii elektrony mogą być wprowadzane do łańcucha oddechowego (a poprawnie łańcucha transportującego elektrony) na trzech poziomach: przez dehydrogenazy, przez pulę ubichinonu oraz na ruchome (mobilne) nośniki elektronów o budowie cytochromowej.

W komórkach bakterii występują wielokrotne kopie łańcuchów oddechowych, niekiedy używane równocześnie. Bakterie mogą używać znacznej ilości rozmaitych dehydrogenaz, reduktaz, oksydaz czy też dużej ilości różnorodnych donorów i akceptorów elektronów. Przykładowo komórki Escherichia coli rosnąc w warunkach beztlenowych na pożywce zawierającej glukozę używają dwóch różnych dehydrogenaz NADH, które przekazują po 2 elektrony do dwóch różnych łańcuchów transportujących elektrony pracujących równocześnie.

Bakteryjne łańcuchy transportujące elektrony zawsze (!), pomimo dużych różnic, charakteryzują się obecnością wtórnej pompy protonowej, czyli Kompleksu V (H(+)-transportująca dwu-sektorowa ATP-aza). Z nielicznymi wyjątkami (np. Halobacteria) w łańcuchu transportującym elektrony u Prokaryota występuje przynajmniej jedna pierwotna pompa protonowa, czyli jeden z Kompleksów I, III lub IV. U większości chemoorganotrofów występują wszystkie trzy Kompleksy.

Obok dehydrogenazy NADH (Kompleks I) i dehydrogenazy bursztynianowej (Kompleks II) prokariota mogą używać innych dehydrogenaz, np.: formaldehydowej, mrówczanowej, mleczanowej, aldehydu glicero-3-fosforanowego, itp. Niektóre z tych dehydrogenaz mogą pełnić funkcję pierwotnych pomp elektronowych. Natomiast taką funkcję u znacznej liczby bakterii pełnią oksydazy i reduktazy. Znaczna część dehydrogenaz jest enzymami indukcyjnymi; są syntetyzowane jedynie wtedy, kiedy są potrzebne.

W warunkach tlenowych u prokariota końcowym akceptorem elektronów jest zawsze tlen (O₂) redukowany do wody przez kompleks IV (oksydazę cytochromu c) lub inne oksydazy (np. E. coli używa dwóch różnych oksydaz chinolowych - obie o funkcji pierwotnych pomp protonowych). Ale jeśli bakterie rosną w warunkach beztlenowych lub o obniżonej ilości tlenu w środowisku, końcowym akceptorem elektronów jest związek aktywowany (wykorzystywany) przez odpowiednią reduktazę (np. u E. coli może to być reduktaza fumaranowa, reduktaza azotanowa lub azotynowa, itp.). Zdecydowana większość końcowych oksydaz i reduktaz należy do enzymów indukcyjnych.

Poniżej omówiono łańcuchy transportujące elektrony u wybranych mikroorganizmów.

Escherichia coli. E.coli jest chemoorganotrofem, tym niemniej u tych bakterii łańcuch oddechowy jest inny, niż przedstawiono to w rozdziale 4.2.2.1. Występują w nim Kompleksy I i II, ale brak jest Kompleksu III. W jego miejsce w łańcuchu oddechowym E.coli występuje cytochrom O (cyt b₅₅₅) lub cytochrom D, które działają jak oksydaza cytochromu c, pompując z cytoplazmy do przestrzeni periplazmatycznej 2H⁺ (czyli razem w całym łańcuchu tylko 4H⁺). Należy jednak wziąć pod uwagę, że u E.coli niektóre oksydazy związane z membraną komórkową też mogą działać jako pierwotne pompy protonowe, pompując do przestrzeni periplazmatycznej protony.

Chemolitotrofy. Źródłem energii może być u nich utlenienie nieorganicznych związków lub niektórych jednowęglowych elementów (np.CH₄). Posiadają Kompleksy I, IV i V oraz elementy Kompleksu III (to jest, cytochromy b i c₁). Jednakże w kompleksie III nie przebiega cykl Q i stąd ten kompleks w ogóle nie transportuje H⁺. Całkowity jest brak Kompleksu II. Za to w membranie komórkowej zakotwiczone są od strony przestrzeni periplazmatycznej liczne enzymy utleniające nieorganiczne związki (np. dehydrogenaza siarczanowa - EC 1.8.2.1, dioksygenaza siarkowa - EC 1.13.11.18, reduktaza azotanowa - EC 1.7.99.4., itp.). Enzymy te przenoszą elektrony z utlenianych związków na różnego typu akceptory (m.in. ubichinon i cytochrom c) równocześnie pozostawiając w przestrzeni periplazmatycznej protony oderwane od tych związków (np. z H₂S → S + 2H⁺) lub od wody biorącej udział w tych reakcjach. Protony te napędzają wtórną pompę protonową (Kompleks V), dzięki czemu powstaje ATP.

Oddychanie beztlenowe. U tego typu drobnoustrojów występuje bardzo skomplikowany łańcuch transportujący elektrony. Oczywiście, brak w nim Kompleksu IV (oksydazy cytochromu c). Część H⁺ z przestrzeni periplazmatycznej zużywana jest przez enzymy częściowo wystające z membrany komórkowej właśnie po tej stronie. Przykładem może być system enzymów prowadzących denitryfikację, a wśród nich np. reduktaza azotynowa (NO tworząca) - EC 1.7.2.3. (porównaj wykład „Ekologia Biochemiczna” - Obieg azotu). Ale z drugiej strony, część enzymów zakotwiczona w membranie komórkowej i wystająca po stronie przestrzeni periplazmatycznej bezpośrednio zasila ją w H⁺. Przykładem może być dehydrogenaza mrówczanowa (cytochrom) - EC 1.2.2.1 oraz hydrogenazy: cytochromu c3 (EC 1.12.2.1) u Thiobacillus ferrooxidans lub feeredoksynowa (EC 1.12.7.2) u niektórych gatunków Clostridium.

Fotoautotrofy to organizmy samożywne. Syntetyzują one związki organiczne (m.in. składniki strukturalne komórki) z prostych związków mineralnych (CO₂ i H₂O). Energia konieczna do tego procesu pochodzi z energii słonecznej (fotosynteza). Zalicza się je do roślin, bakterii, protistów i sinic. Ich łańcuch transportujący elektrony łącznie z mechanizmem fotosyntezy zostanie szczegółowo omówiony w rozdziale 5.5.

5.3. Katabolizm komórkowy

Pierwotnymi źródłami energii dla wszystkich organizmów żywych na kuli ziemskiej są: promieniowanie słoneczne i związki chemiczne nieorganiczne. To jedynie te formy energii wykorzystują organizmy samożywne (autotroficzne) do fotosyntezy i chemosyntezy związków organicznych, stanowiących składniki strukturalne ich własnych organizmów. Z kolei związki te są źródłami węgla, azotu oraz wtórnej energii dla innych organizmów, a w szczególności dla organizmów heterotroficznych, które najczęściej wykorzystują je, jako jedynie dla nich dostępne. W komórkach organizmów heterotroficznych zachodzą przemiany enzymatyczne, które umożliwiają wykorzystanie tych związków organicznych do wytworzenia innych, niekiedy jeszcze bardziej złożonych biopolimerów, które mogą być przyswajane przez kolejne organizmy heterotroficzne. Przyswajanie tych związków oraz przetwarzanie energii w nich zawartej zaliczamy do procesów katabolicznych.

Celem katabolizmu jest enzymatyczne utlenienie związków organicznych, które komórka jest w stanie utlenić („enzymatycznie je spalić”) z wykorzystaniem energii w nich zawartej.

Dla przypomnienia: szlaki kataboliczne to ciągi reakcji, w których następuje rozkład złożonych związków organicznych na mniejsze, zawierające mniejszą ilość energii swobodnej aniżeli wyjściowe substraty. Uwalniana energia chemiczna, przetwarzana jest w wysokoenergetyczne związki typu ATP.

W wielu opracowaniach dla studentów medycyny katabolizm komórkowy utożsamiany jest z oddychaniem komórkowym, definiowanym jako: „proces przenoszenia energii z substancji pokarmowych na inne, użyteczne dla komórki” i dalej - według tych pojęć - „cykl Krebsa... to II etap oddychania komórkowego” lub „komórka oddycha glukozą” (co to znaczy?), itp. Do tak rozumianych procesów katabolicznych zalicza się także transport elektronów w łańcuchu oddechowym, jako trzeci etap katabolizmu. Autor podręcznika jest przeciwny takiemu definiowaniu katabolizmu. Bo od razu nasuwają się poważne wątpliwości, np.: w jakiej kategorii procesów rozpatrywać trawienie u zwierząt albo spalanie etanolu w ludzkim organizmie? A do jakiej kategorii zaliczyć procesy detoksykacji zachodzące w naszym organizmie. A co z procesami katabolitycznymi u Procaryota? W jakiej kategorii rozpatrywać fermentację metanową, a co z procesami katabolicznymi u fotoautotrofów (czyżby roślina oddychała światłem?) lub chemoautotrofów, itp.?

Natomiast można się zgodzić ze stwierdzeniem, że celem katabolizmu jest ekstrakcja wodoru ze związków organicznych, potem wykorzystywanego w procesach anabolicznych, jako potencjalnego źródła energii i czynnika redukującego (NADPH) lub przetwarzanego w ATP.

Jednakże autor akceptuje tradycyjne rozumienie katabolizmu i takie zostanie zaprezentowane w podręczniku.

U chemoorganotrofów eukariotycznych sprawa jest w miarę prosta: w zasadzie katabolizm sprowadza się do „enzymatycznego spalania” węglowodanów i/lub tłuszczów. Natomiast przemiany białek u tych organizmów - w mniemaniu autora - powinno się rozpatrywać raczej w kategorii ogólnego metabolizmu. Białka dostarczają przede wszystkim komórce aminokwasów niezbędnych do utworzenia składników budulcowych - tylko w niezwykłej potrzebie komórka eukariotyczna katabolizuje aminokwasy (z oczywistą stratą dla siebie). Podstawowy schemat katabolizmu u tych organizmów pokazano w tabeli 5.3.1.

Natomiast u Procaryota w przemianach komórkowych rozpatrywanych w kategorii katabolizmu występują setki możliwości (w tym duża część zaliczana do procesów tlenowego lub beztlenowego rozkładu martwej materii organicznej lub biodegradacji ksenobiotyków) i nie jest łatwo ująć je w jeden ogólny schemat. Skład jakościowy i ilościowy związków chemicznych pobieranych przez poszczególne organizmy prokariotyczne jest u różnych gatunków odmienny: zależny od ich potrzeb pokarmowych i upodobań (asymilacja, odżywianie, rozkład, biodegradacja, itp.). Charakterystyka metabolizmu danego organizmu decyduje o zakwalifikowaniu danej substancji jako "pożywnej" lub "trującej", w zależności od możliwości przetworzenia i ewentualnego wykorzystania powstałych metabolitów. Znaczną część zagadnień z tego zakresu autor podręcznika porusza w ramach wykładów „Ekologia biochemiczna” i „Podstawy procesów biodegradacyjnych”.

W podręczniku skupiono głównie uwagę na katabolizmie węglowodanów i tłuszczów, gdyż są to procesy dostarczające komórce przeważającą część energii. Katabolizm tych związków przebiega bardzo podobnie w komórkach Eucaryota i Procaryota. Poruszone zostaną także niektóre zagadnienia związane z katabolizmem aminokwasów, choć część wiedzy z tego zakresu można znaleźć w ramach wykładu „Ekologia biochemiczna - obieg azotu w ekosystemach”.

Tabela 5.3.1. Ogólny schemat katabolizmu u chemoorganotrofów Eukariota

Faza	Tłuszcze	Węglowodany	Białka	Efekt energetyczny
I	Kwasy tłuszczowe Glicerol	Heksozy	Aminokwasy	0
II	Acylo~SCoA	Fosforany heksoz Fosforany trioz glikoliza etanol Pirogronian mleczan Acetylo~SCoA	α-ketokwasy szczawiooctan α-ketoglutaran szlaki anaplerotyczne	~8%
III		Cykl Krebsa CO2 + H2O	NH4^+, mocznik, SO4^2-	~87%

Katabolizm w tradycyjnym ujęciu, prezentowanym także w podręczniku, składa się z trzech faz:

• I faza - w zależności od organizmu, można ją nazwać: trawieniem, rozkładem, degradacją lub hydrolizą enzymatyczną złożonych polimerów do monomerów.

W zdecydowanej większości trawienie jest charakterystyczne dla zwierząt. U kręgowców, w tym u człowieka, trawienie zachodzi w układzie pokarmowym.

Natomiast w żołądkach przeżuwaczy występują bakterie symbiotyczne „rozkładające” błonnik komórek roślinnych na mniejsze fragmenty (można również powiedzieć, że ich enzymy hydrolizują go na mniejsze fragmenty, ale należy unikać pojęcia „trawią”). Ale można powiedzieć: „ten nadtrawiony pokarm przechodzi do żwacza, gdzie bytujące tam pierwotniaki zaczynają degradować go dalej”, albo „ich enzymy hydrolizą go na jeszcze mniejsze fragmenty”.

U sporej grupy prokariota proces rozkładu złożonych biopolimerów na mniejsze fragmenty z premedytacją można nazwać hydrolizę enzymatyczną (np. „bakterie Bacillus hydrolizują skrobię występującą w ich podłożach hodowlanych na mniejsze fragmenty, przyswajalne przez ich komórki”.

U wielu innych drobnoustrojów mamy do czynienie z tlenowym lub beztlenowym rozkładem materii organicznej (czyli butwieniem lub gniciem np. drewna).

Wiele prokariota wykazuje zdolność do biodegradacji złożonych związków organicznych na mniejsze fragmenty, które dalej są np. katabolizowane.

• II faza - obejmuje przemiany enzymatyczne (szlaki i cykle kataboliczne oraz biodegradacyjne), a także pojedyncze przekształcenia enzymatyczne rozmaitych metabolitów pośrednich, powstałych w I fazie katabolizmu, a także innych przyswajanych przez komórkę względnie prostych związków organicznych. Końcowym produktem II fazy katabolizmu komórkowego jest zazwyczaj acetylo~SCoA. Wyjątkowo podczas katabolizmu aminokwasów, a także u niektórych Procaryota w pewnych szlakach biodegradacyjnych mogą powstawać inne proste związki, łatwo włączane w cykl Krebsa (np. szczawiooctan, α-ketoglutaran, bursztynian, bursztynylo~SCoA, fumaran lub jabłczan).

U chemoorganotrofów eukariotycznych w tej II fazie przebiegają dobrze znane i rozpracowane szczegółowo od strony biochemicznej szlaki, cykle lub transformacje kataboliczne:

- glikoliza - przebiega w cytoplazmie: polega na wieloetapowej przemianie cząsteczki glukozy w pirogronian.

- dekarboksylacja oksydacyjna (α-ODC) - u Eucaryota przebiega w błonie mitochondrialnej, u Procaryota w cytoplazmie na styku z membraną cytoplazmatyczną: polega na przekształceniu pirogronianu do acetylo~SCoA. Pirogronian jest węzłowym metabolitem wewnątrzkomórkowym; jest ostatnim metabolitem glikolizy oraz większości przemian katabolicznych aminokwasów. Swobodnie przenika z cytoplazmy do matrixu, po drodze ulegając właśnie tam α-ODC.

- β-oksydacja - przebiega w matrixie, polega na konwersji wyższych kwasów tłuszczowych do acetylo-CoA.

- cykl pentozowy - przebiega w cytoplazmie: dostarcza NADPH wykorzystywanego do syntezy tłuszczów, cholesterolu i nukleotydów, a także dostarcza „strategicznego” składnika do syntezy RNA i DNA - rybozo-5-fosforanu. W sprzężeniu z łańcuchem oddechowym, równie dobrze może być dostarczycielem energii chemicznej dla komórki w formie ATP.

- przemiany aminokwasów: deaminacja, transaminacja, katabolizm szkieletów węglowych pozostałych po deaminacji (m.in. szlak homogentyzynianowy, szlak kinureninowo-antranilanowy, katabolizm rodników rozgałęzionych aminokwasów, itp.).

Ponadto u chemoorganotrofów prokariotycznych można znaleźć:

- szlak Entnera-Doudorffa, alternatywny szlak przemian glukozy do pirogronianu. Spotykany bywa jedynie w komórkach Procaryota;

- transformacje enzymatyczne względnie prostych związków organicznych o charakterze ksenobiotyków (np. aniliny, fenolu, toluenu, itp.) do jednego z 9-ciu głównych metabolitów pośrednich procesów biodegradacyjnych;

- szlaki rozkładu 9-ciu głównych metabolitów pośrednich procesów biodegradacyjnych (m.in. szlaki orto- i meta-katecholowe, szlaki protokatechanowe, szlak o-aminofenolowy, itp.);

- szlaki fermentacyjne.

• III faza - w tej fazie w cyklu Krebsa w warunkach tlenowych dochodzi do całkowitego utlenienia enzymatycznego końcowego produktu katabolizmu, jakim jest u większości żywych organizmów acetylo~SCoA („spaleniu” ulega jedynie dwuwęglowy element CH₃-CO-, acetyl) do CO₂ i H₂O. Jak już wspomniano, w niektórych przypadkach końcowymi produktami katabolizmu mogą też być: α-ketoglutaran, bursztynian, bursztynylo~SCoA, szczawiooctan, fumaran lub jabłczanu; związki te włączane są też do cyklu Krebsa i tam też ulegają całkowitemu „spaleniu” do CO₂ i H₂O. W trakcie przebiegu cyklu Krebsa dochodzi do wytworzenia dużej ilości zredukowanych form NADH i FADH₂. Cykl Krebsa sprzężony jest z łańcuchem oddechowym, gdzie następuje utlenienie zredukowanych form NADH i FADH₂ dostarczając komórce ATP. U roślin i niektórych organizmów prokariotycznych, substytutem cyklu Krebsa jest cykl glioksalowy.

W kolejnych rozdziałach zostaną szczegółowo omówione wszystkie trzy fazy katabolizmu komórkowego. Ich omawianie rozpoczniemy od III fazy (czyli cyklu Krebsa i cyklu glioksalowego), co powinno ułatwić studiowanie całości katabolizmu komórkowego, a zwłaszcza zrozumienie efektów energetycznych poszczególnych szlaków.

5.3.1. III faza katabolizmu

Jak już wspomniano, w III fazie katabolizmu u aerobów, w ich niezmutowanych komórkach, w warunkach tlenowych w cyklu Krebsa lub glioksalowym dochodzi do całkowitego utlenienia dwuwęglowego elementu acetylo-CoA - reszty acetylowej (CH₃-CO-).

Rys. 5.3.1. Schemat cyklu Krebsa

1. (Si)-syntaza cytrynianowa - EC 2.3.3.1, 2. Hydrataza akonitanowa - EC 4.2.1.3, 3. Dehydrogenaza izocytrynianowa (NAD⁺) - EC 1.1.1.41, 4. System dehydrogenazy oksoglutaranowej (przenoszącej sukcynyl) - EC 1.2.4.2, 5. Ligaza bursztynylo-CoA (tworząca ADP) - EC 6.2.1.5, 6. Dehydrogenaza bursztynianowa (ubichinon) - EC 1.3.5.1, 7. Hydrataza fumaranowa - EC 4.2.1.2, 8. Dehydrogenaza jabłczanowa - EC 1.1.1.37.

5.3.1.1. Cykl Krebsa

Cykl Krebsa, zwany też cyklem kwasów trikarboksylowych (TCA) lub cyklem kwasu cytrynowego to cykliczny ciąg reakcji enzymatycznych. Stanowi końcowy, III etap katabolizmu u organizmów aerobowych - ostatni etap spalania komórkowego węglowodanów, tłuszczów i białek. U organizmów eukariotycznych przebiega w matrixie, natomiast o Procaryota w cytoplazmie.

Istota cyklu polega na tym, że substrat wyjściowy acetylo-CoA (CH₃-CO~SCoA, zwany też czynnym octanem) łączy się ze szczawiooctanem (C4) dając kwas cytrynowy (C6), który w kolejnych przemianach (m.in. dwie dekarboksylacje, cztery odwodornienia) z powrotem przekształca się w szczawiooctan, dzięki czemu może nastąpić kolejny obrót cyklu. Efektem cyklu jest „spalenie” dwuwęglowej jednostki, jaką jest acetyl (CH₃-CO-) do CO₂ i H₂O. Przy okazji powstają 3 cząsteczki zredukowanego NADH, 1 cząsteczka FADH₂ i 1ATP.

W szczegółach cykl Krebsa przebiega następująco:

1. W pierwszym etapie cyklu (Si)-syntaza cytrynianowa (EC 2.3.3.1) łączy szczawiooctan z acetylo-CoA, w wyniku czego powstaje kwas cytrynowy. Aktywność enzymu hamowana jest wysokimi stężeniami ATP w komórce.

Większość syntaz należy do acylotransferaz (EC 2.3.) i nie potrzebuje ATP jako źródła energii do wytworzenia wiązania kowalencyjnego. W tym konkretnym przypadku energia zawarta jest zresztą w wysokoenergetycznym acetylo~SCoA.

U niektórych beztlenowców w komórkach występuje (Re)-syntaza cytrynianowa (EC 2.3.3.3); enzym o stereospecyficzności będącej w opozycji do (Si)-syntazy cytrynianowej, ponadto bardzo wrażliwy na obecność tlenu.

2. W drugim etapie cyklu Krebsa dochodzi do transformacji cytrynianu do izocytrynianu. Pomimo, że w nomenklaturze enzymów (ExPASy - http://www.expasy.org/enzyme/) reakcja jest przedstawiana jednoetapowo - tak, jak to pokazano na rys. 5.3.1. - w rzeczywistości jest ona dwuetapowa (patrz rysunek poniżej). Cytrynian pod wpływem hydratazy akonitanowej (EC 4.2.1.3) zostaje najpierw przekształcony w cis-akotynian, a ten dalej zostaje przekształcony pod wpływem tego samego enzymu w izocytrynian. Kofaktorem reakcji jest białko żelazo-siarkowe Fe₃S₄.

W cytoplazmie Procaryota (podobnie zresztą jak, i w matrixie Eucaryota) ustala się równowaga pomiędzy tymi trzema kwasami: udowodniono, że w środowisku reakcji enzymatycznej prowadzonej in vitro procentowy udział tych trzech kwasów jest następujący: cytrynian 91%, cis-akonitan 3%, izocytrynian 6%. W warunkach tlenowych, u aerobów równowaga przesunięta jest wybitnie w stronę powstawania izocytrynianu, który nieustannie ulega dalszym transformacjom enzymatycznym.

Natomiast w warunkach beztlenowych izocytrynian nie może być dalej przekształcany (ponieważ w komórce brak jest NAD-u) i u pewnych szczepów pleśni, np. Aspergillus itaconicus lub Asp.terreus dekarboksylaza akonitanowa (DA - EC 4.1.1.6) przekształca izocytrynian w kwas itakonowy (kwas metylenobursztynowy). Możemy w tym przypadku śmiało mówić o typowej fermentacji beztlenowej.

Kwas itakonowy stanowi podstawowy substrat w produkcji tworzyw sztucznych otrzymywanych na drodze estryfikacji i polikondensacji z glikolami. Ponadto, kwas itakonowy można stosować do różnych cyklizacji.

As

3. W trzecim etapie dehydrogenaza izocytrynianowa (NAD⁺) - EC 1.1.1.41, utlenia z jednoczesną dekarboksylacją izocytrynian (C6) do α-ketoglutaranu (C5). Aktywatorem enzymu są jony Mg²⁺ lub Mn²⁺, AMP i ADP. Aktywność enzymu hamują zaś wysokie stężenia NADH i ATP w komórce.

W komórkach organizmów eukariotycznych znalezione dwie formy enzymu: jedna (EC 1.1.1.41) współdziałająca z NAD⁺ występuje jedynie w mitochondriach. Ten enzym wykazuje właściwości allosteryczne. Bezpośrednio przekształca izocytrynian w α-ketoglutaran.

Druga forma enzymu (EC 1.1.1.42) współdziała z NADP⁺; nie wykazuje właściwości allosterycznych i występuje zarówno w mitochondriach, jak i w cytoplazmie. Ten enzym przekształca izocytrynian w α-ketoglutaran dwuetapowo, poprzez szczawiobursztynian (patrz rysunek poniżej). Aktywność tego enzymu hamowana jest przez cAMP.

4. W czwartym etapie cyklu Krebsa występuje dekarboksylacja oksydacyjna α-ketoglutranu (α-ODCG), zostaje przekształcony enzymatycznie w bursztynylo-CoA (zwany też sukcynylo-CoA). Reakcję katalizuje system dehydrogenazy oksoglutaranowej (przenoszącej sukcynyl) - EC 1.2.4.2. Skrócony zapis tej reakcji przedstawiono poniżej.

W rzeczywistości reakcja ta jest kilkuetapowa, a system katalizujący tę reakcję jest złożonym kompleksem wieloenzymatycznym. Na rys. 5.3.2 przedstawiono szczegółowy przebieg dekarboksylacji oksydacyjnej, który jest identyczny zarówno dla transformacji 2-ketoglutaranu (α-ODCG), jak i pirogronianu (α-ODCP) - różnice dotyczą detali: m.in. numerów EC i nazw komponentów białkowych systemu.

Rys. 5.3.2. Szczegółowy schemat przebiegu dekarboksylacji oksydacyjnej

Przy dekarboksylacji oksydacyjnej α-ketoglutaranu (α-ODCG) występują: dehydrogenaza 2-oksoglutaranowa (przenosząca sukcynyl) - EC 1.2.4.2, sukcynylotransferaza dihydroliponyloamidowa - EC 2.3.1.61, dehydrogenaza dihydroliponyloamidowa - EC 1.8.1.4.

Kompleks dehydrogenazy 2-oksoglutarowej katalizuje, ogólnie biorąc, konwersję 2-oksoglutaranu do sukcynylo-CoA i CO₂. Kompleks ten zawiera wielokrotne kopie trzech enzymatycznych komponentów: E1 - dehydrogenazy 2-oksoglutaranowej (przenoszącej sukcynyl) - EC 1.2.4.2, E2 - sukcynylotransferazy dihydroliponyloamidowej - EC 2.3.1.61, i E3 - dehydrogenazy dihydroliponyloamidowej - EC 1.8.1.4. W rdzeniu kompleksu znajduje się element E2, zbudowany z 24 polipeptydowych monomerów, do którego kowalencyjnie są przyłączone podjednostki E1 i E2. Jednym z kofaktorów reakcji jest amid kwasu liponowego (liponyloamid). Obok niego w reakcji biorą udział jeszcze cztery inne koenzymy: DPT, FAD, NAD⁺ i CoASH. Końcowym produktem reakcji jest bursztynylo~SCoA (inaczej zwany: sukcynylo~SCoA) i zredukowany NADH+H⁺.

U niektórych bakterii (m.in. u Mycobabacterium, Bacillus subtilis, Escherichia coli) występuje w cytoplazmie dekarboksylaza 2-oksoglutaranowa (EC 4.1.1.71), która bezpośrednio dekarboksyluje 2-oksoglutaran do semialdehydu bursztynowego, który w kolejnym kroku zostaje utleniony do kwasu bursztynowego przez dehydrogenazę semialdehydu bursztynianowego sprzężoną z NAD (EC 1.2.1.24). Kwas bursztynowy zostaje włączony w cykl Krebsa lub glioksalowy. Z punktu widzenia bioenergetycznego, ta „odnoga” teoretycznie przysparza komórce nieco większy zysk ATP: zyskuje ona zredukowany NADH (czyli 8/3 ATP), a traci jedynie 1ATP (brak 5 etapu cyklu Krebsa, czyli fosforylacji substratowej), ale z kolei komórka nie zyskuje w 5 etapie bursztynylo~SCoA, który wykorzystywany jest w procesach anabolicznych.

5. W piątym etapie cyklu Krebsa mamy do czynienia z fosforylacją substratową. Ligaza bursztynylo-CoA (tworząca ADP) - EC 6.2.1.5 - katalizuje w pełni odwracalną reakcję powstawania bursztynylo~SCoA lub też reakcję odwrotną tworzenia ATP z wykorzystaniem energii w nim zawartej. Enzym ten lepiej jest znany pod nazwą syntetaza bursztynylo-CoA (tworząca ADP). Aktywatorem enzymu są jony Mg²⁺. Ta odmiana enzymu związana z cyklem Krebsa występuje u drożdży i u wielu szczepów bakteryjnych, m.in. Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas.

U zwierząt z cyklem Krebsa związana jest ligaza bursztynylo-CoA (tworząca GDP) - EC 6.2.1.4. Mechanizm katalizy jest identyczny jak u wyżej opisanego enzymu bakteryjnego.

W komórkach zwierzęcych występuje także hydrolaza sukcynylo-CoA - EC 3.1.2.3, która hydrolitycznie rozkłada bursztynylo~S-CoA na bursztynian i CoASH. Aktywność enzymu hamowana jest nadmiarem pirofosforanu (PP_i) w komórce. Uwolniona w tej reakcji energia chemiczna zamieniana jest na ciepło.

bursztynylo~S-CoA + H₂O <==> bursztynian + CoASH

6. Szósty etap cyklu Krebsa katalizuje, znany już z łańcucha oddechowego, Kompleks II, czyli dehydrogenaza bursztynianowa (ubichinon) - EC 1.3.5.1. Więcej szczegółów dotyczących tego enzymu podano w rozdziale 5.5.2.1 na str. 115.

W wyniku działanie enzymu powstaje fumaran i zredukowana forma FADH₂. Silnym inhibitorem kompetycyjnym tego enzymu jest malonian (porównaj str.101). Aktywność enzymu hamują także wysokie stężenie szczawiooctanu w komórce.

7. Siódmy etap to transformacja fumaranu do (S)-jabłczanu (dawniej zapisywanego, jako L-jabłczan). Reakcję katalizuje hydrataza fumaranowa - EC 4.2.1.2.

fumaran + H₂O <==> (S)-jabłczan

8. Ostatni, ósmy etap to utlenienie jabłczanu do szczawiooctanu. Reakcja katalizowana jest przez dehydrogenazę jabłczanową - EC 1.1.1.37, która sprzężona jest z NAD-em. Enzym utlenia również inne 2-hydroksydikarboksy kwasy. W wyniku tej reakcji zostaje odtworzony szczawiooctan, który zamyka cykl oraz zredukowana forma NADH+H⁺.

Regulacja cyklu Krebsa

Ogólnie można stwierdzić, że cykl Krebsa przebiega szybciej, gdy poziom energii w komórce jest niski (wysokie stężenia ADP, przy niedoborze ATP i NADH), a zwalnia swój bieg, gdy dochodzi do nagromadzenia w komórkach ATP i NADH, ale także byrsztynylo-CoA oraz cytrynianu.

Na regulację intensywności przebiegu cyklu Krebsa mają wpływ m.in.: dostępność substratów wyjściowych - szczawiooctanu i acetylo-CoA, hamujące działanie nagromadzonych produktów oraz oparte na mechanizmach sprzężenia zwrotnego allosteryczne hamowanie enzymów szlaku przez wytwarzane przez nie produkty poszczególnych reakcji. Najskuteczniej regulowane są enzymy katalizujące reakcje nieodwracalne:

• (Si)-syntaza cytrynianowa - hamowana przez cytrynian, a także przez ATP,

• dehydrogenaza izocytrynianowa (NAD⁺) - hamowana przez NADH i ATP, a aktywowana przez ADP),

• system dehydrogenazy oksoglutaranowej (przenoszącej sukcynyl) - hamowany przez NADH i bursztynylo-CoA.

Ilość acetylo-CoA w komórkach zależy m.in. od aktywności systemu dehydrogenazy pirogronianowej (przenoszącej acetyl) - EC 1.2.4.1 - odpowiedzialnego za transformację pirogronianu do acetylo-CoA. Enzym ten bardzo skutecznie hamowany jest wysokimi stężeniami NADH i acetylo-CoA w komórce.

Znaczenie cyklu Krebsa

• Podstawową rolą cyklu Krebsa jest „spalenie” dwuwęglowej jednostki, jaką jest acetyl (CH₃-CO-) do CO₂ i H₂O i przy okazji wytworzenie zredukowanych form NADH+H⁺ i FADH₂;

• w komórce cykl Krebsa jest głównym dostarczycielem zredukowanych form NADH+H⁺ i FADH₂, które oczywiście regenerują się (ulegają utlenieniu) w łańcuchu oddechowym;

• cykl Krebsa jest sprzężony z łańcuchem oddechowym i w związku z tym, może przebiegać jedynie w warunkach wybitnie tlenowych;

• zredukowane formy NADH i FADH₂ są dostarczycielami protonów i elektronów do łańcucha oddechowego i podczas ich regeneracji zostają wytworzone cząsteczki ATP;

• w wyniku utleniania jednej reszty octanu powstają 3 cząsteczki NADH+H⁺ i jedna FADH₂, ponadto w wyniku fosforylacji substratowej powstaje też 1 cząsteczka ATP (lub GTP w komórkach zwierzęcych); stąd efekt energetyczny cyklu Krebsa jest następujący:

strata komórki	zysk komórki	ilość powstałego ATP
-	3 NADH+H^+	3 x 8/3 ATP = 8 ATP
	1 FADH2	1 x 2 ATP = 2 ATP
	1 ATP (z fosforylacji substratowej)	1 ATP
	razem	11 ATP

Sumarycznie daje to 11 cząsteczek ATP zysku ze „spalenia” jednej cząsteczki octanu.

Cykl Krebsa należy do szlaków amfibolicznych (wielofunkcyjnych), ponieważ spełnia nie tylko funkcje kataboliczne. Dostarcza prekursorów do wielu szlaków anabolicznych: Jego enzymy i metabolity pośrednie uczestniczą m.in. w: glukoneogenezie, transaminacjach, deaminacjach i syntezie kwasów tłuszczowych. Przykładowo:

• cytrynian - bierze udział w syntezie kwasów tłuszczowych i steroli,

• α-ketoglutaran i szczawiooctan - synteza glutaminy, asparaginy i innych aminokwasów, zasad purynowych i pirymidynowych,

• szczawiooctan i dehydrogenaza jabłczanowa - udział w procesie glukoneogenezy,

• bursztynylo-CoA - udział w syntezie porfiryn, hemu i chlorofilu.

5.3.1.2. Cykl glioksalowy

Cykl glioksalowy przebiega przede wszystkim u roślin. Ale również występuje w komórkach drożdży, u Escherichia coli, u różnych gatunków z rodzaju Aspergillus, Mycobacterium, Pseudomonas i innych. U bakterii z rodzaju Bacillus pojawia się w początkowej fazie logarytmicznego wzrostu.

Cykl glioksalowy składa się z 5 etapów, katalizowanych przez 5 odrębnych enzymów. Pierwsze dwa etapy cyklu glioksalowego i ostatni - piąty - są identyczne jak w cyklu Krebsa (porównaj rozdział 5.3.1.1). W szczegółach wygląda to następująco:

1. W pierwszym etapie cyklu glioksalowego (Si)-syntaza cytrynianowa (1) (EC 2.3.3.1) łączy szczawiooctan z acetylo-CoA, w wyniku czego powstaje kwas cytrynowy.

2. Podobnie jak w cyklu Krebsa, etap 2-gi składa się z dwóch podetapów, katalizowanych przez ten sam enzym - hydratazę akonitanową (2) - EC 4.2.1.3. W efekcie tego etapu powstaje izocytrynian.

3. W trzecim etapie liaza izocytrynianowa (3) - EC 4.1.3.1 - zwana też izocytrytazą rozkłada izocytrynian na bursztynian (równie często w literaturze zwany sukcynylem) i glioksal. Od powstającego glioksalu wywodzi się nazwa cyklu.

izocytrynian <==> sukcynyl + glioksal

Ligaza ta działa jedynie na izomer izocytrynianu (1R,2S)-1-hydroksypropano-1,2,3- trikarboksylan. Enzym jest homotetramerem. Jego działanie hamują: jabłczan, bursztynian (hamowanie, na zasadzie sprzężenia zwrotnego) i fosfoenolopirogronian.

4. W czwartym etapie syntaza jabłczanowa (4) - EC 2.3.3.9 syntetyzuje (S)-jabłczan z glioksalu i acetylo-CoA. Syntaza ta, podobnie jak syntaza cytrynianowa należy do acylotransferaz i nie potrzebuje dodatkowego źródła energii w postaci ATP (energia zawarta jest w acetylo~SCoA).

glioksal +acetylo-CoA + H₂O <==> (S)-jabłczan + CoA

Enzym jest monomerem, jego aktywność hamuje fosfoenolopirogronian.

5. Piąty etap cyklu glioksalowego jest identyczny z 8 etapem cyklu Krebsa - dehydrogenaza jabłczanowa (5) (EC 1.1.1.37) utlenia jabłczan do szczawiooctanu i cykl zostaje zamknięty.

Rys. 5.3.3. Schemat cyklu glioksalowego

1. (Si)-syntaza cytrynianowa - EC 2.3.3.1, 2. Hydrataza akonitanowa - EC 4.2.1.3, 3. Liaza izocytrynianowa - EC 4.1.3.1, 4. Syntaza jabłczanowa- EC 2.3.3.9, 5. Dehydrogenaza jabłczanowa - EC 1.1.1.37, 5'. Dehydrogenaza jabłczanowa (szczawiooctan-dekarboksylująca) - EC 1.1.1.38, 6. Dehydrogenaza bursztynianowa (ubichinon) - EC 1.3.5.1, 7. Hydrataza fumaranowa - EC 4.2.1.2, 8. Dekarboksylaza szczawiooctanowa - EC 4.1.1.3, 9. System dehydrogenazy pirogronianowej (przenoszącej acetyl) - EC 1.2.4.1.

Podstawowym zadaniem cyklu glioksalowego jest zsyntetyzowanie cząsteczki bursztynianu z dwóch cząsteczek acetylo-CoA. Przy tym, w trakcie jego przebiegu powstaje jedynie 1 cząsteczka zredukowanego NADH. Ta niewielka ilość pojawiającego się NADH, dla wielu drobnoustrojów jest niezwykle korzystna; zwłaszcza, kiedy rosną one w środowisku o ograniczonej dostępności tlenu (chyba, że posiadają zdolności fermentacyjne). Należy bowiem pamiętać, że zredukowany NADH i ewentualnie FADH₂ muszą z powrotem ulec utlenieniu. Jeżeli pojawia się ich duża ilość w komórce (tak, jak w cyklu Krebsa), łańcuch oddechowy przy niedostatecznym dostępie tlenu może ich nie nadążyć utleniać. W przypadku roślin jest to oczywiste.

Sumarycznie cykl glioksalowy można zapisać następująco:

2 acetylo-CoA + NAD⁺ → bursztynian + NADH + H⁺ + 2 CoASH

Pojawiający się w trakcie przemian glioksal niekoniecznie musi „domykać” cykl glioksalowy. U archeowców (Archaea) reduktaza glioksalowa (EC 1.1.1.26) redukuje glioksal do glikolu. U Escherichia coli syntaza semialdehydu tartronianowego (EC 4.1.1.47) z dwóch cząsteczek glioksalu syntetyzuje semialdehyd kwasu tartronianowego (2-hydroksy-3-oksopropionian), który dalej jest przekształcany w D-glicerynian, a ten może być wykorzystany do syntezy niektórych aminokwasów (np. seryny, alaniny). W liściach niektórych roślin (np. kukurydzy), ale także w komórkach niektórych drobnoustrojów (np. Rhodopseudomonas palustris) transaminaza glicynowa - EC 2.6.1.4 -transformuje glioksal w glicynę.

U niektórych roślin (np. w liściach szczawiu, w szpinaku) oksydaza (S)-2-hydroksykwasowa (EC 1.1.3.15) - z FMN, jako kofaktorem - utlenia glioksal do kwasu szczawiowego. Ten z kolei dekarboksylaza szczawianowa - EC 4.1.1.2 - może przekształcić w kwas mrówkowy (np. u bakterii Bacillus subtilis). Część z tych transformacji (11) można rozpatrywać w kategorii szlaków peryferyjnych.

U roślin i w niektórych mikroorganizmach eukariotycznych (np. w glonach) cykl glioksalowy zlokalizowany jest w specjalnych organellach komórkowych zwanych glioksysomami. Ta lokalizacja jest nieprzypadkowa, bowiem w glioksysomach przebiega również proces β-oksydacji kwasów tłuszczowych, którego końcowym produktem jest acetylo-CoA, będący równocześnie substratem cyklu glioksalowego.

Wytworzony w cyklu glioksalowym bursztynian może ulegać dalszym przekształceniom; poprzez fumaran do jabłczanu i ten dalej do szczawiooctanu (tzw. boczna odnoga cyklu glioksalowego), a ten ostatni może zostać włączony w proces glukoneogenezy - czyli syntezy glukozy i z niej innych sacharydów. U roślin przemianę bursztynianu do szczawiooctanu katalizują enzymy cyklu Krebsa: dehydrogenaza bursztynianowa (ubichinon) (6) - EC 1.3.5.1 i hydrataza fumaranowa (7) - EC 4.2.1.2, a ostatnią transformację jabłczanu do szczawiooctanu enzym wspólny dla obu cykli: dehydrogenaza jabłczanowa (5) - EC 1.1.1.37.

Szczególne znaczenie ma cykl glioksalowy u roślin oleistych. Gromadzą one tłuszcze w nasionach jako materiał zapasowy dla zarodka. Kiedy nasionko kiełkuje, cykl glioksalowy umożliwia szybkie uruchomienie syntezy cukrów kosztem zawartych w komórce tłuszczów.

Cykl glioksalowy dostarcza komórce roślinnej jedynie 1-ną cząsteczkę zredukowanego NADH, która zresztą i tak jest wykorzystywana w procesach anabolicznych. Tak więc, komórka roślinna nie zyskuje energii w postaci ATP w wyniku przebiegu cyklu glioksalowego. Ale, jak to opisano w rozdz.5.5, rośliny wytwarzają ATP w oparciu o fotofosforylację i ilość ATP wytworzona w tym procesie w zupełności im wystarcza do prawidłowego funkcjonowania.

Natomiast u chemoorganotrofów prokariotycznych - nie mających zdolności fotosyntezy, a posiadających cykl glioksalowy zamiast lub obok cyklu Krebsa - sprawa przedstawia się zupełnie inaczej. Cała energia wytwarzana w postaci ATP pochodzi u nich z procesów katabolicznych. U różnych drobnoustrojów przedstawia się to rozmaicie.

Komórki Saccharomyces cerevisiae mogą - w zależności od warunków środowiska (tj. dostępu do źródła węgla, w postaci sacharydów oraz natlenienia podłoża) - prowadzić zarówno metabolizm tlenowy, jak i beztlenowy. Drożdże niefermentujące (należy pamiętać o względnym znaczeniu tego słowa) katabolizują sacharydy wyłącznie na drodze tlenowej. Jednakże, w momencie wyczerpania się zasobów cukru w podłożu hodowlanym, cykl Krebsa zostaje zahamowany (na etapie transformacji do izocytrynianu). Zostaje natomiast uruchomiony cykl glioksalowy i wówczas, jako źródło węgla komórki wykorzystują inne dostępne w komórce lub w podłożu metabolity np. aldehyd octowy, etanol, glicerol, które są przekształcane w cyklu glioksalowym w acetylo-CoA.

Uruchomiana zostaje boczna odnoga cyklu glioksalowego (enzymy 6, 7), a pojawiający się jabłczan zostaje przekształcony w pirogronian za pomocą dehydrogenazy jabłczanowej (szczawiooctan-dekarboksylującej) (5') - EC 1.1.1.38.

(S)-jabłczan + NAD⁺ <=> pirogronian + NADH+H⁺ + CO₂

Ten metaloenzym ma zdolność dekarboksylacji szczawiooctanu in vitro. Aktywatorem są jony Mg²⁺ lub Mn²⁺. Występuje nie tylko, u Saccharomyces cerevisiae, ale także m.in. u Schizosaccharomyces pombe, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shewanella frigidimarinam.

Powstający pirogronian na drodze dekarboksylacji oksydacyjnej, pod działaniem dehydrogenazy pirogronianowej (przenoszącej acetyl) (9) - EC 1.2.4.1 z powrotem zostaje transformowany w acetylo-CoA.

Efekt energetyczny cyklu glioksalowego w tym przypadku jest następujący:

strata komórki	zysk komórki	ilość powstałego ATP
-	2 NADH+H^+	2 x 8/3 ATP = 5 i 1/3 ATP
	1 FADH2	1 x 2 ATP = 2 ATP
	razem	7 ⅓ ATP

W porównaniu z cyklem Krebsa (11ATP) 7⅓ ATP jest prawie o 4 ATP mniej. Ale, w przypadku Saccharomyces cerevisiae:

• komórka nie musi rosnąć w silnie natlenionych podłożach,

• komórka może wykorzystywać bursztynian w szlakach anabolicznych (10),

• komórka może katabolizować różne metabolity pośrednie (niekoniecznie sacharydy).

Ponadto, uwzględniając fakt, że u drożdży występuje cykl pentozowy - dostarczający całą gamę metabolitów pośrednich dla anabolizmu (szlaki amfiboliczne) - należy uznać, iż cykl glioksalowy jest doskonałą alternatywą cyklu Krebsa.

U bakterii z rodzaju Bacillus, występuje pewna analogia do układu opisanego u Saccharomyces cerevisiae. Przykładowo w komórkach Bacillus subtilis, w początkowych godzinach hodowli wgłębnych w fermentorach (do około 15-27 godziny hodowli, w zależności od warunków natlenienia podłoża) uruchomiony jest jedynie cykl glioksalowy. W podłożu zostaje nagromadzany bursztynian, stąd widoczne zakwaszenie środowiska hodowlanego z wyjściowego pH 8,5 do 5,8-6,2 (przy niedostatecznym natlenieniu, pH może obniżyć się nawet do 4,0). Jeżeli ilość rozpuszczonego tlenu w podłożu jest nie mniejsza niż 60% nasycenia, podobnie jak u drożdży Saccharomyces cerevisiae część bursztynianu jest konwertowana boczną odnogą cyklu glioksalowego do acetylo-CoA - zysk komórki to wyliczone już 7⅓ ATP.

Cykl Krebsa zostaje odblokowywany dopiero w późnej fazie logarytmicznego wzrostu, a nawet niekiedy tuż przed sporulacją, gdy wyczerpaniu ulegają łatwo przyswajalne źródła węgla i energii, a komórki zaczynają się przygotowywać do wytworzenia endospor. Wtedy też w cyklu Krebsa spaleniu do CO₂ ulega nagromadzony bursztynian i inne kwasy organiczne. Dzięki temu w krótkim czasie powstaje dużo ATP niezbędnego przy sporulacji. Wtedy też, w warunkach tlenowych, pH środowiska zaczyna z powrotem wzrastać nawet pod koniec hodowli do 8,7- 8,9, czyli wyższego niż wyjściowe.

U niektórych drobnoustrojów, m.in. Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Pasteurella multocida, Vibrio vulnificus, Actinobacillus pleuropneumoniae transformację szczawiooctanu do pirogronianu katalizuje dekarboksylaza szczawiooctanowa (8) - EC 4.1.1.3. Z bioenergetycznego punktu widzenia komórki nie ma to większego znaczenia. Enzym jest o tyle ciekawy, że jego działaniu towarzyszy wydalenie poza komórkę dwóch jonów sodu. Koenzymem jest biotyna, a kofaktorem, reakcji Mg²⁺.

Zwierzęta (w tym człowiek) nie posiadają cyklu glioksalowego.

5.3.2. I faza katabolizmu

Dopiero teraz, po omówieniu III fazy katabolizmu - co według autora jest oczywiste, z punktu widzenia logistycznego i jednocześnie dydaktycznego - zostanie omówiona I faza katabolizmu. Jej omawianie rozpoczniemy od rozkładu poli- i oligosacharydów do monosacharydów i przekształceń tych ostatnich do glukozy. W podrozdziale 5.3.2.2. omówiona zostanie hydroliza tłuszczów, w podrozdziale 5.3.2.3 rozkład białek i peptydów do aminokwasów i na koniec transport komórkowy.

5.3.2.1. Konwersja złożonych węglowodanów do glukozy

Węglowodany są szeroko rozpowszechnionymi substancjami w świecie ożywionym i pełnią niezliczoną ilość funkcji, m.in. magazynowania i transportu energii (skrobia u roślin, glikogen u zwierząt), budowy składników strukturalnych komórek (lignino-celuloza u roślin, chityna u zwierząt, mannan u drożdży, itp.).

Najwięcej węglowodanów występuje w roślinach. Nic też dziwnego, że są one podstawowym składnikiem diety roślinożerców. Ale również stanowią one około 60% spożywanego pokarmu i pokrywają 25% zapotrzebowania energetycznego organizmu ludzkiego. Praca niektórych organów np. mózgu w 100% czerpie energię z przemian glukozy. Spośród wszystkich węglowodanów, w największych ilościach spożywamy skrobię. Zwierzęta roślinożerne spożywają najwięcej błonnika roślinnego - kompleksu substancji ścian komórkowych roślin o budowie lignino-celulozowej - nieprzyswajalnego przez nasz organizm. Obok tych dwóch biopolimerów w pokarmie człowieka w znaczących ilościach występują: disacharydy - sacharoza, laktoza, maltoza, a także monosacharydy - glukoza i fruktoza.

I-sza faza katabolizmu węglowodanów polega na pozakomórkowym rozłożeniu poli- i oligosacharydów do monosacharydów, które są transportowane do wnętrza komórek i dalej przekształcane w glukozę.

Mikroorganizmy wydzielają enzymy rozkładające poli- i oligosacharydy do swojego otoczenia, natomiast zwierzęta produkują je w odpowiednio wyspecjalizowanych komórkach (np. w trzustce) i wydzielają je do przewodu pokarmowego; tym niemniej, w obu tych przypadkach mamy do czynienia z enzymami pozakomórkowymi.

Depolimeryzacja skrobi do glukozy: enzymy amylolityczne

Makromolekuła taka, jak skrobia nie może być bezpośrednio wchłonięta przez komórkę. Musi ona zostać wcześniej rozłożona na mniejsze cząsteczki.

W naszym organizmie proces enzymatycznego rozkładu skrobi zapoczątkowany zostaje już w jamie ustnej podczas żucia pokarmu. Ślina zawiera enzym α-amylazę „ślinową” - zwaną w medycynie ptialiną, która rozszczepia wiązania α-1,4-glikozydowe występujące w skrobi. Dzięki jej działaniu amyloza rozkłada się nawet do maltozy i maltotriozy, a amylopektyna do α-dekstryn, związków zbudowanych z kilku do kilkunastu cząsteczek glukozy połączonych wiązaniami α-1,4 i jednym, rzadko dwoma wiązaniami α-1,6. Nazwa α-dekstryny wskazuje, że są to produkty działania α-amylazy (odpowiednio β-dekstryny są produktami działania β-amylazy). Ptialina może działać jedynie w obrębie jamy ustnej i przełyku, dlatego że jej optymalne pH wynosi 6,7 (nie działa już w żołądku, gdzie pH obniża się nawet do 1,5). Aktywatorem α-amylazy „ślinowej” są jony Cl^-.

Powstałe α-dekstryny trawione są dopiero w dwunastnicy pod wpływem α-amylazy trzustkowej. Ta odmiana α-amylazy działa dużo dłużej, w porównaniu ze ślinową i w efekcie jej działania powstają: glukoza, maltoza, izomaltoza (wszystkie trzy w niewielkich ilościach) oraz α-dekstryny graniczne - krótkołańcuchowe polimery glukozy o 3-4 cząsteczkach glukozy połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi zawierające jedno wiązanie α-1,6 (z wyjątkiem maltotriozy). α-Dekstryny graniczne z chemicznego punktu widzenia są oligosacharydami. Disacharydy: maltoza i izomaltoza już w pewnym, choć niewielkim stopniu mogą być wchłaniane do krwi. Jednakże z reguły zarówno one, jak i α-dekstryny graniczne ulegają w kolejnym etapie trawienia dalszej hydrolizie do glukozy, na powierzchni komórek pokrywających jelito cienkie przy udziale glukoamylazy i glukozydazy amylopektynowej (oficjalne nazwy i numery EC tych enzymów oraz ich właściwości omówione zostaną w dalszej części tego rozdziału). W podobny sposób, jak skrobia w naszym organizmie ulega trawieniu glikogen.

Natomiast u roślin, a zwłaszcza u drobnoustrojów znaleziono dużo więcej enzymów depolimeryzujących skrobię.

Enzymy rozkładające skrobię ogólnie nazywa się je enzymami amylolitycznymi. Należą one klasy hydrolaz - EC 3., podklasy glukozylaz - EC 3.2., pod-podklasy glukozydaz - EC 3.2.1. Poniżej scharakteryzowano najważniejsze z nich. O kolejności ich omawiania zdecydowało biotechnologiczne znaczenie (przyjęte według uznania autora podręcznika). Dla niektórych enzymów, obok nazwy oficjalnej (rekomendowanej przez ExPASy), podano dla porównania nazwę systematyczną.

• 
  α-amylaza - EC 3.2.1.1. Nazwa systematyczna: glukanohydrolaza α-1,4-D-glukanu. Jest to tzw. "amylaza dekstrynująca". W sposób losowy rozszczepia wiązania α-1,4-glikozydowe wewnątrz łańcucha - jest więc endoenzymem. Nie potrafi rozszczepiać wiązania α-1,6-glikozydowego. Wiązanie α-1,4 rozszczepia jedynie wtedy, gdy obok siebie znajdują się trzy cząsteczki glukozy połączone takimi wiązaniami i jednocześnie przy środkowej cząsteczce brak jest wiązania α-1,6.

Wskutek jej działania szybko spada lepkość roztworów skrobiowych, gdyż α-amylaza może „rozpołowić” cząsteczkę amylozy lub amylopektyny, a lepkość roztworów skrobi zależy od jej stopnia spolimeryzowania (długości łańcucha). Przy dłuższym działaniu na skrobię kolejno pojawiają się amylodekstryny, erytrodekstryny, achrodekstryny i wreszcie na koniec α-dekstryny graniczne oraz pewne ilości glukozy, maltozy i izomaltozy. Grupy hydroksylowe przy 1 atomie węgla glukozy uwalniane w wyniku jej działania występują w konfiguracji α.

Atakuje skrobię, glikogen i spokrewnione poli- i oligosacharydy.

Ryc.5.3.4. Schemat działania α-amylazy: a) na amylozę, b) na amylopektynę.

R - glukoza z końcową grupą redukująca

• β-amylaza - EC 3.2.1.2. Nazwa systematyczna: maltohydrolaza α-1,4-D-glukanu. Jest to tzw. "amylaza cukrująca". Hydrolizuje wiązania α-1,4-glikozydowe, co drugie, od końca nieredukującego, odszczepiając maltozę - jest więc egzoenzymem. Nie rozszczepia wiązań α-1,6-glikozydowych, dlatego rozkłada ona amylopektynę tylko w 65% pozostawiając "rdzeń", tzw. β-dekstrynę graniczną, w której pozostają niezhydrolizowane wszystkie wiązanie α-1,6, czyli rozgałęzienia. Szeroko rozpowszechniona u roślin, spotykana też u niektórych gatunków bakterii z rodzaju Bacillus.

Wskutek jej działania lepkość roztworów skrobiowych obniża się bardzo powoli, (bo wolno przebiega skracanie łańcucha amylozy i amylopektyny), natomiast względnie szybko pojawiają się cukry redukujące (maltoza). Przy długim działaniu w roztworach skrobi stwierdza się jedynie obecność maltozy i β-dekstryn granicznych. Uwalniana ze skrobi maltoza występuje w konfiguracji β.

Atakuje skrobię, glikogen i spokrewnione poli- i oligosacharydy.

Ryc.5.3.5. Schemat działania β-amylazy: a) na amylozę, b) na amylopektynę.

R - glukoza z końcową grupą redukująca

• α-1,4-glukozydaza glukanowa - EC 3.2.1.3. Nazwa systematyczna: glukohydrolaza α-l,4-D-glukanu. Znana w biotechnologii jako glukoamylaza lub amyloglukozydaza, jeszcze dawniej nazywana γ-amylazą.

Hydrolizuje terminalne wiązanie α-1,4-glikozydowe, sukcesywnie odrywając od nieredukującego końca łańcucha cząsteczki β-D-glukozy. Większość znanych form tego enzymu może również względnie szybko hydrolitycznie rozszczepiać napotkane po drodze wiązanie α-1,6-glikozydowe, ale pod warunkiem, że następne w sekwencji jest wiązanie α-1,4-glikozydowe. W amylopektynie szybkość hydrolizy wiązania α-1,6-glikozydowego jest, tym niemniej, prawie 30 razy mniejsza od szybkości rozszczepienia wiązania α-1,4- w amylozie.

Niektóre preparaty bakteryjne tego enzymu mogą hydrolizować wiązania α-1,6- i α-1,3-D-glikozydowe również w innych polisacharydach. Enzym działa dużo szybciej na polisacharydy aniżeli na oligosacharydy.

• oligo-1,6-glukozydaza - EC 3.2.1.10. Nazwa systematyczna: α-1,6-glukozydaza oligosachary- dowa. Znana też jako izomaltaza. Hydrolizuje wiązania α-1,6-glikozydowe w wielu oligosacharydach powstających podczas rozkładu skrobi i glikogenu przez α-amylazę, ale także rozszczepia wiązanie α-1,6 w izomaltozie.

Ponadto, enzym ten - podobnie jak amylo-α-1,6-glukozydaza (EC 3.2.1.33) - może hydrolizować wiązanie α-1,6-glikozydowe w krótkich łańcuchach, które mogą się pojawiać przy działaniu pullulanazy (EC 3.2.1.41) i izoamylazy (EC 3.2.1.68).

• dekstrynaza graniczna - EC 3.2.1.142. Systematyczna nazwa: α-1,6-glukanohydrolaza dekstrynowa. Znana również jako glukozydaza amylopektynowa, bądź R-enzym. Hydrolizuje wiązania α-1,6-glikozydowe w α- i β-dekstrynach granicznych powstałych z amylopektyny, glikogenu oraz z pullulanu. W pełni rozkłada do glukozy α-dekstryny graniczne. Natomiast, enzym roślinny w zasadzie nie działa na glikogen.

• izoamylaza - EC 3.2.1.68. Nazwa systematyczna: alfa-1,6-glukanohydrolaza glikogenowa. Hydrolitycznie rozszczepia wiązanie α-1,6-glikozydowe w glikogenie, amylopektynie i β-dekstrynach granicznych, usuwając rozgałęzienia. Różni się od dekstrynazy granicznej (EC 3.2.1.142) i pullulanazy (EC 3.2.1.41) tym, że nie jest w stanie hydrolizować pullulanu i α-dekstryn granicznych.

Obok wymienionych wyżej enzymów na amylopektynę może działać jeszcze kilka innych, np.:

• α-1,6-glukozydaza glukanowa (EC 3.2.1.70) wytwarzana przez bakterie z rodzaju Streptococcus. Enzym hydrolizuje wiązanie α-1,6-D-glikozydowe w α-1,6-D-glukanach i pochodnych oligosacharydach, ale na dekstran i izomaltosacharydy działa bardzo wolno.

• pullulanaza (EC 3.2.1.41). Hydrolizuje wiązanie α-1,6-D-glikozydowe w pullulanie, w amylopektynie i glikogenie a także w α- i β-deksretnach granicznych.

• α-glukozydaza (EC 3.2.1.20) - została szczegółowo opisana w grupie sacharydaz.

Depolimeryzacja polisacharydów innych niż skrobia

Glikogen. Zapasowy węglowodan zwierząt. Rozkład glikogenu do glukozy lub do glukozo-1-fosforanu nazywa się glikogenolizą. Proces ten może przebiegać dwoma drogami: fosforolityczną i hydrolityczną. Rozkład ten jest indukowany działaniem glukagonu, hormonu wytwarzanego w komórkach trzustki. Rozkład hydrolityczny jest w zasadzie identyczny z enzymatyczną depolimeryzacją amylopektyny - w jego rozkładzie uczestniczą te same enzymy, co w rozkładzie amylopektyny.

Natomiast rozkład fosforolityczny, przebiegający w mięśniach i w wątrobie, podlega zupełnie innej zasadzie. Biorą udział w nim trzy enzymy:

• fosforylaza glikogenowa - EC 2.4.1.1,

• enzym rozgałęziający α-1,4-glukan - EC 2.4.1.18,

• izoamylaza - EC 3.2.1.68 lub pullulanaza - EC 3.2.1.41.

Efektem ich działania jest wytworzenie glukozo-1-fosforanu (bez straty ATP) wykorzystywanego po transformacji do glukozo-6-fosforanu w glikolizie.

Fosforylaza glikogenowa - EC 2.4.1.1 - katalizuje reakcję fosforolitycznego odszczepiania reszty glukozy od nieredukującego końca cząsteczki glikogenu, z jednoczesnym jej ufosforylowaniem, w wyniku czego powstaje α-D-glukozo-1-fosforan.

(α-1,4-D-glukan)_n + fosforan <==> (α-1,4-D-glukan)_n-1 + α-D-glukozo-1-fosforan

Takie fosforolityczne odszczepienie cząsteczki glukozy jest niezwykle korzystne energetycznie dla komórki, ponieważ oszczędza ona w ten sposób ATP niezbędne dla ufosforylowania glukozy do glukozo-6-fosforanu przed glikolizą. Koenzymem fosforylazy jest fosforan pirydoksalu.

Enzym usuwa reszty glukozy pod warunkiem, że są one oddalone o 4 i więcej wiązań α-1,4-glikozydowych od miejsca rozgałęzienia α-1,6. W przeciwnym przypadku enzym rozgałęziający α-1,4-glukan (EC 2.4.1.18) musi przenieść trzy reszty glukozowe z ramienia rozgałęzienia na rdzeń glikogenu - na grupę hydroksylową przy 4 atomie węgla (czyli przenosi trzy elementowy segment α-1,4-glukanu na rdzeń α-1,4-glukanu przy końcu nieredukującym). Teraz np. izoamylaza (EC 3.2.1.68) lub pullulanaza (EC 3.2.1.41) mogą rozszczepić wiązanie rozgałęziające α-1,6-glikozydowe i usunąć rozgałęzienie. U drobnoustrojów ich rolę może również pełnić dekstrynaza graniczna (EC 3.2.1.142). Po rozerwaniu wiązania α-1,6-glikozydowego ponownie działanie kontynuuje fosforylaza glikogenowa i odłącza kolejne cząsteczki glukozy.

Powstałe w procesie fosforolizy cząsteczki glukozo-1-fosforanu przekształcane są w glukozo-6-fosforan pod wpływem fosfoglukomutazy (EC 5.4.2.2). W wątrobie glukozo-6-fosforan przekształcany jest w glukozę pod wpływem glukozo-6-fosfatazy (EC 3.1.3.9), a następnie glukoza dyfunduje do krwi.

Dekstran. W technologii żywności stosowany bywa jako zagęszczacz, dzięki któremu można uzyskać półstałą konsystencję produktów. Natomiast dekstran o masie cząsteczkowej 40 kDa i 70 kDa jest stosowany w medycynie, jako zamiennik plazmy krwi, zwłaszcza po urazach chirurgicznych. Jest także polecany jako bezpieczny biodegradowalny składnik opakowań dla żywności.

Do rozkładu dekstranu zdolne są bakterie zasiedlające jelita człowieka i zwierząt. Znanych jest kilka enzymów, które działając w kooperacji mogą zdepolimeryzować go do glukozy.

• dekstranaza (EC 3.2.1.11). Systematyczna nazwa: 6-glukanohydrolaza α-1,6-glukanu. Jest to endoenzym losowo hydrolizujący wiązania α-1,6-glikozydowe zwłaszcza w dekstranie.

• egzo-1,2-α-glukozydaza łańcucha dekstranu (EC 3.2.1.115). Hydrolizuje wiązania α-1,2-D-glikozydowe w miejscach rozgałęzienia dekstranu i podobnych polisacharydów, uwalniając wolną D-glukozę.

• α-1,6-izomaltotriozydaza dekstranowa (EC 3.2.1.95). Hydrolizuje wiązania α-1,6-glikozydowe w dekstranie, usuwając sukcesywnie izomaltotriozę od nieredukującego końca łańcucha.

• α-1,6-izomaltozydaza glukanowa (izomaltodekstranaza - EC 3.2.1.94). Hydrolizuje wiązanie α-1,6-glikozydowe w polisacharydach (m.in. w dekstranie) usuwając sukcesywnie izomaltozę od nieredukującego kończ łańcucha. Enzym znaleziony m.in. u Arthrobacter globiformis.

• mykodekstranaza (EC 3.2.1.61). Endoenzym, hydrolizujący wiązania α-1,4-glikozydowe w α-D-glukanach zawierających zarówno wiązania α-1,4, jak i α-1,3-glikozydowe. Działa na niektóre odmiany dekstranu, uwalniając nigerozę (α-1,3-D- glikopiranozydo-glikopiranozyd) i α-4-D-nigerozoglukozę.

Inulina. Stanowi materiał zapasowy dla niektórych roślin; spore ilości tego polisacharydu występują w korzeniach cykorii czy omanu, bulwach topiamburu, a także w roślinach z rodziny astrowatych. Można ją spotkać także w miodzie. Jest prebiotykiem i nie jest trawiona przez enzymy naszego ustroju. Jej rozkładu dokonują bakterie w okrężnicy.

Do enzymów rozkładających inulinę należą:

• inulinaza (EC 3.2.1.7). Jest to endohydrolaza rozszczepiająca wiązania β-2,1-fruktofuranozowe w inulinie.

• β-(2,1)-fruktozydaza fruktanowa (EC 3.2.1.153). Hydrolizuje końcowe nieredukujące wiązanie β-2,1-fruktofuranozowe we fruktanach.

• β-fruktozydaza fruktanowa (EC 3.2.1.80). Hydrolizuje terminalne, nieredukujące wiązania β-2,1 i β-2,6-fruktofuranozowe występujące we fruktanach. Rozkłada inulinę, lewan i sacharozę.

Lewan. Może być wytwarzany w medium podczas fermentacji żywności lub pasz dla zwierząt przez niektóre szczepy bakterii mlekowych (np. przez Lactobacillus reuteri)

Do enzymów rozkładających lewan należą:

• β-(2,6)-fruktozydaza fruktanowa (EC 3.2.1.154). Hydrolizuje końcowe nieredukujące wiązanie β-2,6-fruktofuranozowe we fruktanach.

• lewanaza (EC 3.2.1.65). Losowo hydrolizuje wiązanie β-2,6-fruktoforanozowe β-2,6-fruktanach zawierających więcej niż trzy podjednostki fruktozowe.

• 6-lewanobiohydrolaza 2,6-β-fruktanowa (EC 3.2.1.64). Hydrolizuje β-2,6-fruktofuran, usuwając sukcesywnie od końca łańcucha disacharyd - lewanobiozę (β-6-fruktofuranozydo-D-fruktozę).

Błonnik roślinny to kompleks substancji ścian komórkowych roślin, który jest nieprzyswajalny przez nasz organizm. Jest substancją niejednorodną, o budowie lignino-celulozowej. Obejmuje on zarówno frakcje polisacharydów np. celulozę, hemicelulozę, pektyny, gumy i kleje roślinne, polisacharydy roślin morskich (alginiany, agar, karaceny), skrobię oporną, jak i ligniny, nie będące węglowodanami.

Surowy błonnik roślinny pochodzący z jadalnych części roślin (ewentualnie poddanych obróbce technologicznej) nazywany jest błonnikiem pokarmowym i stanowi pewien procent naszej diety. Większość składników włókna pokarmowego jest degradowana częściowo lub całkowicie przez bakterie w przedżołądkach przeżuwaczy (np. krowy), w jelicie grubym i ślepym innych zwierząt roślinożernych, a także w jelicie grubym wszystkożernych, w tym człowieka.

Pektyna. Pektyny dla ludzi, pod względem odżywczym są ciałami balastowymi. Pod względem żywieniowym stanowią jedną z frakcji rozpuszczalnego włókna pokarmowego (błonnika). Wiele mikroorganizmów jest w stanie rozkładać pektynę.

Do enzymów pektynolitycznych - rozkładających pektyny - zalicza się niektóre hydrolazy i liazy.

• pektynoesteraza (EC. 3.1.1.11). Hydrolizuje wiązanie estrowe w pektynie uwalniając alkohol metylowy.

• poligalakturonaza (E.C 3.2.1.15). Systematyczna nazwa glikanohydrolaza poli-α-1,4-galaktouronidu. W sposób losowy hydrolizuje wiązanie α-1,4-D-galoktozouronowe w kwasie poligalakturonowym, uwalniając oligogalaktouronidy. Działa również na pektynę, ale jedynie w miejscach, występowania kwasu galakturonowego (z wolną grupą -COOH) - powoduje szybki spadek lepkości roztworów pektyny.

• α-1,4-galakturonidaza galakturanowa (EC 3.2.1.67). Nazwa systematyczna: galakturonohydrolaza poli-α-1,4-galaktouronidu. Odszczepia po jednej cząsteczce D-galaktouronianu od poli-α-1,4-galaktouronidu.

• egzo-poli-α-galakturonozydaza (EC. 3.2.1.82). Nazwa systematyczna: digalakturonohydrolaza poli-α-1,4-galaktouronidu. Odszczepia dwie cząsteczki kwasu galakturonowego od nieredukującego końca łańcucha poli-α-1,4-galaktouronidu.

• liaza pektynianowa (EC. 4.2.2.2). Nazwa systematyczna liaza α-1,4-D-galaktouronianowa. Powoduje niehydrolityczne rozszczepienie wiązania α-1,4-galaktouranowego w pektynianie dając oligosacharyd z grupą 4-deoksy-α-D-gluc-4-enuronyzolową od jego końca nieredukującego i skrócony pektynian. Preferuje działanie na pektynian, natomiast pektyna jest preferowanym substratem dla liazy pektynowej (EC. 4.2.2.10).

• liazy pektynowej (EC. 4.2.2.10). Działa tak, jak liaza pektynianowa, preferując jednak pektynę, jako substrat.

• 
  disacharydoliaza pektynianowa (EC 4.2.2.9). Nazwa systematyczna: egzoliaza poli-α-1,4-galaktouronidu. Niehydrolitycznie odrywa od redukującego końca łańcucha pektynianu, pektyny lub podobnych związków disacharyd, cząsteczkę 4-(4-deoksy-α-D-gluc-4-enuronyzylo)-D-galakturonową.

• liaza oligogalakturonidowa (EC. 4.2.2.6 ). Niehydrolitycznie degraduje oligogalaktouronidy. Także katalizuje reakcję usuwania terminalnych nienasyconych fragmentów z 4-(4-deoksy-α-D-gluc-4-enuronyzylo)-D-galakturonianów.

Celuloza. Organizm ludzki celulozę wykorzystuje w minimalnym stopniu tj. ok. 5% i to tylko dzięki enzymom wytwarzanym przez mikroflorę przewodu pokarmowego. Celuloza jest w wysokim stopniu wykorzystywana przez przeżuwacze, które dzięki bogatej mikroflorze swoich żołądków są w stanie niemal całkowicie rozłożyć celulozę do β-D-glukozy.

Do enzymów celulolitycznych - rozkładających celulozę - zalicza się:

• celulaza (EC 3.2.1.4). Nazwa systematyczna: 4-glukanohydrolaza β-1,4-(1,3;1,4)-D-glukanu. Enzym w sposób losowy hydrolizuje wiązanie β-1,4-glikozydowe wewnątrz łańcucha celulozy (jest endohydrolazą). Atakuje amorficzne regiony celulozy, choć niektóre celulazy działają również na krystaliczne fragmenty. Działa również na inne β-glukany, w tym na licheninę -celulozę rezerwową niektórych porostów i mchów. Hydrolizuje również wiązanie β-1,4 w D-glukanach zawierających wiązanie β-1,3. Szeroko rozpowszechniona w świecie drobnoustrojów.

• β-glukozydaza (EC 3.2.1.21). Nazwa systematyczna: glukohydrolaza β-D-glukozydów. Hydrolizuje wiązanie β-1,4-glikozydowe, odszczepiając od nieredukującego końca łańcucha β-D-glukozę. Działa na celobiozę i krótkie oligocelulodekstryny. Wykazuje szeroką specyficzność substratową w stosunku do β-D-glukozydów: może działać również na β-D-galaktozydy, α-L-arabinozydy, β-D-ksylozydy i β-D-fukozydy.

• β-1,4-celobiodaza celulozowa (EC.3.2.1.91). Znana też jako celobiaza. Odcina cząsteczkę celobiozy od nieredukującego końca łańcucha celulozy i celobiotetroz. Działają na amorficzne i krystaliczne regiony celulozy i celulodekstryn.

• β-1,4-glukozydaza glukanu (EC3.2.1.74). Hydrolizuje wiązanie β-1,4- glikozydowe w β-1,4-D-glukanach, usuwając sukcesywnie glukozę. Działa również powoli na celobiozę.

Hemicelulozy, niejednorodna grupa polisacharydów występujących, obok celulozy i ligniny, w ścianach komórkowych roślin - są jednym ze składników błonnika pokarmowego. Wśród hemiceluloz rozróżnia się ksylany, galaktany, arabany oraz mannany. W ich skład wchodzą również kwasy uronowe.

Ze względu na złożoną budowę hemiceluloz istnieje wiele enzymów rozkładających ten biopolimer. Szczegóły dotyczące jego degradacji omawiane są w ramach wykładu „Ekologia Biochemiczna” - obieg węgla w przyrodzie.

Przykładowo, enzymatyczna hydroliza ksylanu wymaga udziału kilku enzymów o różnych funkcjach. Do całkowitej degradacji rozgałęzionego acetyloksylanu niezbędne mogą być następujące enzymy:

• endo-β-1,4-ksylanaza (EC 3.2.1.8). Atakuje w sposób przypadkowy łańcuch ksylanu, rozszczepiając liniowe wiązania glikozydowe typu β-1,4. W wyniku jej działania powstają ksylooligosacharydy. Enzym ten spotykany bywa u wielu grzybów, m.in. u szczepów Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, ale także u bakterii, np. z rodzaju Bacillus czy też Clostridium.

• β-1,4-ksylozydaza ksylanowa (EC 3.3.1.37). Odszczepia od nieredukującego końca łańcucha ksylanu D-ksylozę - jest egzoenzymem. Działa głównie na ksylooligosacharydy, ale również na ksylobiozę. Enzym ten znajdowany bywa u wielu gatunków pleśni z rodzaju Aspergillus, u Candida utilis, Trichoderma koningii, ale także u bakterii z rodzaju Bacillus.

• endo-β-1,3-ksylozydaza ksylanowa (EC 3.2.1.32). Losowo hydrolizuje wiązanie β-1,3-D-glikozydowe w β-1,3-ksylanach.

• β-1,3-ksylozydaza ksylanowa (EC 3.2.1.72). Sukcesywnie usuwa D-ksylozę od nieredukującego końca łańcucha β-1,3-D- ksylanów rozszczepiając terminalne wiązanie β-1,3-glikozydowe.

• α-1,2-glukuronozydaza ksylanowa (EC 3.2.1.131). Hydrolizuje połączenia α-1,2-(4-O-metylo)glukuronydowe w głównym łańcuchu ksylanów z „twardych drzew”.

• endo-1,4-β-ksylanaza glukuronoarabinoksylanowa (EC 3.2.1.136). Jest to endoenzym i hydrolizuje w połączenia β-1,4-D-ksylulozylowe w niektórych glukanoarabinoksylanach. Przejawia zwłaszcza wysoką aktywność hydrolityczną w stosunku do hemiceluloz ścian komórkowych niektórych zbóż. Jest wytwarzana m.in. przez Bacillus subtilis.

• celobiohydrolaza oligoksyloglukanowa specyficznie redukująca koniec (EC 3.2.1.150). Hydrolizuje celobiozę z redukującego końca ksyloglukanów składających się z β-1,4-glukanów zawierających α-D-ksylulozową grupę na 6-O-glukozie. Jej substratem są różne nietypowe hemicelulozy znajdowane w ścianie komórkowej niektórych roślin. Enzym znaleziono u grzybów Geotrichum sp. M128.

• endo-β-1,4-glukanaza ksyloglukano-specyficzna (EC 3.2.1.151). Enzym hydrolitycznie rozszczepia ksyloglukan na oligosacharydy ksyloglukanowe - jest endoenzymem. Znaleziony został m.in. u Aspergillus aculeatus.

• egzo-β-1,4-glukanaza ksyloglukano-specyficzna (EC 3.2.1.155). Odszczepia ksyloglukano-oligasacharydy hydrolizując wiązanie β-1,4-glukozydowe.

• ksylanaza oligosacharydowa redukująca koniec (EC 3.2.1.156). Hydrolizuje β-1,4-D-ksylozę umieszczoną na końcu oligosacharydów.

• α-L-arabinofuranozydaza (EC. 3.2.1.55). Usuwa arabinozę i podstawniki kwasu 4-O-metyloglukuronowego z łańcucha ksylanu.

Do całkowitego rozłożenia mannanów zawartych w drewnie, bądź w ścianie komórkowej drożdży niezbędne są inne enzymy, m.in.:

• endo-β-1,4-mannanaza (EC 3.2.1.78). Atakuje główny łańcuch mannanów, odcinając podstawione i niepodstawione oligomery takie jak: mannobiozę i mannozę.

• β-mannozydaza (EC. 3.2.1.25). Prowadzi hydrolizę rozpuszczalnych w wodzie oligomerów i dimerów do cząsteczki mannozy.

• 1,2-(1,3)-α-mannozydaza mannanowa (EC 3.2.1.77). Hydrolizuje wiązania α-1,2- i α-1,3- w mannanie z drożdży, usuwając mannozę. Po działaniu na mannan pochodzący z Saccharomyces cerevisiae pozostaje jedynie szkielet zbudowany z α-1,6-D-mannanu.

• 1,4-mannobiozydaza mannanowa (EC 3.2.1.100). Hydrolizuje wiązanie β-1,4-D-mannozydowe w β-1,4-mannanach, usuwając sukcesywnie mannobiozę od nieredukującego końca łańcucha.

• endo-1,6-α-mannozydaza mannanowa (EC 3.2.1.101). Losowo hydrolizuje wiązanie α-1,6-D-mannozydowe w nierozgałęzionych 1,6-mannanach - jest endoenzymem. Spotykana jest u wielu gatunków drożdży (w tym Schizosaccharomyces pombe).

• glukozydaza mannozylooligosacharydowa (EC 3.2.1.106). Jest to egzoenzym odcinający terminalną glukozę od nieredukującego końca łańcucha mannozylo-oligosacharydów.

• 1,2-α-mannozydaza mannozylooligosacharydowa (EC 3.2.1.113). Hydrolizuje terminalne wiązanie α-1,2-D-mannozydowe w mannozo-oligosacharaydach typu (Man)₉(GluNAc)₂.

• 1,3-1,6-α-mannozydaza mannozylooligosacharydowa (EC 3.2.1.114). Hydrolizuje terminalne wiązania α-1,3- i α-1,6-mannozydowe w mannozylo-oligosacharydach.

• egzo-1,2-1,6-α-mannozydaza mannanowa (EC 3.2.1.137). Hydrolizuje wiązania α-1,2- i α-1,6-mannozydowe w mannanie z drożdży uwalniając D-mannozę.

Pullulan. Polisacharyd syntetyzowany jest przez grzyb należący do gatunku Aureobasidium pullulan, powszechnie występujący na owocach i roślinach.

Pullulan depolimerowany jest pullulanazę (EC 3.2.1.41). Enzym hydrolizuje wiązanie α-1,6-D-glikozydowe w pullulanie, amylopektynie, glikogenie oraz w α- i β-granicznych dekstrynach.

Chityna jest polimerem zbudowanym z reszt N-acetyloglukozoaminy (spotyka się również nazwę N-acetyloglukozamina), połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym. Jest to składnik strukturalny zrogowaciałych pancerzy owadów i skorupiaków.

Do enzymów rozkładających chitynę należą:

• chitynaza (EC 3.2.1.14). Nazwa systematyczna glukanohydrolaza poli[1,4-(N-acetylo-β-D-glukozoaminidynowa)]. Jest to endoenzym, który losowo hydrolizuje wiązanie β-1,4-N-acetylo-β-D-glukozoaminidynowe w chitynie i chitynodekstrynach. Niektóre odmiany enzymu wykazują również aktywność typową dla lizozymu (EC 3.2.1.17). Chitynaza jest szeroko rozpowszechniona w świecie drobnoustrojów; m.in. Streptomyces i Escherichia coli stosują ją do walki z innymi drobnoustrojami i stąd ich odmiana enzymu wykazuje aktywność lityczną „lizozymo-chitynazową”. Można ją jednak spotkać również u roślin (m.in. ziemniaki, tytoń), gdzie pełni funkcje obronną przeciw grzybowym patogenom zawierającym chitynę. Można ją również spotkać u niektórych ssaków (w tym u człowieka); pełni funkcję obronną przeciw nicieniom i innym patogenom, ale też bierze udział w degradacja chityny i chitynotrioz.

• chitozanaza (EC 3.2.1.132). Ten endoenzym hydrolizuje wiązanie β-1,4- glukozoaminidynowe pomiędzy resztami D-glukozaminy w częściowo jeszcze acetylowanym chitozanie. Znanych jest wiele odmian tego enzymu, które hydrolizują rozmaite typy połączeń w chitozanie. We wszystkich przypadkach ich wspólną cechą jest hydroliza wiązania pomiędzy układem: -GluN-|-GluN-.

• deacetylaza chitynowa (EC 3.5.1.41). Hydrolitycznie rozkłada N-acetamidową grupę uwalniając octan i prowadząc do powstania chitozanu.

• 
  lizozym (EC 3.2.1.17), znany również jako muramidaza. Hydrolizuje wiązanie β-1,4 pomiędzy kwasem N-acetylo-muraminowym a N-acetylo-glukozaminą w peptydoglikanach lub pomiędzy resztami N-acetylo-D-glukozaminy występującymi w chitodekstrynach.

Kwas hialuronowy jest polisacharydem, w którym występuje wielokrotnie disacharyd utworzony z kwasu D-glukuronowego i D-N-acetyloglukozoaminy połączonych wiązaniem β-1,3. Kwas hialuronowy jest polisacharydem naturalnie występującym w ludzkim ciele, głównie w skórze.

Do enzymów degradujących ten biopolimer zalicza się:

• hialuronoglukuronidaza (EC 3.2.1.36). Losowo hydrolizuje wiązanie β-1,3 pomiędzy D-glukuronianem i N-acetylo-D-glukozoaminą.

• hialuronoglukozoaminidaza (EC 3.2.1.35). Losowo hydrolizuje wiązanie β-1,4 pomiędzy N-acetylo-β-D-glukozoaminą a D-glukuronianem w hialuronianie.

• liaza hialuronianowa (EC 4.2.2.1). Rozrywa hialuronowy łańcuch przy wiązaniu β-1,4- pomiędzy N-acetylo-D-galaktoaminą i D-glukozoaminą.

Lichenina (celuloza rezerwowa), polisacharyd o składzie chemicznym zbliżonym do celulozy. Występuje w mchach i porostach, szczególnie w mchu islandzkim (Cetraria islandica). Korealina (β-glukan zbożowy), polisacharyd liniowy, w którym obok wiązań β-1,4-glikozydowych występują wiązania β-1,3-glikozydowe.

Oba te biopolimery depolimeryzuje licheninaza:

• licheninaza (EC 3.2.1.73). Hydrolizuje wiązania β-1,4-glikozydowe w β-glukanach, w których obok siebie występują wiązania β-1,4- i β-1,3-glikozydowe.

Agaroza to naturalny polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy. Agarobiozy połączone są ze sobą wiązaniami β-1,4 i β-1,3-glikozydowymi. Występuje w ścianie komórkowej krasnorostów, należących do rodzajów Gelidium, Gelidella, Pterocladia, Gracillaria i Ahnfeltia. Glony te są także źródłem agaru. Depolimeryzację tego związku prowadzi β-agaraza.

• β-agaraza (EC 3.2.1.81). Enzym hydrolizuje wiązania β-1,4-D-galaktozydowe w agarozie, dając tetramer, jako główny produkt.

κ-Karagenian jest liniowym sulfonowanym polisacharydem, w którym na zmianę pochodne galaktozy są połączone wiązaniami α-1,3 i β-1,4-glikozydowymi. Występuje w morskich glonach czerwonych z rodzin Gigartinaceae, Solieriaceae, Hypneaceae i Furcellariaceae. W czasie hydrolizy, rozpada się, dając galaktozę i anhydro-3,6-galaktozę.

• κ-karaginanaza (EC 3.2.1.83). Jest endoenzym, który hydrolitycznie rozszczepia wiązanie β-1,4-glikozydowe pomiędzy 4-sulfo-D-galaktozą i 3,6-anhydro-D-galaktozą w κ-karagenianie.

Kwas alginowy, jest prostołańcuchowym kopolimerem złożonym z dwóch homopolimerów; jeden to poli-β-1,4-D-mannuronian zbudowany z kwasu D-mannurowego, a drugi to jego C-5 epimer poli-α-1,4-L-guluronian zbudowany z kwasu L-gulurowego. Kwas alginowy występuje w plechach różnych gatunków brunatnic (Phaeophyceae).

Do enzymów rozkładających ten biopolimer należą:

• liaza poli(β-D-mannnuronianu) - (EC 4.2.2.3) znana lepiej jako liaza alginianowa. Enzym depolimeryzuje alginian rozrywając wiązanie β-1,4-D-glikozydowe w poli-β-1,4-D-mannuronianie dając oligosacharydy. Głównie występuje u Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae.

• liaza poli(α-L-guluronianu) - (EC 4.2.2.11) znana jako alginaza II. Enzym depolimeryzuje alginian rozrywając wiązanie α-1,4-D-glikozydowe w poli-α-1,4-L-guluronianie.

Rozkład di- i oligosacharydów do monocukrów: Sacharydazy

Jak już wspomniano, w trakcie depolimeryzacji polisacharydów mogą pojawiać się di- i oligosacharydy. Związki te w wyniku działania di i oligosacharydaz są rozkładane do monocukrów. Część tych enzymów omówiono już wcześniej. Do omówienia pozostały disacharydazy (glukozydazy działające na disacharydy), które rozkładają tak ważne cukry, jak maltoza, sacharoza czy laktoza. Omówienia wymaga również rozkład niektórych oligosacharydów spotykanych w przyrodzie.

Maltoza. Cukier słodowy, tworzy się podczas enzymatycznego rozpadu skrobi. Zbudowana jest z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem -1,4-glikozydowym. Rozkładana jest przez α-glukozydazę:

• α-glukozydaza - (EC 3.2.1.20). Nazwa systematyczna: glukohydrolaza α-D-glukozydów. Znana również pod niezalecaną nazwą: maltaza. Hydrolizuje terminalne wiązanie α-1,4-glikozydowe, odszczepiając cząsteczkę α-D-glukozy od nieredukującego końca łańcucha. Skutecznie działa na maltozę i krótkie oligosacharydy z wiązaniami α-1,4. Bakteryjne enzymy nie działają na polisacharydy, a jeżeli już, to bardzo wolno. Jednakże α-glukozydaza jelitowa wolno hydrolizuje wiązanie α-1,4 w polisacharydach, a także bardzo wolno może hydrolizować wiązanie α-1,6-glikozydowe.

Sacharoza, zwana również cukrem trzcinowym lub buraczanym, zasługuje na szczególne wyróżnienie wśród disacharydów, z uwagi na szerokie rozpowszechnienie w przyrodzie. Występuje w liściach, łodygach, nasionach, owocach, korzeniach i bulwach różnych roślin. Jej zawartość w łodygach trzciny cukrowej i bulwach buraków cukrowych może dochodzić do 24%. Znaczne jej ilości zawiera miód naturalny.

• β-fruktofuranozydaza (EC 3.2.1.26), znana również jako inwetaza. Hydrolizuje terminalne nieredukujące wiązanie β-D-fruktofuranozydowe występujące w β-D-fruktofuranozydach. Szeroko rozpowszechniona w świecie drobnoustrojów i roślin. Działa bardzo skutecznie na sacharozę, prowadząc do jej rozkładu na fruktozę i glukozę (ale nazwa sacharaza jest niezalecana). Niektóre odmiany enzymu (np. z Thermotoga maritima) równie skutecznie hydrolizują rafinozę, inulinę i lewan, a także mogą wykazywać aktywność fruktotransferazową.

• α-glukozydaza sacharozowa - (EC 3.2.1.48). Nazwa systematyczna: α-D-glukohydrolaza sacharozowa. Występuje u zwierząt (również u człowieka). Hydrolizuje sacharozę i maltozę przez atak na α-glikozydowe wiązanie. Hydrolizuje również wiązanie α-1,6-D-glikozydowe i stąd rozkłada również izomaltozę. U zwierząt odgrywa ważną rolę w końcowym etapie trawienia węglowodanów z α-D-glikozydowym wiązaniem.

Laktoza, czyli cukier mlekowy, bo występuje w mleku ssaków. Zbudowana jest z galaktozy i glukozy połączonych wiązaniem β-1 od strony galaktozy i stąd jej nazwa β-1,4-D-galaktopiranozylo-glukopiranozyd.

Do enzymów rozkładających laktozę zalicza się:

• β-galaktozydaza (EC 3.2.1.23), zwana niepoprawnie laktazą. Hydrolizuje terminalne, nieredukujące wiązanie β-D-galaktozowe w β-D-galaktozydach. Niektóre odmiany enzymu mogą również hydrolizować wiązanie α-L-arabinozowe. Odmiany zwierzęce enzymu hydrolizują również β-D-fukozydy i β-D-glukozydy.

• laktaza (EC 3.2.1.108). Nazwa systematyczna: galaktohydrolaza laktozowa. Enzym jelitowy izolowany w kompleksie z dwoma innymi enzymami: z glikozyloceramidazą (EC 3.2.1.62) i β-galaktozydazą (EC 3.2.1 23). Rozkłada laktozę na D-galaktozę i D-glukozę. Do niedawna uważano, że jest to enzym związany jedynie z gatunkiem Homo sapiens i małpami (występuje u większości z nich). Dzisiaj wiadomo, że występuje również u niektórych innych ssaków np. u dzika, świni, owcy oraz szczura.

Celobioza (β-glikozyd) w stanie wolnym nie znaleziona w przyrodzie; powstaje podczas enzymatycznej hydrolizy celulozy.

Rozkładana jest przez omówioną już wcześniej β-glukozydazę (EC 3.2.1.21).

Melibioza. Otrzymywana jest przez częściową hydrolizę rafinozy. Stosowana w badaniach laboratoryjnych.

• α-galaktozydaza (EC 3.2.1.22), zwana też melibiazą. Hydrolizuje terminalne, nieredukujące wiązanie α-D-galaktozowe w α-D-galaktozydach. Działa m.in. na galaktomannany.

Rafinoza. Występuje w wielu roślinach np. w nasionach bawełny, a w małych ilościach w burakach cukrowych (podczas ich przeróbki gromadzi się w melasie) i w soi.

Dla przypomnienia: trisacharyd zbudowana z galaktozy, połączonej wiązaniem α-1,6 z glukozą, a ta wiązaniem -1--2 z fruktozą.

Cukier ten rozkładają omówione już wcześniej: β-fruktofuranozydaza (EC 3.2.1.26) i α-galaktozydaza (EC 3.2.1.22).

Panoza i izopanoza są to maltotriozy powstałe podczas rozkładu pullulanu i amylopektyny. Panoza: α-4-izomaltozyloglukoza, izopanoza: α-6-maltozyloglukoza. Powstają w wyniku działania:

• izopullulanaza (EC 3.2.1.57). Hydrolizuje pullulan do izopanozy. Enzym hydrolizuje panozę do do izomaltozy i glukozy. Znaleziony został m.in. u Aspergillus niger.

• neopullulanaza (EC3.2.1.135). Hydrolizuje pullulan do panozy (hydrolizuje wiązanie α-1,4-glikozydowe - ale na skrobię działa opornie).Hydrolizuje izopanozę do maltozy i glukozy. Znaleziony u Bacillus stearothermophilus i Thermoactinomyces vulgaris.

Rozkład glikozydów, glikanów i pokrewnych związków

Glikozydy to związki chemiczne, pochodne węglowodanów, które przyłączone są do niecukrowej grupy. Część cukrową takiego związku nazywa się glikonem, a cząsteczkę niecukrową aglikonem. W przypadku glikozydów roślinnych część cukrowa składa się najczęściej z kilku (do 12) cząsteczek cukrów prostych. Poniżej przedstawiono kilka przykładów tego typu związków i enzymt je rozkładające na jednostki składowe.

Kwercetyna to związek aromatyczny pochodzenia roślinnego z grupy flawonoidów glikozydowych, będący pochodną flawonu. W wyniku przyłączenie do cząsteczki kwercetyny cząsteczek różnych monosacharydów (np. ramnozy, glukozy, galaktozy) powstają glikozydy: np. kwercytryna, izokwercytryna, rutyna, i inne. Kwercytryna występuje w wielu roślinach m.in. w liściach dębu i w cebuli.

• kwercytrynaza (EC 3.2.1.66). Hydrolitycznie rozkłada kwercytrynę na L-ramnozę I kwercetynę.

Amigdalina. Jest β-gencjobiozydem nitrylu kwasu (-)-D-migdałowego (gencjobioza jest disacharydem zbudowanym z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem β-1,6-glikozydowym). Występuje w nasionach migdałowca zwyczajnego, pigwy pospolitej, czeremchach i niektórych drzew owocowych (np. moreli, wiśni, śliw, brzoskwiń). Końcowymi produktami rozkładu amigdaliny w naszym organizmie są: glukoza, aldehyd benzoesowy i cyjanowodór.

• β-glukozydaza amigdalinowa (EC 3.2.1.117). Enzym rozszczepia wiązanie β-1,6-glikozydowe w amigdalinie odszczepiając cząsteczkę glukozy; pozostały związek nazywa się (R)-prunazyną. Prunazyna dalej jest rozkładana do glukozy i nitrylu kwasu (-)-D-migdałowego przez β-glukozydazę prunazynową (EC 3.2.1.118).

α- i β-Fukozydy oraz α i β-ramnozydy. Tego typu związki są rozkładane przez następujące enzymy:

• β-D-fukozydazę (EC 3.2.1.38), fukoidanazę (EC 3.2.1.44), α-L-fukozydazę (EC 3.2.1.51).

• α-L-ramnozydazę (EC 3.2.1.40) i β-L-ramnozydazę (EC 3.2.1.43).

Glukuronidy to glikozydy złożone z kwasu glukuronowego oraz fenoli, alkoholi, steroidów lub innych związków z grupą hydroksylową; przekształceniu w glukuronidy ulega w organizmie wiele leków i trucizn. Rozkładane są przez β-glukuronidazę.

• β-glukuronidaza (EC 3.2.1.31). Rozkłada β-D-glukuronidy (w tym β-D-glukuronozydy) na kwas D-glukuronowy i odpowiedni alkohol.

Glikosfingolipidy. Należą do glikolipidów, związków zbudowanych z reszt sacharydowych połączonych kowalencyjnie z lipidami. W glikosfingolipidach część lipidową stanowi sfingozyna połączona z kwasami tłuszczowymi (tzw. ceramid).

• glikozyloceramidaza (EC 3.2.1.62). Odszczepia resztę cukrową od glikozylo-N-acylosfingozyny.

• endoglikozyloceramidaza (EC 3.2.1.123.). Enzym z Rhodococcus sp. degraduje glikosfingolipidy do oligosacharydu i ceramidu.

Glikany to część cukrowa przyłączona do łańcucha polipeptydowego. Tworzą złożone biopolimery zwane glikoproteinami.

Do enzymów rozkładających glikoproteiny zalicza się:

• endo-β-mannozydaza mannozyloglikoproteinowa (EC 3.2.1.152), endo-α-1,2-mannozydaza glikoproteinowa (EC 3.2.1.130) oraz endo-β-N-acetyloglukozoaminidaza mannozyloglikoproteinowa (EC 3.2.1.96).

* * *

W wyniku działania opisanych wyżej enzymów naturalnie występujące w przyrodzie biopolimery o budowie polisacharydowej, oligosacharydy, disacharydy, glikozydy, itd. są rozkładane do monomerów: glukozy i jej pochodnych, fruktozy, galaktozy i jej pochodnych, mannozy, ksylozy, itp. Powstałe heksozy i pentozy oraz ich pochodne wchłaniane są do komórki, gdzie heksozy przekształcone zostają do glukozy lub glukozo-6-fosforanu (takim transformacjom nie musi podlegać fruktoza - porównaj glikoliza). Natomiast pentozy są włączane w cykl pentozowy lub są transformowane do rybozy lub jej fosforanu.

Dalsze losy sacharydowych produktów rozkładu złożonych węglowodanów

Fruktoza. W procesach katabolicznych nie musi być przekształcana do glukozy. Frutozo-6-fosforan, który powstaje z fruktozy pod działaniem fruktokinazy (EC 2.7.1.4) bezpośrednio włączony może być do glikolizy. Tym niemniej istnieje możliwość jego transformacji do glukozo-6-P i glukozy:

• izomeraza glukozo-6-fosforanowa (EC 5.3.1.9) przekształca glukozo-6-P w fruktozo-6-P i na odwrót.

D-frutozo-6-fosforan <==> D-glukozo-6-fosforan

Hydroliza glukozo-6-P pod działaniem glukozo-6-fosfatazy (EC 3.1.3.9) pozwala otrzymać glukozę. A ponadto u wielu drobnoustrojów istnieje możliwość bezpośredniej transformacji fruktozy do glukozy:

• izomeraza ksylozowa (EC 5.3.1.5). Enzym ten katalizuje, przede wszystkim., przemianę D-ksylozy do D-ksylulozy, jednakże wiele drobnoustrojowych odmian tego enzymu może również wzajemnie przemieniać D-glukozę we D-fruktozę i na odwrót.

Galaktoza. Transformacja galaktozy do glukozy jest kilkuetapowa i przebiega w pseudocyklu:

1. galaktokinaza

2. urydylilotransferaza UDP-glukoza-

heksozo-1-fosforan

3. 4-epimeraza UDP-glukozowa

4. fosfoglukomutaza

2'. urydililotransferaza UTP-

heksozo-1-fosforan

5. glukozo-6-fosfataza

Rys.5.3.6. Katabolizm galaktozy

Podczas katabolizmu galaktozy, w pierwszym kroku (1) następuje jej ufosforylowanie do galaktozo-1-fosforanu pod działaniem galaktokinazy (EC 2.7.1.6). Krok drugi zależy od fazy wzrostu komórki, a ściślej biorąc od intensywności procesów anabolicznych. Podczas inicjacji katabolizmu galaktozy oraz podczas intensywnego anabolizmu z wykorzystaniem UDP-galaktozy (6) przebiega reakcja (2'), podczas której urydililotransferaza UTP-heksozo-1-fosforanowa (EC 2.7.7.10) katalizuje reakcję powstania UDP-galaktozy („aktywnej galaktozy”).

UTP + α-D-galaktozo-1-fosforan ==> UDP-galaktoza + PPi

Ta z kolei (3) pod działaniem 4-epimerazy UDP-galaktozowej (EC 5.1.3.2) jest przekształcana do UDPG (UDP-glukozy).

UDP-galaktoza <==> UDP-glukoza

Teraz w reakcji (2) urydylilotransferaza UDP-glukoza—heksozo-1-fosforan (EC 2.7.7.12) przenosi UMP z UDPG na galaktozo-1-P z wytworzeniem UDP-galaktozy i glukozo-1-P. Reakcja ta jest w pełni odwracalna a jej kierunek zależy od stężeń reagentów.

UDP-glukoza + α-D-galatozo-1-fosforan <==> α-D-glukozo-1-fosforan + UDP-galaktoza

Tak więc w reakcji (2) odtworzona zostaje zużyta w reakcji (3) UDP-galaktoza - stąd pojęcie pseudocyklu. Kiedy w komórce występuje wystarczająca ilość UDP-galaktozy (reakcje anaboliczne z jej wykorzystaniem (6) nie są zbyt intensywne), reakcja (2') jest zbędna i jest hamowana.

Powstały w reakcji (2) glukozo-1-fosforan pod działaniem fosfoglukomutazy (EC 5.4.2.2) w reakcji (4) zostaje przekształcony glukozo-6-P.

α-D-glukozo-1-fosforan <==> α-D-glukozo-6-fosforan

Glukozo-6-fosforan bezpośrednio zostaje włączony w glikolizę i w warunkach tlenowych zostaje przemieniony ostatecznie w acetylo-CoA, który dalej zostaje „spalony” w cyklu Krebsa. Tym samym wyjściowa cząsteczka galaktozy „spalona” zostaje do CO₂ i H₂O.

Ale istnieje możliwość transformacji glukozo-6-P do glukozy; reakcję hydrolizy katalizuje glukozo-6-fosfataza (EC 3.1.3.9).

Mannoza. W tym przypadku istnieją dwie możliwości włączenia tego związku w procesy mikrobiologicznego rozkładu:

• Izomeraza mannozowa (EC 5.3.1.7). Działa też na D-ramnozę

D-mannoza <==> D-fruktoza

• Izomeraza mannozo-6-fosforanowa (EC 5.3.1.8).

D-mannozo-6-fosforan <==> fruktozo-6-fosforan

Sorbitol (zwany też sorbitem). Alkohol heksahydroksylowy (zaliczany do heksoz) występuje w jagodach jarzębiny. Istnieją dwie drogi włączenia go w procesy kataboliczne. Pierwsza, z udziałem reduktazy aldehydowej (EC 1.1.1.21), która przekształca go w D-glukozę i druga droga, z udziałem 2-dehydrogenazy L-iditolowej (EC 1.1.1.14), która transformuje go do D-fruktozy.

L-fukoza (6-deoxy-L-galaktoza). Inicjacja katabolizmu L-fukozy jest kilku etapowa:

Rys. 5.3.7 Katabolizm L-fukozy

1. izomeraza L-fukuzowa, 2. fukulokinaza, 3. aldolaza fukolozo-fosforanowa

W pierwszej kolejności L-fukoza ulega izomeryzacji do L-fukulozy pod wpływem izomerazy L-fukuzowej (EC 5.3.1.25). Powstały sacharyd ulega ufosforylowaniu do L-fukulozo-1-fosforanu pod działaniem L-fukulokinazy (EC 2.7.1.51). Ten z kolei przy udziale aldolazy fukulozo-fosforanowej (EC 4.1.2.17) ulega rozszczepieniu na fosfodihydroksyaceton (jego dalsze losy są omówione w glikolizie) oraz (S)-aldehyd mlekowy, który łatwo ulega utlenieniu do kwasu mlekowego w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę laktaldehydową (EC 1.2.1 22).

Kwas glukuronowy. U wielu zwierząt i wielu drobnoustrojów przede wszystkim jest wykorzystywany w procesach anabolicznych. U Homo sapiens istnieje jednak droga pozbycia się jego nadmiaru z komórek (mówimy o metabolizmie glukuronianu). Natomiast wiele drobnoustrojów (rozmaite szczepy Bacillus, Clostridium, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus a ponadto Aspergillus niger i Escherichia coli) wykazuje zdolność do jego rozkładu, który można - w przypadku, kiedy jest istotnym źródłem energii dla komórki - rozpatrywać w kategorii katabolizmu. Ta droga wygląda następująco:

W pierwszym kroku kwas glukuronowy ulega ufosforylowaniu do 1-fosfo-α-D-glukuronianu pod działaniem glukuronokinaza (EC 2.7.1.43).

D-glukuronian + ATP ==> 1-fosfo-α-D-glukuronian + ADP

Następnie urydylilotransferaza glukuroniano-1-fosforanowa (EC 2.7.7.44) katalizuje reakcję powstania UDP-glukuronianu.

1-fosfo-α-D-glukuronian + UTP ==> UDP-glukuronian + PP_i

Ten ostatni pod działaniem 6-dehydrogenazy UDP-glukozowej (EC 1.1.1.22) ulega redukcji do UDPG, którego dalsze losy już znamy.

UDP-glukuronian +2NADH <==> UDP-glukoza +2NAD⁺ +H₂O

U niektórych roślin (np. Lemna minor - rzęsa drobna - rosnąca w moich akwariach) lub ryb (np. Danio rerio - danio pręgowany, też pływający w moich akwariach) istnieje alternatywna droga transformacji UDP-glukuronianu; pod działaniem dekarboksylazy UDP-glukuronianowej (EC 4.1.1.35) zostaje on transformowany do UDP-ksylozy. UDP-ksyloza wykorzystuwana jest w procesach anabolicznych.

UDP-glukuronian <==> UDP-ksyloza + CO₂

Kwas galakturonowy. Dla wielu drobnoustrojów może być świetnym źródłem węgla i energii - w tym przypadku śmiało możemy mówić o katabolizmie tego związku u tych mikroorganizmów.

W pierwszym kroku galakturonian pod działaniem galakturonokinazy (EC 2.7.1.44) ulega ufosforylowaniu do 1-fosfo-α-D-galakturonianu:

D-galakturonian + ATP ==> 1-fosfo-α-D-galakturonian + ADP

Następnie związek ten pod działanie bliżej jeszcze nie scharakteryzowanego enzymu - odpowiednika urydylilotransferazy glukuroniano-1-fosforanowej (EC 2.7.7.44) - ulega przekształceniu do UDP-galakturonianu, który dalej pod działaniem 4-epimerazy UDP-glukuronianowej (EC 5.1.3.6) ulega przekształceniu do UDP-glukuronianu, a dalsze losy tego związku już znamy.

UDP-D-galakturonian <==> UDP-glukuronian

Glukozoamina (zwana też glukozaminą). Wiele zwierząt żywiących się owadami lub skorupiakami posiada zdolność do katabolizowania glukozoaminy. Również nasz organizm posiada enzymy pozwalające na przyswajanie tego związku. Dla niektórych bakterii glukozoamina może być jedynym źródłem węgla, azotu i energii.

W pierwszym kroku ulega ona ufosforylowaniu do glukozoamino-6-fosforanu pod działaniem kinazy glukozoaminowej (EC 2.7.1.8). Powstały fosforan glukozoaminy ulega deaminacji do D-fruktozo-6-fosforanu pod działaniem deaminazy glukozoamino-6-fosforanowej (EC 3.5.99.6).

D-glukozoamino-6-fosforan + H₂O <==> D-fruktozo-6-fosforan + NH₃

Dalsze losy fruktozo-6-fosforanu już poznaliśmy.

N-acetylo-glukozoamina. Istnieją dwa sposoby włączenia tego związku w procesy rozkładu. Pierwszy jest bardzo prosty i polega na bezpośredniej deacetylacji N-acetylo-glukozoaminy pod działaniem deacetylazy N-acetyloglukozoaminowej (3.5.1.33) do glukozoaminy.

N-acetylo-D-glukozoamina + H₂O ==> D-glukozoamina + octan

Jednakże enzym ten posiadają jedynie nieliczne drobnoustroju m.in.: Bacillus cereus, Aspergillus niger, Escherichia coli i kilka szczepów Streptococcus.

Drugi sposób polega na ufosforylowaniu N-acetylo-D-glukozoaminy przez kinazę N-acetyloglukozoaminową (EC 2.7.1.59) do N-acetylo-D-glukozoamino-6-fosforanu, a ten pod działaniem deacetylazy N-acetyloglukozoamino-6-fosforanowej (EC 3.5.1.25) ulega deacetylacji do D-glukozoamino-6-fosforanu.

N-acetylo-D-glukozoamino-6-fosforan + H₂O ==> D-glukozoamino-6-fosforan + octan

Dalsze losy D-glukozoamino-6-fosforanu już znamy. Z punktu widzenia energetycznego obie drogi są identyczne. Ta druga droga występuje u wielu drobnoustrojów, a także u Homo sapiens.

Pentozy: D-ryboza, D-ksyloza i L-arabinoza. D-ryboza wykorzystywana jest przez żywe organizmy przede wszystkim w procesach anabolicznych (w syntezie nukleoidów). Natomiast niektóre drobnoustroje są w stanie wykorzystywać D-ksylozę i L-arabinozę, jako źródło węgla i energii.

Wszystkie te trzy pentozy, a także D-rybuloza i D-ksyluloza mogą podczas przemian komórkowych wzajemnie przechodzić w siebie, bezpośrednio lub też przez odpowiednie fosforany. Oto kilka przykładów:

• izomeraza rybozowa (EC 5.3.1.20). Występuje jedynie u Lactobacillus sp. i Mycobacterium smegmatis. Katalizuje reakcję:

D-ryboza <==> D-rybuloza

• izomeraza rybozo-5-fosforanowa (EC 5.3.1.6). Katalizuje reakcję:

D-rybozo-5-fosforan <==> D-rybulozo-5-fosforan

Reakcję ufosforylowania D-rybozy do D-rybozo-5-fosforanu katalizuje rybokinaza (EC 2.7.1.15).

A oto inna ważna reakcja:

D-rybulozo-5-fosforan <==> D-ksylulozo-5-fosforan

Przemianę katalizuje 3-epimeraza rybulozo-fosforanowa (EC 5.1.3.1).

Kolejna ważna reakcja, katalizowana przez izomerazę ksylozową (EC 5.3.1.5):

D-ksyloza <==> D-ksyluloza

I jeszcze jeden ważny ciąg reakcji: L-arabinoza. Izomeraza L-arabinozowa (EC 5.3.1.4) transformuje L-arabinozę do L-rybulozy

L-arabinoza <==> L-rybuloza

Ta z kolei pod wpływem rybolokinazy (EC 2.7.1.16) ulega ufosforylowaniu do L-rybulozo-5-fosforanu.

L(lub D)-rybuloza + ATP <==> L(lub D)-rybulozo-5-fosforan+ ADP

I na koniec 4-epimeraza L-rybuluzo-5-fosforanowa (EC 5.1.3.4) transformuje ten ostatni związek do D-ksylulozo-5-fosforanu.

L-rybulozo-5-fosforan <==> D-ksylulozo-5-fosforan

Reasumując: tak jak już wspomniano, pentozy w komórkach żywych organizmów bez problemów mogą przechodzić wzajemnie jedna w drugą. Te wzajemne transformacje pentoz w biochemii nazywane są „wewnątrzkomórkowymi przemianami pentoz”.

Powszechnie u żywych organizmów występuje zjawisko „recyklingu pentoz” - zwanego też „reutilizacją pentoz”, co m.in. oznacza pozbycie się ich nadmiaru z organizmu. W tym celu komórka wykorzystuje jedynie dwa enzymy występujące w cyklu pentozowym. Wbrew opinii prezentowanej w wielu podręcznikach z mikrobiologii i biochemii, te dwa enzymy właściwego cyklu pentozowego (patrz rozdz.5.4.) są obecne u większości żywych organizmów (stan wiedzy na rok 2008). Do nich należą:

• transketolaza (EC 2.2.1.1). Występująca u wszystkich znanych organizmów. Szczegóły dotyczące tego enzymu opisano w rozdziale 5.4.

• transaldolaza (EC 2.2.1.2). też szeroko rozpowszechniona wśród żywych organizmów.

Oba te enzymy konwertują D-ksylulozo-5-fosforan i D-rybozo-5-fosforan do fruktozo-6-fosforanu i aldehydu 3-fosfo-glicerynowego (szczegóły patrz - cykl pentozowy). Dalsze losy fruktozo-6-fosforanu już świetnie znamy. Losy aldehydu 3-fosfo-glicerynowego poznamy podczas omawiania glikolizy.

Rys. 5.3.8. Konwersja D-ksylulozo-5-fosforanu i D-rybozo-5-fosforanu do fruktozo-6-fosforanu i aldehydu 3-fosfoglicerynowego

Niektóre drobnoustroje są w stanie wykorzystywać pentozy jako jedyne źródła węgla i energii; mówimy wtedy o typowym katabolizmie pentoz u tych drobnoustrojów. U większości mikroorganizmów wykazujących taką zdolność, katabolizm pentoz odbywa się w cyklu pentozowym (szczegóły można znaleźć w rozdz. 5.4.).

Ale u drożdży (z rodzaju Candida, Hansenula i Saccharomyces cerevisiae) i u niektórych innych mikroorganizmów (np. Fusarium, Shewanella, i Pseudomonas putida) istnieje inna droga włączenia pentoz w szlaki kataboliczne. Jej węzłowym punktem jest ksylulozo-5-fosforan.

• fosfoketolaza (EC 4.1.2.9) katalizuje reakcję fosforolizy D-ksylulozo-5-fosforanu (kofaktorem jest DPT):

D-ksylulozo-5-fosforan + PO₄^3- <==> acetylo~P + aldehyd 3-fosfoglicerynowy + H₂O

Niedługo dowiemy się, że acetylo-fosforan łatwo może przejść w acetylo~SCoA pod wpływem acylotransferazy fosforanowej (EC 2.3.1.8):

acetylo-fosforan <==> acetylo~SCoA + fosforan

Tak więc, produkty fosforolizy D-ksylulozo-5-fosforanu bezpośrednio są włączane w szlaki kataboliczne: acetylo-CoA do cyklu Krebsa, a aldehyd 3-fosfoglicerynowy w szlak glikolizy.

5.3.2.2. Rozkład tłuszczów na monomery

Enzymy rozkładające tłuszcze nazywa się enzymami lipolitycznymi. Należą one do klasy hydrolaz (EC 3.), podklasy enzymów atakujących wiązanie estrowe (EC 3.1.) i pod-podklas: hydrolaz estrów karboksylowych (EC 3.1.1.) lub hydrolaz diestrów fosforowych (EC 3.1.4.). Poniżej scharakteryzowano najważniejsze z nich.

Lipazy

Lipazy to grupa enzymów z pod-podklasy hydrolaz estrów karboksylowych wykazująca zdolność do rozkładu estrów utworzonych przez kwasy karboksylowe o krótkich lub długich łańcuchach, nasyconych lub nienasyconych, oraz glicerolu a także niektórych alkoholi jednowodorotlenowych.

• lipaza triacylogliceroli (EC 3.1.1.3). Przede wszystkim enzym ten katalizuje reakcję hydrolizy nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli (TAG - zwanych dawniej triglicerydami) do diacyloglicerolu (DAG):

triacyloglicerol + H₂O <==> diacyloglicerol + kwas tłuszczowy

Reakcja ta zachodzi na granicy międzyfazowej wody i tłuszczu, (oczywiście enzym jest rozpuszczony w wodzie). Lipaza triacylogliceroli jest szeroko rozpowszechniona w ożywionym świecie. Odmiany tego enzymu występują w soku żołądkowym, trzustkowym, jelitowym (te, zaliczane są do enzymów trawiennych) i we krwi, jak również w wielu roślinach (głównie w nasionach) a także wytwarzane są przez wiele drobnoustrojów.

Trzustkowa odmiana enzymu działa również na diglicerydy DAG (ale wolniej) i jeszcze dalej na monoglicerydy prowadząc do pełnej hydrolizy cząsteczki triacyloglicerolu na glicerol i trzy cząsteczki kwasów tłuszczowych. Lipaza trzustkowa, jest produkowana w trzustce, skąd pod wpływem pobudzenia zostaje wydzielona do dwunastnicy w formie nieaktywnego proenzymu. W dwunastnicy, pod wpływem soli kwasów żółciowych, fosfolipidów i białka kolipazy, przekształca się w formę czynną. Enzym wykazuje również aktywność O-acylotransferazy.

• lipaza acylogliceroli (EC 3.1.1.23). Enzym hydrolizuje monoestry glicerolu z długimi łańcuchami kwasów tłuszczowych (głównie wyższych kwasów tłuszczowych).

Enzym znaleziony przede wszystkim u zwierząt (m.in. u człowieka, szczura, myszy); występuje w wątrobie, nerkach i w mózgu. Znaleziony został również u niektórych bakterii z rodzaju Bacillus. Jest enzymem wybitnie wewnątrzkomórkowym.

• lipaza lipoproteinowa (EC 3.1.1.34). Podobnie jak lipaza triacylogliceroli katalizuje reakcję hydrolizy triglicerydów do diglicerydów: Enzym zwierzęcy działa również na diacyloglicerole.

triacyloglicerol + H₂O <==> diacyloglicerol + kwas tłuszczowy

Specyficzność lipaz. Lipazy, ze względu na różnorodną specyficzność, mogą być podzielone ogólnie na pięć grup:

1. Lipazy substratospecyficzne. Preferują hydrolizę określonych estrów glicerolu (np. lipaza Penicillium sp. nie hydrolizuje DAG, natomiast lipaza Penicillium cyclopium hydrolizuje głównie MAG i DAG, zaś reakcja z udziałem TAG przebiega bardzo powoli).

2. Lipazy regioselektywne (specyficzne pozycyjnie). Są one aktywne tylko w stosunku do wiązań estrowych znajdujących się w określonej pozycji cząsteczki triacyloglicerolu (np. sn-1 i sn-3 lub sn-2). Przykładem lipazy 1,3-regioselektywnej może być wieprzowa lipaza trzustkowa oraz lipazy m.in. z Aspergillus niger lub Rhizopus oryzae. Regioselektywność w stosunku do pozycji sn-2 triacylogliceroli jest bardzo rzadka - taką specyficzność wykazuje lipaza Candida antarctica.

3. Lipazy niespecyficzne, które katalizują hydrolizę wiązania estrowego we wszystkich trzech pozycjach cząsteczki triacyloglicerolu z taką samą szybkością. Przykładami lipaz niespecyficznych są lipazy Penicillium expansum, Candida rugosa lub Staphylococcus hyicus.

4. Lipazy acylospecyficzne, czyli specyficzne w stosunku do struktury kwasów tłuszczowych. Niektóre z nich mogą być specyficzne dla określonego kwasu tłuszczowego, lub bardziej ogólnie dla określonej klasy kwasów tłuszczowych. Np. lipaza Geotrichum candidum jest wysoce specyficzna dla cis-9-nienasyconych kwasów tłuszczowych zawierających podwójne wiązanie w pozycji 9 (cis -9). Innym przykładem są lipazy z Penicillium roquefortii i różne zwierzęce lipazy żołądkowe, specyficzne w stosunku do krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, a wykazujące niewielką aktywność w stosunku do długołańcuchowych kwasów tłuszczowych.

5. Lipazy stereospecyficzne. Rozróżniają one konformację przestrzenną grup acylowych. Rozróżniają one dwie różne cząsteczki enancjomerów lub też rozróżniają dwie, identyczne chemicznie, ale stereochemicznie różne enancjomeryczne grupy wewnątrz prochiralnych cząsteczek substratu. Oznacza to, że w mieszaninie racemicznej związku chemicznego katalizują one przemiany tylko jednego z obecnych w niej cząsteczek enancjomeru (R)- lub (S)-. Przykładami lipaz stereospecyficznych typu sn-1 są lipazy z Humicola lanuginosa lub Pseudomonas fluorescens natomiast stereospecyficznych typu sn-3 lipazy z Candida antarctica lub Fusarium solani.

Fosfolipazy

Fosfolipazy to enzymy zaliczane do grupy lipolitycznych, katalizujących hydrolityczny rozkład fosfolipidów. Znanych jest pięć fosfolipaz o właściwościach lipolitycznych; oznaczonych odpowiednio A(1), A(2), B (o oficjalnej nazwie lizofosfolipaza), C i D. Wydzielane są one na zewnątrz komórki w przewodzie pokarmowym zwierząt, ale także mogą znajdować się w wydzielinach bakteryjnych i jadach.

Na poniższym rysunku pokazano miejsce hydrolizy wiązań estrowych w lecytynie przez fosfolipazy A(1), A(2), C i D.

Rys. 5.3.9. Miejsce działania fosfolipaz A(1), A(2), C i D w lecytynie

• fosfolipaza A(1) - (EC 3.1.1.32). Hydrolitycznie rozszczepia wiązanie estrowe pomiędzy grupą hydroksylową SN-1 glicerolu i grupą karboksylową nasyconego kwasu tłuszczowego. Kofaktorem reakcji są jony wapnia.

Fosfatydylocholina + H₂O <==> 2-acyloglicerofosfocholina + kwas tłuszczowy

Fosfolipaza A(1) wykazuje dużo szerszą specyficzność niż fosfolipaza A(2); mianowicie niektóre odmiany enzymu mogą również rozszczepiać wiązanie estrowe przy SN-2, prowadząc do powstania 1-acyloglicerofosfocholiny. Fosfolipaza A(1) występuje w jadzie os i szerszeni, a także w wydzielinach niektórych bakterii (np. Serratia liquefaciens i Escherichia coli).

• fosfolipaza A(2) - EC 3.1.1.4. Hydrolitycznie rozszczepia wiązanie estrowe pomiędzy grupą hydroksylową SN-2 glicerolu i grupą karboksylową nienasyconego kwasu tłuszczowego. Kofaktorem reakcji są jony wapnia.

Fosfatydylocholina + H₂O <==> 1-acyloglicerofosfocholina + kwas tłuszczowy

Enzym działa również na fosfatydyloetanoloaminę i niektóre inne fosfatydy usuwając kwas tłuszczowy przyczepiony w pozycji 2 glicerolu.

Fosfolipaza A(2) jest szeroko rozpowszechniona w żywych organizmach; występuje u ssaków, w jadzie wielu węży (m.in. żmije, kobry, jadowite węże Australijskie, węże koralowe i inne), a także u niektórych bakterii (np. Salmonella typhimrium).

• lizofosfolipaza zwana również fosfolipazą B (EC 3.1.1.5). Hydrolitycznie odłącza kwas tłuszczowy z pozycji SN-1 2-lizofosfatydylocholiny (inaczej 2-lizolecytyny, czyli związku powstałego po enzymatycznym odłączeniu acylu z pozycji 2 lecytyny, np. z 1-acyloglicerofosfocholiny).

2-lizofosfatydylocholina+ H₂O <==> glicerofosfocholina + kwas tłuszczowy

Bardzo szeroko rozpowszechniona w żywych organizmach, m.in. zwierzęta, (w tym człowiek), drożdże, grzyby, niektóre bakterie (np. E.coli). Występuje również w jadzie osy i szerszenia.

• fosfolipaza C (EC 3.1.4.3). Enzym należy do pod-podklasy hydrolaz diestrów fosforowych. Odszczepia od fosfatydylocholiny (lecytyny) fosfocholinę. Kofaktorem reakcji są jony Zn.

Fosfatydylocholina +H₂O <==> 1,2-diacyloglicerol + fosfocholina

Bakteryjny enzym działa także na sfingomeliny i fosfatydyloinozytol.

• fosfolipaza D (EC 3.1.4.4). Enzym należy do pod-podklasy hydrolaz diestrów fosforowych. Odszczepia od fosfatydylocholiny (lecytyny) cholinę.

Fosfatydylocholina +H₂O <==> kwas fosfatydylowy + cholina

Działa również na inne estry fosfatydylowe. Występuje u ssaków, drożdży i niektórych bakterii (np. Corynebacterium haemolyticum).

Inne enzymy lipolityczne

Do enzymów lipolitycznych soku trzustkowego obok lipazy trzustkowej i fosfolipaz zalicza się również esterazy.

• karboksyloesteraza (EC 3.1.1.1). Wykazuje bardzo szeroką specyficzność. Głównie katalizuje reakcję hydrolizy rozmaitych estrów kwasów karboksylowych:

ester kwasu karboksylowego + H₂O <==> alkohol + kwas karboksylowy

Działa również tak, jak lipaza acylogliceroli (EC 3.1.1.23), lizofofolipaza (EC 3.1.1.5) lub acetyloesteraza (EC 3.1.1.6). Esteraza soku trzustkowego rozszczepia m.in. estry cholesterolu i witamin rozpuszczalnych w tłuszczach oraz monoglicerydy. Wymaga soli żółciowych do pełnej aktywności i ochrony przed proteolizą w jelitach

Bardzo szeroko rozpowszechniona w świecie ożywionym (w tym człowiek).

5.3.2.3. Rozkład białek i peptydów do aminokwasów

Rozkład białek i peptydów do aminokwasów prowadzą enzymy zwane pospolicie proteolitycznymi. Należą one do podklasy hydrolaz peptydowych - EC 3.4. Enzymy te katalizują rozszczepienie wiązania peptydowego. Wewnątrz łańcucha polipeptydowego czynią to endopeptydazy (od EC 3.4.21. do EC 3.4.25. i ponadto EC 3.4.99.) a od jednego z jego końców: peptydazy (od EC 3.4.11. do EC 3.4.19.).Wśród nich są zwierzęce enzymy trawienne (np. pepsyna, trypsyna), proteinazy bakteryjne posiadające zdolności biodegradacyjne (np. subtilizyna z Bacillus subtilis), drobnoustrojowe endopeptydazy służące do ataku na inne drobnoustroje (np. α-lityczne proteinazy), endopeptydazy roślinne (np. papaina) i inne.

Endopeptydazy

Jeszcze do 2004 roku zwane były proteinazami. Nazwa proteinazy sugerowała jednak, że działają one jedynie na białka, co jest niezgodne z dzisiejsza wiedzą; enzymy te działają również na peptydy (w tym syntetyczne). Endopeptydazy charakteryzują się nietypową specyficznością. Mianowicie rozpoznają one konkretne miejsce w łańcuchu polipeptydowym, w którym rozszczepiają wiązanie peptydowe - ściślej biorąc, rozpoznają aminokwas lub aminokwasy, przy których rozszczepiają wiązanie peptydowe. Ponadto wiele z nich wykazuje specyficzność esterazową; tzn. są zdolne hydrolizować (ewentualnie w specyficznych warunkach syntetyzować) wiązania estrowe utworzone przez grupę karboksylową aminokwasu z odpowiednim alkoholem.

Endopeptydazy dzieli się na sześć pod-podklas:

• EC 3.4.21. - endopeptydazy serynowe,

• EC 3.4.22. - endopeptydazy cysteinowe,

• EC 3.4.23. - endopeptydazy aspartylowe,

• EC 3.4.24. - metaloendopeptydazy,

• EC 3.4.25. - endopeptydazy treoninowe,

• EC 3.4.99. - endopeptydazy o nieznanym mechanizmie działania.

Za podstawę tego podziału przyjęto budowę centrum aktywnego tych enzymów, a ściślej biorąc aminokwas bezpośrednio działający.

Endopeptydazy serynowe (EC 3.4.21.).

W centrum aktywnym tych enzymów występuje triada: Ser (jako aminokwas bezpośrednio działający), histydyna i kwas asparaginowy, jako aminokwasy wspomagające. W tej pod-podklasie znanych jest obecnie ponad 100 enzymów. Poniżej przedstawiono najważniejsze z nich, grupując je na podstawie ich katalitycznych właściwości.

• Endopeptydazy chymotrypsyno-podobne

Ich optymalne pH działania mieści się w przedziale 7-9. Ogólnie biorąc preferują rozrywanie wiązań peptydowych po karboksylowej stronie tyrozyny i fenyloalaniny.

• Chymotrypsyna - EC 3.4.21.1. Enzym trawienny pozakomórkowy, typowo zwierzęcy: głównie ssaki i owady. U człowieka produkowany jest przez trzustkę w postaci proenzymu - chymotrypsynogenu. Rozszczepia wiązanie peptydowe w układzie: Tyr-|-X, Trp-|-X, Phe-|-X i Leu-|-X.

• Chymotrypsyna C - EC 3.4.21.2. Enzym bardzo podobny do EC 3.4.21.1; główne różnice to: występuje w jelicie cienkim ssaków (u innych zwierząt nie spotykany) i preferuje hydrolizę wiązań peptydowych w układzie: Leu-|-X, Tyr-|-X, Phe-|-X, Met-|-X, Trp-|-X, Gln-|-X i Asn-|-X.

• Endopeptydaza Clp (inna nazwa: kazeinolityczna proteaza) - EC 3.4.21.92. Enzym bardzo szeroko rozpowszechniona w świecie bakterii: m.in. B.cereus, bakterie z rodzaju Mycobacterium, Streptomyces, niektóre Rhizobium, enterobakterie, bakterie z rodzaju Clostridium, itp. Zaliczany do endopeptydaz chymotrypsyno-podobnych. Hydrolizuje białka do małych peptydów w obecności ATP i jonów Mg²⁺. Przy braku ATP, hydrolizuje pentapeptydy i krótsze.

Jest to enzym wewnątrzkomórkowy, występujący w cytoplazmie. Bierze udział m.in. w rozkładzie uszkodzonych białek.

• Streptogryzyna A (inna nazwa: proteaza A ze Streptomyces) - EC 3.4.21.80. Hydrolizuje białka wykazując specyficzność podobną do chymotrypsyny. Jest to enzym charakterystyczny dla wielu szczepów bakterii z rodzaju Streptomyces.

• Endopeptydazy trypsyno-podobne

Ich optymalne pH działania mieści się około 8. Ogólnie biorąc preferują rozrywanie wiązań peptydowych po karboksylowej stronie aminokwasów zasadowych (argininy i lizyny). Ich masy cząsteczkowe są nieco większe od 20kDa.

• Trypsyna - EC 3.4.21.4. Pozakomórkowy zwierzęcy enzym trawienny (jakkolwiek znaleziony również u niektórych drobnoustrojów np. Fusarium oxysporum, czy Streptomyces erythraeus). U człowieka wchodzi w skład soku trzustkowego, wydzielany z trzustki w postaci nieaktywnego proenzymu - trypsynogenu, który w dwunastnicy pod wpływem niewielkich nawet ilości enterokinazy przekształca się w trypsynę. Dzięki autokatalitycznej zdolności trypsyny szybko dochodzi do pełnego uczynnienia wydzielonego trypsynogenu.

Optymalne pH działania trypsyny wynosi 8. Rozszczepia wiązanie peptydowe w białkach w układzie: Arg-|-X i Lys-|-X. Jej masa cząsteczkowa sięga 24kDa.

• Streptogrisin B - EC 3.4.21.81. Endopeptydaza wytwarzana przez bakterie z rodzaju Streptomyces. Pod względem właściwości jest bardzo podobna do trypsyny.

• Alkaliczne proteinazy

Jest to grupa endopeptydaz szeroko rozpowszechnionych u drobnoustrojów (zwłaszcza u bakterii z rodzaju Bacillus). Ich optymalne pH działania jest większe od 9. Ogólnie biorąc preferują rozrywanie wiązań peptydowych po karboksylowej stronie Leu, Tyr i Fen. Ich masy cząsteczkowe mieszczą się w zakresie od 15kDa do 30kDa.

• Subtilizyna - EC 3.4.21.62. W zasadzie można mówić o subtilizynach i subtilizyno-podobnych endopeptydazach, gdyż istnieje tak wiele odmian tych enzymów wytwarzanych przez rozmaite gatunki bakterii z rodzaju Bacillus i inne drobnoustroje. Wszystkie charakteryzuje optymalne pH działania większe od 10. Wykazują szeroką specyficzność pod względem miejsca ataku na wiązanie peptydowe w łańcuchu białka; mówi się nawet, że „rozszczepiają wiązania peptydowe w białkach w sposób trudny do jednoznacznego sprecyzowania”. Na przykład subtilizyna Carlsberg hydrolizuje wiązania peptydowe w utlenionym łańcuchu β-insuliny w 7 miejscach, a sublilizyno-podobna proteinaza ze Streptomyces aż w 11 miejscach. Tym niemniej preferują rozrywanie wiązań peptydowych w układzie Tyr-|-X, Phe-|-X i Leu-|-X (pod tym względem są podobne do chymotrypsyny, choć bez wątpienia ewoluowały niezależnie od siebie). Endopeptydazy te mogą ponadto hydrolizować wiązania peptydowe w peptydach, wiązania amidowe w amidach i estrowe w estrach aminokwasów. Enzymy te wykazują absolutny brak cysteiny.

• Peptydaza K (znana lepiej jako proteinaza K lub pronaza) - EC 3.4.21.64. Z uwagi na właściwości katalityczne zaliczana do alkalicznych proteinaz. W niektórych publikacjach zaliczana do endopeptydaz subtilizyno-podobnych, choć różni się od nich wybitną zdolnością do hydrolizy keratyn. Stąd niekiedy nazywana keratynazą ze Streptomyces. Wytwarzana m.in. przez Streptomyces fradie i Tritirachium album.

• Oryzyna (zwana też aspergillopeptydazą B lub alkaliczną proteinazą z Aspergillus) - EC 3.4.21.63. Pozakomórkowy enzym wytwarzany przez niektóre pleśnie z rodzaju Aspergillus (np. Asp. flavus lub Asp.sojae). Pod wieloma względami przypomina subtilizyny; m.in. podobnie hydrolizuje wiązania peptydowe w białkach. Nie hydrolizuje wiązań amidowych.

• Alpha-lityczna endopeptydaza - EC 3.4.21.12. Enzym zaliczany do alkalicznych endopeptydaz serynowych (m.in. z uwagi na optymalne pH działania równe 9), choć preferuje rozrywanie wiązań peptydowych w układzie Ala-|-X i Wal-|-X, zwłaszcza w ścianie komórkowej bakterii. Świetnie sobie radzi z rozkładem elastyny i stąd w wielu publikacjach nazywany elastazo-podobną endopeptydazą. Wytwarzany m.in. przez Achromobacter lyticus i Lysobacter enzymogenes. Nie wykazuje aktywności esterolitycznej.

• Inne endopeptydazy serynowe

• Elastaza trzustkowa (znana również jako pankreopeptydaza E) - EC 3.4.21.36. Enzym znajdowany w soku trzustkowym (w formie proenzymu uaktywnianego przez trypsynę). Hydrolizuje różne białka, ale odznacza się szczególną skutecznością w rozkładzie elastyny. Preferuje hydrolizę wiązania peptydowego utworzonego przez alaninę (Ala-|-X). Enzym typowy dla ssaków.

• Elastaza trzustkowa II - EC 3.4.21.71. Różnie się od EC 3.4.21.36 szerszym spektrum działania - preferuje hydrolizę wiązań peptydowych w białkach w układzie: Leu-|-X, Met-|-X i Phe-|-X. Enzym typowo zwierzęcy, rozkłada z powodzeniem elastynę.

Endopeptydazy tiolowe (EC 3.4.22.).

W centrum aktywnym tych enzymów, jako aminokwas bezpośrednio działający występuje cysteina (z reaktywną grupą tiolową -SH). Tego typu endopeptydazy występują głównie u roślin, ale można je też spotkać u niektórych drobnoustrojów, a ponadto wiele katepsyn należy do tej pod-podklasy enzymów.

• Endopeptydazy cysteinowe roślinne

• Papaina - EC 3.4.22.2. Enzym wytwarzany przez roślinę o wdzięcznej nazwie Carica papaya. Jej specyficzność substratowa jest szeroka. Hydrolizuje wiązania peptydowe obok aminokwasów kwaśnych, preferując jednak atak na rozległe obszary hydrofobowe w cząsteczce białka. Unika ataku w okolicach występowania waliny. Optymalne pH działania wynosi 7.

• Fikaina (ficyna) - EC 3.4.22.3 wytwarzana przez fikusy (np. Ficus glabrata) i Aktynidaina - EC 3.4.22.14 znajdowana w owocach kiwi (Actinidia chinensis) to dwie kolejne endopeptydazy cysteinowe o właściwościach zbliżonych do papainy.

• Bromelaina z pnia (dawna nazwa - bromelaina) - EC 3.4.22.32 i bromelaina z owoców (EC 3.4.22.33) to dwie endopeptydazy cysteinowe znajdowane w ananasach (Ananas comosus). Preferują rozrywanie wiązania peptydowego w układach: Arg-|-Ala, Arg-|-Arg i Liz-|-Tyr. Szybciej hydrolizują niskocząsteczkowe substraty białkowe.

• Katepsyny

• Katepsyna B - EC 3.4.22.1. Katepsyny to enzymy wewnątrzkomórkowe, u ssaków stanowiące integralną część lizosomalnego aparatu proteolitycznego, w którego skład wchodzą głównie endopeptydazy cysteinowe (katepsyny B, H, K, L, T i inne) ale także serynowe (katepsyna G - EC 3.4.21.20) i aspartylowe (katepsyna D - EC 3.4.23.5). Połączenie aktywności endopeptydazowej i peptydazowej tych enzymów pozwala na wydajne trawienie różnorodnych białek transportowanych do lizosomów, uwalniając wolne aminokwasy i dipeptydy, które są następnie ponownie transportowane do cytoplazmy i powtórnie zużywane w procesach metabolicznych, takich jak np. synteza białek.

Katepsyna B hydrolizuje szereg wiązań peptydowych, jednakże preferuje rozszczepienie wiązanie w układzie -Arg-Arg-|-X.

Katepsyny H, T, K, F, O, i V - należące do pod-podklasy endopeptydaz cysteinowych, w klasyfikacji enzymów oznaczone są odpowiednio: EC 3.4.22.16, 24, 38, 41 42 i 43.

• Endopeptydazy tiolowe drobnoustrojowe

• Klostrypaina (znana również jako Clostridiopeptydaza B) - EC 3.4.22.8. Enzym charakterystyczny dla bakterii z rodzaju Clostridium (np. Clostridium histolyticum). Optymalne pH działania 7, pI 4,8 a masa cząsteczkowa 50 kDa. Preferuje hydrolizę wiązań peptydowych w układzie Arg-|-X (z włączeniem układu Arg-|-Pro) oraz Lys-|-X; pod tym względem przypomina enzymy trypsynopodobne. Jest bardzo wrażliwa na związki chemiczne utleniające HCN i cysteinę.

• Streptopaina (zwana również proteinazą ze Streptpcocus) - EC 3.4.22.10. Jej specyficzność substratowa jest bardzo szeroka: pod tym względem przypomina papainę i stąd zaliczana do enzymów papino-podobnych. Optymalne pH działania w okolicach 7,5, pI=8,4 a masa cząsteczkowa sięga 32 kDa. Jest endopeptydazą charakterystyczną dla bakterii z rodzaju Streptococcus.

• Stafopaina - EC 3.4.22.48. Endopeptydaza cysteinowa o szerokim spektrum działania na białka z włączeniem elastyny! Jednakże preferuje hydrolizę niskocząsteczkowych substratów. Ale równie skutecznie hydrolizuje białka typu hemoglobiny czy kazeiny. Preferuje hydrolizę wiązania peptydowego w układzie Phe-Arg-|-X. Jest to typowa endopeptydaza cysteinowa dla bakterii z rodzaju Staphylococcus.

Endopeptydazy aspartylowe (EC 3.4.23.).

W centrum aktywnym tych enzymów, jako aminokwas bezpośrednio działający występuje reszta kwasu asparaginowego (z niezdysocjowaną grupą -COOH). I dlatego tego typu endopeptydazy działają w środowisku kwaśnym, w pH poniżej 5 (stąd dawna nazwa - proteinazy kwaśne).

• Endopeptydazy aspartylowe zwierzęce

• Pepsyna A - EC 3.4.23.1. i Pepsyna B - EC 3.4.23.2, dwa enzymy znajdowane u ssaków. Oba są składnikami soku żołądkowego. Pepsyna A wydzielana jest przez komórki gruczołowe żołądka w postaci pronzymu - pepsynogenu, który w środowisku kwaśnym (w pH około 2) lub/i pod wpływem samej pepsyny przechodzi w aktywną postać enzymu (tzw. autoaktywacja). Jej optymalne pH działania wynosi 1,8.

Pepsyna A preferuje rozrywanie wiązań peptydowych przy aminokwasach hydrofobowych, a już szczególnie lubi aminokwasy aromatyczne. W β utlenionym łańcuchu insuliny tnie wiązania wokół: 1-Phe-|-Val-2, 4-Gln-|-His-5, 13-Glu-|-Ala-14, 14-Ala-|-Leu-15, 15-Leu-|-Tyr-16, 16-Tyr-|-Leu-17, 23-Gly-|-Phe-24, 24-Phe-|-Phe-25 i 25-Phe-|-Tyr-26.

Pepsyna B z powodzeniem degraduje żelatynę, w stosunku do hemoglobiny nie przejawia zbytniej aktywności. W odróżnieniu od pepsyny A nie tnie wiązań peptydowych w układach: 1-Phe-|-Val-2, 4-Gln-|-His-5 oraz 23-Gly-|-Phe-24.

• Chymozyna (rennina, podpuszczka) - EC 3.4.23.4. Wykazuje szeroką specyficzność podobną do pepsyny. Wyróżnia się jednak tym, że w sposób specyficzny tworzy skrzep kazeinowy, poprzez rozerwanie wiązania peptydowego w κ-kazeinie 105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108.

Enzym wydzielany jest dużych ilościach przez gruczoły żołądkowe młodych ssaków, ale pod warunkiem, że karmione są one mlekiem (rozkłada kazeiną mleka).

• Katepsyna D - EC 3.4.23.5. Enzym o specyficzności zbliżonej do pepsyny, choć nieco węższej. Np. nie hydrolizuje wiązania peptydowego 4-Gln-|-His-5 w łańcuchu β utlenionej insuliny.

• Endopeptydazy aspartylowe pleśniowe

• Aspergillopepsyna I - EC 3.4.23.18. Wykazuje szeroką specyficzność w stosunku do rozkładanych białek. Generalnie faworyzuje hydrolizę wiązań peptydowych obok aminokwasów hydrofobowych. Nie akceptuje hydrolizy wiązań obok lizyny. Nie ścina mleka. Działa efektywnie w środowisku kwaśnym.

Enzym charakterystyczny dla wielu gatunków pleśni z rodzaju Aspergillus (m.in. A.awamori, A.foetidus, A.fumigatus, A.kawachii, A.niger, A.oryzae, A.saitoi, i A.sojae).

• Aspergillopepsyna II - EC 3.4.23.19. Występowanie i właściwości tej endopeptydazy są podobne do wyżej opisanej aspergillopepsyny I. Preferuje hydrolizę wiązań peptydowych w łańcuchu β insuliny w układzie: 3-Asn-|-Gln-4, 13-Gly-|-Ala-14, and 26-Tyr-|-Thr-27.

• Penicyliopepsyna - EC 3.4.23.20. Rozkłada wiele białek; pod tym względem przypomina pepsynę. Nie hydrolizuje wiązania peptydowego w β łańcuchu insuliny w układzie: 20-Gly-|-Glu-21. Ścina mleko ale nie aktywuje trypsynogenu.

Enzym spotykany u pleśni z rodzaju Penicillium (np. P. janthinellum, P.roqueforti i P.duponti).

• Endopeptydazy aspartylowe grzybowe

• Rhizopuspepsyna - EC 3.4.23.21. Pod względem specyficzności działania przypomina pepsynę. Nie hydrolizuje wiązań peptydowych w β łańcuchu insuliny w układzie: 4-Gln-|-His-5, 10-His-|-Leu-11 i 12-Val-|-Glu-13. Ścina mleko i aktywuje trypsynogen.

Znaleziona u Rhizopus chinensis i R.niveus.

• Mucorpepsyna - EC 3.4.23.23. Podobna do pepsyny. Nie hydrolizuje wiązań peptydowych obok lizyny. Ścina mleko, nie aktywuje trypsynogenu.

Izolowana była z Mucor pusillus i M.miehei.

• Endopeptydazy aspartylowe drożdżowe

• Candidiopepsyna - EC 3.4.23.24. Generalnie przypomina pepsynę: hydrolizuje wiązania peptydowe od strony grupy karboksylowej aminokwasów hydrofobowych, ale w β łańcuchu insuliny opuszcza układy: 15-Leu-|-Tyr-16, 16-Tyr-|-Leu-17 i 24-Phe-|-Phe-25. Charakteryzuje się aktywnością keratynolityczną (degraduje keratynę). Aktywuje trypsynogen.

• Saccharopepsyna - EC 3.4.23.25. Podobnie jak pepsyna, rozkłada wiele białek. Hydrolizuje wiązanie Leu-Leu-|-Val-Tyr-. Nie wykazuje aktywności esterolitycznej w stosunku do estrów Tyr i Arg..

• Rhodotorulopepsyna - EC 3.4.23.26. Specyficzność zbliżona do pepsyny. Hydrolizuje wiązanie peptydowe obok lizyny Lys-|-Ala-Ala. Aktywuje trypsynopgen.

Metaloendopeptydazy (EC 3.4.24.)

W centrum aktywnym tych enzymów, zamiast aminokwasu bezpośrednio działającego występuje jon Zn²⁺. Tego typu endopeptydazy działają w środowisku obojętnym lub lekko alkalicznym (w pH pomiędzy 7 a 9). Głównie są to enzymy drobnoustroje, ale można je również znaleźć u zwierząt. Tradycyjnie dzieli się je na kilka grup.

• Metaloproteinazy zwierzęce

U zwierząt znaleziono zaledwie kilka tego typu enzymów: m.in. prokolagenową N-endopeptydazę (EC 3.4.24.14) i neurolizynę (EC 3.4.24.16); oba enzymy spotykane u ssaków (m.in. człowiek, mysz, krowa).

• Metaloproteinazy obojętne

Te metaloendopeptydazy są szeroko rozpowszechnione wśród drobnoustrojów. W centrum aktywnym zawierają jon Zn²⁺. Ich optymalne pH działania oscyluje wokół 7.

• Termolizyna - EC 3.4.24.27. Preferuje rozrywanie wiązania peptydowego w układach: X-|-Leu i X-|-Phe. Jest to pozakomórkowy enzym. Zawiera obok jonu Zn²⁺ cztery jony Ca²⁺, stabilizujące jej IV-rzędową strukturę. Jej optymalna temperatura działania sięga 60°C, ale jest stabilna przez co najmniej 10 minut w temperaturze 90°C. Po raz pierwszy została znaleziona u Bacillus thermoproteolyticus. Odmiany termolizyny zostały znalezione u Micrococcus caseolyticus i Aspergillus oryzae.

• Bacillolizyna (obojętna proteinaza z Bacillus, megateriopeptydaza) - EC 3.4.24.28. Pod wieloma względami przypomina termolizynę, choć oba enzymy nieco się różnią.

Znajdowana jest u bakterii z rodzaju Bacillus, a zwłaszcza gatunków B.subtilis, B.amyloliquefaciens, B.megaterium, B.mesentericus, B.cereus i B.stearothermophilus.

• Pseudolizyna (obojętna proteinaza Pseudomonas) - EC 3.4.24.26. Podobna do termolizyny. Rozkłada wiele białek, w tym elastynę, odmiany kolagenu typu III i IV, fibroinę oraz immunoglobulinę A. Znajdowana u niektórych gatunków bakterii z rodzaju Pseudomonas.

• Metaoloproteinazy alkaliczne

Metaloendopeptydazy alkaliczne nie są tak szeroko rozpowszechnione, jak obojętne. Można je głównie spotkać wśród drobnoustrojów. W centrum aktywnym zawierają jon Zn²⁺. Ich optymalne pH działania oscyluje pomiędzy 7 a 9. Większość z nich przejawia aktywność kolagenolityczną.

• Kolagenaza bakteryjna (znana dawniej jako clostridiopeptydaza A) - EC 3.4.24.3. Wykazuje szczególne zdolności do hydrolizy wiązań peptydowych w kolagenie w tripletach: X-|-Gly-Pro-Pro lub X-|-Gly-Pro-Pro(OH).

Po raz pierwszy znaleziona została u Clostridium perfringens. Ale występuje również u innych bakterii z rodzaju Clostridium (np. Clostridium histolyticum), u wielu gatunków bakterii Vibrio, u Bacillus cereus, Pseudomonas marinoglutinosa, a nawet u znaleziona został u niektórych bakterii Streptomyces.

• Serralizyna - EC 3.4.24.40. Preferuje rozrywanie wiązań peptydowych w hydrofobowych obszarach białka. Jej optymalne pH działania waha się w granicach 9-10.

Znaleziona została u Serratia marcescens (i stąd nazwa enzymu), Escherichia freundii, Pseudomonas aeruginosa i Erwinia chrysanthemi.

• Proteinazy z Myxobacter

• Metaloendopeptydaza peptydylo-Lys - EC 3.4.24.20. Preferuje hydrolizę wiązania peptydowego w układzie X-|-Lys (w którym X może być Pro).

Znaleziona u Myxobacter sp.

• Metaloendopeptydazy inne

Do tej grupy należy cała gama różnych endopeptydaz zawierających w centrum aktywnym jon Zn²⁺. Trudno wszystkie tu wymienić. Przykładem mogą być:

• Saccharolysin - EC 3.4.24.37. Hydrolizuje wiązanie peptydowe w układach: Pro-|-Phe i Ala-|-Ala. Znajdowana głównie u drożdży.

• Metaloendopeptydaza β-lityczna - EC 3.4.24.32. W utlenionym β łańcuchu insuliny hydrolizuje m.in. wiązania: 23-Gly-|-Phe-24 i 18-Val-|-Cys(SO₃H).

Izolowana z Achromobacter lyticus i Lysobacter enzymogenes.

Endopeptydazy treoninowe (EC 3.4.25.)

W centrum aktywnym tych enzymów, jako aminokwas bezpośrednio działający występuje reszta treoniny. Aktualnie (2009) w tej pod-podklasie umieszczony jest jedynie jeden enzym (a w zasadzie olbrzymi kompleks enzymatyczny zbudowany z 28 podjednostek): kompleks endopeptydazy proteasomu - EC 3.4.25.1.

Endopeptydazy o nieznanym mechanizmie działania (EC 3.4.99.)

W tej pod-podklasie umieszczane są przejściowo endopeptydazy o nie znanym lub bliżej nie sprecyzowanym mechanizmie działania. Aktualnie (2009) ta pod-podklasa jest pusta..

Peptydazy

Peptydazy są egzoenzymami; hydrolitycznie rozrywają wiązanie peptydowe na końcach łańcucha peptydowego. Działają skutecznie na małe peptydy, jakkolwiek niektóre z nich mogą również działać na polipeptydy a nawet białka. Z punktu widzenia mechanizmu działania i ewentualnie budowy centrum aktywnego dzieli się je na 8 pod-podklas (pod-podklasa EC 3.4.12. jest aktualnie usunięta). Znanych jest obecnie (2009) ponad 100 tego typu enzymów. W podręczniku ograniczono się do podania jedynie kilku ich przykładów z każdej pod-podklasy.

Aminopeptydazy (EC 3.4.11.).

Odrywają po jednym aminokwasie od aminowego N-końca łańcucha peptydowego. Działają najskuteczniej na niewielkie peptydy. Są metaloenzymami; w centrum aktywnym występuje jon Zn²⁺. Stabilizatorami wielu tych enzymów są jony Ca²⁺. Większość z nich, to enzymy wewnątrzkomórkowe. Ich optymalne pH działania oscyluje wokół wartości 7. Niektóre z nich są tak wysoce specyficzne, że odrywają jedynie jeden konkretny aminokwas - np. aminopeptydaza prolilowa (EC 3.4.11.5), która odrywa jedynie prolinę od N-terminalnego końca peptydu (enzym znaleziony m.in. u Bacillus coagulans).

• Aminopeptydaza leucylowa - EC 3.4.11.1. Odrywa od N-terminalnego końca peptydu leucynę, choć wiele odmian tego enzymu może też - choć znacznie mniej skutecznie - odrywać inne aminokwasy (ale nie Arg i Lys).

Zawiera dwa jony Zn (jeden z nich może być zastępowany przez jon magnezu lub manganu). Jest niewrażliwa na obecność jonów metali ciężkich; niektóre z nich mogą być wręcz aktywatorami enzymu. Występuje w cytoplazmie.

Bardzo szeroko rozpowszechniona wśród żywych organizmów. U niektórych bakterii (Escherichia coli i Staphylococcus thermophilus) znaleziono nieco inny, choć bardzo podobny enzym aminopeptydazę leucylową z bakterii - EC 33.4.11.10.

• Aminopeptydaza B - EC 3.4.11.6. Pozwala na odrywanie z N-terminalnego końca peptydu Arg i Lys pod warunkiem, że obok nie ma proliny. Jest to enzym zwierzęcy. Kofaktorem jego działania są jony Zn; aktywatorami zaś jony Cl^-.

• Aminopeptydaza clostrydiolowa - EC 3.4.11.13. Pozwala na oderwanie Pro lub Pro(OH) z N-terminalnego końca peptydu, ale nie potrafi oderwać N-końcowego aminokwasu, jeśli przed nim jest prolina (X-|-Pro-). Kofaktorem jego działania są jony Co²⁺ lub Mn²⁺. U Clostridium histolyticum jest to enzym pozakomórkowy.

Dipeptydazy (EC 3.4.13).

Dipeptydazy działają wyłącznie na dipeptydy. Występują u zwierząt i bakterii. Niektóre z nich wykazują bardzo wąską specyficzność; np. dipeptydaza Xaa-His - (EC 3.4.13.3) występująca u E.coli hydrolizuje jedynie wiązanie peptydowe w dipeptydach utworzone przez histydynę: X-|-His.

Centrum aktywne u dipeptydaz bywa zróżnicowane.

• Dipeptydaza cytozolowa niespecyficzna - EC 3.4.13.18. Rozszczepia wiązanie peptydowe w dipeptydach preferując dipeptydy zbudowane z aminokwasów o hydrofobowych właściwościach. Kofaktorem reakcji są jony Zn²⁺.

Dipeptydylo- i tripeptydylo-peptydazy (EC 3.4.14).

Peptydazy te usuwają N-terminalne di- lub tripeptydy. W ich centrum aktywnym występuje cysteina; są podobne do katepsyny C. U bakterii występują rzadko.

• Dipeptydylo-peptydaza I - EC 3.4.14.1. Usuwa dipeptydy od N-terminalnego końca w oligo- i polipeptydach w układach: X-Y-|-Z-, z wyjątkiem, kiedy X jest argininą lub lizyną oraz kiedy Y lub Z jest proliną.

Peptydylo-dipeptydazy (EC 3.4.15.).

Peptydazy te dawniej zwane były karboksypeptydazami dipeptydylowymi - usuwają C-terminalny dipeptyd. Są to metaloenzymy zawierające w centrum katalitycznym jon Zn²⁺.

• Peptydylo-dipeptydaza A - EC 3.4.15.1. Skutecznie usuwa dipeptydy od C-terminalnego końca niedużych peptydów: oligopeptyd-|-X-Y pod warunkiem, że Y nie jest Asp lub Glu. Peptydaza ta jest zdolna do konwersji angiotensyny I do angiotensyny II. Działanie enzymu zależne jest od obecności jonów chlorkowych, choć sam enzym w centrum aktywnym zawiera jon Zn²⁺. Jest to enzym zwierzęcy.

Karboksypeptydazy typu serynowego (EC 3.4.16.)

Peptydazy te dawniej zwane były hydrolazami peptydyloaminoacylowymi - usuwają C-terminalny aminokwas. W ich centrum aktywnym aminokwasem bezpośrednio działającym jest seryna.

• Karboksypeptydaza C - EC 3.4.16.5. Enzym wykazuje bardzo szeroką specyficzność: usuwa C-terminalne aminokwasy nie przywiązując wagi, jakiego są rodzaju. Jej optymalne pH działania mieści się w zakresie 4,5- 6,0. Spotykana u zwierząt i drożdży.

Metalokarboksypeptydazy (EC 3.4.17.).

Podobnie jak karboksypeptydazy z pod-podklasy EC 3.4.16. usuwają C-terminalny aminokwas. W ich centrum aktywnym występuje Zn²⁺.

• Karboksypeptydaza A - EC 3.4.17.1. Usuwa C-terminalny aminokwas, ale działa wolno kiedy jest nim -Asp, -Glu, -Arg, -Lys czy -Pro. Enzym typowo zwierzęcy.

Karboksypeptydazy typu cysteinowego (EC 3.4.18.).

W tej pod-podklasie występuje jedynie jeden enzym: Katepsyna X - EC 3.4.18.1. Usuwa C-terminalny aminokwas z szeroką specyficznością z wyjątkiem proliny. Enzym zwierzęcy.

Omega peptydazy (EC 3.4.19.).

Te peptydazy uwalniają N-acetylowany lub N-formylowany aminokwas z N-końca polipeptydu.

• Acyloaminoacylo-peptydaza - EC 3.4.19.1. Rozcina wiązanie peptydowe pomiędzy N-terminalnym N-acetylowanym lub N-formylowanym aminokwasem w polipeptydach. Najefektywniej działa w obojętnym pH.

* * *

Reasumując: współdziałanie enzymów proteolitycznych doprowadza rozkład białek do końca, czyli do wolnych aminokwasów.

5.3.2.4 Transport produktów rozkładu biopolimerów i innych złożonych związków do komórki

Większość enzymów biorących udział w II fazie katabolizmu (pamiętając również o procesach degradacyjnych) działa poza komórką lub też u prokariota zlokalizowana może być w błonie cytoplazmatycznej. Wyjątkowo u niektórych bakterii (np. Bacillus stearothermophilus) niektóre enzymy degardujące mogą występować w warstwie "powierzchniowej" komórki (tzw. S-layer). To w tych obszarach dochodzi do rozkładu biopolimerów, ksenobiotyków i innych złożonych związków do prostszych, które wnikają do wnętrza komórki i tam dalej ulegają katabolizmowi. Istotną barierą, którą muszą przekroczyć, jest błona cytoplazmatyczna.

Błona komórkowa (membrana cytopazmatyczna) odpowiada za pobieranie wody, soli mineralnych i właśnie tych produktów rozkładu złożonych związków (w tym pokarmu), wydzielanie substancji na zewnątrz (w tym enzymów pozakomórkowych), u Eucariota odbieranie bodźców ze środowiska zewnętrznego oraz innych procesów metabolicznych komórki. Możliwe jest to m.in. dzięki zespołom „białek transporterów - tzw. BT” związków do i z komórki, w tym białek systemu sekrecji.

Transport poprzez błonę cytoplazmatyczną może zachodzić na zasadzie:

1. prostej dyfuzji

2. poprzez błonowy kanał (także dyfuzja prosta)

3. współpracy z białkami przenośnikowymi (wspomagana dyfuzja)

4. aktywny transport

1. Dyfuzja prosta dotyczy niepolarnych związków niskocząsteczkowych oraz małych cząsteczek polarnych, ale pod warunkiem, że nie posiadają ładunku elektrostatycznego.

2. Kanały błonowe - ten rodzaj transportu dotyczy jedynie związków niskocząsteczkowych, nie mogących przenikać swobodnie poprzez warstwę lipidową membrany. Kanały błonowe są w rzeczywistości białkami, które przenikają błonę cytoplazmatyczną z jednej strony na drugą. Kanały takie dostępne są dla naładowanych lub polarnych cząsteczek. Białka będące kanałami błonowymi charakteryzują się następującymi cechami:

• są wybiórcze jedynie wobec jednego jonu,

• dostęp do kanałów podlega ścisłej regulacji - komórka może je otwierać i zamykać, w zależności od swoich potrzeb.

3. Białka przenośnikowe są zanurzone w lipidowej warstwie błony cytoplazmatycznej. Przenośniki te wyłapują transportowaną cząsteczką z jednej ze stron błony i przenoszą ją na stronę drugą, gdzie ją uwalniają.

4. Transport aktywny to jedyny sposób przenoszenia związków przeciw gradientowi stężeń; w transporcie tym biorą udział przenośniki wykorzystujące energię z ATP.

Do tego miejsca podręcznik jest gotowy!!!

Ponadto Rozdz. 5.5.- Fotosynteza

5.3.3. II faza katabolizmu

II faza katabolizmu obejmuje przemiany enzymatyczne - szlaki, cykle oraz pojedyncze transformacje - rozmaitych metabolitów pośrednich powstałych w I fazie katabolizmu. W tej fazie enzymatycznemu spaleniu ulegają również proste związki bezpośrednio przyswajane przez komórkę (np. glukoza, laktoza, glicerol, itp.). Należy również pamiętać, że u Prokariotów w II fazie katabolizmu dalszej degradacji ulegają ksenobiotyki i produkty pośrednie ich przemian pochodzące z I fazy przemian. Końcowym produktem II fazy katabolizmu komórkowego jest zazwyczaj acetylo~SCoA. Wyjątkowo podczas katabolizmu aminokwasów, a także u niektórych Procaryota w pewnych szlakach biodegradacyjnych mogą powstawać inne proste związki, łatwo włączane w cykl Krebsa (np. szczawiooctan, α-ketoglutaran, bursztynian, bursztynylo~SCoA, fumaran lub jabłczan).

Podstawowym szlakiem spalania rozłożonych w I fazie katabolizmu węglowodanów jest glikoliza. Zachodzi ona w cytoplazmie komórki. Końcowym produktem glikolizy jest pirogronian. Może on dalej ulegać w komórkach dekarboksylacja oksydacyjna (α-ODC) - u Eucaryota przebiega w błonie mitochondrialnej, u Procaryota w cytoplazmie na styku z membraną cytoplazmatyczną: polega na przekształceniu pirogronianu do acetylo~SCoA. Pirogronian jest węzłowym metabolitem wewnątrzkomórkowym; jest ostatnim metabolitem glikolizy oraz większości przemian katabolicznych aminokwasów. Swobodnie przenika z cytoplazmy do matrixu, po drodze ulegając właśnie tam α-ODC.

Alternatywą dla glikolizy jest cykl pentozowy (szlak pentozofosforanowy), utlenianie glukozy na innej drodze niż szlak glikolityczny, ma znaczenie w metabolizmie jako źródło czynników redukujących do wytwarzania NADPH (NADP) oraz jako mechanizm syntezy i dostarczania pentoz (cukrów pięciowęglowych).

Reakcje szlaku pentozofosforanowego przebiegają znacznie mniej intensywnie w mięśniu szkieletowym niż w tkance tłuszczowej. Jest to zgodne z hipotezą zakładająca, iż główna rola szlaku pentozofosforanowego polega na dostarczeniu NADPH niezbędnego do biosyntez redukcyjnych. Duże ilości NADPH są zużywane w tkance tłuszczowej podczas redukcji syntezy kwasów tłuszczowych z acetylo-CoA oraz w gruczole mlekowym w czasie laktacji.

cykl pentozowy - przebiega w cytoplazmie: dostarcza NADPH wykorzystywanego do syntezy tłuszczów, cholesterolu i nukleotydów, a także dostarcza „strategicznego” składnika do syntezy RNA i DNA - rybozo-5-fosforanu. W sprzężeniu z łańcuchem oddechowym, równie dobrze może być dostarczycielem energii chemicznej dla komórki w formie ATP.

Jeszcze innym sposobem spalenia glukozy w komórkach Procaryota jest szlak Entnera-Doudorffa. W dużym uproszczeniu można powiedzieć, że jest on hybrydą glikolizy i początkowych etapów cyklu pentozowego.

Kwasy tłuszczowe uwolnione w I fazie katabolizmu z tłuszczów podlegają β-oksydacja - przebiega w matrixie, polega na konwersji wyższych kwasów tłuszczowych do acetylo-CoA.

przemiany aminokwasów: deaminacja, transaminacja, katabolizm szkieletów węglowych pozostałych po deaminacji (m.in. szlak homogentyzynianowy, szlak kinureninowo-antranilanowy, katabolizm rodników rozgałęzionych aminokwasów, itp.).

5.3.3.1. Glikoliza

Glukoza i fruktoza (a także galaktoza pochodzenia pokarmowego) zostają enzymatycznie spalone w II fazie katabolizmu. W wyniku ich katabolizmu powstaje kwas pirogronowy. Zdecydowana jego większość zostaje przekształcana w acetylo-CoA i włączana w cykl Krebsa. W warunkach beztlenowych w efekcie glikolizy powstaje kwas mlekowy - pirogronian przy udziale dehydrogenazy mleczanowej, utleniającego ponownie NADH do NAD⁺ dla powtórnego użycia w glikolizie. Alternatywną drogą rozkładu glukozy jest szlak pentozofosforanowy, podczas którego następuje redukcja koenzymu NADPH i produkcja cukrów pentozowych takich jak ryboza, cukrowy komponentkwasu nukleinowego.

Zasadnicze znaczenie glikolizy polega na tym, że może ona dostarczać ATP w nieobecności tlenu, co pozwala mięśniom szkieletowym funkcjonować sprawnie przy niedostatecznych procesach aerobowych. Miesień sercowy, przystosowany do warunków tlenowych, charakteryzuje się małą aktywnością glikolityczną.

Rozpad glikogenu zachodzi jedynie wtedy, gdy w organizmie występuje niedobór glukozy i trzeba ją pozyskać z wielocukrów zapasowych - informuje o tym hormon adrenalina.

Poniżej przedstawiony jest nieco uproszczony schemat glikolizy.

Rys. 5.3.10. Schemat glikolizy

1. Heksokinaza - EC 2.7.1.1 lub Glukokinaza - EC 2.7.1.2, 2. Izomeraza glukozo-6-fosforanowa - EC 5.3.1.9, 3. 6-fosfofruktokinaza - EC 2.7.1.11, 4. Aldolaza fruktozo-bisfosforanowa - EC 4.1.2.13, 5. Izomeraza triozofosforanowa - EC 5.3.1.1, 6. Dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa (fosforylująca) - EC 1.2.1.12, 7. Kinaza fosfoglicerynianowa - EC 2.7.2.3, 8. Mutaza fosfoglicerynianowa - EC 5.4.2.1, 9. Hydrataza fosfopirogronianowa - EC 4.2.1.11, 10. Kinaza pirogronianowa - EC 2.7.1.40, 11. - Fosforylaza glikogenowa - EC 2.4.1.1, 12. - Fosfoglukomutaza - EC 5.4.2.2. lub Fosfoglukomutaza (glukoza-kofaktor) (EC 5.4.2.5)

W szczegółach glikoliza przebiega następująco:

1. W pierwszym etapie.

Pierwsza z reakcji - fosforyzacja glukozy  katalizowana jest przez 2 enzymy. W tkankach występuje heksokinaza, która ma duże powinowactwo do glukozy i dzięki temu zapewnia dostarczanie cukru nawet przy niskim poziomie we krwi. W wątrobie natomiast występuje glukokinaza. Ma ona mniejsze powinowactwo do glukozy i w praktyce zaczyna działać dopiero przy stężeniach glukozy przekraczających poziom 100mg%. Służy więc do wyciągania nadmiaru cukru z krwi po posiłkach w celu zmagazynowania go w postaci glikogenu lub zamiany na tłuszcz.

Heksokinaza (EC 2.7.1.1)

D-heksoza + ATP ==> D-heksozo-6-fosaforan + ADP

Atakuje D-glukozę, D-mannozę, D-fruktozę, sorbitol i D-glukozoaminę. Występuje głównie u zwierząt, ale także można ją spotkać u drożdży i niektórych roślin (np. w liściach tytoniu).

Glukokinaza zwana dawniej heksokinazą typu IV - EC 2.7.1.2.

D-glukoza + ATP ==> ADP + D-glukozo-6-fosforan

Szeroko rozpowszechniona w przyrodzie - można ją znaleźć u drożdży, pleśni (m.in. Aspergillus), bakterii (np. E.coli, Bacillus subtilis) a także u zwierząt (np. mysz). U ludzi występuje w wątrobie.

2. izomeraza glukozo-6-fosforanowa (EC 5.3.1.9)

D-glukozo-6-fosforan <==> D-frutozo-6-fosforan

3. 6-fosfofruktokinaza - EC 2.7.1.11.

D-frutozo-6-fosforan + ATP ==> D-fruktozo-1,6-bisfosforan + ADP

4. aldolaza fruktozo-bisfosforanowa - EC 4.1.2.13.

D-fruktozo-1,6-bisfosforan <==> fosfodihydroksyaceton + aldehyd 3-fosfo-D-glicerynowy

Uwaga! Fosfodihydroksyaceton w nomenklaturze enzymów zwany bywa także gliceronofosforanem, a aldehyd 3-fosfo-D-glicerynowy - D-gliceroaldehydo-3-fosforanem.

5. Izomeraza triozofosforanowa - EC 5.3.1.1.

D-gliceroaldehydo-3-fosforan <=> gliceronofosforan

lub aldehyd 3-fosfo-D-glicerynowy <==> fosfodihydroksyaceton

6. Dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa (fosforylująca) - EC 1.2.1.12.

aldehyd 3-fosfo-D-glicerynowy + NAD + H₃PO₄ <==> 1,3-difosfo-D-glicerynian + NADH

Uwaga! 1,3-difosfo-D-glicerynian w nomenklaturze enzymów zwany bywa także 3-fosfo-D-glicerylofosforanem.

7. Kinaza fosfoglicerynianowa - EC 2.7.2.3.

1,3-difosfo-D-glicerynian + ADP <==> 3-fosfo-D-glicerynian + ATP

8. Mutaza fosfoglicerynianowa - EC 5.4.2.1.

3-fosfo-D-glicerynian <==> 2-fosfo-D-glicerynian

9. Hydrataza fosfopirogronianowa - EC 4.2.1.11.

2-fosfo-D-glicerynian <==> fosfoenolopirogronian + H₂O

Kofaktorem reakcji są jony Mg²⁺.

10. Kinaza pirogronianowa - EC 2.7.1.40.

fosfoenolopirogronian + ADP ==> pirogronian + ATP

Aktywatorem są jony Mg²⁺ i K⁺

11. - fosforylaza glikogenowa - EC 2.4.1.1.

(α-1,4-glukozyl)_n + H₃PO₄ <=> (α-1,4-glukozyl)_n-1 + α-D-glukozo-1-fosforan

12'. - fosfoglukomutaza - EC 5.4.2.2.

α-D-glukozo-1-fosforan <=> α-D-glukozo-6-fosforan

Enzym szeroko rozpowszechniony w żywych organizmach.

12''. - fosfoglukomutaza (glukoza-kofaktor) (EC 5.4.2.5)

α-D-gluozo-1-fosforan <=> α-D-gluozo-6-fosforan

Aktywatorem enzymu jest glukoza, która prawdopodobnie jest akceptorem reszty fosforanowej z substratu, czyli α-D-gluozo-1-fosforanu tworząc od razu α-D-gluozo-6-fosforan.

Kolejne związki pośrednie na drodze od glukozy do pirogronianu w szlaku glikolizy to:

 

1. glukozo-6-fosforan. Połączenie łańcucha węglowego z grupą fosforanową tworzy wiązanie wysokoenergetyczne. Przyłączenie grupy fosforanowej do 6-go węgla glukozy wymaga zużycia 1 cząsteczki ATP. Obecność grupy fosforanowej sprawia, że cząsteczka, mając w sobie więcej energii, łatwiej wchodzi w następne reakcje.

2. fruktozo-6-fosforan. Następuje przegrupowanie atomów wewnątrz cząsteczki. W tym miejscu, po fosforylacji, do szlaku wchodzi w normalnym trybie fruktoza.

3. fruktozo-1,6-dwufosforan. Następuje przyłączenie kolejnej grupy fosforanowej kosztem następnej cząsteczki ATP.

4. gliceraldehydo-3-fosforan (2x). Następuje rozpad łańcucha 6-węglowego na dwa łańcuchy 3-węglowe. Wszystkie dalsze przemiany występują podwójnie w stosunku do wyjściowej cząsteczki glukozy.

5. 1,3-dwufosfoglicerynian (2x). Następuje odłączenie dwóch atomów wodoru połączone z przyłączeniem kolejnej grupy fosforanowej. Przyłączenie grupy fosforanowej tym razem nie wymaga ATP.

6. 3-fosfoglicerynian (2x). Odłączenie grupy fosforanowej sprzężone jest z odzyskiem ATP.

7. 2-fosfoglicerynian (2x). Następuje przeniesienie grupy fosforanowej z węgla trzeciego na drugi.

8. fosfoenolopirogronian (2x). Następuje odłączenie cząsteczki wody.

9. pirogronian (2x). Następuje odłączenie grupy fosforanowej sprzężone z syntezą cząsteczki ATP.

 

Na co należy zwrócić uwagę przyglądając się powyższemu schematowi:

I. Ostatnia reakcja, czyli zamiana pirogronianu na mleczan zachodzi w warunkach przede wszystkim w warunkach beztlenowych. Spalenie wodoru z NADH₂ wymaga przetransportowania go do mitochondrium, a tam obecności tlenu. Przy jego braku nadmiar gromadzącego się w cytoplazmie i mitochondrium NADH₂ przenosi tenże wodór na gromadzący się również pirogronian i powstaje mleczan. W skutek tego komórka może pozyskać niedużą ilość energii z rozpadu glukozy do mleczanu, jednak komórka szybko się zakwasza. Jest to tzw. glikoliza beztlenowa.

W komórkach drożdży zachodzi jeszcze jedna reakcja - mianowicie zamiana mleczanu na alkohol i CO₂.

II. Szybkość zachodzenia glikolizy regulowana jest przez 2 enzymy oznaczone na schemacie strzałkami i napisem `regulacja'. Reakcje te związane są ze stosunkowo dużą stratą energii swobodnej i dlatego są nieodwracalne.

Etapy glikolizy są następujące:

1. Glukoza przez fosforylację z udziałem heksokinazy w obecności ATP jest przekształcana w glukozo-6-fosforan.

2. Glukozo-6-fosforan (aldoza) ulega izomeryzacji katalizowanej przez izomerazę glukozofosforanową w fruktozo-6-fosforan (ketoza).

3. Fruktozo-6-fosforan jest fosforylowany z udziałem fosfofruktokinazy w obecności ATP w fruktozo-1,6-bisfosforan.

4. Fruktozo-1,6-bisfosforan (6 atomów węgla) jest rozszczepiany przez aldolazę na dwie cząstki: aldehyd 3-fosfoglicerynowy (3 atomy węgla) i fosfodihydroksyaceton (3 atomy węgla).

5. Aldehyd 3-fosfoglicerynowy jest dalej wykorzystywany w procesie glikolizy i jest on przekształcany do 1,3-bisfosfoglicerynianu. Reakcję katalizuje dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego z użyciem nieorganicznego fosforanu i NAD H⁺.

6. 1,3-bisfosfoglicerynian jest przekształcany do 3-fosfoglicerynianu. Reakcję katalizuje kinaza fosfoglicerynianowa tworząca też ATP.

7. 3-fosfoglicerynian jest przekształcany w 2-fosfoglicerynian przez fosfogliceromutazę.

8. Enolaza katalizuje odwodnienie 2-fosfoglicerynianu i powstanie fosfoenolopirogronianu.

9. Kinaza pirogronianowa katalizuje utworzenie pirogronianu i ATP.

Znaczenie glikolizy

1. Wytwarzanie ATP; w reakcjach szlaku glikolitycznego bezpośrednio powstają tylko dwie cząsteczki ATP na jedną cząsteczkę glukozy. Sumaryczna reakcja przekształcenia glukozy w pirogronian jest następująca:

glukoza + 2P_i + 2ADP + 2NAD⁺ → 2 cząsteczki pirogronianu + 2ATP + 2NADH + 2H⁺ + + 2H₂O.

2. Wytwarzanie intermediatów, np. acetylo-CoA - prokursora w syntezie kwasów tłuszczowych i cholesterolu.

2. Glikoliza dostarcza także substratów do cyklu kwasu cytrynowego i fosforylacji oksydacyjnej.

Glikoliza jest procesem amfibolicznym, gdyż wiele metabolitów pośrednich tego szlaku jest wykorzystywane do biosyntezy składników komórkowych: glukozo-6-fosforan w syntezie glukanu (sacharyd ściany komórkowej), triozofosforany w syntezie lipidów, pirogronian jako prekursor aminokwasów.

Jednak rosnące komórki drożdży wymagają do procesów biosyntezy znacznie więcej związków niż szlak EMP jest w stanie dostarczyć. Są one tworzone w obecności tlenu, w cyklu Krebsa oraz na drodze tlenowych przemian glukozo-6-fosforanu w obecności NADP+ w szlaku heksozomonofosforanowym (HMP), nazywanym też szlakiem pentozowym. W warunkach beztlenowych - poziom enzymów cyklu Krebsa (gł. Dehydrogenazy 2-oksoglutaranu) oraz szlaku pentozowego (dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu) jest bardzo niski.

W glikolizie 1 cząsteczka glukozy C₆H₁₂O₆ zostaje zamieniona na 2 cząsteczki kwasu pirogronowego CH₃-CO-COOH. Kwas pirogronowy (pirogronian) jest najważniejszym punktem węzłowym pozamitochondrialnego metabolizmu wewnątrzkomórkowego. Jest on tą cząsteczką, która przenika do mitochondrium by tam ulec dalszym przemianom.

Sumarycznie szlak ten można przedstawić następującym równaniem:

1 C₆H₁₂O₆ + 2 NAD + 2 ADP + 2 P  →  2 CH₃-CO-COOH  + 2 NADH₂ + 2 ATP

W glikolizie w początkowych etapach zostają zużyte 2 cząsteczki ATP do przyłączania grup fosforanowych, następnie jednak odzyskane są 4 cząsteczki. Łącznie powstają więc 2 cząsteczki ATP oraz 2 cząsteczki NADH₂. Wodór z NADH₂ może zostać przetransportowany do mitochondrium i tam ulec spaleniu z tlenem. Powstanie wtedy 6 cząsteczek ATP z 2 cząsteczek NADH₂.

2 NADH₂ + O₂    +     6 ADP + 6 P       →      2 NAD + 2 H₂O      +     6 ATP

Łącznie więc na tym etapie spalania glukozy z 1 cząsteczki glukozy powstaje 8 cząsteczek ATP.

Losy pirogrionianu powstałego w procesie glikolizy

  W warunkach tlenowych pirogronian zostaje przekształcony w acetylo-CoA (CH₃-CO-S-CoA, aktywny octan) , który wchodzi w cykl kwasu cytrynowego:

pirogronian + NAD⁺ + CoA → acetylo-CoA + CO₂ + NADH.

Reakcję tę katalizuje dehydrogenaza pirogronianowa.

W warunkach ograniczonego dostępu tlenu, panujących podczas intensywnego wysiłku fizycznego, ilość NADH wytwarzanego podczas glikolizy przekracza możliwości łańcucha oddechowego pod względem utleniania NADH z powrotem do NAD ⁺. W tym wypadku pirogronian syntetyzowany w mięśniu szkieletowym podczas glikolizy zostaje przekształcony w mleczan przez dehydrogenazę mleczanową w reakcji generującej NAD ⁺ , dzięki czemu glikoliza w dalszym ciągu wytwarza ATP. Jednakże mleczan jest metabolitem uwięzionym w ślepej uliczce, ponieważ metabolizowany może być dalej tylko z powrotem w pirogronian. Mleczan dyfunduje więc z mięśni do krwi, skąd przechodzi do wątroby. Tutaj w wątrobie, przedostaje się do komórek, gdzie z udziałem dehydrogenazy mleczanowej zostaje przekształcony z powrotem w pirogronian. Następnie pirogronian w procesie glukoneogenezy ulega przekształceniu w glukozę; ta zostaje uwolniona znów do krwiobiegu, skąd może być pobierana przez mięsień szkieletowy (i mózg). Cykl tych reakcji nazywa się cyklem Corich.

U drożdży i innych mikroorganizmów, NAD⁺ niezbędny do podtrzymywania ciągłości glikolizy w warunkach beztlenowych jest regenerowany w procesie nazywanym fermentacją alkoholową. Pirogronian zostaje przekształcony w aldehyd octowy (przez dekarboksylazę pirogronianową), a następnie w etanol (przez dehydrogenazę alkoholową), przy czym w tej drugiej reakcji zachodzi reoksydacja NADH do NAD⁺:

pirogronian + H⁺ → aldehyd octowy + CO₂

aldehyd octowy + NADH + H⁺ → etanol + NAD⁺ .  

Losy pirogronianu

 

Jak już pisałem, pirogronian to węzłowy związek chemiczny w metabolizmie wewnątrzkomórkowym. Jest on końcowym etapem wstępnego spalania glukozy oraz większości aminokwasów. Jest on tym związkiem, który swobodnie przenika z cytoplazmy do mitichondrium, by tam ulec dalszym przemianom. W mitochondrium ma on dwie możliwości przemian.

Pierwsza z nich, to zamiana na acetylo-koenzym A, zwany też aktywnym octanem. W reakcjach chemicznych związek ten zapisywany jest w skrócie jako CH₃-CO-CoA lub po prostu acetylo-CoA. W czasie tej reakcji odłączony zostaje CO₂, a dwa wodory zostają przeniesione na NAD, by później w trakcie spalania z tlenem wytworzyć 3 cząsteczki ATP:

 

CH₃-CO-COOH + CoA + NAD     →      CH₃-CO-CoA + CO₂ + NADH₂

 

Reakcja ta zachodzi w błonie mitochondrialnej, jest więc sprzężony transport priogronianu do mitochondrium i równoczesne przekształcenie go w acetylo-CoA, który jest podstawową cegiełką paliwową w mitochondrium. Enzym, który katalizuje tę reakcję jest dużym złożonym kompleksem enzymatycznym, który nie ma odpowiednika w cytoplazmie. (Podobnym kompleksem jest dehydrogenaza bursztynianowa pojawiająca się w połowie cyklu Krebsa.)

Acetylo-CoA to drugi bardzo ważny, węzłowy związek w metabolizmie wewnątrzkomórkowym. Jest on cząsteczką, która może ulec albo spaleniu w mitochondrium, albo wyjść z mitochondrium i zostać zużytym do syntezy kwasów tłuszczowych lub cholesterolu w cytoplazmie komórki.

Wracając jednak do pirogronianu: druga możliwość, jaka może mu się przydarzyć poza zamianą na acetylo-CoA, to zamiana na szczawiooctan. Podstawowy cel tej przemiany to dostarczenie związków pośrednich dla cyklu Krebsa. O dodatkowej roli tej reakcji opowiemy za chwilę.

U organizmów beztlenowych pirogronian nie jest utleniany w cyklu kwasów karboksylowych lecz na drodze fermentacji może być redukowany do mleczanu lub najpierw ulega dekarboksylacji do aldehydu octowego, a następnie redukcji do etanolu.

Jak wynika z powyższych rozważań metabolizm odgrywa kluczową rolę. Dzięki ciągle zachodzącym procesom metabolicznym możliwe jest utrzymanie komórki przy życiu.

Sensem glikolizy jest utlenienie glukozy do kwasu pirogronowego w wyniku dehydrogenacji.

Na tym etapie energetycznym zyskiem jest 12ATP.

Glikoliza jest oddychaniem beztlenowym aż do momentu utleniania kwasu pirogronowego. U organizmów beztlenowych dochodzi w tym momencie do fermentacji:

0. alkoholowej:

1. mlekowej:

U organizmów tlenowych dochodzi do powstania Acetylo-CoA, potrzebnego do następnego etapu oddychania, jakim jest cykl Krebsa.

α-ODCP dekarboksylacja oksydacyjna pirogronianu

EC 1.2.4.1 - Dehydrogenaza pirogronianowa (przenosząca acetyl)

2.3.1.12

It is a component (in multiple copies) of the multienzyme pyruvate dehydrogenase complex in which it is bound to a core of molecules of EC 2.3.1.12, which also binds multiple copies of EC 1.8.1.4.

It does not act on free lipoamide or lipoyllysine, but only on the lipoyllysine residue in EC 2.3.1.12.

Cykl pentozofosforanowy może również służyć do biosyntezy węglowodanów, w wyniku czego mogą tworzyć się cukry o różnej liczbie atomów węgla.

U człowieka cykl ten jest szczególnie intensywny w tkance tłuszczowej, gdyż oprócz biosyntezy cukrów, dochodzi w tym procesie również do redukowania NADP do NADPH, który jest potrzebny w biosyntezie kwasów tłuszczowych.

Cykl pentozofosforanowy przebiega następująco:

Glikoliza nie jest jedyną drogą utlenienia glukozy w komórkach roślinnych równolegle do niej w cytoplazmie biegnie oksydacyjny szlak pentzofosforanowy.

Glukozo-6-fosforan przeksztalcany jest w rybulozo - 5 -fosforan towarzyszy temu utrata jednej cząstki CO₂ oraz wytworzenie dwóch cząstek NADPH w warunkach fizjologicznych reakcje te są odwracalne. Rybulozo 5-fosforan zostaje przeksztalcony w aldehyd fosfoglicerynowy i fruktozo-6-fosforan produkty pośrednie glikolizy.

Funkcje szlaku:

Źródło rybozo-5-fosforanu prekursora rybozy, deoksyrybozy i związków niezbędnych do syntezy RNA i DNA

Eryztrozo-4-fosforan jest prekursorem syntezy związków fenolowych aminokwasów aromatycznych lignin i flawonoidów.

Wytwarza NADPH służący jako reduktor w procesach biosyntezy różnych związków w cytozolu.

Szlak Entnera-Doudorffa

Pseudomonas, Xantomonas, Azotobacter, grzyby, pierwotniaki......

Może dostarczać pośredników do biosyntezy nukleotydów lub spełniać funkcje procesów prowadzących do degradacji glukozy, np.Acetobacter, Pseudomonas, Gluconobacter glukoza

U niektórych bakteri polega na utlenianiu glukozo-6-fosforanu do kw. 6-fosfoglukanowego który z kolei po dolączeniu wody przeksztalaca się w 2-keto-3dezoksy-6fosfoglukanion początkowo w forme enolową a następnie ketonową. Specyficzna aldolaza rozszczepia ten związek na dwa fragment trójwęglowe. Jednym z nich jest cząsteczka aldehydu 3-fosfoglicerynowego która ulega dalszym przmianom jak w szlaku glikolitycznym a drugi jest pirogronian.

The Entner-Doudoroff pathway describes an alternate series of reactions that catabolize glucose to pyruvate using a set of enzymes different from those used in either glycolysis or the pentose phosphate pathway. Most bacteria use glycolysis and the pentose phosphate pathway. Distinct features of the Entner-Doudoroff pathway are that it:

Occurs only in prokaryotes

Uses 6-phosphogluconate dehydrase and 2-keto-3-deoxyglucosephophate aldolase to create pyruvates from glucose.

Has a net yield of 1 ATP for every glucose molecule processed, as well as 1 NADH and 1 NADPH By comparison, glycolysis has a net yield of 2 ATP and 2 NADH for every one glucose molecule processed.

Organisms that utilize the Entner-Doudoroff pathway

There are a few bacteria that substitute classic glycolysis with the Entner-Doudoroff Pathway. They may lack enzymes essential for glycolysis, such as phosphofructokinase-1. Most organisms that use the pathway are aerobes due to the low ATP yield per glucose.

Pseudomonas aeruginosa, a Gram-negative bacterium

Azotobacter, a Gram-negative bacterium

Rhizobium Gram-negative bacterium

Enterococcus faecalis, a Gram-positive bacterium

Zymomonas mobilis, a Gram-negative facultative anaerobe

Xanthomonas Campestris, a Gram negative bacteria which uses this pathway as main pathway for providing energy

Beta oksydacja -zasadniczą role odgrywa tu CoA Metabolity pośrednie są jego pochodnymi.

1.przylączenie kw. tluszczowego do CoA katalizowane przez syntetazę acyloCoA przy równoczesnym rozkladzie ATP w obecności jonów Mg. Powstaly acyloCoA odlacza dwa wodory przy węglu alfa i beta pod wplywem dehydrogenazy acyloCoA związanej z FAD. Powstaje enoilo-CoA którego hydrataza przylacza czast wody tworzącą beta-hudroksyacyloCoA związany z NAD odlacza dwa wodory przy weglu beta. Dzialanie tiolazy beta-ketoacyloCoA rozbija ona wiązania między między alfa i beta weglem powodując odlaczanie acetyloCoA z równoczesnym przylacaniem czast HS-CoA do pozostalego lańcucha kw. tluszczowego. W wyniku jednego obrotu następuje skrócenie lańcucha o 2 atomy węgla, a wytworzony acetyloCoA zostaje wlączony do cyklu Krebsa i wodory przejmuje NAD i FAD dzięki którym zostają one skierowane do lancucha oddechowego.

Acyl-CoA dehydrogenase. EC 1.3.99.3

Acyl-CoA + acceptor <=> 2,3-dehydroacyl-CoA + reduced acceptor

Kofaktorem jest FAD

Forms with another flavoprotein (electron-transferring flavoprotein) and EC 1.5.5.1 a system reducing ubiquinone and other acceptors.

Electron-transferring-flavoprotein dehydrogenase EC 1.5.5.1

Reduced electron-transferring flavoprotein + ubiquinone <=> electron-transferring flavoprotein + ubiquinol

Kofaktory: FAD i białko Fe-S

Forms part of the mitochondrial electron-transfer system.

Zwierzęta (głownie ssaki), nieliczne bakterie (np. Pseudomonas aeruginosa) i drożdże (np. Saccharomyces cerevisiae lub Schizosaccharomyces pombe )

Acyl-CoA dehydrogenase (NADP(+)) EC 1.3.1.8

Acyl-CoA + NADP <=> 2,3-dehydroacyl-CoA + NADPH

The liver enzyme acts on enoyl-CoA derivatives of carbon chain length 4 to 16, with optimum activity on 2-hexenoyl-CoA.

In Escherichia coli, cis-specific and trans-specific enzymes exist (cf. EC 1.3.1.37 and EC 1.3.1.38).

EC 1.3.1.37 Cis-2-enoyl-CoA reductase (NADPH).

Acyl-CoA + NADP(+) <=> cis-2,3-dehydroacyl-CoA + NADPH

EC 1.3.1.38

Acyl-CoA + NADP(+) <=> trans-2,3-dehydroacyl-CoA + NADPH

Wiele ssaków w tym człowiek, drożdże

Oksydaza acylo-CoA - EC 1.3.3.6

Acyl-CoA + O(2) <=> trans-2,3-dehydroacyl-CoA + H(2)O(2)

Kofaktorem jest FAD

Acts on CoA derivatives of fatty acids with chain length from C(8) to C(18).

U wielu ssaków (w tym człowiek), drożdże (ale głównie z rodzaju Candida np. Candida tropicalis, ale też Pichia pastoris Ashbya gossypii).

Alfa oksydacja (czyli biodegradacja kwasów tłuszczowych u bakterii). W procesie tym rozkładowi ulegają tylko kwasy tłuszczowe mające od 13 do 18 atomów węgla. Szlak ten omawiany jest szczegółowo w ramach wykładu „Procesy biodegradacyjne”. Pierwszy etap katalizowany jest przez peroksydazę kwasów tłuszczowych i polega na dekarboksylacji kwasu tłuszczowego do aldehydu krótszego o jeden atom C. Kolejne etapy są identyczne jak w β-oksydacji, a jedyna różnica związana jest z działaniem dehydrogenazy acylo-CoA (NADP⁺) - EC 1.3.1.8 - powodującej odwodorowanie acylo-CoA.

• Katabolizm aminokwasów: produkty pośrednie powstające ze szkieletów węglowych

20 aminokwasów, które mogą wejść w cykl Krebsa (acetyloCoA, á-ketoglutaran, bursztynyloCoA, fumaran, szczawiooctan).

Tworzenie z 10 aminokwasów: acetyloCoA poprzez pirogronian (alanina, seryna, glicyna, cysteina, treonina) i á-ketoglutaranu (glutaminian, glutamina, arginina, histydyna, prolina).

Przemiana fenyloalaniny i tyrozyny do acetyloCoA (poprzez acetoacetyloCoA) i fumaranu. Charakterystyka zaburzeń metabolicznych w ich przemianie - fenyloketonurii, alkaptonurii, albinizmu, tyrozynemii.

Szlak kinureninowo-antranilanowy katabolizmu tryptofanu prowadzący do acetyloCoA

poprzez acetoacetyloCoA.

Przekształcanie tryptofanu do serotoniny na szlaku hydroksy-indolowym.

Tworzenie NAD+. Charakterystyka zaburzeń w katabolizmie tryptofanu - choroba Hartnupa, rakowiak złośliwy.

Katabolizm aminokwasów rozgałęzionych

- leucyny, (do acetyloCoA) poprzez acetoacetyloCoA, izoleucyny i waliny (do

bursztynyloCoA). Zahamowanie dekarboksylacji oksydacyjnej tych aminokwasów jako

główny blok metaboliczny - charakterystyka choroby „moczu o zapachu syropu klonowego”.

Katabolizm lizyny (do acetyloCoA przez aceto-acetyloCoA), metioniny (do bursztynyloCoA),

asparaginianu i asparaginy (do szczawiooctanu)

• Biosynteza 9 aminokwasów endogennych: asparaginianu, asparaginy, glutaminianu,

glutaminy, alaniny, glicyny, seryny, proliny i cysteiny

• Biosynteza aminokwasów egzogennych: treoniny, metioniny oraz aminokwasów

rozgałęzionych: waliny, leucyny, izoleucyny. Biosynteza lizyny i argininy: biosynteza lizyny

u bakterii i wyższych roślin (poprzez pimelinian) oraz u grzybów (poprzez adypinian).

Tworzenie argininy poprzez ornitynę. Biosynteza aminokwasów aromatycznych - fenyloalaniny,

tyrozyny i tryptofanu z prekursorów alifatycznych. Biosynteza histydyny

• Suplementacja aminokwasów w celach terapeutycznych.

• Biosynteza ważnych składników azotowych pochodzących z aminokwasów:

hipuranu, kreatyny, karnozyny, anseryny, spermidyny, sperminy, melatoniny

• Modyfikacje potranslacyjne białek — acetylacja, fosforylacja, metylacja, hydroksylacja,

ADP-rybozylacja, karboksylacja glutaminianu, palmitynacja, mirystylacja, prenylacja,

glikozylacja, amidowanie C-końcowego aminokwasu, ubikwitynacja, ograniczona

proteoliza

• Postępowanie prowadzące do określenia struktury I-rzędowej białek — określenie

składu aminokwasowego czystego białka; oznaczenie N- i C-końcowego aminokwasu;

hydroliza enzymatyczna lub chemiczna; frakcjonowanie i oczyszczanie peptydów;

określenie składu aminokwasowego peptydów; degradacja Edmana; analiza nakładania

się peptydów po zastosowaniu innego typu hydrolizy białka

Metabolizm kwasów nukleinowych

Rozpad zasad azotowych cechuje się bardzo dużą intensywnością. Końcowym produktem rozpadu pirymidyn jest bursztynylo-CoA (do cyklu Krebsa), zaś puryn może być kwas moczowy, alantoina, mocznik lub amoniak.

Synteza nukleotydów przebiega dwoma etapami. Najpierw zasada azotowa zostaje przyłączona wiązaniami -N-glikozydowymi z cukrem i tak tworzy się nukleozyd. Następnie poddajemy nukleozyd estryfikacji kwasem fosforowym i otrzymujemy nukleotyd.

Wszystkie przemiany metaboliczne łączą się pomiędzy sobą i są współzależne. Uniemożliwienie zajścia jednej reakcji może prowadzić do zatrzymania wszystkich innych. Ważne jest więc dostarczanie wszelkich potrzebnych czynników dla prawidłowego funkcjonowania organizmu zwierzęcego, czy też roślinnego.

Koenzym A odgrywa podstawową rolę w aktywowaniu grup acylowych w komórkach. Jest on tiolem, którego cząsteczka składa się z difosforanu adenozyny (ADP) i pantoteiny, zawierającej kwas pantotenowy i cysteaminę (czyli 2-aminoetanotiol).

Grupa tiolowa cysteaminy jest odpowiedzialna za najważniejsze funkcje koenzymu A, ponieważ dzięki obecności tej grupy funkcjonalnej koenzym może być przekształcany w tioester, aktywny czynnik transferu acylowego w komórce.

Kluczową pozycję w metabolizmie zajmuje acetylo~S-CoA, który reaguje z wieloma nukleofilami, przekazując im grupę acetylową, dlatego też jest najważniejszy wśród tioestrów koenzymu A. W metabolizmie tłuszczów ważne są też inne jego tioestry tj.: malonylo~S-CoA, acetoacetylo~S-CoA, bursztynylo~S-CoA, palmitoilo~S-CoA i inne. Grupy -SR tioestrów w nukleofilowej substytucji są zdecydowanie lepszymi grupami odchodzącymi niS grupy estrów -OR, dlatego tioestry są znacznie lepszymi czynnikami transferu acylowego niS typowe estry.

Reakcją odwrotną do glikolizy jest glukoneogeneza, polegająca na odtworzeniu glukozy z pirogronianu (a ten z kolei z kwasu mlekowego lub niektórych aminokwasów).

Zachodzi wtedy, gdy w organizmie potrzebna jest glukoza, której ubyło np. podczas długotrwałej pracy mięśni.

Bezpośrednie przerabianie kwasów tłuszczowych na cukry nie jest możliwe, więc dobrym rozwiązaniem jest tworzenie glukozy w procesie glukoneogenezy.

5.4. Anabolizm

Do syntezy glikogenu używana jest UDP-glukoza (urydyno-difosfoglukoza):

Synteza glikogenu zachodzi wtedy, gdy jest nadwyżka glukozy - informuje o tym hormon insulina.

5.5. Fotosynteza

Fotosynteza przebiega w organizmach roślin, w glonach, u cyjanobakteria (sinice) i w nieco innych wariantach u bakterii zielonych oraz purpurowych. W procesie tym strukturalne składniki komórki, syntetyzowane są z wody i dwutlenku węgla, dzięki wykorzystaniu energii słonecznej.

W podręczniku przedstawiony zostanie szczegółowo proces fotosyntezy, zachodzący u zielonych eukariotów, czyli u organizmów posiadających w swoich komórkach jądro i chloroplasty.

Z wyjątkiem pewnych bakterii, fotosynteza przebiega w dwóch fazach: jasnej i ciemnej.

• faza jasna: energia fotonów wykorzystana jest do wytworzenia ATP i NADPH;

• faza ciemna: komórka zużywa NADPH i ATP do syntezy węglowodanów z CO₂ i H₂O.

W roślinach i glonach fotosynteza jest umiejscowiona w chloroplastach (sinice nie posiadają chloroplastów, ale mają tylakoidy). Reakcja świetlna zachodzi w błonie tylakoidów, a reakcja ciemna przebiega w stromie. U bakterii fotosyntetyzujących reakcja świetlna zachodzi w błonie komórkowej lub w miejscach inwaginacji tej błony (wgłębieniach) w tzw. chromatoforach.

Tylakoidy. U roślin stanowią podstawowy element chloroplastów, w fotoautotroficznych komórkach Prokariota jest to podobna struktura. Przypominają one spłaszczone, okrągłe, pęcherzykowate torebeczki, tworzące silnie rozbudowany system błon. W chloroplastach tylakoidy tworzą tzw. system lamellarny, w którego skład wchodzą grana, czyli zwarte stosy spłaszczonych tylakoidów oraz intergrana (tylakoidy stromy), czyli pojedyncze pęcherzyki tylakoidów łączące grana. Im wyższa ranga taksonomiczna rośliny, tym uporządkowanie tylakoidów jest wyższe. Błony komórkowe tylakoidów zawierają zakotwiczone, ciasno ułożone cząsteczki barwników fotosyntetyzujących, z których u roślin najważniejszy są chlorofile a i b, karotenoidy i ksantofile oraz cały aparat fazy świetlnej fotosyntezy. Chlorofil jest pochodną protoporfiryny IX z wbudowanym centralnie jonem Mg²⁺ (porównaj: str.79). W cząsteczce chlorofilu występuje sprzężony układ podwójnych wiązań, co umożliwia wprawianie elektronów w rezonans, dlatego chlorofil jest niezastąpiony w fotosyntezie. Długi węglowodorowy łańcuch fitolowy zakotwicza cząsteczkę chlorofilu w błonie. Drobne różnice w budowie bocznych reszt przyłączonych do układu porfirynowego decydują o rodzaju chlorofilu i jego barwie. Karoteny i ksantofile należą do związków izoprenowych i pełnią rolę barwników pomocniczych fotosyntezy.

Rys. 5.5.1. Schemat budowy chloroplastów

Po naświetleniu, chloroplasty fotoautotrofów „fotosyntetyzują”, wytwarzając ATP i NADPH, które następnie, również wewnątrz chloroplastów, są wykorzystywane do przekształcenia CO₂ w cukry (monosacharydy). Te z kolei są transportowane do cytozolu, gdzie służą jako źródło energii wtórnej do wytwarzania ATP oraz jako substraty do wielu innych, koniecznych do życia komórki fotoautotroficznej, cząsteczek organicznych. Monosacharydy są także transportowane do wszystkich tych komórek, które są pozbawione chloroplastów.

5.5.1. Fosforylacja fotosyntetyczna

Fosforylacja fotosyntetyczna polega na “przekształceniu” energii świetlnej w ATP. Przebiega ona wyłącznie w fazie jasnej.

Światło widzialne jest formą promieniowania elektromagnetycznego złożonego z wielu fal o różnej długości, których zakres rozciąga się od fioletu (długość fali 400 nm) do dalekiej czerwieni (700 nm). Fotony światła czerwonego niosą ze sobą niższą energię niż np. fotony światła fioletowego. Cząsteczki chlorofilu najsilniej absorbują światło czerwone. Sens fizyczny tego zjawiska polega na tym, że energia zawarta w pojedynczym fotonie zostaje w całości pochłonięta przez elektron należący do chlorofilu lub innego barwnika, co powoduje podniesienie jego stanu podstawowego w stan wzbudzony. Aby cząsteczka mogła osiągnąć trwały stan wzbudzony musi zaabsorbować odpowiednią ilość energii. W chloroplastach, kiedy fotony światła zostają zaabsorbowane przez cząsteczki chlorofilu, wtedy ich elektrony wpadają w rezonans z kolejnymi fotonami i są przenoszone na wyższy poziom energetyczny osiągając stan wzbudzony. Proces zachodzi jedynie wówczas, gdy chlorofil jest związany z innymi właściwymi białkami i występuje jako integralny składnik tylakoidów. In vitro cząsteczka chlorofilu (czyli, wyizolowana z komórki) nie jest zdolna do przekształcania zaadsorbowanego światła w energię użyteczną dla komórki fotoautotroficznej.

U roślin, glonów i sinic chlorofile absorbujące energię świetlną wchodzą w skład dużych i złożonych z wielu białek kompleksów zwanych fotosystemami (PS).

5.5.1.1. Elementy składowe łańcucha transportującego elektrony u fotoautotrofów - Fotosystemy

Fotosystemy to zgrupowania rozmaitych związków chemicznych, których głównym elementem są barwniki fotosyntetyczne, a wśród nich przede wszystkim chlorofile. Umiejscowione są one w błonie tylakoidów i emitują elektrony w odpowiedzi na pobudzenie światłem.

U roślin wyższych, zielonych alg i u cyjanobakteria wyróżnia się dwa typy fotosystemów: PSI, którego centrum reakcji posiada zdolność maksymalnej absorpcji światła o długości około 700 nm (zwane P700), oraz PSII, w którym ta wartość wynosi 680 nm (P680). Spektrum absorpcji barwników karotenowych i ksantofilowych dopełnia i uzupełnia spektrum chlorofilu, tak że rośliny mogą korzystać ze wszystkich długości światła słonecznego, żarowego i luminescencyjne (te ostatnie, np. szklarniach, w akwarystyce, itp.).

Fotosystemy PSI i PSII różnią się zarówno budową, składem barwników, lipidów i białek jak i właściwościami spektralnymi. Fotosystem PSII jest bogatszy o chlorofil b i wykazuje w czerwonym obszarze widma przesunięcia maksimum absorpcji w kierunku fal krótszych. U roślin wyższych, glonów i u Cyanobacteria oba fotosystemy są składnikami łańcucha transportującego elektrony.

Barwniki fotosyntetyczne. Główne barwniki fotosyntetyczne to chlorofile (Chl). Dzieli się je na chlorofile a, b, c oraz d, a bakteriochlorofile na a, b, c, d, e oraz g. U roślin, sinic i prochlorofitów (Prochlorophyta) występuje chlorofil a, u roślin telomowych (Telomophyta) i zielenic ponadto występuje chlorofil b, u glonów brak jest chlorofilu b natomiast występują chlorofile c i d.

Karotenoidy: są pochodnymi izopropenu i dzielą się na pomarańczowe karoteny i na żółto-pomarańczowe ksantofile zawierające np.: luteinę, karoten, ksantofil czy zeaksantynę. Mogą one absorbować światło w zakresie długości fali innym niż chlorofil a następnie przekazywać energię stanu wzbudzonego na cząsteczkę chlorofilu działając jak antena.

Fotosystemy. U roślin wyższych, glonów i u cyjanobakteria fotosystemy (PS) składają się z dwóch zasadniczych części: rdzenia fotosystemu (Core) i anten fotosyntetycznych (LHC - light harvesting antenna).

Energia świetlna służąca do napędzanie reakcji zachodzących w komórce podczas fotofosforylacji jest wychwytywana przez cząsteczki chlorofili a i b (ponad 200 na jeden rdzeń systemu) oraz karotenoidów przyłączonych wiązaniami niekowalencyjnymi do białek anten fotosyntetycznych. Istnieje kilka odmian anten fotosyntetycznych; różnych dla każdego z dwóch systemów, a także różnych w obrębie nich samych (np. dla PSII istnieje, co najmniej 6 odmian anten fotosyntetycznych z chlorofilem b - od LHC-b1 do LHB-b6). Przykładowo: anteny LHC PSII otaczają rdzeń fotosystemu kilkoma grupkami, złożonymi z pojedynczych, podwójnych a nawet potrójnym gron (patrz rysunek poniżej). Chlorofile w LHC są ułożone w taki sposób, że energia wzbudzenia elektronu może przechodzić z jednej cząsteczki chlorofilu na inną i być przemieszczana w kierunku zmniejszającego się gradientu energii, tzn. w kierunku rdzenia fotosystemów. Tam zlokalizowane są główne komponenty służące do transportu elektronów oraz białka i polipeptydy strukturalne i elementy pomocnicze. Sercem rdzenia fotosystemów jest centrum reakcji (RC). To tam jest transportowana energia wzbudzenia elektronów z anten fotosyntetycznych.

Rys. 5.5.2. Schematyczny wygląd fotosystemów (widok od strony stromy)

Rys. 5.5.3. Schemat budowy fotosystemów PSI i PSII u roślin wyższych

(opis poniżej)

Transfer energii wzbudzenia (EET) wymaga obecności dwóch cząsteczek barwników znajdujących się w odpowiedniej orientacji i odległości od siebie. Sens fizyczny przeniesienia energii wzbudzenia polega na tym, że cząsteczka wzbudzona przekazuje tę energię cząsteczce, która ją przyjmuje, jednocześnie sama powraca do stanu podstawowego, natomiast cząsteczka akceptora energię tę absorbuje i przyjmuje stan wzbudzony. Kompleksy białkowo-barwnikowe anten LHC, posiadają strukturę umożliwiającą taki transfer energii wzbudzenia. Tylko jedna z cząsteczek chlorofilu w każdej antenie posiada zdolność przekazania zebranej energii wzbudzenia do centrum reakcji fotosystemu RC. Tam energia ta jest wykorzystywana do „wybicia” jednego elektronu w specjalnej parze cząsteczek chlorofilu a. Ten elektron wędruje dalej poprzez system przekaźników elektronów (m.in. ferredoksyna, białka żelazowo-siarkowe, plastochinon, itp.), poprzez Kompleks cytochromów b₆f, fotosystem PSI aż do reduktazy ferredoksyna-NADP⁺ - patrz rysunek poniżej.

Fotosystem I (PS I), występuje w lamellach stromy, w błonach i na brzegach gran. Jest kompleksem barwnikowo-lipidowo-białkowym.

W antenach fotosystemu PSI na jedno centrum reakcji fotosyntetycznej RC PSI przypada ok. 200 cząsteczek chlorofilu (głównie chlorofilu a, np. P 683 - daleka czerwień). Rdzeń PSI otoczony jest przez pojedynczą warstwę złożoną z 8 białek LHC PSI. Te osiem cząsteczek LHC wiąże około 120 cząsteczek chlorofilu (pozostałe 80 jest wiązanych przez rdzeń PSI). W LHC PSI zachodzi bardzo szybki przekaz energii wzbudzenia w całym obszarze systemu antenowego i szybki transfer EET do RC PSI.

W rdzeniu (Core) kompleksu PS I występuje 128 cząsteczek kofaktorów. W centrum reakcji RC PSI występują dwie cząsteczki specjalnego chlorofilu P700, w miejscu A₀ kolejna cząsteczka chlorofilu a, w miejscu A₁ filochinon (Fl - witamina K), w pobliżu białko żelazowo-siarkowe Fe₄S₄ i β-karoten (porównaj rysunek 5.5.3). Kompleks rdzeniowy PS I zbudowany jest z 13 polipeptydów. Centrum reakcji stanowi dimer PSI-A i PSI-B wiążący 2 chlorofile a P-700 oraz 3 przenośniki elektronów. Inne polipeptydy rdzenia PS I to między innymi PSI-C wiążący 3 centra żelazowo-siarkowe (Fe₄S₄), polipeptydy PSI-D i PSI-E wiążące ferredoksynę (Fd) i PSI-F wiążący plastocyjaninę (PCY).

Kofaktory związane z podjednostkami PSI-A i PSI-B są zorganizowane podobnie jak w RC PSII, tzn. występują równoległe dwie gałęzie przepływu elektronów, zorganizowane przy utrzymaniu pseudosymetrii. (na rys.5.5.3 dla uproszczenia pokazano jedynie jedną gałąź).

Karoteny pełnią funkcję przenośnika energii wzbudzenia, jak również chronią fotosystem przed nadmiarem energii świetlnej.

Rys. 5.5.4. Schemat łańcucha transportującego elektrony u roślin wyższych

Fotosystem II (PSII) u roślin jest zlokalizowany w membranie tylakoidów. PSII jest multibiałkowym kompleksem złożonym z ponad 25 trans-membranowych i częściowo wystających poza membranę białek. W antenach fotosystemu PS II znajduje się około 250-300 cząsteczek głównie chlorofilu b P 650. Główne białko wiążące cząsteczki chlorofilu w antenie - LHC IIb, ma masę cząsteczkową 25 kDa. Przyłącza 8 cząsteczek chlorofilu a (Chl[a]), 7 cząsteczek chlorofilu b (Chl[b]) oraz cząsteczki β-karotenu (β-Car). Składa się ono z 3 łańcuchów polipeptydowych, tworzących trimer, a każdy z nich obejmuje 3 helisy transmembranowe. 15 cząsteczek chlorofilu znajduje się na zewnętrznej powierzchni struktury spiralnej. W rdzeniu PSII istnieją dwie prawie identyczne drogi transportu elektronów, o pseudosymetrycznym ułożeniu niezbędnych komponentów w każdej z tych gałęzi (na rys.5.5.3 dla uproszczenia pokazano jedynie jedną gałąź). Komponenty te są ulokowane w białkowym heterodimerze D1/D2, który zbudowany jest z 10 transmembranowych α-helis: PsbA (D1) i PsbD (D2). W skład obu gałęzi PSII wchodzą także po 2 cząsteczki chlorofilu a P680, po 1 cząsteczce feofityny (Fp), po 1 cząsteczce β-karotenu oraz cytochromy c 550 i b559 (ten drugi jest prawdopodobnie zaangażowany w ochronę fotosystemu PSII przed fotouszkodzeniem). Ponadto w D1 (białku PbsA), już częściowo poza membraną tylakoidalną (w lumenie), zlokalizowana jest „aktywna tyrozyna” Tyr161, zwana „Z”. W jej pobliżu ulokowany jest klaster mangano-wapniowy Mn₄Ca. Struktura przestrzenna klastera Mn₄Ca w PSII przypomina niesymetryczny sześcian, z trzema jonami Mn i Ca połączonymi z czwartym atomem Mn, który ulokowany jest w większej odległości od sześciennego motywu. Do PS II dołączony jest także plastochinon (PQ).

Cytochrom b₆f (cyt. b₆f) jest wielkocząsteczkowym kompleksem białkowym zlokalizowanym w błonach tylakoidów w chloroplastach (rys.5.5.4). Kompleks ten jest w rzeczywistości enzymem: reduktazą plastochinol-plastocyjanina (EC 1.10.99.1) i katalizuje reakcję przeniesienia dwóch elektronów z plastochinolu (PQH₂) na dwie cząsteczki utlenionej plastocyjaniny (PCYox):

W efekcie powstaje plastochinon i zredukowana postać plastocyjaniny (jony Cu2⁺ redukują się do Cu⁺). Z transportem elektronów sprzężony jest transport protonów ze stromy do przestrzeni tylakoidów (do lumenu).

Cyt.b₆f jest dimerem, zbudowanym z dwóch monomerów (o osi symetrii prostopadłej do powierzchni błony tylakoidów). W skład każdego monomeru wchodzi cytochrom b6, zawierający cząsteczki hemu b_L i b_H (niski i wysoki potencjał red-ox); cytochrom f, zawierający białko Rieske'go (ISP) z pojedynczym klasterem Fe₂-S₂, a ponadto jedna cząsteczka chlorofili a i β-karoten.

Cytochrom b6 jest białkiem integralnie związanym z błoną tylakoidów zbudowanym z około 400 reszt aminokwasowych, które prawdopodobnie posiada 8 transmembranowych segmentów. U roślin i u cyjanobakteria składa się z dwóch podjednostek, do których niekowalencyjnie przyczepione są dwie grupy hemowe (b_L i b_H) znane jako b562 i b566. Ligandami jonu żelaza w tych heminowych grupach są reszty histydyny.

Cytochrom f jest zakotwiczony w błonie tylakoidów pojedynczą transbłonową domeną, zlokalizowaną w pobliżu hydrofobowego końca C łańcucha polipeptydowego. Druga część tego białka (z N-końcem) w postaci globularnej ma charakter hydrofilowy i wystaje z błony do przestrzeni tylakoidalnej (do lumenu). Część ta posiada ładunek umożliwiający przyłączenie cząsteczki plastocyjaniny (PCYox).

Kompleks cyt. b₆f może uczestniczyć w przenoszeniu elektronu ze zredukowanej ferredoksyny (Fdred) na utlenioną plastocyjaninę (PCYox ) poprzez pulę plastochinonową (PQ/PQH₂) w czasie cyklicznego transportu elektronów.

Reduktaza ferredoksyna-NADP⁺ (EC 1.18.1.2) jest kolejnym elementem składowym łańcucha transportującego elektrony u fotoautotrofów. Enzym katalizuje reakcję utlenienia zredukowanej ferredoksyny; akceptorem elektronów jest NADP⁺, protony dobierane są za stromy. Kofaktorem reakcji jest FAD.

Plastochinon to związek organiczny z grupy chinonów, pełniący rolę przenośnika elektronów. Różni się strukturalnie od ubichinonu tym, że zamiast grup metoksy występują przy pierścieniu grupy metylowe, a łańcuch boczny złożony jest z 9 reszt izoprenowych. Plastochinon może przyjmować elektrony redukując się do plastochinolu, a następnie oddawać je utleniając się z powrotem do plastochinonu.

Feofityna (Fp) jest cząsteczką chlorofilu, w której atom Mg zastąpiony został dwoma atomami wodoru.

Ferredoksyna i plastocyjanina zostały opisane w rozdziale 1.3 na str.13. Należy zwrócić uwagę na to, że obok plastochinolu oba te związki są ruchliwymi przenośnikami elektronów w łańcuchu transportującym elektrony u fotoautotrofów.

Kompleks V zwany potocznie syntazą ATP (czyli H(+)-transportującą dwu-sektorową ATP-azą - EC 3.6.3.14), opisany już został w rozdziale 5.2.2.1, na str. 117)

5.5.1.2. Mechanizm działania łańcucha transportującego elektrony u fotoautotrofów

U roślin wyższych łańcuch transportujący elektrony, którego elementami składowymi są oba fotosystemy, może działać na dwa różne sposoby i tym samym mówi się o dwóch typach fosforylacji fotosyntetycznej: niecyklicznej i cyklicznej.

Istotą fosforylacji niecyklicznej jest wytworzenie ATP i jednocześnie NADPH. Energia świetlna zaabsorbowana przez oba fotosystemy wystarcza do oderwanie dwóch elektronów od cząsteczki wody i przetransportowania ich na NADP⁺. W trakcie transportu tych dwóch elektronów następuje „przepompowanie” protonów ze stromy do przestrzeni tylakoidów, co z kolei pozwala na fosforylację, czyli wytworzenie ATP z ADP w kompleksie V. W transporcie elektronów od wody do NADP⁺ uczestniczą oba fotosystemy oraz cały łańcuch je transportujący. W efekcie cztery zaabsorbowane fotony (dwa w PSI i dwa w PSII) pozwalają komórce uzyskać 2 cząsteczki ATP i 1 cząsteczkę NADPH oraz jako produkt uboczny 1/2cząsteczki tlenu.

W komórce roślinnej zdarzyć się jednak może sytuacja zwiększonego zapotrzebowania na ATP w stosunku do NADPH. Zostaje wtedy uruchomiony cykliczny transport elektronów, w którym uczestniczy tylko fotosystem PS I. Nie powstaje wtedy NADPH, natomiast tworzy się wyłącznie ATP.

Mechanizm fotofosforylacji niecyklicznej

Po absorpcji fotonu, chlorofilowa antena PSII szybko transportuje przechwyconą energię do centrum reakcji PSII. Dzięki temu podnosi się energia jednego z π elektronów i tworzy wzbudzony stan chlorofilu P680*. Po absorpcji kolejnego fotonu, z tej wzbudzonej cząsteczki chlorofilu P680* zostaje wybity elektron o wysokiej energii, który przekazany zostaje na pierwotny akceptor elektronów, którym w fotosystemie PSII jest feofityna (Fp). Redukcji feofityny towarzyszy utworzenie kationu chlorofilu a P680⁺.

Układ feofityna/chlorofil a P680⁺, jest najsilniejszym, spośród to tej pory poznanych, biologicznych utleniaczy (E½ = 1,2V). Reakcja ta uważana jest za najwyższą energetycznie reakcją biochemiczną w żywych organizmach.

W ciągu następnych 200ps elektron ze zredukowanej feofityny transferowany jest do przenośnika elektronów PQ_A, który jest stabilnym akceptorem elektronów. Bezpośrednim akceptorem elektronów w przenośniku PQ_A jest cząsteczka plastochinonu; plastochinon w miejscu PQ_A może przyjąć tylko jeden elektron przechodząc w formę semichinonową. Kolejnym przenośnikiem akceptorowym jest PQ_B będący też cząsteczką plastochinonu, ale związanym z innym białkiem. Plastochinon w miejscu PQ_B przejmuje dwa elektrony napływające kolejno z PQ_A, a protony dobiera ze stromy przechodząc w plastochinol (PQH₂).

Powstały plastochinol oddysocjowuje od miejsca PQ_B i jego miejsce zajmuje kolejna cząsteczka plastochinonu. Plastochinol (PQH₂) dyfunduje do błony tylakoidów i tam wędruje do kompleksu cytochromu b₆f.

W tym samym czasie brakujące elektrony we wzbudzonym chlorofilu P-680⁺ są uzupełniane u roślin i u sinic elektronami pochodzącymi z cząsteczki wody (donora elektronów o niskiej energii) i chlorofil P-680⁺ powraca do stanu niewzbudzonego. Cząsteczka wody ulega rozkładowi zgodnie z równaniem:

W rzeczywistości fotolizie muszą ulec dwie cząsteczki wody, gdyż 1/2O₂ w przyrodzie nie istnieje. Dla celów dydaktycznych z reguły jednak przy rozpatrywaniu fotosyntezy punktem wyjściowym jest absorpcja przez oba fotosystemy 4 fotonów światła.

Mechanizm rozkładu wody na elektrony, protony i tlen jest złożony; ważną w nim rolę odgrywają 4 atomy manganu związane z białkiem PsbA oraz tyrozyna Z. Atomy Mn²⁺ przechodzą na wyższy stopień utlenienia przekazując kolejno elektrony do chlorofilu P-680⁺ i dopiero po odłączeniu od manganu 4 elektronów następuje rozszczepienie 2 cząsteczek wody na 4 elektrony, 4 protony i cząsteczkę tlenu. Rola tyrozyny Z nie do końca została wyjaśniona. Ogólnie uważa się, że pośredniczy ona w transporcie elektronów z klastera Mn₄Ca do P680⁺. Jedna z hipotez (2007) mówi, że tyrozyna Z bierze także udział w uwalnianiu protonów powstałych z rozkładu wody do wnętrza pęcherzyka tylakoidu. Tlen jest produktem ubocznym procesu i uwalniany jest do atmosfery.

Po dotarciu do cytochromu b₆f plastochinol wiąże się z miejscem PQ_Z. Tam jeden z elektronów cząsteczki PQH₂ przekazany zostaje do centrum żelazowo siarkowego Rieske'go ISP, redukując Fe⁺³ do Fe⁺². Jednocześnie PQH₂ utlenia się do semiplastochinonu PQH^-, uwalniając jeden z protonów do lumenu. Elektron wychwycony w Fe₂-S₂ przechodzi dalej na cytochrom f, redukując żelazo w układzie hemowym. Końcowym odbiorcą tego elektronu jest plastocyjanina (PCYox), która redukuje się do PCYred i dalej wędruje w lumenie do PSI.

W tym samym czasie drugi z elektronów z cząsteczki PQH^- zostaje przekazany na hem o niskim potencjale b_L; jednocześnie uwolniony zostaje drugi proton do przestrzeni tylakoidalnej (do lumenu) i powstaje plastochinon PQ, który natychmiast odłącza się od PQ_Z i dyfunduje do wnętrza błony włączając się w pulę plastochinonową.

Teraz, z nanosekundowym opóźnieniem, do miejsca PQ_Z w cyt. b₆f przyłącza się cząsteczka PQH₂' wydalona z miejsca PQ_C z cyt. b₆f (jest to analogiczny mechanizm, jak w przypadku cyklu Q w Kompleksie III łańcucha oddechowego chemoorganotrofów prokariotycznych). I sekwencja zdarzeń, która spotkała pierwszą cząsteczkę PQH₂ zostaje powtórzona teraz z tą drugą PQH₂'.

W międzyczasie elektron z hemu b_L zostaje przeniesiony w poprzek kompleksu b₆f - w kierunku prostopadłym do błony - na hem b_H (znajdujący się w pobliżu stromy). Elektron ten zostaje przesłany do miejsca PQ_C, gdzie czeka na niego przyłączona tam cząsteczka plastochinonu PQ. Do hemu b_H z pikosekundowym opóźnieniem dociera drugi elektron ze zredukowanej ferredoksyny Fdred, która od strony stromy dociera tam z kompleksu PSI. I ten elektron przesłany zostaje do miejsca PQ_C na cząsteczkę PQ, która pobiera teraz ze stromy dwa protony H⁺ redukując się do PQH₂. To właśnie ta zredukowana cząsteczka PQH₂' za moment dotrze do PQ_Z. I zaraz potem kolejne cząsteczki PQH₂ i PQH₂' będą podlegały tym samym przemianom w kompleksie cytochromu b₆f.

Równocześnie z przemianami zachodzącymi w PSII, również kompleks antenowy PSI absorbuje energię świetlną, którą dalej przekazuje do centrum reakcji RC PSI. Tutaj chlorofil P700 ulega wzbudzeniu do P700* i po kolejnej dawce energii z LHC PSI emituje elektron o wysokiej energii na cząsteczkę chlorofilu a umieszczoną w miejsca A₀, przy czym sam staje się kationem P700⁺. Ten chlorofil P700⁺ przyjmuje elektron ze zredukowanej plastocyjaniny PCYred wędrującej z cytochromu b₆f i w ten sposób powraca do stanu niewzbudzonego. Utleniona plastocyjanina PCYox wraca w lumenie do kompleksu cytochromu b₆f.

W międzyczasie elektron z przenośnika A₀ transportowany jest na cząsteczkę witaminy K (filochinonu - Fl) znajdującą się w miejscu A₁. Stamtąd poprzez białka żelazowo-siarkowe typu Fe₄S₄ kierowany jest na ferredoksynę, która przyjmując ten elektron redukuje się do Fdred.

Zredukowana ferredoksyna ma do wyboru dwa kierunki wędrówki: w stronę reduktazy ferredoksyna-NADP⁺, albo w kierunku cyt. b₆f. W fotofosforylacji niecyklicznej od tego "rozwidlenia" na zmianę Fdred wędruje w obu kierunkach. Jedna cząsteczka dociera do cyt. b₆f i już wiemy, że włącza się tam w cykl PQ. Natomiast druga cząsteczka Fdred wędruje do reduktazy ferredoksyna-NADP⁺, gdzie oddaje transportowany elektron na FAD, utleniając się do Fdox i zawraca w stromie do PSI. Po kilkunastu pikosekundach do reduktazy ferredoksyna-NADP⁺ dociera od strony "rozwidlenia" kolejna cząsteczka Fdred i też oddaje swój elektron na FAD. FAD jest kofaktorem reakcji katalizowanej przez reduktazę ferredoksyna-NADP⁺. Oba elektrony ze zredukowanego FAD są przenoszone na NADP⁺, który redukuje się do NADPH czerpiąc proton ze stromy (drugi proton zwyczajowo dopisywany do NADPH+H⁺ w tym przypadku można pominąć, gdyż i tak występuje on w stromie). I w tym miejscu kończy się transport elektronów przez cały układ fotosyntetyczny.

Jak już wspomniano, przepływowi elektronów przez łańcuch fotosyntetyczny towarzyszy transport protonów do lumenu (do wnętrza tylakoidu). Tam zgromadzone protony przepływają z powrotem do stromy przez wtórną pompę protonową zwaną potocznie syntazą ATP (czyli przez Kompleks V). Przepływowi 3 protonów przez syntazę ATP towarzyszy wytwarzanie z ADP i P_i 1 cząsteczki ATP. Proces wytworzenia ATP w rozpatrywanym w tym rozdziale układzie nazywany bywa fosforylacją fotosyntetyczną (lub krótko fotofosforylacją).

Reasumując: po zaabsorbowaniu dwóch fotonów światła efektem działania fotosystemu PSII jest rozkład cząsteczki wody, co daje dwa protony H⁺ w przestrzeni tylakoidalnej, ½ cząsteczki O₂ wydzielonej do atmosfery oraz dwa elektrony przeniesione na cząsteczkę plastochinolu (PQH₂), która wędruje do kompleksu cytochromu b₆f.

W wyniku działania cytochromu b₆f cztery protony zostają przerzucone ze stromy do lumenu, następuje regeneracja docierającego z PSII PQH₂ do PQ, utlenienie 2 cząsteczek ferredoksyny docierającej w stromie z PSI Fdred do Fdox oraz redukcja dwóch cząsteczek plastocyjaniny PCYox do PCYred, która dalej w lumenie wędruje do PSI.

W PSI, po zaabsorbowaniu dwóch fotonów światła następuje utlenienie 2 cząsteczek PCYred do PCYox oraz redukcja czterech cząsteczek ferredoksyny Fdox do Fdred. Dwie z nich powracają do cyt. b₆f, a dwie wędrują do reduktazy ferredoksyna-NADP⁺, gdzie ulegają utlenieniu do Fdox kosztem redukcji 1 cząsteczki NADP⁺ do NADPH.

W Kompleksie V 6 protonów przepompowanych w poprzednich przemianach ze stromy do lumenu podczas powrotnego transportu pozwala wytworzyć 2 cząsteczki ATP.

Mechanizm fotofosforylacji cyklicznej

W sytuacji zwiększonego zapotrzebowania na ATP w stosunku do NADPH zostaje uruchomiony cykliczny transport elektronów, w którym uczestniczy tylko PS I, cyt. b₆f oraz Kompleks V. Nie powstaje wtedy NADPH natomiast tworzy się jedynie ATP. W procesie tym elektron ze wzbudzonego chlorofilu P-700* jest przekazywany poprzez kolejne przenośniki elektronów fotosystemu PS I, czyli: chlorofil a - w miejscu A₀, filochinon - w miejscu A₁, poprzez białka żelazowo-siarkowe typu Fe₄S₄ w kierunku ferredoksyny, która przyjmując ten elektron redukuje się do Fdred. Jednakże od miejsca "rozwidlenia" obu szlaków (cyklicznego i niecyklicznego) zredukowana ferredoksyna wędruje jedynie do kompleksu cytochromowego b₆f, tam zostawiając transportowany elektron, który następnie poprzez przenośniki cyt. b₆f przenoszony jest na plastocyjaninę, która redukuje się do PCYred. Zredukowana plastocyjanina wraca do PSI, dostarczając brakującego elektronu P-700⁺. Dzięki takiemu cyklicznemu przepływowi elektronów następuje w cytochromie b₆f przepompowanie 4 protonów ze stromy do lumenu, co pozwala syntazie ATP na fosforylację, czyli wytworzenie ATP, którą w tym układzie określa się terminem fotofosforylacji cyklicznej.

Efektem fotofosforylacji cyklicznej jest wytworzenie w jednym cyklu - po absorpcji 2 fotonów światła - 4/3 ATP, czyli w 3 cyklach 4 cząsteczek ATP. Uwzględniając fakt, że jeden cykl fotofosforylacji cyklicznej przebiega prawie trzykrotnie szybciej aniżeli niecyklicznej, można przyjąć, iż komórka wytwarza w ten sposób prawie dwa razy więcej ATP w tym samym czasie.

٭ ٭ ٭

Fotofosforylacja u bakterii purpurowych (np. Rhodobacter sphaeroides). Zamiast typowego dla chemoorganotrofów Kompleksu I posiadają one skomplikowany fotosystem, z centrum reakcji zawierającym chlorofil P865. Luka po wybitym elektronie zapełniana jest w P865⁺ elektronem transportowanym w przestrzeni periplazmatycznej przez cytochrom c₂. Posiadają Kompleks II i Kompleks III sprzęgnięty z cyklem Q (skąd pompowane są 4H⁺). Kompleks I występuje dopiero za Kompleksem III i nie pompuje protonów do przestrzeni periplazmatycznej. Ponadto występuje transhydrogenaza NADP (B-specyficzna) - EC 1.6.1.1, która z powrotem do cytoplazmy zawraca 1H⁺. Tak, że w sumie z łańcucha transportującego elektrony pochodzą tylko 3H⁺, czyli 1 ATP

Fotofosforylacja u Halobacteria halobium. Ta holobakteria utlenia tlenem związki organiczne, lecz jednocześnie wykorzystuje światło jako dodatkowe źródło energii. Z punktu widzenia fotosyntezy, brak u niej PSI, PSII i cyt. b₆f - występuje jedynie Kompleks V. Natomiast w ich błonach periplazmatycznych występują purpurowe płaty zbudowane z białka zwanego bakteriorodopsyną, które jako grupę prostetyczną ma wbudowany retinal (aldehyd witaminy A). Po przejściowym wzbudzeniu kwantem światła retinal powraca do stanu podstawowego, a wyzwolona energia zostaje zużyta do przetransportowania jednego protonu z cytoplazmy do przestrzeni periplazmatycznej. Bakteriorodopsyna stanowi więc specyficzną pierwotną pompę protonową. Tak więc, absorpcja 3hν pozwala na wytworzenie 1 cząsteczki ATP.

5.5.2. Faza ciemna - cykl Calvina

Fotosynteza w rzeczywistości jest procesem anabolicznym, w wyniku którego z prostych związków nieorganicznych z wykorzystaniem energii świetlnej powstają związki organiczne.

W formie sumarycznej przebieg fotosyntezy można zapisać następująco:

Organizmy produkujące związki organiczne na drodze fotosyntezy to:

• wszystkie rośliny (nieliczne wyjątki to rośliny cudzożywne, saprofityczne i pasożytnicze),

• niektóre protisty,

• część bakterii (m.in. bakterie purpurowe oraz sinice).

Faza ciemna fotosyntezy (w tym, cykl Calvina) przebiega bez udziału światła i polega na asymilacji i włączeniu CO₂ w budowę składników strukturalnych komórki z wykorzystaniem energii zgromadzonej w fazie jasnej fotosyntezy.

Cykl Calvina (a właściwie Calvina-Bensona, zwany też cyklem C3) to cykl biochemiczny, który zachodzi w stromie chloroplastów i jest drugim etapem fotosyntezy niezależnym bezpośrednio od dostępu światła, określany stąd jako faza ciemna fotosyntezy.

W cyklu Calvina wyróżnia się trzy fazy:

• I. Faza karboksylacji

• II. Faza redukcji

• III. Faza regeneracji.

Faza I karboksylacji. Rozpoczyna cały cykl Calvina. Polega na przyłączenia cząsteczki CO₂ do 1,5-bisfosforybulozy (RuBP). Reakcja katalizowana jest przez karboksylazę rybulozo-bisfosforanową - EC 4.1.1.39 (1 na rys.5.5.5) w skrócie zwaną RuBisCO. W wyniku przyłączenia CO₂ powstaje nietrwały produkt przejściowy 1,5-bisfosfo-2-karboksy-3-ketoarabanitol, który szybko ulega rozpadowi na dwie cząsteczki 3-fosfoglicerynianu.

Faza II redukcji. Powstały w I fazie 3-fosfoglicerynian pod działaniem kinazy fosfoglicerynianowej - EC 2.7.2.3 (2) przy udziale ATP jako kosubstratu ulega ufosforylowaniu do 1,3-bisfosfoglicerynianu, który następnie ulega redukcji pod działaniem dehydrogenazy gliceroaldehydo-3-fosforanowej (NADP(+)) (fosforylującej) - EC 1.2.1.13 (3), sprzężonej z NADPH, do aldehydu 3-fosfoglicerynowego (PGA).

Faza III regeneracji. W tej fazie z PGA (aldehydu 3-fosfoglicerynowego) i jego izomeru fosfodihydroksyacetonu odtwarzana jest w wyniku wielu reakcji biochemicznych 1,5-bisfosforybuloza (występuje tu analogia do cyklu pentozowego). Część PGA, która nie jest potrzebna do odtworzenia 1,5-bisfosforybulozy jest przekształcana w glukozę, a ta w dalszym metabolizmie w skrobię.

Etap regeneracji jest najbardziej skomplikowanym ciągiem reakcji w całym cyklu. W jego trakcie pojawiają się triozy, tetrozy, pentozy, heksozy i heptuloza.

Na rys. 5.5.5. przedstawiono schematycznie przebieg cyklu Calvina. Dla celów dydaktycznych wygodnie jest rozpatrywać ten cykl wychodząc z 6 cząsteczek 1,5-bisfosforybulozy. Kolorem niebieskim na schemacie oznaczono ilość cząsteczek danego metabolitu, zaś czerwonym odnośniki do nazw enzymów katalizujących daną reakcję.

Rys. 5.5.5. Schemat cyklu Calvina

1. Karboksylaza rybulozobisfosforanowa - EC 4.1.1.39, 2. Kinaza fosfoglicerynianowa - EC 2.7.2.3, 3. Dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa (NADP(+)) (fosforylująca) - EC 1.2.1.13, 4. Izomeraza triozofosforanowa - EC 5.3.1.1, 5. Aldolaza fruktozobisfosforanowa - 4.1.2.13, 6. Fosfataza bisfosfoglicerynianowa - EC 3.1.3.11, 7. Izomeraza glukozo-6-fosforanowa- 5.3.1.9, 8. Transketolaza - EC 2.2.1.1, 9. Sedoheptulozobisfosfataza - EC 3.1.3.37, 10. Izomeraza rybozo-5-fosforanowa - EC 5.3.1.6, 11. 3-Epimeraza rybulozofosforanowa - EC 5.1.3.1, 12. Fosforybulokinaza - EC 2.7.1.19.

5 (z 12) cząsteczek PGA w reakcji katalizowanej przez izomerazę triozofosforanową - EC 5.3.1.1 (4) przekształconych zostaje w fosfodihydroksyaceton (C3). Aldolaza fruktozobisfosforanowa - 4.1.2.13 (5) przeprowadza reakcję syntezy 1,6-bisfosfofruktozy (C6) z 3 cząsteczek PGA i 3 cząsteczek fosfodihydroksyacetonu. Powstałe 3 cząsteczki 1,6-bisfosfofruktozy zostają przekształcone w fruktozo-6-fosforan pod działaniem fosfatazy bisfosfoglicerynianowej - EC 3.1.3.11 (6). 1-na z tych cząsteczek przy udziale izomerazy glukozo-6-fosforanowej- 5.3.1.9 (7) zostaje transformowana do glukozo-6-fosforanu (stanowiącego czysty zysk komórki). Z pozostałych 2 cząsteczek transketolaza - EC 2.2.1.1 (8) przenosi fragment dwuwęglowy „aktywny aldehyd glikolowy” na 2 cząsteczki PGA, w wyniku czego powstają 2 cząsteczki ksylulozo-5 fosforanu (C5) oraz 2 cząsteczki erytrozo-4-fosforanu (C4). Te 2 cząsteczki ksylulozo-5 fosforanu w reakcji katalizowanej przez 3-epimerazę rybulozofosforanową - EC 5.1.3.1 (11) zostają przekształcone w rybulozo-5-fosforan. Równolegle aldolaza fruktozobisfosforanowa - 4.1.2.13 (5) łączy 2 cząsteczki erytrozo-4-fosforanu z 2-ma cząsteczkami fosfodihydroksyacetonu, w wyniku czego powstają 2 cząsteczki seduheptulozo- bisfosforanu, które sedoheptulozobisfosfataza - EC 3.1.3.37 (9) hydrolitycznie rozkłada na seduheptulozo-7-fosforan (C7) i resztę fosforanową. Teraz transketolaza - EC 2.2.1.1 (8) z tych 2 cząsteczek seduheptulozo-7-fosforanu przenosi „aktywny aldehyd glikolowy” (C2) na 2 cząsteczki PGA, w wyniku czego powstają kolejne 2 cząsteczki rybulozo-5-fosforanu oraz 2 cząsteczki rybozo-5-fosforanu. Te 2 cząsteczki rybozo-5-fosforanu pod działaniem izomerazy rybozo-5-fosforanowej - EC 5.3.1.6 (10) zostają przekształcone w kolejne 2 cząsteczki rybulozo-5-fosforanu (razem powstaje ich 6). Teraz fosforybulokinaza - EC 2.7.1.19 (12) dokonuje ich ufosforylowania do 6 cząsteczek 1,5-bisfosforybulozy i w ten sposób cykl zostaje zamknięty.

W cyklu Calvina zużywane zostają wytworzone w fazie jasnej ATP i NADPH, a ich energia zmagazynowana zostaje w wytworzonej cząsteczce glukozo-6-fosforanu, która w wyniku dalszych przemian anabolicznych stanowi punkt wyjściowy do syntezy całej gamy związków strukturalnych komórki - w tym skrobi, która jest materiałem zapasowym komórki.

Regulacja cyklu Calvina. Aktywność wielu enzymów cyklu Calvina stymulowana jest przez alkaliczne środowisko, co komórka w stromie osiąga w czasie fazy jasnej fotosyntezy. Jony Mg²⁺ są aktywatorem karboksylazy 1,5-bisfosforybozy, fosforybulokinazy oraz kinazy fosfoglicerynianowej. Ten ostatni enzym aktywowany może być również przez jony Mn²⁺. Kofaktorem reakcji katalizowanej przez aldolazę fruktozobisfosforanową są jony Zn²⁺. Szybkość wiązania CO₂ zależy od stężenia metabolitów pośrednich cyklu oraz od dostępności nieorganicznego fosforu.

Odmiany cyklu Calvina

Jeżeli pierwszym produktem fotosyntezy jest trioza (tak, jak w cyklu Calvina: 3-fosfoglicerynian) to rośliny, które ją wytwarzają zalicza się do typu C3. Do nich należy większość, w tym wszystkie rośliny stref umiarkowanych i chłodnych. Istnieje jednak grupa roślin, u których pierwotnym produktem fotosyntezy jest tetroza, a dopiero później pojawia się trioza. Takie rośliny zalicza się do typu C4; należą do nich m.in. tropikalne trawy, trzcina cukrowa, kukurydza, itp. Tego typu rośliny charakteryzują się dużą produktywnością biomasy i przystosowaniem do gorących i niezbyt wilgotnych stref klimatycznych. Istnieją jeszcze rośliny typu CAM; wiązanie CO₂ przebiega u nich jeszcze inaczej niż u roślin typu C3 lub C4 (choć istnieje podobieństwo do roślin typu C4). Przystosowane są one do jeszcze większej suszy i gorąca. U roślin typu C4 i CAM dwutlenek węgla wbudowywany jest przejściowo w związki organiczne o trzech atomach węgla dając w efekcie czterowęglowy kwas jabłkowy, z którego CO₂ uwalnia się sukcesywnie m.in. w trakcie dnia. Roślina asymiluje CO₂ w nocy, a prowadzi właściwą fotosyntezę w dzień w pełnym słońcu, bez konieczności otwierania aparatów szparkowych. Ciekawe, że enzymy tego typu roślin słabo działają w klimacie chłodniejszym.

Cykl Hatcha-Slacka (cykl C4). Rośliny typu C4 posiadają dwa rodzaje komórek zaangażowanych w proces fotosyntezy: komórki miękiszu liścia (komórki mezofilu) oraz specjalną grupę komórek otaczających wiązki przewodzące zwane pochwą okołowiązkową. Cykl C4 rozpoczyna się od przetransportowania z chloroplastów pochwy okołowiązkowej (KPO) pirogronianu do chloroplastów komórki miękiszowej - patrz rys.5.5.6. Tam pirogronian pod działaniem enzymu dikinazy pirogronian-fosforan (EC 2.7.9.1) zostaje przekształcony w fosfoenolopirogronian. Enzym ten fosforyluje nie tylko pirogronian, ale także cząsteczkę fosforanu nieorganicznego, zużywając dwa wysokoenergetyczne wiązania w ATP (ATP przekształca się w AMP i PP_i).

Fosfoenolopirogronian w komórkach mezofilu jest przerzucany z chloroplastów do cytozolu. Tam karboksylaza fosfoenolopirogronianowa (EC 4.1.1.31), przyłącza do niego CO₂, co daje w efekcie szczawiooctan (C4 - i stąd nazwa cyklu). Szczawiooctan transportowany jest z powrotem do chloroplastów, gdzie dehydrogenaza jabłczanowa (NADP⁺) - EC 1.1.1.82 redukuje go do jabłczanu (aktywatorem tego enzymu jest światło). Teraz jabłczan jest transportowany do chloroplastów komórek pochwy okołowiązkowej (KPO), gdzie dehydrogenaza jabłczanowa (dekarboksylująca szczawiooctan (NADP(+)) - EC 1.1.1.40, redukuje go do pirogronianu z jednoczesną dekarboksylacją (rysunek obok). Uwolniony CO₂ zostaje włączony do cyklu Calvina, a pirogronian zamyka cykl i jest transportowany do chloroplastów komórek miękiszu.

Rys. 5.5.6. Reakcje cyklu C4 zachodzące w komórkach miękiszu

KPO - komórki pochwy okołowiązkowej, EC 4.1.1.31 - Karboksylaza fosfoenolopirogronianowa, EC 2.7.9.1 - Dikinaza pirogronian-fosforan, EC 1.1.1.82 - Dehydrogenaza jabłczanowa (NADP(+)).

Na jedną związaną cząsteczkę CO₂ potrzeba w tym cyklu 2 cząsteczki NADPH oraz 5 ATP, zaś w przypadku roślin typu C3 odpowiednio 2NADPH i 3 ATP.

Bez wątpienia utrudnieniem w cyklu C4 jest konieczność przemieszczania uczestniczących w nim metabolitów pośrednich pomiędzy komórkami mezofilu a komórkami pochwy. Ale, z kolei, rośliny typu C4 wykazują wysoką wydajność i szybszy przyrost biomasy. Zużywają także dużo mniej wody, aniżeli rośliny typu C3, mogą więc zasiedlać suche tereny. Ponadto karboksylaza fosfoenolo- pirogronianowa wykazuje duże powinowactwo do CO₂ i może go wydajnie wiązać nawet wtedy, gdy jego stężenie jest bardzo małe. Karboksylaza 1,5-bisfosforybulozy wykazuje stosunkowo małe powinowactwo do CO₂ dlatego w warunkach ograniczonego jego dopływu do liścia wiązanie tego gazu zachodzi mało efektywnie. Karboksylaza fosfoenolopirogronianowa i dikinaza pirogronian- fosforan występują wyłącznie w komórkach mezofilu, zaś enzymy dekarboksylujące występują wyłącznie w komórkach pochwy okołowiązkowej.

Wiązanie CO₂ w roślinach typu CAM. Rośliny rosnące w klimacie półpustynnym i pustynnym prowadzą bardzo oszczędną gospodarkę wodną. Otwierają one szparki tylko w nocy, umożliwiając wtedy dopływ CO₂ do komórek rośliny. Podobnie jak w przypadku roślin typu C4 dopływający CO₂ jest przyłączany w cytozolu przez karboksylazę fosfoenolopirogronianową do fosfoenolopirogronianu z utworzeniem szczawiooctanu. Jednakże u roślin typu CAM fosfoenolopirogronian w cytozolu pochodzi z glikolizy (glukoza pochodzi z rozkładu skrobi). Powstały szczawiooctan ulega redukcji do jabłczanu, który jest transportowany do wakuoli i tam nagromadzany powodując jej zakwaszenie. W czasie dnia, kiedy szparki są zamknięte, jabłczan jest przenoszony z powrotem do cytozolu i ulega dekarboksylacji przez znaną już z cyklu C4 dehydrogenazę jabłczanową (dekarboksylującą szczawiooctan (NADP(+)) - EC 1.1.1.40 i tym sposobem dostarcza chloroplastom CO_2. Ponieważ w czasie dnia zachodzą typowe procesy fazy świetlnej fotosyntezy, tzn. wytwarzane są ATP i NADPH, uruchomiony zostaje cykl Calvina, zachodzi więc asymilacja uwolnionego CO₂ i następuje regeneracja zapasów skrobi.

W roślinach typu C4 procesy karboksylacji fosfoenolopirogronianu do szczawiooctanu i dekarboksylacji jabłczanu zachodzą równocześnie, ale w różnych typach komórek, więc są one oddzielone przestrzennie. W roślinach CAM oba procesy przebiegają w tych samych komórkach, ale są rozdzielone w czasie, karboksylacja zachodzi w nocy, zaś dekarboksylacja za dnia.

Czynniki zewnętrzne i wewnętrzne wpływające na intensywność fotosyntezy

1. Światło. Rośliny fotosyntetyzują przy długości fali świetlnej w granicach 400-700 nm. Przy zbyt dużym natężeniu światła występuje efekt wysycenia i dalsze jego zwiększanie nie prowadzi do wzrostu intensywności fotosyntezy. Przy zbyt małym natężeniu światła może się zdarzyć, że wydzielanie CO₂ przez roślinę przewyższa jego wiązanie w procesie fotosyntezy. Przy naturalnym oświetleniu z reguły dominuje wiązanie CO₂ przez roślinę. Zarówno niedobór jak i nadmiar światła może być niekorzystny dla roślin.

2. Dwutlenek węgla. Na intensywność fotosyntezy w znacznym stopniu wpływa stężenie CO₂ w stromie chloroplastów, gdzie zachodzi proces karboksylacji katalizowany przez karboksylazę 1,5- bisfosforybulozy. CO₂ w drodze z powietrza do stromy napotyka na wiele barier. Jedna z nich związana jest z dyfuzją CO₂ do miękiszu liścia; jest to tzw. opór warstwy właściwej, czyli aparatu szparkowego. Przy nadmiernym nasłonecznieniu rośliny zamykają szparki, co z jednej strony zapobiega utracie wody, ale jednocześnie zmniejsza dopływ CO₂ i obniża intensywność fotosyntezy.

3. Temperatura. Jej wpływ na fotosyntezę ma charakter kompleksowy i zależy od gatunku rośliny. Zmiana temperatury powoduje zmianą powinowactwa karboksylazy 1,5-bisfosforybulozy do CO₂: wzrost temperatury przyspiesza reakcję karboksylacji, ale zmniejsza powinowactwo enzymu do CO₂ i tym samym intensywność fotosyntezy. U większości roślin powyżej 40°C uszkodzony zostaje aparat fotosyntetyczny i fotosynteza zanika.

4. Woda. W miarę postępującego deficytu wody intensywność fotosyntezy zmniejsza się, a następnie ulega zahamowaniu. Rośliny w klimacie wilgotnym i gorącym nie muszą zamykać szparek a transpiracja jest jednym z czynników obniżających temperaturę liścia. W klimacie suchym i gorącym szparki są prawie cały czas zamknięte, co utrudnia wnikanie CO₂ do liścia, przez co maleje intensywność fotosyntezy.

5. Inne. Dostęp tlenu (obniża intensywność fotosyntezy u roślin typu C3 i CAM), uwodnienie tkanki, układ chloroplastów (w słabym świetle w komórkach układają się płasko, natomiast przy silnym oświetleniu ich położenie jest profilowe), a także okres wegetacji i wiek liści.

5.6. Chemosynteza

Chemosynteza jest procesem podobnym do fotosyntezy, ale energia do jej przebiegu nie jest uzyskiwana z energii świetlnej, lecz z energii wiązań chemicznych, uzyskiwanej przy utlenianiu siarki, siarkowodoru, amoniaku, itp.

Chemosynteza zachodzi przy udziale bakterii chemosyntetyzujących, które dzielimy na:

2. azotowe (nitryfikacyjne):

- Nitrosomonas:

- Nitrobacter:

3. siarkowe:

- Beggiatoa:

- Thiotrix:

4. żelazowe:

5. wodorowe:

6. metanowe:

Dzięki ich istnieniu jest możliwy obieg pierwiastków w przyrodzie.

Chemosyntezę, podobnie jak fotosyntezę, dzielimy na dwa etapy.

1. W pierwszym dochodzi do utlenienia związku chemicznego:

2. W drugim etapie następuje asymilacja CO₂ :

Istnieje inny proces anaboliczny, który przeprowadzają głównie bakterie, a jest nim chemosynteza. Podobnie jak w przypadku fotosyntezy proces ten prowadzi do syntezy związków organicznych ze związków o prostszej budowie, przy czym energia pochodzi z utleniania związków nieorganicznych lub jednowęglowych związków organicznych. Produktami wyjściowymi dla chemosyntezy mogą być: amoniak, azotany (III), siarkowodór, siarka, tiosiarczany, sole żelaza (II), CO₂, metan i inne jednowęglowe związki organiczne. Chemosyntezę jak wspomniano przeprowadzają bakterie, których nazwy tworzymy od wyjściowego utlenianego związku. Wyróżniamy więc: bakterie nitryfikacyjne, wodorowe, siarkowe, żelazowe. Proces chemosyntezy podobnie jak fotosynteza przebiega w dwóch etapach. Podczas pierwszego z nich dochodzi do utlenienia danego związku oraz powstania wysokoenergetycznych związków ATP i NADPH+H⁺, które w fazie drugiej zużywane są do syntezy związków organicznych, gdzie również produktem ubocznym jest cząsteczka tlenu.

Chemosyntezą odgrywa ogromną rolę w krążeniu pierwiastków, w cyklach biogeochemicznych takich pierwiastków jak: węgiel, azot czy fosfor. Ponadto neutralizuje niektóre związki o charakterze toksycznym jak H₂S.

Chemosynteza- proces przekształcenia CO2 w związki organiczne, w którym wykorzystywana jest energia pochodząca z utleniania związków nieorganicznych lub prostych jednowęglowych związków organicznych, Występuje u chemoorganotrofów czerpią energię z utleniania prostych, jednowęglowych zw. org.: metan, metanol czy mrówczan z użyciem tlenu atmosferycznego jako akceptora elektronów są to tzw. metylotrofy, np. Mathylobacter , melanofory, np. Pseudomanas oxalaticus prowadzą reakcję ulatniania metanu do CO₂ poprzez kilka stadiów pośrednich:

CH₄ + ½ O_2CH3OHCHOH + 2H

CHOH + H₂OHCOOH + 2H

HCOOH CO₂ + 2H

Melanofory nie mogą asymilować CO₂, jako źródło węgla wykorzystują metanol czy aldehyd mrówkowy w których węgiel jest na niższym stopniu utlenienia niż w dwutlenku węgla. Składa się z 2 faz 1). Przekształcenie energii w wyniku utleniania określonych substratów zawartych w środowisku za pomocą tlenu atmosferycznego i użycia jej do wytworzenia siły redukcyjnej w postaci NADH i ATP; 2). Fazy wiązania i redukcji CO_2. Odgrywa ważną role w krążeniu pierwiastków w przyrodzie i przeksztalacaniu związków nieorganicznych w formy przyswajalne dla innych organizmów.

Chemiolitotrofy:

Nitrosomonas: NH₃ 2NH₃+3O₂→2NO₂^-+2H₂O

Nitrobacter: NO₂^- NO₂^-+1//2 O₂→NO₃^-

Bakterie siakrowe S₂O₃^2- S₂+1/2O₂+H₂O→SO₄^2-

H₂S H₂S+1/2O₂ →H₂O+S

S+H₂O+1 1/2O₂→2H⁺+SO₄^2-

Bakterie wodorowe H₂ H₂_1/2O₂→H₂O(hydrogenaza przenosi elekt z H₂ na NAD⁺)

Bakterie żelazowe Fe²⁺ 4FeCO₃+O₂+6H₂O→4Fe(OH)₃+4CO₂

Chemoorganotrofy:

Metanotrofy CH_{4_}+1/2O₂→CH₃OH→CHOH+2H

CHOH+H₂O→HCOOH+2H

HCOOH→CO₂+2H

CHEMOSYTNTEZA

Oprócz organizmów fotosyntetyzujących, do autotrofów zaliczane są prokarioty, nie mające wprawdzie barwników asymilacyjnych, ale wyposażone w enzymy, za pomocą których mogą uzyskiwać związki organiczne z nieorganicznych na drodze chemosyntezy.

Chemosynteza jest procesem polegającym na asymilacji CO2 i przetwarzaniu go na związki organiczne - cukry - przy wykorzystaniu energii chemicznej pochodzącej z utleniania ( najczęściej tlenem atmosferycznym) różnych związków mineralnych.

Energia wyzwalana podczas utleniania związków mineralnych zostaje wykorzystana do redukcji węgla w CO2.

Prawie wszystkie bakterie chemosyntetyzujące są bezwzględnymi tlenowcami. Są to przeważnie organizmy fizjologicznie bardzo wyspecjalizowane i często jako substrat utleniany mogą wyzyskać tylko jeden określony związek , np. bakterie:

• nitryfikacyjne utleniają amoniak i sole amonowe do azotynów ( bakterie Nitrosomonas)

2NH3 + 3O2 → 2HNO2 + 2H2O + energia

lub azotyny do azotanów ( bakterie Nitrobacter)

2HNO2 + O2 → 2HNO3 + energia

• siarkowe utleniają siarkowodór do wolnej siarki

2H2S + O2 → 2S + 2H2O + energia

lub siarkę do siarczanów

2S + O2 + 2H2O → 2H2SO4 + energia

Z bakterii siarkowych najdokładniej poznany został rodzaj Thiobacillus. Bezwzględnymi autotrofami są: Thiobacillus thiooxidans, T. thioparus, T.denitryficans, T. neapolitanus. Poza T. denitrificans wszystkie są bezwzględnymi tlenowcami. T. thiooxidans i T. ferrooxidans żyją w środowisku kwaśnym i są zdolne do rozwoju nawet przy pH 1,0. T.ferrooxidans utlenia również sole żelazawe. Do miksotrofów zaliczamy Thiobacillus novellus, T.intermedius, T.acidophilus, T.versutus, Sulfolobus.

• wodorowe utleniają wodór cząsteczkowy do wody

2H2 + O2 → 2H2O + energia

Bakterie wodorowe dawniej zaliczano do rodzaju Hydrogenomonas, opisanego po raz pierwszy przez polskiego badacza Niklewskiego. Zaliczamy tu Pseudomonas facilis, P. saccharophila, Alcaligenes eutrophus, Nocardia autotrophica. Są to organizmy bezwzględnie tlenowe, posiadające zdolność wykorzystywania nawet śladów tlenu w środowisku. Bakterie wodorowe są względnymi autotrofami, mogącymi odżywiać się auto- i heterotroficznie.

• żelazowe utleniają związki żelazawe do żelazowych

4FeCO3 + O2 + 6H2O → 4Fe(OH)3 + 4CO2 + energia

Wśród bakterii żelazowych bezwzględnym autotrofem jest Thiobacillus ferrooxidans, utleniający także siarkę. Inne bakterie żelazowe to: Galionella ferruginea, Sphaerotilus natans, S. discophorus, Leptothrix i Cladothrix.

Proces chemosyntezy przebiega w dwóch etapach, które ogólnie można zapisać następująco:

1. związek mineralny + O2 → związek mineralny + energia (zredukowany) ( utleniony) ( ATP + NADPH + H+)

2. CO2 + H2O + energia → związek organiczny + O2 ( ATP + NADPH + H+) ( cukier)

Pierwszy etap dotyczy sposobu dostarczenia energii, a drugi wykorzystania energii do asymilacji CO2 i przetworzenia go na cukier.

Udział chemosyntezy w produkcji biomasy jest tak minimalny, że z tego względu nie ma właściwie żadnego znaczenia, ale przynosi inne bardzo istotne korzyści. Dzięki utlenianiu związków mineralnych przechodzą one w postać łatwiej przyswajalną przez rośliny,co przyczynia się do lepszego ich wykorzystania i niezalegania w środowisku. Z tego względu chemosynteza wnosi ważny wkład do obiegu materii w przyrodzie. Utlenienie związków toksycznych, jak siarkowodór, siarka, powoduje dodatkowo oczyszczanie środowiska. W porównaniu z fotosyntezą, chemosyntezą jest procesem mało skomplikowanym, nie wymagającym energii świetlnej. Najprawdopodobniej ten rodzaj autotrofizmu ustąpił miejsca fotosyntezie ze względu na mniejszą wydajność i ograniczony dostęp do surowców energetycznych.

Chemolitotrofia to rodzaj metabolizmu charakterystyczny dla niektórych organizmów prokariotycznych; pozyskują one energię z utleniania związków nieorganicznych. Mogą one używać wodoru,^[40] zredukowanych związków siarki (jonów S^2-, siarkowodoru i tiosiarczanów S₂O₃^2-),^[41] jonów żelaza (II) Fe²⁺,^[42] lub amoniaku^[43] jako źródła potencjału redukcyjnego i czerpać energię z utleniania tych związków kosztem akceptorów takich jak tlen czy azotany (III).^[44] Te mikrobiologiczne procesy mają ogromne znaczenie w globalnych cyklach biogeochemicznych, takich jak acetogeneza, nitryfikacja i denitryfikacja; od ich przebiegu zależy także żyzność gleb.^[45][46]

Wiązanie

PODSUMOWANIE

Biochemia ma olbrzymie znaczenie praktyczne dla wielu dziedzin życia codziennego, w tym również w przemyśle spożywczym. Powstały nowe gałęzie przemysłu spożywczego oparte na osiągnięciach biochemii (m.in. biotechnologia). Wielka rola przypada biochemii w unowocześnianiu procesów technologicznych przemysłu spożywczego oraz w opracowaniu nowych metod przeróbki surowców (a zwłaszcza wykorzystania enzymów). Dzięki temu udaje się zredukować do minimum różnorodne straty zarówno ilościowe, jak i jakościowe, wynikające z procesów niepożądanych dla technologii.

PISMIENNICTWO

Stryer L.: Biochemia, PWN, W-wa 1986

Gacesa P., Hubble J.: Enzyme technology. Open University Press, 1987.

Chaplin M.F., Bucke C.: Enzyme technology. Cambridge University Press, 1990.

Chmiel A., Biotechnologia, PWN, W-wa 1991

Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.: Biochemia Harpera, Wyd. Lekarskie PZWL, W-wa 1994

Tramper J. W: Applied Biocatalysis. ed.by Cabral J.M.,Best D.,Boross L., and Tramper J., Harwood Ac. Publish., 1994, s.1-45

Galas E.: Wiadomości chemiczne (1984), 11, 11-30

Galas E., Trzmiel T.: Kosmos (1989), 38, 15-24

Dodatek

KOENZYMY

SŁOWNICZEK GENETYKI

Amplifikacja - zwielokrotnienie liczby kopii genu lub sekwencji DNA

Anonimowy segment DNA - segment DNA o nieznanej funkcj

Cistron (cystron) to najmniejsza jednostka ekspresji genetycznej. Jest jednostką genetyczną kodującą strukturę jednego łańcucha polipeptydowego, np. podjednostki cząsteczki białka kilkupolipeptydowego.

Gen indukowany to gen, którego ekspresja zwiększa się w wyniku reakcji na swoisty sygnał regulatorowy - induktor.

Ekspresja niektórych genów jest konstytutywna, co oznacza, że ekspresja ich utrzymuje się na stałym poziomie i nie podlega regulacji.

Biblioteka DNA - biblioteka zrekombinowanego DNA jest zbiorem identycznych cząsteczek wektora, z których każda zawiera inną wstawkę DNA - różne wstawki razem mogą reprezentować cały genom, na przykład ludzki (ludzka biblioteka genomowa); lub zbiór kopii mRNA izolowanego z komórek określonego typu przekształconych do postaci cDNA (biblioteka cDNA)

cDNA - nić DNA powstała przez skopiowanie nici RNA przez odwrotną transkryptazę; sekwencja cDNA jest komplementarna do RNA użytego jako matryca

Chromosom - silnie skręcona nić DNA wraz z dodatkowymi substancjami chemicznymi znajdująca się w jądrze komórkowym

Crossing-over - oddziaływania między dwoma chromosomami homologicznymi, prowadzące do wymiany fragmentów chromosomów (czyli dwuniciowego DNA)

DNA - kwas deoksyrybonukleinowy, substancja chemiczna będąca nośnikiem informacji genetycznej, występująca we wszystkich żywych organizmach. Łańcuch DNA występuje w postaci podwójnej, skręconej nici, tzw. podwójnej helisy

Gen - fragment DNA, w którym zakodowana jest informacja o produkcji białka

Genetyczny odcisk palca - wzór fragmentów DNA powstałych po strawieniu wybranego obszaru genomu odpowiednim enzymem restrykcyjnym i rozdzielonych w żelu elektroforetycznym; jeśli do badań wybierze się odpowiedni odcinek DNA, powstaje wzór charakterystyczny dla każdego osobnika danego gatunku

Genetyka molekularna - badanie struktury molekularnej czynników uczestniczących w procesach dziedziczenia i mechanizmów chemicznych tych zjawisk

Klon - zbiór organizmów, komórek, wirusów lub cząsteczek DNA powstałych w wyniku replikacji jednego genetycznego przodka

Klonowanie molekularne - klonowanie cząsteczek DNA

Kod genetyczny - wspólny dla wszystkich organizmów sposób zapisu informacji genetycznej za pomocą czterech "liter", cząsteczek-nukleotydów oznaczonych: A, T, C, G

Koniugacja - przeniesienie odcinka DNA z jednej komórki bakteryjnej do drugiej za pośrednictwem mostka białkowego

Konwersja genów - rodzaj rekombinacji między dwoma blisko leżącymi homologicznymi regionami DNA, podczas której jedna z sekwencji DNA jest zmieniana tak, by pasować do drugiej; proces ten, nazywany też korektą sekwencji, może zachodzić wewnątrz jednego chromosomu lub między dwoma chromosomami

Kwas nukleinowy - długa spolimeryzowana cząsteczka złożona z pojedynczych jednostek nukleotydowych związanych silnymi wiązaniami chemicznymi; łańcuchy DNA i RNA są kwasami nukleinowymi różniącymi się od siebie cukrowym składnikiem nukleotydów, jest nim odpowiednio deoksyryboza i ryboza

Linia zarodkowych komórek macierzystych - to zbiór hodowanych w laboratorium komórek, które wyizolowano z pojedynczego zarodka ludzkiego. Komórki zarodkowe mają zdolność do zmieniania się w dowolny inny rodzaj komórek organizmu (są totipotentne). To właśnie ta cecha sprawia, że naukowcy tak się nimi interesują. Chcą oni tak pokierować ich rozwojem, aby zmieniały się w pewne szczególne typy komórek - źle funkcjonujących u osób chorych na np. parkinsona, alzheimera czy cukrzycę. Komórki pochodzą zwykle z kilkudniowych embrionów ludzkich będących efektem „nadprodukcji” podczas procedury zapłodnienia in vitro.

Mapa genetyczna - przedstawienie liniowego ułożenia genów na chromosomie

Mapa molekularna - opis liniowego ułożenia odcinków DNA wzdłuż chromosomu

Mejoza - proces rozdziału chromosomów towarzyszący podziałowi komórkowemu, prowadzącemu do powstania komórek rozrodczych; po podziale mejotycznym każda z komórek potomnych zawiera tylko jeden chromosom z homologicznej pary chromosomów, jest więc haplontem

Mitochondria - "centra energetyczne" znajdujące się w każdej komórce i  dzielące się niezależnie od niej. Materiał genetyczny zawarty w  mitochondriach dziedziczy się inaczej niż ten znajdujący się w  jądrach komórkowych. Geny jądrowe otrzymujemy po obojgu rodzicach, podczas gdy DNA mitochondrialny - tylko po matce

"Mitochondrialna Ewa" - według teorii współczesnej genetyki, kobieta od której pochodzą wszyscy współcześni ludzie. Prawdopodobnie żyła ok. 140-200 tys. lat temu. Nazwa "mitochondrialna Ewa" pochodzi od sposobu określenia jej wieku w badaniach naukowych, do których wykorzystano geny zawarte w  ludzkich mitochondriach - "centrach energetycznych" każdej naszej komórki. Teoria dziedziczenia mitochondrialnego DNA po istniejącej kiedyś jednej kobiecie znana jest również pod nazwami: "pożegnanie z Afryką" (od miejsca pochodzenia), "rajskiego ogrodu" i  "arki Noego".

Mutacja - zmiana w sekwencji DNA; mutacja może spowodować zmianę produktu genu lub inną regulację ekspresji genu, co w efekcie może prowadzić do zmiany cechy

Mutant - gen, w którym nastąpiła mutacja, lub organizm zawierający taki gen

Operon, zbiór wspólnie transkrybowanych i regulowanych genów.

Pozytywna regulacja występuje wtedy, gdy cząsteczka represora musi przyłączyć się do locum operatora, aby mogła zajść transkrypcja.

Rekombinacja - naturalny proces powstawania nowych zestawień odcinków chromosomów (a więc i odcinków DNA)

Replikacja - proces powielania DNA lub RNA

Replikacja DNA - synteza dwóch nowych podwójnych helis DNA na podstawie jednej podwójnej helisy; każdy łańcuch w pierwszej podwójnej helisie służy jako matryca do syntezy łańcucha komplementarnego

RNA (kwas rybonukleinowy) - spolimeryzowana cząsteczka zbudowana z czterech różnych jednostek zwanych rybonukleotydami (A, U, G, i C) zawierających cukier rybozę

Sonda - odcinek DNA lub RNA wyznakowany radioaktywnym izotopem (lub łatwo wykrywalną grupą chemiczną) używany do wykrywania komplementarnych odcinków kwasów nukleinowych metodą hybrydyzacji
telomer - zakończenie chromosomu (a więc i podwójnej helisy chromosomowego DNA)

Transformacja - stała, dziedzicząca się zmiana właściwości komórki spowodowana przez wprowadzenie nowej sekwencji DNA pozyskanej z otoczenia komórki lub przez mutację (na przykład transformacja nowotworowa zmieniająca zdrową komórkę w nowotworową)

Transgen - gen, który został eksperymentalnie wprowadzony do genomu organizmu i jest przekazywany jego potomstwu (organizmom transgenicznym)

Wektor - cząsteczka DNA, z którą można połączyć odcinek obcego DNA - tak zrekombinowany DNA można wprowadzić do komórki, w której będzie replikowany

Represja kataboliczna powstaje za pośrednictwem białka CAP (catabolite gene activator protein) w połączeniu z cAMP.

Skoordynowana ekspresja - genetyczne uszeregowanie kilku genów strukturalnych i ich genów regulatorów.

Wstawka - odcinek DNA połączony z cząsteczką wektora w celu klonowania; razem z wektorem tworzy zrekombinowany DNA

Zrekombinowany DNA - cząsteczka DNA zawierająca odcinki DNA pochodzące z różnych źródeł - syntetyzowane metodami biologicznymi lub chemicznymi - i połączone in vitro z innymi odcinkami DNA

Monokarboksylowe nasycone kwasy alifatyczne

Ilość atomów węgla	Nazwa kwasu	Wzór	Nazwa reszty kwasowej (acylu)
1	mrówkowy	H COOH	formylo
2	octowy	CH3 COOH	acetylo
3	propionowy	CH3 CH2 COOH	propionylo
4	masłowy	CH3 CH2 CH2 COOH	butyrylo
5	walerianowy	CH3 CH2 CH2 CH2 COOH	pentynylo
6	kapronowy	CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH	heksynylo
7	enantowy (heptanowy)	CH3 (CH2)5 COOH	heptynylo
8	kaprylowy (oktanowy)	CH3 (CH2)6 COOH	oktylo

Dikarboksylowe nasycone kwasy alifatyczne

Ilość atomów węgla	Nazwa kwasu	Wzór	Nazwa reszty kwasowej
2	szczawiowy	HOOC-COOH	oksalilo
3	malonowy	HOOC CH2 COOH	malonylo
4	bursztynowy	HOOC CH2 CH2 COOH	bursztynylo (sukcynylo)
5	glutarowy	HOOC CH2 CH2 CH2 COOH
6	adypinowy	HOOC CH2 CH2 CH2 CH2 COOH
7	pimelinowy	HOOC CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH

Monokarboksylowe nienasycone kwasy alifatyczne

W skład monokarboksylowych nienasyconych kwasów alifatycznych wchodzą liczne wyższe nienasycone kwasy tłuszczowe (m.in. olejowy ,linolowy, linolenowy, elaidynowy, undecylenowy, rycynolowy, ω3-kwasy nienasycone, itp.).

Dikarboksylowe nienasycone kwasy alifatyczne

Hydroksykwasy alifatyczne

Ketokwasy i semialdehydy alifatyczne

Inne kwasy alifatyczne

¹ Przykład kwasów uronowych.

Kwasy aromatyczne

Związki heterocykliczne pięcioczłonowe - C⁵

Związki heterocykliczne sześcioczłonowe - C⁶

Układy skondensowane

Układy 6-5 Układy 6-6

Układy 6-5-6 Układy 6-6-6

^* Konsekwentnie, grupa karboksylowa na rysunkach przedstawiana jest w formie niezdysocjowanej.

Umownie używane w podręczniku skrócone zapisy NAD i NADH odpowiadają zapisom NAD i NADH + H⁺ stosowanym dotychczas w biochemii.

173

2

1

5'

5

4

3

2'

2

1

Zn²⁺

Zn²⁺

START

5

12

3

3

2

ATP

ADP + P_i

2

2

2

6

2

2

6

10

5

8

11

7

6

9

8

5

4

12

2

3

12

12

1

3

2

1

Cyt b_L

Fe₂S₂

Cyt f

PQ_Z

PQ_C

Cyt b_H

2PQH₂

2PQ

2hν

2hν

FAD

2e

NADPH

+ H⁺

EC 1.18.1.2

NADP

2e

Fd_ox

Fd_red

PCY_red

PCY_ox

PS I

PQ_B

2H⁺

PQ

ATP

ADP+P_i

3H⁺

3H⁺

Stroma

Kompleks V

2H⁺

PQH₂

2e

4H⁺

½O₂+2H⁺

2H⁺

Cyt. b₆f

PS II

Lumen

H₂O

A₀

A₁ ● Fl

Błona

tylako-

idów

2e

2e

b 550

EC 1.18.1.2

Fd

Fe₄S₄

Fe₄S₄

2e

2e

PCY

P 700

Fotosystem I

PQH₂

PQ

2e

2e

2e

PQ_B

Fotosystem II

Fp

2e

Z (tyrozyna)

½O₂ +2H⁺

4Mn

P 680

+

Chlorofil a

Chlorofile

(Barwniki

organiczne)

Mg

Mg

Mg

2hη

Centrum PS II

Antena

PS II

PQ_A

Mg

Chlorofil a

Chlorofile

Mg

Mg

Mg

2hη

Centrum PS I

Antena

PS I

Fe₄S₄

2H⁺

FeS

H₂O

Cytochrom b₆f

Lumen

Stroma

Core

LHC

LHC

LHC

LHC

LHC

LHC

RC

Lumen -

wnętrze tylakoidy

Lamella

Granum -

stos tylakoid

Tylakoida

Błona

wewnętrzna

H₂O

1/2O₂

3H⁺

3H⁺

Cytoplazma

Kompleks V

Przestrzeń

periplazmatyczna

2H⁺

Cyt c

2H⁺

Kompleks IV

QH₂

Q

2H⁺

4H⁺

bursztynian

fumaran

FAD

Kompleks II

Cyt c₁

Cyt b

2H⁺

Fe₂S₂

QH₂

2H⁺

NAD

NADH

Fe₄S₄

FAD

Kompleks III

Kompleks I

Potencjał redox E₀ [mV]

-700

-1200

+1000

-500

+800

2H⁺

P_i

NADH

H⁺

P_i

H⁺

NADP

NAD

H⁺

lub

H⁺

transhydrogenaza

NADPH

NADH

jabłczan-

asparaginian

NADH

NAD

glicerol-3-P

matrix

przestrzeń

międzybłonowa

mitochondrialna

NAD

Przestrzeń

międzybłonowa

Stroma

Błona

zewnętrzna

β-dekstryna graniczna

b)

a)

b)

START

7

6

5

4

3

2

1

8

6

10

9

8

7

6

5'

START

5

4

3

2

11

1

3

α-dekstryny graniczne

a)

---