dr hab. inż. Tadeusz Przemysław Trzmiel

profesor nadzw. PŁ

Instytut Biochemii Technicznej

Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności

POLITECHNIKA ŁÓDZKA

KOMPENDIUM BIOCHEMII

BIOCHEMIA KOMÓRKI

ŁÓDŹ 2009

Wstęp

Biochemia jest nauką zajmującą się poznaniem budowy chemicznej składników organizmów żywych oraz przemian, jakie w nich zachodzą. Tradycyjnie biochemię dzieli się na dwa działy, a mianowicie:

1. biochemię statyczną

2. biochemię dynamiczną.

Pierwszy z tych działów skupia uwagę na strukturze i właściwościach związków chemicznych znajdowanych w przyrodzie ożywionej i stąd coraz częściej nazywany bywa chemią bioorganiczną.

Z kolei biochemia dynamiczna za pomocą metod chemicznych wyjaśnia istotę procesów przemiany materii i stąd identyfikuje się ją z metabolizmem komórkowym.

Ponieważ każdy organizm ma pewne odrębne właściwości, biochemię w zależności od badanego obiektu dzieli się na:

1. biochemię drobnoustrojów,

2. biochemię roślin

3. biochemię zwierząt.

Z tych trzech podstawowych działów wyodrębnia się dalsze bardziej wąskie specjalistyczne kierunki (np. biochemia człowieka, biochemia bakterii itd.).

W podręczniku tym, w formie zwięzłego kompendium, omówiono jedynie wybrane zagadnienia biochemii związane bezpośrednio z problematyką poruszaną w ramach wykładów na kierunku Ochrona Środowiska (czyli biochemię komórki drobnoustrojowej - Procaryota). Przede wszystkim, ma on ułatwić studiowanie na tym kierunku, a nie zastąpić podręczników niezbędnych do dokładnego i systematycznego przyswajania ogólnej wiedzy biochemicznej.

ROZDZIAŁ 1. ELEMENTY CHEMII BIONIEORGANICZNEJ

Równie dobrze rozdział ten można by nazwać biochemią nieorganiczną. Jego celem jest omówienie roli, jaką pierwiastki biogenne zwane też biofilnymi pełnią - w szeroko rozumianej - biochemii organizmów żywych. Większość zagadnień poruszanych w tym rozdziale, to rozszerzenie wykładu „Chemia Ogólna i Nieorganiczna”. Dodatkowo, w podrozdziale 1.3. omówione zostaną niektóre kompleksy organiczne metali, o których jest mowa w tekście podręcznika.

Należy wyraźnie rozróżnić znaczenie semantyczne terminów „pierwiastki biogenne a biofilne”. Przyrostek -genny, wskazuje na "pochodzenie, przyczynę, rodowód”, czyli w biochemii mówimy o pierwiastkach sprzyjających powstaniu życia, niezbędnych dla żywych organizmów, natomiast przyrostek -filne (gr. phileín = lubić), czyli lubiące dane środowisko, znajdowane w danym środowisku, np. w organizmach żywych. Tak więc, pod względem znaczenia, pojęcia „pierwiastki biogenne” i „pierwiastki biofilne” nieco się różnią, choć bardzo często opisują podobne zjawisko.

Pierwiastki biogenne są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania organizmów żywych. Należą do nich C, N, O, H, Na, K, Ca Mg, Cu, Zn, Fe, Co, Ni, F, I, Se, itp. Pierwiastki te stanowią materiał budulcowy organizmów żywych, wchodzą w skład enzymów i ich koenzymów lub grup prostetycznych, sterują lub kontrolują procesy metaboliczne, regulują ponadto równowagę jonową i ciśnienie osmotyczne organizmów a nadto, u zwierząt utrzymują pobudliwość nerwowo-mięśniową.

Pierwiastki biofilne to takie, które znajdowane są w organizmach żywych. Okazuje się, że część z nich, po usunięciu ze zbioru pierwiastków biogennych, nie wykazuje istotnego wpływu na funkcjonowanie organizmów, jednak kilka z nich to pierwiastki toksyczne dla żywych organizmów (m.in.. Pb, Hg, Al, Cd, itp.); zliczane są one do biocydów.

Pierwiastki biogenne (inaczej biogeny) dzieli się na makroelementy i mikroelementy. Dla niektórych organizmów wyróżnia się również ultraelementy.

Niestety, definicje tych pojęć nie są jednoznaczne i w dużej mierze zależą od dziedziny wiedzy, w której są stosowane.

I tak biolodzy, za podstawę tego podziału przyjmują ilościową zawartość pierwiastków biogennych w organizmie. Makroelementy, to pierwiastki występujące w organizmie w dużych ilościach (powyżej 1% suchej masy organizmu) a mikroelementy występują w organizmach roślinnych i zwierzęcych rzadziej i w mniejszych ilościach. I zgodnie z tą definicją, dla człowieka do makroelementów zalicza się: C, O, H, N, P, S, K, Mg i Ca, Na i Cl a do mikroelementów Fe, Zn, Mn, Cu, B, Cr, F, I, Co, Si, Mo, Ni, Se i V.

Ale dla hydrofitów, które są uzależnione od otaczającego je wodnego środowiska, biolodzy do makroelementów zaliczają: C, O, H, N, K, P, Ca, Mg, S, Na, Cl ale także Fe, Si, Al, a do mikroelementów B, Cu, Zn, Mo, Co.

Biochemicy do makroelementów zaliczają pierwiastki budulcowe organizmów, a więc wchodzące w skład białek, enzymów, kwasów nukleinowych, składników ściany komórkowej, i tym podobnych związków organicznych znajdowanych w komórce. Najważniejsze makroelementy to CHOPKiNS.

Lekarze, dietetycy i hodowcy zwierząt mianem makroelementów określają pierwiastki, których dobowe zapotrzebowanie w diecie człowieka i zwierząt hodowlanych przekracza 100 mg.

W ujęciu agrocenozy (biocenozy uprawnej) makroelementy to pierwiastki niezbędne dla życia roślin, dostępne w glebie (decydujące o jej żyzności). Do nich należą: N, P, K, Ca, Mg i S. Mikroelementy to pierwiastki pobierane przez rośliny w bardzo niewielkich ilościach - od kilku do kilkunastu gramów z powierzchni 1 ha, jednak w intensywnej produkcji często będące czynnikiem ograniczającym plonowanie wielu upraw.

Już z tego prostego zastawienia jasno wynika, że podział na makroelementy i mikroelementy jest w znacznej mierze uzależniony od dyscypliny naukowej, która zajmuje się tymi problemami, od organizmu, którego dotyczy, miejsca jego występowania, a także upodobań autora, itp.

W tabeli 1 pokazano przykładowo zawartość najważniejszych pierwiastków biogennych w przeciętnym organizmie ludzkim (70 kg wagi). Te 18 pierwiastków dostarcza około 99,98 % wszystkich atomów składających się na ciało statystycznego człowieka.

Tab. 1.1. Zawartość pierwiastków biogennych w [g] w organizmie ludzkim (70 kg wagi)

Tlen	45500	Magnez	35
Węgiel	12600	Żelazo	4
Wodór	7000	Cynk	1,9
Azot	2100	Miedź	0,2
Wapń	1050	Mangan	0,02
Fosfor	700	Jod	0,03
Potas	245	Molibden	0,015
Siarka	175	Kobalt	0,003
Sód	105
Chlor	105

Dla biotechnologa dane te nie przedstawiają jednak większej wartości, a wręcz mogą być nieco mylące. W organizmie ludzkim ilościowo pierwsze miejsce zajmuje woda (od 42% nawet do 66% ciężaru ciała). Jej ilość zmienia się w zależności od płci, wieku i różnic osobniczych. Tak więc, także procentowa zawartość tlenu i wodoru będzie ulegała znacznym wahaniom. Również kilka innych pierwiastków może w naszym organizmie wykazywać dość duże ilościowe zróżnicowanie (m.in. NaCl - głównie składnik płynów ustrojowych, Ca i P - składniki szkieletu, itp.).

Dla biotechnologa (a zwłaszcza biotechnologa środowiska) dużo istotniejszy jest podział pierwiastków biofilnych pokazany schematycznie na rysunku 1.1. Według tego schematu, pierwiastki biofilne, czyli znajdowane w organizmach żywych, bądź w ich pokarmie (w tym także w podłożach stosowanych do hodowli roślin czy drobnoustrojów) dzieli się na biogenne i inne. Wśród tych drugich, spora część bez większego znaczenia dla organizmu, lecz kilka toksycznych. W podręczniku przyjęto, że wśród pierwiastków biofilnych, po usunięciu ze zbioru pierwiastków biogennych, zainteresowanie biotechnologa środowiska powinny budzić głównie pierwiastki toksyczne dla funkcjonowania żywych organizmów (czyli, biocydy), to jest Pb, Hg, As, Cd, itp. - zostaną one omówione w rozdziale 1.2.

Biotechnolodzy środowiska pierwiastki biogenne też dzielą na makroelementy i mikroelementy. Ale punktem wyjściowym tego podziału jest podejście troficzne, wskazujące na związek przyczynowy z pokarmem i odżywianiem mikroorganizmów i roślin. Makroelementy to pierwiastki budulcowe żywych organizmów: CHOPKiNS.

Rys. 1.1. Schemat podziału pierwiastków biofilnych stosowany w biotechnologii środowiska

Biotechnologia ogólna i środowiska mikroelementy rozpatruje w trzech kategoriach:

1. Pierwiastki dodawane pod kontrolą do podłoży hodowlanych roślin i drobnoustrojów, gdyż ich ilość naturalnie występująca jest zbyt mała. Dla drobnoustrojów do nich należą: Ca, Mg, Fe, Zn i Mn (dla niektórych również NaCl). Dla roślin uprawnych aktualnie (Polska, 2007) do mikroelementów o znaczeniu nawozowym zalicza się B, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn (dla niektórych roślin również Co). Dla roślin wodnych do nich należą: Ca, Mg, Fe, Cu, B i Mn (dla roślin halofilnych również NaCl). Należy pamiętać, że do podłoży tych bezwzględnie dodawane są sole potasu, który zaliczony został już do makroelementów.

2. Pierwiastki śladowe, to takie, których obecność w podłożach hodowlanych roślin i drobnoustrojów jest nieodzowna, lecz naturalnie już tam występują lub dodawane są z innymi składnikami, w których z reguły też naturalnie występują (głównie w wodzie!). Ogólnie do nich zalicza się: Cu, Co, Mo, B, I, Se, Si, Ni, Cr, F, a także niekiedy Ti, W i V choć te trzy ostatnie bywają też zaliczane do ultraelementów. Pierwiastki te wchodzą w skład białek, enzymów, koenzymów lub grup prostetycznych i hormonów. Zarówno niedobór, jak i nadmiar pierwiastków śladowych jest niekorzystny dla ustroju, dlatego ich poziom musi być kontrolowany.

3. Pierwiastki ultraśladowe, są to pierwiastki znajdowane w ilościach kilku μg na gram masy organizmu. Na przykład u zwierząt 1÷5 μg na gram masy ciała m.in. Sn, Ra, Ag, Au, Pt. Dla roślin i drobnoustrojów zaliczamy do nich: W, V Li, F, As, Sn i Al (choć ten ostatni znajdowany jest u niektórych hydrofitów nawet w ilościach sięgających 10 mg/g masy rośliny). Niektóre z nich są aktywatorami enzymów specyficznych szlaków metabolicznych.

1.1. Pierwiastki biogenne

Makroelementy

W biotechnologii oznaczane są łatwym do zapamiętania skrótem CHOPKiNS (węgiel, wodór, tlen, fosfor, potas i azot z siarką). Są one niezbędne do prawidłowego funkcjonowania wszystkich żywych organizmów.

Obecność wśród tych pierwiastków C,H,O,P N i S nie budzi żadnych wątpliwości. Są one składnikami aminokwasów, nukleotydów, koenzymów, itp.

Węgiel. Podstawowy składnik związków organicznych. Związki te mogą występować w postaci łańcuchów (prostych lub rozgałęzionych), pierścieni lub tworzyć różne kombinacje łańcuchów i pierścieni - szkieletu cząsteczek związków organicznych.

Wodór i tlen. Są to podstawowe składniki związków organicznych występujących w komórce. Wchodzą w skład wielu grup funkcyjnych przyłączonych do atomów węgla. Biorą ponadto udział w wielu ważnych procesach oksydoredukcyjnych.

Azot - składnik wszystkich aminokwasów (a zatem i białek), wszystkich kwasów nukleinowych, wielu barwników, lipidów złożonych budujących błony komórkowe, chityny oraz związków o budowie pierścieniowej - odgrywających podstawową role w metabolizmie komórkowym. Wchodzi również w skład alkaloidów: kofeiny, teiny, morfiny i wieli innych związków biologicznie czynnych.

Siarka. Wchodzi w skład dwóch aminokwasów - cystyny i metioniny. Odgrywa ważną rolę w stabilizacji struktury przestrzennej białek (mostki disiarczkowe). Występuje w pierścieniu tiazolowym tiaminy, a także w koenzymach: lipoamidzie, biotynie i w koenzymie A. Można ją znaleźć wbudowaną w pierścienie heterocykliczne bacytracyny i penicyliny. Jest składnikiem budulcowym białek żelazowo-siarkowych (patrz: str.12).

Fosfor. Jest składnikiem kości i zębów (w naszym organizmie aż 80% całej puli tego pierwiastka), występuje również w mięśniach, w mózgu oraz w błonach komórkowych i we krwi. W postaci fosforanów jest składnikiem związków wysokoenergetycznych (m.in. ATP), kwasów nukleinowych, całej grupy koenzymów, fosfolipidów, itp.

Potas. Zdziwienie może budzić obecność wśród makroelementów potasu (przez wiele autorytetów zaliczanego do mikroelementów), jednakże jego dodatek w istotnych ilościach do podłoży hodowlanych roślin i drobnoustrojów jest nieodzowny, gdyż z reguły występuje jego niedobór (patrz tabela 1.2.).

Tabela 1.2. Zalecane stężenia mikroelementów w podłożach hodowlanych drobnoustrojów i hydrofitów oraz ich ilość w wodzie wodociągowej

Pierwiastek		Ilość pierwiastka [mg/dm^3]
				Zalecana w podłożach hodowlanych dla drobnoustrojów i hydrofitów		W łódzkiej wodzie wodociągowej (dane z 2004 roku)
Potas		100 -700		1,7
Wapń		6 - 200		71
Magnez		3 - 200		28
Żelazo		0,05 - 40		0,08
Cynk		0,05 - 7		Poniżej 0,1
Mangan		0,04 - 15		Poniżej 0,1

Potas to główny składnik płynu wewnątrzkomórkowego, aż 75% jego ustrojowej zawartości zlokalizowane jest w tkance mięśniowej. Potas zapewnia organizmom zwierząt prawidłową gospodarkę wodną, m.in. reguluje objętość komórek i ciśnienie wewnątrzkomórkowe. W komórkach potas reguluje także równowagę kwasowo-zasadową. Jest antagonistą sodu, który zatrzymuje wodę, zaś potas zwiększa jej wydalanie. Potas przyczynia się także do prawidłowego funkcjonowania nerwów i mięśni oraz zwiększa aktywność gruczołów wydzielniczych i przepuszczalność błon komórkowych. Bierze udział w obniżaniu ciśnienia krwi, przez co zmniejsza ryzyko wystąpienia zawału i chorób serca. U zwierząt można go także znaleźć w sokach trawiennych. Pomaga w oczyszczaniu organizmu z niepotrzebnych produktów przemiany materii.

U roślin, reguluje stopień otwarcia aparatów szparkowych u form emersyjnych (nadwodnych elementów roślin bagiennych). Jego dodatek dla hydrofitów powinien wynosić 2-3 g na 100 dm³ wody.

Bierze udział jako kofaktor w wielu reakcjach enzymatycznych; głównie jest aktywatorem enzymów, m.in. tryptofanazy (EC 4.1.99.1) Uczestniczy też w syntezie białek i metabolizmie węglowodanów (niezwykle istotny w syntezie glikogenu) oraz przemianach energetycznych komórki.

Mikroelementy

Jak już wspomniano, mikroelementy to pierwiastki chemiczne występujące w organizmach w bardzo małych ilościach, lecz niezbędne do normalnego ich funkcjonowania. W podręczniku zostaną omówione w kolejności ich biochemicznego znaczenia (według uznania autora podręcznika). Należy zawsze pamiętać, że zarówno ich nadmiar, jak i niedobór wpływa ujemnie na organizm.

Sód i omówiony wcześniej potas (u ssaków zaliczane do makroelementów) są niezbędne w funkcjonowaniu pompy jonowej sodowo-potasowej regulowanej przez enzym ATPazę wymieniającą sód na potas - EC 3.6.3.9. Enzym ten utrzymuje właściwy gradient stężeń sodu i potasu w płynach wewnątrz- i poza komórkowych. Działanie enzymu aktywowane jest przez jony Mg²⁺.

Chlor. Utrzymuje równowagę jonową ustroju. U ssaków wchodzi w skład soku żołądkowego, a przenikając przez błony erytrocytów ułatwia uwalnianie z nich dwutlenku węgla, który jest usuwany z organizmu. Jest aktywatorem α-amylazy ślinowej.

Rola u roślin jest słabo poznana. Wiadomo, że rośliny go łatwo pobierają i że prawdopodobnie jest on niezbędny w procesie fotosyntezy.

Wapń. Stanowi 2% masy ciała dorosłego człowieka, z czego 99% tej ilości zawarte jest w kościach i szkliwie zębów. Bierze udział w przewodzeniu impulsów nerwowych, mechanizmie skurczu mięśni, przepuszczalności błon komórkowych, w regulacji procesu krzepnięcia krwi i rytmu serca oraz wpływa na kontrolę ciśnienia tętniczego.

Jest kofaktorem w wielu reakcjach enzymatycznych:

1. jest czynnikiem strukturotwórczym niektórych białek enzymatycznych: m.in. 4 jony Ca²⁺ utrzymują strukturę IV-rzędową bacillolizyn (EC 3.4.24.28 - metaloendopeptydaz wytwarzanych przez bakterie z rodzaju Bacillus).

2. jest aktywatorem niektórych enzymów, np. kinazy fosforylazowej (EC 2.7.11.19).

Jest ponadto stabilizatorem aktywności wielu enzymów; m.in. subtilizyny (EC 3.4.21.62 - endopeptydazy serynowej z Bacillus subtilis), czy też termolizyny (EC 3.4.24.27 - metaloendopeptydazy z Bacillus thermoproteolyticus). Termolizyna działa skutecznie w obecności jonów Ca²⁺ nawet w temperaturze 80°C, bez ich udziału termostabilność obniża się do około 40°C.

Odmiany polimorficzne węglanu i fosforanu wapnia stanowią minerały szkieletowe, czyli mineralne części organizmów żywych takich jak szkielet, zęby, kości, muszle, kolce, itp. Np. sferulity głowonoga Nautilus pompilius zbudowane są z argonitu (układu rombowego węglanu wapnia), a z kolei cierń jeżowca morskiego Paracentrotus lividus zbudowany jest z kalcytu (układu trygonalnego węglanu wapnia). Amorficzny pirofosforan wapnia często pełni rolę "schowka" dla metali toksycznych.

Nadmiar wapnia hamuje wchłaniania żelaza i cynku.

Magnez. Jest antagonistą wapnia. W ciele dorosłego człowieka jest go około 25 gramów; wchodzi w skład kości, zębów i mięśni. Zwiększa lepkość cytoplazmy, zmniejsza przepuszczalność błon.

Jon Mg²⁺ jest składnikiem chlorofilu, a więc i Systemów Fotosyntetycznych PS I i PS II.

Mg²⁺ kompleksuje ATP (porównaj: str.99). Stąd jest kofaktorem reakcji enzymatycznych, w których ATP jest kosubstratem (jest aktywatorem enzymów katalizujących te reakcje), m.in. kinaz, pirofosfokinaz, systemów fotosyntetyzujących, ATP-az transportujących (np. potas-transportująca ATP-aza - EC 3.6.3.12), itp.

Bierze udział w przemianie węglowodanów i tłuszczów oraz syntezie białek komórkowych (zapewnia odpowiednią strukturę rybosomów). Wpływa na przemiany wapnia, fosforu, potasu i witaminy C.

Jego niedobór może powodować zaburzenia rytmu serca, migreny, zwiększa u kobiet dolegliwości związane z napięciem przedmiesiączkowym. Nadmiar magnezu natomiast wywołuje biegunkę.

Żelazo. W komórkach żywych organizmów występuje w 3 formach: „wolnych” jonów Fe²⁺ lub Fe³⁺, w kompleksach organicznych (np. hemie, heminie, w białkach żelazowo-siarkowych, itp.) oraz w kryształach minerałów (np. magnetyt).

Jony Fe²⁺ w połączeniu z protoporfiryną IX tworzą hem, czerwony barwnik krwi (patrz: str.78).

Jony Fe³⁺ w połączeniu z protoporfiryną IX dają heminę (patrz: str.78). Hemina jest grupą prostetyczną cytochromów i wielu enzymów katalizujących utlenianie (m.in. peroksydaz).

Hem i hemina uczestniczą jako kofaktory w wielu reakcjach enzymatycznych, obok reakcji z udziałem wspomnianych już peroksydaz, uczestniczą w reakcjach reduktaz: azotanowej, azotynowej i siarczynowej (odpowiednio: EC 1.7.1.1÷3, EC 1.7.2.2 i EC 1.8.1.2).

Hemina jest składnikiem białek hemo-tiolowych (patrz str.13). Ugrupowanie hemo-tiolowe, jako grupa prostetyczna, występuje w centrum aktywnym cytochromu P-450. Białka zawierające ugrupowanie hemo-tiolowe są kofaktorem w wielu reakcjach enzymatycznych, przede wszystkim wielu monooksygenaz z pod-podklasy EC 1.14.13.

Jony żelaza biorą udział jako kofaktor w ponad 100 reakcjach enzymatycznych:

1. Jony Fe²⁺ są aktywatorem kilku enzymów, w tym dioksygenaz z pod-podklasy EC 1.14.11. (z α-ketoglutaranem, jako dodatkowym donorem wodoru), np. 3-hydroksylazy prolinowej (EC 1.14.11.28),

2. Jony Fe³⁺ są aktywatorem ponad 100 enzymów, w tym dioksygenaz z pod-podklasy EC 1.13.11.

Jony żelaza są składnikiem białek żelazowo-siarkowych (patrz: str. 12). Białka te są kofaktorem w ponad stu reakcjach enzymatycznych, są składnikiem budulcowym wielu bardzo ważnych enzymów i kompleksów enzymatycznych, m.in. nitrogenaz (EC 1.18.6.1), dehydrogenazy mrówczanowej (cytochrom) - EC 1.2.2.1, Kompleksów I, II i III składających się na łańcuch oddechowy chemoorganotrofów (patrz str.115) oraz fotosystemu PS I (patrz str. ??).

Jony żelaza są składnikiem budulcowym ferredoksyny (patrz: str.12) i rubredoksyny (patrz: str.13). Ferredoksyna jest elementem składowym łańcucha transportującego elektrony w procesie fosforylacji fotosyntetycznej.

Pojedyncze kryształy magnetytu (minerału z gromady tlenków, zaliczanego do grupy spineli żelazowych) są używane przez wiele bakterii, alg i zwierząt do orientacji względem pola magnetycznego Ziemi.

Pierwiastek ten bierze udział w syntezie DNA, niezbędny jest do prawidłowej budowy skóry, włosów, paznokci, do prawidłowego funkcjonowania układu odpornościowego.

Skutki niedoboru to anemia.

Cynk. Odpowiada za prawidłowe działania systemu immunologicznego. Bierze udział w syntezie materiału genetycznego (DNA i RNA), białek, insuliny i nasienia. Bierze udział w metabolizmie węglowodanów, tłuszczy, i alkoholu. Potrzebny w procesie odczuwania smaku i zapachu, ma wpływ na wygląd włosów i paznokci. Przyspiesza gojenie się ran.

Jon Zn²⁺ bierze udział jako kofaktor w ponad 100 reakcjach enzymatycznych:

1. jest grupą prostetyczną wielu metaloenzymów, m.in. metaloendopeptydaz bakteryjnych czy dehydratazy węglanowa (EC 4.2.1.1 - dawniej: anhydraza węglanowa).

2. jest czynnikiem strukturotwórczym niektórych białek enzymatycznych: m.in. centrum aktywnego dehydrogenazy alkoholowej (EC 1.1.1.1), która jest dimerem wiążącym 2 jony cynku.

3. jest aktywatorem ponad 80 enzymów, m.in. reduktazy NADPH:chinon (EC1.6.5.5), czy fosfolipazy C (EC 3.1.4.3).

Zn²⁺ jest czynnikiem strukturotwórczym „palców cynkowych”, czyli domen białek wiążących DNA (odpowiedzialnych za regulację transkrypcji - tzw. czynników transkrypcji). Struktura palca cynkowego składa się z motywu α-zakręt-β. Konstrukcja ta jest stabilizowana przez oddziaływania hydrofobowe i tetraedrycznie ułożone wiązania koordynacyjne jonu cynku z dwoma cysteinami i dwoma histydynami tej domeny.

Niedobór powoduje zaburzenia smaku i węchu.

Mangan. U zwierząt jest elementem struktury kości i skóry. Odgrywa pewną, choć niewielką rolę w działaniu enzymów metabolizujących glukozę i kwasy tłuszczowe. Wpływa korzystnie na prawidłowe działanie ośrodkowego układu nerwowego.

Jest kofaktorem w około 150 reakcjach enzymów z wszystkich 6 klas. Wchodzi w skład kilku enzymów, inne zaś uaktywnia. Na wyróżnienie zasługuje jego rola, jako aktywatora katalazy (EC 1.11.1.6), arginazy (EC 3.5.3.1) oraz kilku liaz.

4 atomy Mn²⁺ wchodzą w skład fotosystemu PS II, gdzie związane są z odpowiednimi białkami (patrz: str.??) i uczestniczą w fotolizie wody.

Miedź. W organizmach żywych szeroko rozpowszechniona, ale w śladowych ilościach. Bierze udział w wielu procesach komórkowych: we wchłanianiu i transporcie żelaza, w wytwarzaniu czerwonych krwinek, w tworzeniu kości i kolagenu, w gojeniu ran, w metabolizmie kwasów tłuszczowych oraz w powstawaniu RNA.

Jest kofaktorem w około 30 reakcjach enzymatycznych. Pełni podstawową rolę w wielu enzymach: m.in. reakcje enzymatyczne z przeniesieniem elektronu lub reakcji z udziałem O₂. Ale przede wszystkim jest kofaktorem i składnikiem budulcowym oksydazy cytochromu c (EC 1.9.3.1) - jednego z najważniejszych enzymów organizmów tlenowych!

Jest składnikiem „niebieskich białek”; plastocyjaniny i azuryny (str.13) oraz hemocyjaniny.

Plastocyjanina (Pc) - przenośnik elektronów u organizmów zdolnych do fotosyntezy, u roślin znajdowana w chloroplastach - (porównaj: rozdz.5.5. - fosforylacja fotosyntetyczna, str. ).

Azuryna - przenośnik elektronów u niektórych mikroorganizmów. M.in. reduktaza arsenianowa (azuryna) - EC 1.20.98.1 u Pseudomonas aeruginosa.

Hemocyjanina jest przenośnikiem tlenu u mięczaków i stawonogów.

Molibden. Wspomaga przemiany białek, węglowodanów i tłuszczów.

Jony Mo²⁺ i niekiedy Mo⁴⁺ lub ich kompleksy organiczne są kofaktorami w kilkunastu reakcjach enzymatycznych.

Jony Mo²⁺ są niezbędne w działaniu nitrogenaz (EC 1.18.6.1 i EC 1.19.6.1), enzymów biorących udział w nitrogenezie (wiązaniu azotu atmosferycznego), oraz reduktaz azotanowych EC 1.7.1.1, EC 1.7.1.2 i EC 1.7.1.3 - kluczowych procesów biologicznego obiegu azotu (patrz wykład „Ochrona Środowiska”). Jest również kofaktorem w reakcji reduktazy ferredoksyna-azotan (EC 1.7.7.2) i oksydazy siarczynowej (EC 1.8.3.1).

Jony Mo²⁺ (i wyjątkowo Mo⁴⁺) są składnikiem budulcowym molibdenopteryny (patrz: str.14) oraz dinukleotydu cytozynomolibdenopterynowego, kofaktorów niektórych reakcji enzymatycznych. Molibdenopteryna jest kofaktorem m.in. hydroksylazy etylobenzenowej (EC 1.17.99.2), enzymu biorącego udział w beztlenowej biodegradacji etylo- i propylobenzenu przez bakterie denitryfikacyjne.

Dwa atomy Mo²⁺ są składnikiem molibdenoferredoksyny białka enzymatycznego znalezionego u Clostridium pasteurianum.

Jego nadmiar prowadzi do skazy moczanowej, bólów i obrzęków stawów.

Jod. Warunkuje prawidłowe działanie tarczycy. Wchodzi w skład jej hormonów, które przyczyniają się do regulacji podstawowych funkcji życiowych: kontroli temperatury, układu nerwowego i mięśniowego oraz podziału komórek.

Niedobór powoduje występowanie wola i niedoczynności tarczycy.

Selen. Ważny antyoksydant, bierze udział w eliminacji wolnych rodników i metali ciężkich, przez co opóźnia proces starzenia się komórek oraz zapobiega powstawaniu nowotworów.

U człowieka zapobiega hemolizie krwi, wraz z witaminą E stabilizuje błony komórkowe oraz steruje przemianami siarki w organizmie człowieka.

U ssaków jest kofaktorem w działaniu peroksydazy fosfolipidowodoronadtlenkowo-glutationowej (EC 1.11.1.12), która zapobiega mechanizmowi hydroperroksydacji (porównaj: wykład „Podstawy Biodegradacji” - subterminalna biodegradacja n-alkanów powyżej C₁₆).

Wchodzi w skład hydrogenaz żelazo-niklowo-slelnocysteinowych np. u Desulfovibrio vulgaris.

Bor. Dla roślin jeden z najważniejszych mikroelementów, tym bardziej, że w polskich glebach i wodach występuje jego znaczny niedobór. Jego rola jest bardzo złożona i nie do końca poznana.

Wiadomo, że jego niedostatek wywołuje czernienie i zanik wierzchołkowych części roślin.

Kobalt. Jest niezbędny do tworzenia witaminy B12 - cyjanokobalaminy (str.83). Jest to jedyny spotykany w komórkach związek metaloorganiczny (z wiązaniem metal-węgiel). Witamina B₁₂ bierze udział w przemianie węglowodanów, białek i tłuszczów. Uczestniczy w wytwarzaniu czerwonych krwinek krwi, przeciwdziała niedokrwistości, umożliwia syntezę DNA i RNA w komórkach, przede wszystkim szpiku kostnego. Pozytywnie wpływa na funkcjonowanie układu nerwowego, zapewnia dobry nastrój, równowagę psychiczną, pomaga w uczeniu się, skupieniu uwagi.

Kobalamina (patrz: str.14) i jej pochodne są kofaktorem kilkunastu reakcji enzymatycznych.

Cyjanokobalamina jest koenzymem niektórych dehydrataz, amoniako-liaz i mutaz. M.in. niezwykle ważnego enzymu - z punktu widzenia przemian nieparzysto-węglowych kwasów tłuszczowych - mutazy metylomalonylo-CoA (EC 5.4.99.2). Jest również kofaktorem w reakcji katalizowanej przez amoniako-liazę etanoloaminową (EC 4.3.1.7), enzymu uczestniczącego w biodegradacji niektórych amin biologicznie czynnych.

W przyrodzie występuje dość powszechnie, rzadko więc mamy do czynienia z przypadkami jego niedoboru.

Krzem. U człowieka występuje przede wszystkim w tkance łącznej, z której zbudowane są ścięgna, błony śluzowe, ściany naczyń krwionośnych, zastawki serca, skóra i układ kostno-stawowy. Krzem usuwa z komórek substancje toksyczne, korzystnie wpływa na naczynia włoskowate, uszczelniając je, zwiększa wytrzymałość tkanki kostnej, wzmacnia zdolność obronną organizmu przeciw zakażeniom, zapobiega przedwczesnemu starzeniu się. Usuwa podrażnienia i stany zapalne skóry, poprawiając jej ogólny wygląd i zapobiegając wiotczeniu, ogranicza wypadanie włosów, przyspiesza ich wzrost, wzmacnia paznokcie.

Krzem stanowi centrum reaktywności kilku enzymów, odpowiedzialnych za "przerób" krzemionki okrzemków i niektórych skorupiaków.

Krzemionka u pewnej grupy organizmów spełnia funkcje szkieletowe. U niektórych z kolei jest wykorzystywana do budowy ścian komórkowych. Wiele roślin, szczególnie traw, stosuje amorficzną krzemionkę jako swoistego rodzaju "materiał ścierny", odstręczający roślinożerców.

* * *

Pozostałe mikroelementy nie wchodzą w skład tak kluczowych związków, jak te opisane wyżej. Są jednak ważne dla wielu procesów życiowych. Ich ilość w komórkach jest niewielka, ale mają one istotny wpływ na ich prawidłowy rozwój i funkcjonowanie.

Chrom. Wpływa - poprzez pobudzanie aktywności komórek β-trzustki - na produkcję insuliny, a więc uczestniczy w przemianach węglowodanów i stąd jego znaczenie w profilaktyce leczenia cukrzycy. Reguluje ponadto poziom cholesterolu i kwasów tłuszczowych

Fluor. Jest składnikiem kości i zębów (zmniejsza rozpuszczalność szkliwa, wzmacnia zębinę oraz zapobiega próchnicy). Szkliwo zębów to głównie: Ca₅(PO₄)₃OH (hydroksyapatyt), ale fluoroapatyt Ca₅(PO₄)₃F jest trudniej rozpuszczalny i stąd mniej podatny na próchnicę (zmniejsza rozpuszczalność szkliwa).

W okresie ciąży pomaga we wchłanianiu żelaza i zapobiega niedokrwistości.

Jest pierwiastkiem niezbędnym i jednocześnie niebezpiecznym.

Nikiel. Znaleziono go w niektórych bakteriach, grzybach i roślinach.

Jest aktywatorem kilku hydrogenaz, m.in. hydrogenazy cytochromu c3 (EC 1.12.2.1), enzymu niklowo-żelazowo-selenocysteinowego z Desulfovibrio vulgaris, hydrogenazy ferredoksynowej (EC 1.12.7.2 z Clostridium pasteurianum oraz hydrogenazy wodorowej (EC 1.12.1.2) z Rhodococcus opacus i Ralstonia eutropha.

Jest kofaktorem w reakcjach z udziałem ureazy (EC 3.5.1.5), enzymu znajdowanego u wielu drobnoustrojów; m.in. ureazy z Bacillus subtilis i Klebsiella aerogenes.

Glin. Niektóre rośliny są zdolne do nagromadzania w swoich tkankach (głownie w liściach) tego pierwiastka lub jego związków.

Glin dla zwierząt w nadmiarze może być rakotwórczy. Podejrzewa się, iż u ludzi powoduje chorobę Alzheimera. Codziennie w pożywieniu, między innymi w warzywach i herbacie, przyjmujemy około 12 mg glinu.

* * *

Trzecią grupę pierwiastków stanowią ultraelementy. Są to pierwiastki występujące w ilościach kilku μg na gram masy organizmu. Zaliczamy do nich: wolfram, wanad, cynę, tytan, arsen, rad, rod, srebro, złoto i platynę (cztery pierwsze, dla niektórych organizmów zalicza się do grupy pierwiastków śladowych). Ich rola biologiczna nie zawsze jest jasna. Wiadomo, że niektóre z nich mogą być aktywatorami enzymów.

Wanad. Wanad jest mikroelementem niezbędnym do życia większości żywych organizmów. Wchodzi w skład enzymów i białek spotykanych u bakterii, glonów i zwierząt morskich (m.in. hemowanadyna). U Azotobacter vinelandi może zastąpić Mo, jako kofaktor reakcji katalizowanej przez nitrogenazę (EC 1.18.6.1) - porównaj wykład „Ochrona Środowiska”.

Nie stwierdza się niedoborów wanadu u prawidłowo odżywiających się osób.

Wolfram. Dla licznych organizmów jest pierwiastkiem biogennym (niezbędnym). W reakcjach enzymatycznych niekiedy zastępuje jony Se, Fe i Mo.

Jako jon W²⁺ lub w postaci wolframopteryny (zastępuje molibden w molibdenopterynie) jest kofakteorem kilku reakcji enzymatycznych.

U wielu szczepów bakterii z rodzaju Pyrococcus i u licznych bakterii metanowych wolframopteryna jest kofaktorem reakcji z udziałem oksydoreduktaz z pod-podklasy EC 1.2.7. (z ferredoksyną).

Jon W²⁺ jest aktywatorem reduktazy karboksylanowej (EC 1.2.999.6).

Arsen. Wbrew jego reputacji niewykluczone, że w ultraśladowych ilościach jest pierwiastkiem niezbędnym dla ludzi. Wiadomo, że jest biogenny dla czerwonych alg, kurcząt, szczurów, kóz i świń.

W chwili obecnej poza melarsprolem i acetarsolem nie stosuje się w lecznictwie związków arsenu, choć w ostatnich latach zaczyna wzrastać zainteresowanie arszenikiem, jako środkiem w terapii przeciwnowotworowej.

Cyna. Niewykluczone, że cyna jest pierwiastkiem niezbędnym do życia szczurów, ale to w ultraśladowych ilościach. Związki organiczne cyny używane są jako bakteriocydy i fungicydy w morskim środowisku, ale istnieją uzasadnione obawy, że przy okazji powodują kilka niekorzystnych zjawisk w lokalnej przyrodzie.

Tytan. Dla ludzkiego organizmu nie ma żadnego znaczenia (jest nietoksyczny). Szacuje się, że każdego dnia człowiek spożywa 0,8 mg tytanu, ale większość nie jest przyswajana przez organizm.

Ma tendencje do akumulacji w tkankach zawierających krzemionkę. Większość roślin zawiera około 1 ppm tytanu, natomiast skrzyp i pokrzywa mogą go zawierać nawet do 80ppm.

Lit. Wydaje się (2007), że nie pełni żadnej biologicznej roli. Jednakże węglan litu z powodzeniem stosowany jest w psychiatrii jako normotymik.

Platyna, złoto, srebro, rad i rod. Pierwiastki te należą do kategorii biofilnych (spotykane są w żywych organizmach). Jednakże dotychczas (2007) nie udało się ustalić ich roli biologicznej i stąd równie dobrze można przyjąć, że nie są pierwiastkami biogennymi, podobnie zresztą, jak Ti i Li.

1.2. Pierwiastki toksyczne

Do najbardziej niebezpiecznych dla środowiska i dla organizmów żywych zalicza się związki rtęci, kadmu, ołowiu, cyjanki i fluorki. Niewiele mniej niebezpieczne są związki chromu, arsenu, baru, boru i berylu, miedzi, niklu, selenu, antymonu, molibdenu, glinu i inne.

Pojęcie metali ciężkich w biotechnologii środowiska

Metale ciężkie to pierwiastki o masie właściwej większej od 4,5 g/cm³, które w reakcjach chemicznych wykazują tendencję do oddawania elektronów, tworząc proste kationy. W naukach biologicznych i związanych z żywnością spośród wszystkich metali ciężkich zainteresowanie budzą: Cu, Co, Cr, Cd, Fe, Zn, Pb, Sn, Hg, Mn, Ni, Mo, W, V, a ponadto umownie rozpatrywane razem z nimi półmetale As i Se. W tej grupie występują jedynie pierwiastki biogenne dla organizmów (np. miedź, cynk, nikiel, chrom, itp.) oraz pierwiastki uznawane za biocydy, czyli toksyczne dla organizmów żywych (kadm, rtęć, ołów, arsen).

Metale ciężkie biogenne rozpatruje się zazwyczaj w kategorii mikroelementów i zostały już omówione w rozdziale 1.1. Natomiast metale ciężkie toksyczne, umownie w biotechnologii, w naukach biologicznych oraz związanych z żywieniem, nazywa się po prostu metalami ciężkimi, pamiętając jednak przy tym, że są one jedynie wyodrębnioną umownie grupą metali ciężkich. Do tak rozumianych metali ciężkich zalicza się też czasami półmetale As i Se.

W technologii żywności - zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 27 grudnia 2001 - za zanieczyszczenia żywności metalami ciężkimi uważa się: Pb, Hg, Cd i As. A wynika to z tego, że częste zatrucia wywołane są spożywaniem pokarmów zanieczyszczonych związkami właśnie tych metali.

W hydrobiologii za metale ciężkie uważa się: Pb, Hg, Cd, As, Cr, Ni, Zn i Cu. Metale te dostają się do wód powierzchniowych głównie ze ścieków przemysłowych i komunalnych, ze spływu z pól gdzie stosowano środki ochrony roślin (Hg, Cu, As) i z opadu atmosferycznego (np. związki Pb).

W biochemii za metale ciężkie uważa się przede wszystkim Pb, Hg i Cu, czyli te metale, których jony (w przypadku Hg mogą być to nawet tylko opary) wywołują niezwykle łatwo denaturację białek i - co za tym idzie - są również silnymi inhibitorami niespecyficznymi enzymów. Jednakże rutynowo zawsze też się bada wpływ kilku innych metali ciężkich na aktywność enzymów (m.in. Ni, Zn, Cd i Cr).

W biotechnologii środowiska za metale ciężkie umownie uważa się: Hg, Pb, Cd, As, Ni, Cu, Se, Cr i Zn. To sole tych metali najczęściej wywołują zakłócenia w ekosystemach, prowadząc do zachwiania równowagi, a w krańcowych przypadkach nawet do zniszczenia biocenozy.

Zatrucia metalami ciężkimi.

Ze względu na znaczą toksyczność wielu metali ciężkich i zdolność do kumulacji (np. w kościach, nerkach, mózgu) ich sole oraz tlenki mogą być przyczyną groźnych zatruć ostrych i przewlekłych, chorób układu krążenia, układu nerwowego, nerek, czy chorób nowotworowych. Metale ciężkie w postaci pierwiastkowej natomiast się zwykle nie wchłaniają (wyjątkiem są rtęć i pyły ołowiu).

Występowanie związków metali ciężkich w biosferze jest zazwyczaj produktem ubocznym działalności technologicznej i eksploracyjnej człowieka. Metale ciężkie są powszechnymi zanieczyszczeniami ekosystemów. Źródłami antropogenicznego skażenia środowiska metalami ciężkimi są różne gałęzie przemysłu, energetyka, komunikacja, gospodarka komunalna, wysypiska odpadów, nawozy i odpady stosowane do nawożenia. Metale ciężkie z tych źródeł ulegają rozproszeniu w środowisku i zanieczyszczają gleby, wody, powietrze i bezpośrednio lub poprzez rośliny dostają się do organizmu zwierząt i człowieka. Dlatego bardzo ważna jest wiedza o ich właściwościach toksycznych - szczegóły dotyczące toksyczności metali ciężkich i schorzeń przez nie wywoływanych są poruszane w ramach wykładu: „Toksykologia”. Już w małych ilościach metale te mogą powodować rozmaite choroby u ludzi i u zwierząt, które narażone były na ich zawartość w podawanych paszach. Na ich szkodliwe działanie narażone są również rośliny. Najbardziej skażone są rośliny uprawiane na terenach uprzemysłowionych, w miejskich ogródkach działkowych oraz pobliżu dróg o dużym natężeniu ruchu samochodowego w odległości mniejszej niż 80 metrów od drogi.

Do najbardziej toksycznych metali należy: ołów, rtęć i kadm. Są to pierwiastki, które występując w środowisku w dawkach wyższych niż NDS (najwyższe dopuszczalne stężenie) powodują najczęściej powstawanie nowotworów i wielu innych chorób (np. rtęć - chorobę Minamata, kadm - chorobę Itai-Itai, ołów - choroby umysłowe).

Istnieją jednak organizmy, które w swoich komórkach akumulują metale ciężkie toksyczne dla ludzi i zwierząt. Możliwości takie posiadają niektóre drobnoustroje, ale także owocniki różnych gatunków grzybów wyższych.

Warto zwrócić uwagę na jeszcze jeden aspekt toksyczności metali ciężkich. Niektóre z nich (np. Cu, Zn, Ni, Cr, W, As, itp.) są pierwiastkami biogennymi, tym niemniej w większych dawkach są bardzo toksyczne (np. sole arsenu wywołują bardzo silne zatrucia).

1.3. Kompleksy organiczne metali występujące w żywych komórkach

Związki kompleksowe (inaczej kompleksy, związki koordynacyjne) to związki chemiczne, w których można wyróżnić jeden lub grupę atomów centralnych, otoczonych przez inne atomy lub ich związki zwane ligandami, przy czym przynajmniej jedno wiązanie atomu centralnego z ligandem musi mieć charakter wiązania koordynacyjnego.

W kompleksach organicznych ligandy są grupami funkcyjnymi związków organicznych (np. grupa aminowa, hydroksylowa, tiolowa, eterowa, imidazolowa, itp.), łączące się z metalem wiązaniem innym niż węgiel-metal.

Białka żelazowo-siarkowe

Białka żelazowo-siarkowe zawierają żelazo niehemowe. Stanowią one jednoelektronowe układy oksydoredukcyjne.

Białka żelazowo-siarkowe (Fe_n-S_n) są białkami wyróżniającymi się obecnością klastera żelazowo-siarkowego (tzn. oba te atomy tworzą wspólną sieć powiązań) zawierającego siarkę na minus drugim stopniu utlenienia (S^2-) związaną z dwoma, trzema lub czterema atomami żelaza na zmiennym stopniu utlenienia (Fe²⁺ lub Fe³⁺). Klastery żelazowo-siarkowe występują w rozmaitych metaloproteinach, ferredoksynie, w kompleksach I, II i III łańcucha oddechowego, w nitrogenazach i innych enzymach.

Strukturalny motyw białek z klasterem Fe-S jest następujący: atomy Fe są umieszczone w środkach tatrahedronów, w wierzchołkach których są umieszczone atomy siarki (siarczkowe i tiolowe - pochodzące od cysteiny).

Znane są trzy różne rodzaje klasterów Fe-S z opisaną wspólną cechą..

Klastery typu Fe₂-S₂. Tego typu klaster składa się z dwóch jonów Fe połączonych przez dwa jony siarczkowe i skoordynowanych przez cztery ligandy cysteinylowe (np. w ferredoksynie) lub przez dwie cysteiny i dwie histydyny (w białkach Rieske). Utlenione białko zawiera dwa jony Fe³⁺, podczas gdy zredukowane białko zawiera po jednym jonie: Fe³⁺ i Fe²⁺. Te dwie formy umownie zapisuje się jako (Fe³⁺)₂ i (Fe³⁺ Fe²⁺) lub bardziej schematycznie, ale czytelniej (Fe₂-S₂)_utl i (Fe₂-S₂)_red.

Przykładem białek żelazowo-siarkowych z klasterem Fe₂-S₂ jest ferredoksyna (Fd). Po raz pierwszy białko to zostało wyizolowane i oczyszczone z beztlenowych bakterii Clostridium pasteurianum. Jednakże okazało się, że podobne białka występują w chloroplastach. Dzisiaj wiadomo, iż ferredoksyna jest typowym białkiem stromy chloroplastów roślin zielonych. Jej masa cząsteczkowa jest rzędu 12 kDa; bierze udział w fosforylacji fotosyntetycznej (porównaj: str. ). Może występować w formie zredukowanej Fd_red lub utlenionej Fd_ox. Obok typowo roślinnych ferredoksyn, znane są ferredoksyny bakteryjne: np. adrenodoksyny, czy ferredoksyno-podobne tioredoksyny.

Innym przykładem białek żelazowo-siarkowych z klasterem Fe₂-S₂ jest białko Rieske (ISP). Białko to jest składnikiem Kompleksu III łańcucha oddechowego u chemoorganotrofów, czyli reduktazy ubichinol-cytochrom c - EC 1.10.2.2 (patrz: str.116). Białko typu Rieske wchodzi także w skład Kompleksu cytochromu b₆f systemów fotosyntetycznych roślin zielonych i niektórych sinic (np. Cyanobacteria), czyli reduktazy plastochinol-plastocyjanina - EC 1.10.99.1 (patrz: str. ). Homologi białka Rieske są również składnikami dioksygenaz: benzenowej, naftalenowej, toluenowej, ftalanowej i podobnych.

Klastery typu Fe₄—S₄. Wspólnym motywem tego typu ugrupowań są cztery jony Fe i cztery jony S^2- umieszczone w wierzchołkach sześcianu. W tego typu klasterach atomy żelaza są koordynowane przez ligandy cysteinylowe.

Przykładami białek zawierających klaster Fe₄-S₄ są Kompleksy I i II znane z łańcucha oddechowego chemoorganotrofów, czyli dehydrogenaza NADH - EC 1.6.5.3 i dehydrogenaza bursztynianowa (ubichinon) - EC 1.3.5.1 (patrz: str. 115)

Bakteryjne białka z klasterem Fe₄-S₄ dzieli się na białka „o niskim potencjale redox” i „z wysokim potencjałem redox” (HiPIP). Podział ten wynika z poniższego schematu:

Formalnie ilość utlenionych jonów żelaza przy białkach o niskim potencjale redox może wynosić: [2Fe³⁺, 2Fe²⁺] lub [1Fe³⁺, 3Fe²⁺].Ilość utlenionych atomów żelaza w przypadku białek z wysokim potencjałem redox może być następująca: [3Fe³⁺, 1Fe²⁺] lub [2Fe³⁺, 2Fe²⁺].

Białka z klasterem Fe₄-S₄ „o niskim potencjale redox” uważane są za „typowe ferredoksyny bakteryjne” i znalezione je np. u Pyrococcus furiosus. Białka z klasterem Fe₄-S₄ „z wysokim potencjałem redox” (HiPIP) są wykorzystywane w beztlenowym transporcie elektronów, np. u Rhodopila globiformis.

Klastery typu Fe₃—S₄. Białka zawierające tego typu klastery mają mniejsze znaczenie biochemiczne. Jednak jeden z enzymów cyklu Krebsa - hydrataza akonitanowa (EC 4.2.1.3) - zawiera właśnie taki klaster.

Rubredoksyna należy do klasy niskocząsteczkowych białek zawierających w centrum aktywnym żelazo koordynacyjnie połączone z czterema cysteinami: Fe(Cys)₄. Niektórzy rubredoksynę zaliczają do białek żelazawo-siarkowych, jednakże w przeciwieństwie do nich nie zawiera ona siarki
nieorganicznej.

Białka będące kompleksami organicznymi z innych centrum niż żelazowo-siarkowe

Plastocyjaniny (PCY) są rozpuszczalnymi w wodzie (a więc i w cytoplazmie) białkami zawierającymi miedź. Z uwagi na kolor zwane są „niebieskimi białkami”. Zlokalizowane są u roślin w przestrzeni tylakoidów. Stanowią ogniwo w transporcie elektronów podczas fotosyntezy. Ich miedziowe T1 centrum aktywne Cu(His)₂(Cys)(Met) funkcjonuje jako dwukierunkowy przekaźnik elektronów:

Krystaliczna struktura pokazuje bardzo nieregularny tetraedr z dwoma siarkami pochodzącymi od cysteiny i metioniny i dwoma azotami dwóch histydyn. Na rysunku obok przedstawiono centrum T1 plastocyjaniny z topoli.

Azuryna. Jest miedziowo-białkowym przenośnikiem elektronów u niektórych drobnoustrojów. Znane są dwie odmiany tego kofaktora kilku reakcji enzymatycznych. Azuryna I znaleziona u Pseudomonas aeruginosa w centrum aktywnym ma układ Cu(His)₂(Cys) i zbudowana jest z czterech różnych łańcuchów polipeptydowych: A,B,C i D. Natomiast azuryna II znaleziona u Alcaligenes xylosoxidans ma identyczny układ Cu(His)₂(Cys), ale dodatkowo aksjalnie przyłączoną metioninę.

Hemoproteiny. Są to białka zawierające jako grupę prostetyczną hem lub heminę. Hem (hemina) to połączenie żelaza Fe²⁺ (w heminie Fe³⁺) z protoporfiryną IX (patrz: str. 78).

Białka hemo-tiolowe. To białka, w których grupa tiolowa cysteiny jest aksjalnie przełączona jako ligand do jonu żelaza heminy.

Molibdenopteryna. Nazwa związku jest co nieco myląca, bo w rzeczywistości jest to układ dwóch skondensowanych pierścieni: pterynowego i piranowego, a ponadto pierścień piranowy podstawiony jest przez dwie grupy tiolowe i alkilofosforan. Jon Mo²⁺ jest kompleksowany przez sąsiadujące grupy tiolowe.

Znana jest odmiana molibdenopteryny z Mo⁴⁺, i wtedy dwa pierścienie piranopterynowe z 4 grupami -SH, kompleksują jon molibdenu.

Znany jest również dinukleotyd cytozynomolibdenopterynowy znaleziony m.in. u Desulfovibro gigas, kofaktor dehydrogenazy aldehydowej (FAD-niezależnej) - EC 1.2.99.7.

Kobalamina. Z chemicznego punktu widzenia kobalamina jest złożonym organicznym związkiem kompleksowym, w którym centralny atom Co³⁺ jest koordynowany przez atomy azotu układu porfirynowego (porównaj: str. 83). Dodatkowe wiązanie koordynacyjne N-Co występuje prostopadle do płaszczyzny układu pierścieni pirolowych z 5,6-dimetylobenzimidazol-rybozą. Drugie wiązanie prostopadłe do tej płaszczyzny jest niestałe (labilne - tzn. mogą się tam koordynacyjnie przyłączać różne ligandy, które stosunkowo łatwo się odrywają od całej cząsteczki). Tymi ligandami mogą być: grupa -CN (występuje w cyjanokobalaminie), grupa -OH, grupa -CH₃ i reszta 5'-deoksyadenozyny. Cyjanidowa odmiana kobalaminy jest stosunkowo najbardziej stabilna i dlatego występuje ona w preparatach witaminowych. W organizmie ulega ona szybkiemu przekształceniu do pochodnej metylowej, która po wymianie na ligand 5'-deoksyadenozynowy staje się rzeczywistym aktywnym biologicznie koenzymem kobalaminy.

ROZDZIAŁ 2. ELEMENTY CHEMII BIOORGANICZNEJ

Jak już wspomniano, biochemia zajmuje się m.in. ustaleniem budowy chemicznej składników żywych organizmów. Ustalono, że do najbardziej rozpowszechnionych w organizmach żywych związków należą: sacharydy, białka (w tym enzymy) i tłuszczowce. Wśród innych na uwagę zasługują: kwasy nukleinowe, witaminy, hormony, barwniki (m.in. pirolowe i karotenoidy), glikozydy, alkaloidy i kwasy organiczne. Ich budowa zostanie omówiona w kolejnych rozdziałach. Przy jej rozpatrywaniu, w większości przypadków, konieczne jest uwzględnienie zjawiska izomerii. Dlatego też pierwszy rozdział poświęcony zostanie omówieniu tego niezwykle ważnego zagadnienia.

2.1. Izomeria

Izomeria polega na występowaniu związków o identycznym składzie atomowym, a różniących się jedynie sposobem, kolejnością lub miejscem powiązania atomów albo ich rozmieszczeniem (lub ich grup) w przestrzeni. Cząsteczki takich związków nazywane są izomerami. Znanych jest kilka różnych odmian izomerii. Tu zostaną omówione jedynie te odmiany, które mają znaczenie z biochemicznego punktu widzenia, a przede wszystkim będą przydatne przy studiowaniu dalszych rozdziałów podręcznika (m.in. przy nazewnictwie enzymów).

Regioizomery (izomery pozycyjne) to izomery różniące się jedynie rozmieszczeniem tych samych grup atomów (np. grup funkcyjnych, podstawników) w podstawowym szkielecie cząsteczki. Mogą one różnić się właściwościami fizyko-chemicznymi, ale przede wszystkim najczęściej wykazują diametralnie różne właściwości biologiczne. Przykładem regioizomerów może być mieszanina dwu diestrów etylowych glicerolu.

Tautomery (izomery funkcyjne - różnią się obecnością w cząsteczce odmiennych grup funkcyjnych) to dwa izomery, które przechodzą nawzajem w siebie w wyniku przesunięcia atomu wodoru z jednoczesnym przemieszczeniem układu wiązań w cząsteczce. Zjawisko występowania obok siebie takich izomerów nazywamy tautomerią. Stan równowagi pomiędzy tautomerami kwasu pirogronowego można zapisać następująco:

Odmiana ketonowa większości tautomerów jest znacznie trwalsza i stąd stan równowagi reakcji przesunięty jest na jej korzyść.

-izomery to dwa izomery różniące się położeniem podwójnego wiązania (lub kilku takich wiązań) w cząsteczce, np.:

Stereoizomeria

Stereoizomeria, czyli izomeria przestrzenna jest związana z różnym przestrzennym rozmieszczeniem atomów (lub grup atomów) i układem wiązań w cząsteczce. Według klasycznego podziału obejmuje ona izomerię geometryczną i izomery optyczne.

Izomery cis-trans -izomery geometryczne, zaliczane do stereoizomerów - różnią się konfiguracją, czyli przestrzennym położeniem wyróżnionych atomów względem wybranej płaszczyzny, przy czym przyjmuje się, że atomy te nie mają możliwości swobodnego obrotu wokół podwójnego wiązania (np. w alkenach) lub - w związkach cyklicznych - wokół wiązania C-C. Izomery, w których takie same lub wyróżnione atomy (albo grupy atomów) znajdują się po tej samej stronie są nazywane odmianami cis, po przeciwnych stronach - odmianami trans. Izomery cis-trans mogą różnić się nieco właściwościami fizyko-chemicznymi, natomiast ich właściwości biologiczne są z reguły całkowicie różne.

Izomery optyczne lub ogólnie związki optycznie czynne, tj. skręcające w różny sposób płaszczyznę światła spolaryzowanego Ta właściwość jest konsekwencją obecności w ich cząsteczkach centrum chiralnego. Chiralność, to właściwość obiektu polegająca na tym, iż nie pokrywa się on ze swoim odbiciem w zwierciadle płaskim. Z reguły centrum chiralne izomerów optycznych stanowi asymetryczny (chiralny) atom lub atomy węgla (oznaczone na rysunkach gwiazdką), wokół których może występować różna konfiguracja, czyli przestrzenne rozmieszczenie innych atomów lub grup atomów.

Izomery optyczne dzieli się na prawoskrętne (+) lub lewoskrętne (-), w zależności od kierunku, w którym skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego. W celu ujednolicenia przedstawiania ich konfiguracji za wzorce przyjęto prawo- i lewoskrętne aldehydy glicerynowe. Grupa aldehydowa jest lokowana na „górze” wzoru, natomiast grupę hydroksylową umieszcza się po lewej stronie (z punktu widzenia patrzącego), otrzymując w ten sposób wzór aldehydu L(-)-glicerynowego, lub po prawej, otrzymując wzór aldehydu D-(+)-glicerynowego.

Enancjomery, to pary prawo- i lewoskrętnych izomerów optycznych, stanowiących wzajemne odbicie w lustrze. Ich właściwości fizyko-chemiczne są identyczne, z wyjątkiem zdolności do kierunku skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Natomiast różnią się właściwościami biologicznymi. Np. pleśnie Penicillium glaucum z roztworu racemicznego winianu amonowego zużywają wyłącznie odmianę prawoskrętną.

Racemat (postać racemiczna) to mieszanina równych ilości cząsteczek enancjomerów, nie wykazująca aktywności optycznej (z uwagi na kompensację) oznaczana znakiem (±) lub literami D,L- umieszczanymi przed nazwą lub wzorem związku chemicznego.

Racemizacja, to zjawisko polegające na wzajemnym przekształcaniu się jednego enancjomeru w drugi, aż do ustalenia się równowagi ilościowej pomiędzy obu odmianami.

Diastereoizomery to izomery optyczne nie będące wzajemnymi odbiciami w lustrze. Różnią się właściwościami fizyko-chemicznymi i biologicznymi. Poniżej przedstawione są konfiguracje czterech stereoizomerów kwasu 2,3-dihydroksymasłowego. Wzory (I) i (II) oraz (III) i (IV) przedstawiają pary enancjomerów, które w stosunku do siebie nawzajem są diastereoizomerami.

Mezo-izomery. Niektóre związki, pomimo obecności asymetrycznych atomów węgla, są nieczynne optycznie na skutek wewnętrznej kompensacji; nazywamy je związkami mezo. Przykładem takiego związku jest kwas mezowinowy, który jest diastereoizomerem w stosunku do swoich odmian prawo- i lewoskrętnej.

* * *

Niektóre inne aspekty stereoizomerii poruszone zostaną w następnym rozdziale, przy omawianiu sacharydów.

2.2. Węglowodany (sacharydy)

Duża grupa związków zaliczanych do węglowodanów, zwana jest również sacharydami lub cukrami. Termin „węglowodany” obejmuje monosacharydy (cukry proste), oligosacharydy, polisacharydy oraz związki pokrewne (aminocukry, kwasy uronowe, itp.). Natomiast do innych klas związków chemicznych zalicza się glikozydy aglikonowe (sacharyd połączony wiązaniem glikozydowym z aglikonem - związkiem niecukrowym), np. nukleozydy, glikozydy roślinne, itp. W tabeli wymieniono sacharydy najczęściej spotykane w przyrodzie.

Tabela 2.1. Klasyfikacja sacharydów najczęściej spotykanych w przyrodzie.

Monosacharydy		Oligosacharydy	Polisacharydy	Pochodne polisacharydów
Pentozy	Heksozy
aldo Arabinoza Ksyloza Ryboza keto Rybuloza Ksyluloza	aldo Glukoza Mannoza Galaktoza keto Fruktoza Sorboza	disacharydy Sacharoza Laktoza Maltoza Celobioza trisacharydy Rafinoza	pentozany Araban Ksylan heksozany Skrobia Glikogen Celuloza	Hemicelulozy Pektyny Aminocukry

W skład węglowodanów wchodzą: węgiel, wodór i tlen. Z chemicznego punktu widzenia są to alkohole wielowodorotlenowe, zawierające w cząsteczce grupę aldehydową (aldozy) lub grupę ketonową (ketozy).

Związki zbudowane z jednej cząsteczki aldozy lub ketozy nazywa się monosacharydami. Ich charakterystyczną cechą jest obecność w cząsteczkach asymetrycznych atomów węgla (oznaczonych na rysunku gwiazdką), co warunkuje istnienie izomerów przestrzennych, czynnych optycznie tzn. skręcających płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo (-) lub prawo (+). Ich konfigurację przestrzenną (wywodzącą się od aldehydu glicerynowego) rozróżnienia się na podstawie układu na przedostatnim węglu, dodając przed nazwą monosacharydu literę D lub L. Izomery D i L różnią się między sobą właściwościami chemicznymi i fizycznymi.

W środowisku alkalicznym monosacharydy występują w formie łańcuchowej, natomiast w kwaśnym lub obojętnym w formie pierścieniowej (półacetalowej): piranozowej (sześcioczłonowy pierścień) lub furanozowej (pięcioczłonowy pierścień).

Pierścień furanozowy jest w zasadzie płaski, natomiast pierścień piranozowy nie leży na płaszczyźnie, lecz na powierzchni pofałdowanej, przypominającej formę krzesełkową cykloheksanu.

Monosacharydy w postaci cyklicznej mają dodatkowo jeden asymetryczny atom węgla więcej, co powoduje powstanie nowych izomerów (tzw. anomerów - i -). Jeśli grupa hydroksylowa przy pierwszym atomie węgla cyklicznej postaci cukru, czyli grypa półacetalowa -OH, jest skierowana przestrzennie tak samo jak grupa wodorotlenowa przy atomie drugim, to izomer (anomer) ten oznaczamy , jeśli jest skierowana przeciwnie, izomer nosi nazwę .

Glukoza wykazuje zjawisko mutarotacji: w odpowiednich warunkach izomery - i - mogą przechodzić jeden w drugi. Związki, w skład których wchodzą izomery - lub - różnią się znacznie między sobą wieloma właściwościami (np. amyloza zbudowana jest z -glukozy, a celuloza w sposób analogiczny z -glukozy).

Grupa hydroksylowa półacetalowa, czyli leżąca przy pierwszym atomie węgla piranozowej postaci cukru lub przy drugim furanozowej postaci, ze względu na swoją reaktywność chemiczną, jest odpowiedzialna za tworzenie wiązań O-glikozydowych, N-glikozydowych i S-glikozydowych.

Dwie aldozy (np. D-glukoza i D-mannoza) różniące się jedynie konformacyjnym położeniem grupy -OH przy drugim atomie węgla (sąsiadującym z grupą aldehydową) nazywa się epimerami. Epimeryzacja to przekształcanie jednej takiej aldozy w drugą.

Uwaga. Przy nazewnictwie enzymów, dla wygody, pojęcie epimeryzacji rozszerzono i dwie aldozy różniące się jedynie przestrzennym położeniem jednej grupy -OH przy którymś z asymetrycznych atomów węgla traktuje się jako epimery. Np. nazwa „4-epimeraza UDP-glukozowa” wskazuje, że enzym może przy czwartym atomie węgla dokonać epimeryzacji (w tym konkretnym przypadku przekształca UDP-1-glukozę w UDP-1-galaktozę).

2.2.1. Monosacharydy

Związki zbudowane z jednej cząsteczki aldozy lub ketozy nazywa się ogólnie monosacharydami (monozami) lub cukrami prostymi. W zależności od ilości atomów węgla w cząsteczce dzieli się je na triozy, tetrozy, pentozy, heksozy, itd.

Triozy.

Spośród trioz w przyrodzie występuje dihydroksyaceton i oba izomery D- i L- aldehydu glicerynowego.

Związki te w postaci estrów fosforanowych tworzą się w zielonych częściach roślin podczas fotosyntezy, w organizmach zwierzęcych między innymi podczas glikolizy oraz podczas fermentacji alkoholowej.

Tetrozy

Spośród tetroz na uwagę zasługują D-erytroza, która pojawia się w cyklu pentozowym, a także podczas fotosyntezy w zielonych częściach roślin w postaci estru fosforanowego oraz izomery D- i L-treozy tworzące się podczas degradacji izomerów D- i L- kwasu ksylonowego.

Pentozy

Pentozy występują obficie w przyrodzie. Tworzą się one w organizmach zwierzęcych i roślinnych w znacznych ilościach i to zarówno w stanie związanym, jako O-glikozydy, N-glikozydy lub wielocukry zwane pentozanami, jak i w stanie wolnym.

D-ryboza i D-dezoksyryboza są składnikami kwasów nukleinowych.

D-rybuloza, m.in. jest związkiem, który przyłącza CO₂ podczas fotosyntezy cukrów, w pierwszej fazie procesu.

L-arabinoza jest jednym z nielicznych L- cukrów występujących w przyrodzie. W postaci spolimeryzowanej jest składową częścią m.in. śluzów, gum roślinnych, pektyn i hemiceluloz.

D-ksyloza, zwana dawniej cukrem drzewnym, występuje w drewnie w postaci polisacharydu ksylanu, będącego składnikiem hemiceluloz.

D-ksyluloza pojawia się w postaci fosforanu podczas wzajemnych przemian pentoz w cyklu pentozowym.

Na uwagę zasługuje również L-ramnoza (uważana za metylopentozę), składnik wielu glikozydów i antocyjanów.

Heksozy

Obok wymienionych wcześniej glukozy i fruktozy do najszerzej rozpowszechnionych w świecie ożywionym monosacharydów z tej grupy należą: D-mannoza i D-galaktoza.

D-glukoza jest najpospolitszą aldozą. Występuje w stanie wolnym w owocach, kwiatach, miodzie, krwi. Jest częścią składową wielu oligosacharydów (sacharozy, maltozy, laktozy). W olbrzymich ilościach występuje jako składnik polisacharydów, przede wszystkim skrobi, glikogenu, celulozy.

D-fruktoza, najważniejsza z ketoz, w stanie wolnym występuje w owocach, zielonych częściach roślin, miodzie. Jest częścią składową sacharozy, rafinozy oraz polisacharydów - inuliny, lewanu.

D -galaktoza w stanie wolnym spotykana bywa rzadko (m.in. owoce bluszczu). Jest częścią składową disacharydu zwierzęcego - laktozy oraz dwóch innych oligosacharydów - melibiozy i rafinozy. Szczególnie szeroko są rozpowszechnione pochodne zawierające kwas galakturonowy takie, jak: agar, gumy, pektyny oraz polisacharydy otoczek bakteryjnych.

D-mannoza w stanie wolnym występuje raczej wyjątkowo, np. w skórkach pomarańczy. Spotykana bywa natomiast w postaci polisacharydów o budowie glikozydowej, zwanych mannozydami. Do pospolitszych mannozydów należy mannan, występujący w łupinach orzechów, w drożdżach. Polisacharyd zbudowany z kwasu mannurowego (pochodnej mannanu) występuje dość powszechnie w wodorostach morskich.

D -sorboza, również jedna z heksoz zasługująca na uwagę (z uwagi na jej wykorzystanie jako podstawowego surowca do produkcji witaminy C), występuje jako produkt utlenienia sorbitolu obecnego w soku nasion jarzębiny.

2.2.2. Oligosacharydy

Monosacharydy mogą kondensować tworząc disacharydy (zbudowane z dwóch cząsteczek cukru prostego), trisacharydy, tetrasacharydy, itd. o ogólnej nazwie oligosacharydów (połączenie od 2 do 10 cząsteczek monosacharydów). Charakter i właściwości powstałego cukru zależą od ilości połączonych monosacharydów, samych monosacharydów, z jakich zbudowany jest cukier złożony, rodzaju wiązania glikozydowego z punktu widzenia konfiguracji - lub - i wreszcie od miejsca ich połączenia, tzn. miejsca grupy wodorotlenowej jednego z monosacharydów, która utworzyła wiązanie glikozydowe (połączone mostkiem tlenowym) z grupą hydroksylową półacetalową drugiego monosacharydu.

Disacharydy

Disacharyd może być zbudowany z dwóch jednakowych lub różnych monosacharydów. Jeżeli w wiązaniu glikozydowym wzięły udział obie grupy hydroksylowe półacetalowe połączonych monosacharydów (jak ma to miejsce np. w sacharozie), to taki disacharyd nie wykazuje właściwości redukujących. Jeżeli w utworzonym disacharydzie jedna z grup hydroksylowych półacetalowych jest nadal wolna (np. w maltozie), to taki disacharyd wykazuje właściwości redukujące.

Do najczęściej spotykanych w przyrodzie disacharydów należą: sacharoza, maltoza, laktoza, celobioza, trehaloza.

Sacharoza. Zbudowana jest z jednej cząsteczki -D-glukozy i jednej cząsteczki -D-fruktozy połączonych wiązaniem β-2,1-glikozydowym i stąd jej nazwa -1-D-glukopiranozylo--2-D-fruktofuranozyd. Jest cukrem nieredukującym. Jest szeroko rozpowszechniona w przyrodzie.

Maltoza. Jest -glikozydem zbudowanym z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem -1,4 i stąd jej nazwa -1,4-D-glukopiranozylo-glukopiranozyd. Jest cukrem redukującym.

Celobioza. Jest -glikozydem zbudowanym z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem -1,4 i stąd jej nazwa -1,4-D-glukopiranozylo-glukopiranozyd. Jest cukrem redukującym.

Laktoza.. Zbudowana jest z galaktozy i glukozy połączonych wiązaniem -1 od strony galaktozy i stąd jej nazwa -1,4-D-galaktopiranozylo-glukopiranozyd. Jest cukrem redukującym.

Melibioza. Zbudowana z galaktozy i glukozy, połączonych wiązaniem -1 od strony galaktozy i stąd jej nazwa -1,6-D-galaktopiranozylo-glukopiranozyd. Jest cukrem redukującym.

Rafinoza, jest trisacharydem. Zbudowana jest z galaktozy, połączonej wiązaniem α-1,6 z glukozą, a ta wiązaniem -1--2 z fruktozą. Jest cukrem nieredukującym.

2.2.3. Polisacharydy

Polisacharydy zbudowane są z setek a nawet tysięcy połączonych ze sobą cząsteczek monosacharydów, tworząc jedną olbrzymią cząsteczkę. Ich skład z reguły przedstawia się wzorem sumarycznym: (C₆H₁₀O₅)_n. Są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Niektóre, jak skrobia i celuloza, spotykane są powszechnie u roślin. Do związków pokrewnych polisacharydom zalicza się także hemicelulozy, aminocukry i pektyny.

Skrobia jest szeroko rozpowszechniona w świecie roślinnym; jest zawarta w ziarnach zbóż i bulwach roślin. Skrobia jest mieszaniną dwóch polisacharydów: rozpuszczalnej w wodzie amylozy (około 20%) oraz nierozpuszczalnej w wodzie amylopektyny (około 80%).

Amyloza zbudowana jest z reszt α-D-glukopiranoz połączonych wiązaniem α-1,4-glikozydowym. Jej łańcuch nie jest rozgałęziony.

Amylopektyna, podobnie jak amyloza, zbudowana jest z reszt glukopiranozy połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. W przeciwieństwie do amylozy jest jednak rozgałęziona; od jej głównego łańcucha, co 24-30 reszt glukozowych, odchodzą łańcuchy boczne utworzone przez wiązania α-1,6-glikozydowe. Jej budowę można schematycznie przedstawić następująco:

Stopień spolimeryzowania amylozy wynosi od 250 do 1500 reszt glukozowych. Natomiast stopień spolimeryzowania amylopektyny waha się w szerokich granicach od 3 000 do 10 000 (przeciętnie 6000 reszt glukozowych).

Dekstryny są produktem częściowej hydrolizy skrobi. Biorąc pod uwagę ciężar cząsteczkowy można je uszeregować następująco:

Glikogen, zapasowy węglowodan zwierząt. Jego struktura przypomina amylopektynę, tyle że o bardziej rozgałęzionych łańcuchach; rozgałęzienie utworzone przez wiązania α-1,6-glikozydowe występuje co 8-12 reszt glukozowych ale łańcuchy boczne są krótsze.

Dekstran Jest polisacharydem bakteryjnym, w którym łańcuch główny zbudowany jest z cząsteczek α-D-glukozy połączonej ze sobą wiązaniami α-1,6-glikozydowymi. Zawiera również rozgałęzienia i łańcuchy boczne, które połączone są z rdzeniem wiązaniami α-1,2-, α-1,3- lub α-1,4-glikozydowymi w zależności od rodzaju bakterii go produkujących. Wiązania α-1-6-glikozydowe stanowią 90 - 95 % wiązań glikozydowych w dekstranie, chociaż występuje również dekstran, w którym wiązania α-1-6 stanowią poniżej 50 %.

Inulina. Jest polifruktozofuranozydem (należy do fruktanów) zbudowanym z około 30 reszt fruktozy połączonych ze sobą wiązaniem β-2,1-glikozydowym. Ponadto zawiera cząsteczkę glukozy przyłączoną wiązaniem β-2,1 glikozydowym do pierwszej fruktozy w łańcuchu.

Lewan, jest polifruktozofruktozydem. Reszty fruktozowe połączone są w nim ze sobą wiązaniami β-2,6-fruktofuranozowymi. Może być wytwarzany w medium podczas fermentacji żywności lub pasz dla zwierząt przez niektóre szczepy bakterii mlekowych (np. przez Lactobacillus reuteri).

Pullulan, polisacharyd zbudowany z cząsteczek maltotriozy połączonych wiązaniem α-1,6-glikozydowym. Schematycznie jego budowę można przedstawić następująco:

Błonnik roślinny to kompleks substancji ścian komórkowych roślin o budowie lignino-celulozowej. Jest substancją niejednorodną. Obejmuje frakcje polisacharydów takich jak celuloza, hemiceluloza, pektyny, gumy i kleje roślinne, polisacharydy roślin morskich (alginiany, agar, karaceny), skrobię oporną, jak i ligniny, nie będące węglowodanami. Surowy błonnik roślinny pochodzący z jadalnych części roślin (ewentualnie poddanych obróbce technologicznej) nazywany jest błonnikiem pokarmowym.

Celuloza. Pod względem chemicznym nie jest jednorodnym związkiem, lecz można ją zaklasyfikować do przynajmniej dwóch głównych klas, alfa i beta. β-Celuloza rozpuszcza się w 17% roztworze wodorotlenku sodowego, podczas gdy α-celuloza w tych warunkach jest nierozpuszczalna. α-Celulozę używa się do produkcji sztucznego włókna.

Budową przypomina amylozę z tym, że reszty glukozowe połączone są wiązaniem β-1,4-glikozydowym.

Hemicelulozy, są niejednorodną grupą polisacharydów występujących, obok celulozy i ligniny, w ścianach komórkowych roślin. Jest wiele różnych rodzajów hemiceluloz, przy czym wszystkie one składają się z połączonych wiązaniami ß-glikozydowymi różnych cukrów prostych tworzących rozgałęzione łańcuchy. Wśród hemiceluloz rozróżnia się ksylany (z D-ksylozą), galaktany (z D-galaktozą), arabany (L-arabinozą) oraz mannany (z D-mannozą). W skład hemiceluloz wchodzą również kwasy uronowe. Proporcje jednostek cukrowych w hemicelulozach oraz ich ukształtowanie przestrzenne i ilość bocznych łańcuchów mogą się różnić w zależności od źródła pochodzenia. Niektórzy jako odrębny komponent błonnika wyróżniają gumy, które od hemiceluloz odróżnia jedynie bardziej rozgałęziona budowa.

Przykładowo, ksylan, jest polisacharydem zaliczanym do pentozanów. Po hydrolizie daje D-ksylozę Niektóre ksylany, podobnie jak celuloza, mają strukturę liniową, inne - rozgałęzioną i dodatkowo zawierają cząsteczki L-arabinozy lub kwasu D-glukuronowego. Główny łańcuch zbudowany jest z reszt D-ksylopiranozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi, od którego odchodzą liczne rozgałęzienia - głównie przy węglach 2 i 3.

Pektyny zazwyczaj występują w postaci złożonego kompleksu zwanego protopektyną, którego skład schematycznie można przedstawić następująco:

araban_zmetoksylowany kwas poligalakturonowy_galaktan

Główną strukturę stanowi łańcuch zbudowany z reszt kwasu D-galakturonowego, połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. Grupy karboksylowe reszt kwasu galakturonowego są w mniejszym lub większym stopniu zestryfikowane alkoholem metylowym. Od węgli 2 i 3 głównego łańcucha odgałęziają się łańcuchy boczne.

Aminocukry. W przyrodzie znaleziono dwie pochodne aminowe cukrów: 2-deoksy-2-aminoglukozę (zwaną glukozoaminą lub glukozaminą) i 2-deoksy-2-aminogalaktozę (zwaną galaktozoaminą). Reszty N-acetylo-2-aminoglukozy połączone wiązaniem β-1,4-glikozydowym są podstawowym składnikiem chityny. Stąd chitynę uważa się za pochodną aminową celulozy acetylowaną przy azocie. D-Glukozoamina wchodzi również w skład kwasu hialuronowego, podstawowej substancji tkanki łącznej.

2.3. Aminokwasy, peptydy i białka

2.3.1. Aminokwasy

Wszystkie aminokwasy wchodzące w skład białek mają konfigurację L i należą do grupy aminokwasów, to znaczy mają grupę aminową przy węglu sąsiadującym z grupą karboksylową. Ogólny ich wzór jest następujący:

R - oznacza tzw. resztę aminokwasową (zwaną też łańcuchem bocznym lub rodnikiem).

Komórka w procesie biosyntezy białek wykorzystuje 20 różnych aminokwasów kodowanych w DNA. Poniżej podano ich wzory, a także wzory cystyny, hydroksylizyny i hydroksyproliny, które także są składnikami wielu białek, a nie posiadają kodu genetycznego.

Aminokwasy proteinogenne (spotykane w białkach)

Hydroksyprolina (Hyp) i hydroksylizyna (Lys-OH) występują w białkach typu kolagenu. Oba te aminokwasy nie są kodowane w DNA, tak że nie są one wbudowywane w syntetyzowany łańcuch białka podczas translacji. Powstają one w gotowych łańcuchach prokolagenu z proliny i lizyny pod działaniem odpowiednich dioksygenaz wbudowujących atom tlenu do tych aminokwasów (porównaj rozdział 2.3.3.2 - str. 38).

W skład niektórych białek enzymatycznych - m.in. peroksydazy glutationowej (EC 1.11.1.9) czy dehydrogenazy mrówczanowej (EC 1.2.1.2) u E. Coli - wchodzi również selenocysteina (Sec), która w ludzkim DNA nie ma przypisanego kodonu. Reszta selenocysteinowa powstaje przez modyfikację seryny związanej z cząsteczką tRNA(Ser) i włączana jest do białek kotranslacyjnie. U pewnej liczby drobnoustrojów selenocysteina kodowana przez kodon UGA. Ponieważ zwyczaj jest to kodon „stop”; dekodowanie UGA na selenocysteinę wymaga spełnienie w komórce podczas translacji kilku specjalnych warunków (m.in. specyficznej struktury drugorzędowej mRNA selenoprotein).

Tyroksyna i trijodotyronina pochodne nie występującej w przyrodzie tyroniny, występują jedynie w tyreoglobulinie, hormonalnym białku tarczycy.

Aminokwasy niekodowane w DNA i niebiałkowe

W organizmach żywych występują również aminokwasy nie będące składnikami białek. Β-alanina, karnityna oraz N-metylohistydyna są aminokwasami biologicznie czynnymi lub też są składnikami biologicznie czynnych substancji niskocząsteczkowych. Homocysteina i homoseryna są metabolitami pośrednimi przemian metioniny i cysteiny. Kwas β-aminomasłowy jest produktem końcowym rozkładu nukleotydów pirymidynowych. Z kolei ornityna i cytrulina biorą udział w syntezie mocznika.

Aminokwasy o konfiguracji D występują w przyrodzie rzadko i to wyłącznie w związkach względnie prostych, nie będącymi białkami (np. w niektórych antybiotykach pochodzenia bakteryjnego o budowie peptydowej).

W komórkach organizmach żywych mogą ponadto pojawiać się sporadycznie nietypowe aminokwasy (np. kwas 2-aminomukonowy) powstające w wyniku procesów biodegradacji toksycznych związków azotowych (np. aniliny), które dostały się do środowiska bytowania organizmu i wniknęły do komórki.

I na koniec jeszcze jedna uwaga. W laboratoriach sztucznie otrzymuje się całą gamę aminokwasów nie spotykanych w przyrodzie ożywionej. Z ich wykorzystaniem np. do produkcji leków wiąże się duże nadzieje. Wiele z nich może być jednak toksycznych dla żywych organizmów.

Podział α-aminokwasów

Poszczególne α-aminokwasy różnią się strukturą rodnika R. Stosuje się różne kryteria ich podziału Rozróżnia się aminokwasy alifatyczne i aromatyczne, a w zależności od ilości grup aminowych i karboksylowych aminokwasy mono- lub di- aminowe lub karboksylowe. Reszty aminokwasów cysteiny i metioniny w swojej budowie zawierają atom siarki (są to aminokwasy siarkowe). Reszty waliny, leucyny i izoleucyny posiadają rozgałęziony łańcuch alifatyczny (aminokwasy rozgałęzione). Prolina jest z kolei iminokwasem (kwasem pirolidyno-karboksylowym).

Często aminokwasy dzieli się biorąc pod uwagę hydrofobowość lub hydrofilowość łańcucha bocznego. Aminokwasy z niepolarnymi rodnikami węglowodorowymi (glicyna, alanina, walina, leucyna i izoleucyna) lub zawierające grupę funkcyjną o znikomej polarności (prolina, fenyloalanina, tryptofan, metionina i cystyna) zalicza się do aminokwasów hydrofobowych.

Z punktu widzenia wartości pokarmowych (dietetycznych) aminokwasy dzieli się na egzogenne (niezbędne) i endogenne (nie niezbędne). Aminokwasy egzogenne muszą być dostarczone organizmowi zwierzęcemu z zewnątrz (np. z pokarmem), z uwagi na zanik zdolności do ich syntetyzowania. Dla człowieka niezbędnymi aminokwasami są walina, leucyna, izoleucyna, fenyloalanina, tryptofan, treonina, metionina i lizyna.

Właściwości fizyko-chemiczne α-aminokwasów

Szczegółowa wiedza na temat właściwości fizyko-chemicznych α-aminokwasów dostępna jest w popularnych podręcznikach chemii i biochemii oraz w skondensowanej formie w instrukcji do ćwiczeń laboratoryjnych z biochemii.

2.3.2. Peptydy

Grupa aminowa jednego α-aminokwasu może reagować z grupą karboksylową^* innego α-aminokwasu tworząc wiązanie peptydowe -CO-NH-, które z chemicznego punktu widzenia jest szczególnym przypadkiem wiązania amidowego (co ma pewne znaczenie, z uwagi na specyficzność działania niektórych enzymów). Związki powstałe z takiego połączenia nazwano peptydami.

Podane wyżej równanie przedstawia jedynie schemat syntezy peptydu i jego uproszczony wzór, nie uwzględniający budowy przestrzennej.

2.3.2.1. Budowa peptydów - wiązanie peptydowe

Badania krystalograficzne wykazały, że wiązanie C-N w wiązaniu peptydowym jest znacznie krótsze niż zwyczajne pojedyncze wiązanie tego typu. Jest to spowodowane, mezomerycznym charakterem wiązania peptydowego (hybrydyzazja typu sp²). Wynikiem tej mezomerii jest brak swobodnego obrotu wokół wiązania C - N i stąd istnienie tylko dwóch stabilnych konformacji cis i trans. Ogólnie w natywnych peptydach i białkach występuje głównie forma trans.

Zgodnie z tym właściwsze jest przedstawianie wiązania peptydowego za pomocą dwu wzorów granicznych lub wzorem, na którym symbolicznie zaznaczono delokalizację elektronów.

Z badań rentgenograficznych wynika, że konfiguracja wiązania peptydowego nie zależy od rodzaju i właściwości łańcuchów bocznych aminokwasów tworzących wiązanie. Wyjątek pod tym względem stanowi prolina i hydroksyprolina, których grupy iminowe związane są z łańcuchami bocznymi.

Delokalizacja elektronów w wiązaniu peptydowym sprawia, że wszystkie cztery jego atomy: _CO_NH_ a również i oba atomy C^α łańcuchów bocznych, leżą w jednej płaszczyźnie (mówi się o planarności wiązania peptydowego). W konsekwencji wiązanie łączące atom węgla i azotu wykazuje znaczną sztywność właściwą wiązaniu podwójnemu, a swobodny obrót wokół niego wymaga przezwyciężenia oporu około 88 kJ/mol. Na poniższym rysunku przedstawiono perspektywicznie strukturę wiązania peptydowego w hipotetycznym tripeptydzie.

Drugim ważnym wiązaniem kowalencyjnym, spotykanym w cząsteczkach peptydów, jest wiązanie disulfidowe (disiarczkowe), tworzone przez sąsiadujące ze sobą grupy tiolowe - SH pochodzące z reszt cysteiny. Rozróżnia się wewnątrzłańcuchowe wiązania disulfidowe, które występują w tym samym łańcuchu peptydowym, oraz międzyłańcuchowe wiązania disulfidowe występujące między dwoma różnymi łańcuchami peptydowymi:

Wewnątrzcząsteczkowe wiązania S - S występują, np. w oksytocynie, wazopresynie, w łańcuchu A insuliny i w rybonukleazie. Wiązania te mogą spowodować, że części cząsteczki o zupełnie różnych sekwencjach znajdują się w bezpośrednim zbliżeniu, jak np. w rybonukleazie. W utlenionej formie glutationu dwa identyczne łańcuchy peptydowe połączone są przez kowalencyjne wiązanie disulfidowe. W insulinie w ten sam sposób połączone są dwa różne łańcuchy.

Sąsiadujące ze sobą wiązania peptydowe, np. w dwu równoległych peptydach, mogą tworzyć wiązania wodorowe >CO···HN<, w których odległość atomu tlenu od atomu azotu wynosi nieco mniej niż 0,3 nm.

Oprócz tych wiązań, czynnikami mającymi wpływ na przyjęcie przez cząsteczkę peptydu określonej konformacji są oddziaływania kwasowych, zasadowych, aromatycznych i alifatycznych łańcuchów bocznych różnych aminokwasów ze sobą lub z łańcuchem głównym peptydu. Te oddziaływania, zwykle stabilizujące, staja się w pełni efektywne dopiero w białkach, niemniej mają one także znaczenie dla utrzymania odpowiednich efektywnych konformacji wielu polipeptydów biologicznie aktywnych.

2.3.2.2. Nazwy i wzory peptydów

Nazwy peptydów są tworzone w zależności od liczby rodników aminoacylowych tworzących cząsteczkę peptydu. Peptyd zbudowany z dwu aminokwasów nazywa się dipeptydem, z trzech — tripeptydem, z dziesięciu — dekapeptydem, itp. Peptydy zawierające w cząsteczce do 10 rodników aminoacylowych nazywa się oligopeptydami, zawierające zaś większą liczbę — polipeptydami. Te ostatnie stanowią przejście do białek (zaliczanych do makropeptydów), których cząsteczki są zbudowane ze 100 i więcej rodników aminoacylowych.

Tabela 2.2. Nazwy i symbole najpospolitszych α-aminokwasów

Rodnik aminoacylowy	Symbol	Rodnik aminoacylowy	Symbol
Alanyl Arginyl Aspargil Asparginyl Cysteil Cysteinyl Fenyloalanyl Glicyl Glutamil Glutaminyl Histydyl Hydroksylizyl	Ala Arg Asp Asn lub Asp(NH2) Cys Cys_Cys^1 Fen (Phe) Gli (Gly) Glu Gln lub Glu(NH2) His Hyl lub Liz(OH)	Hydroksyprolil Izoleucyl Leucyl Lizyl Metionyl Ornityl Prolina Seryl Treonyl Tryptofanyl Tyrozyl Walil	Hyp lub Pro(OH) Ileu (Ile) Leu Liz (Lys) Met Orn Pro Ser Tre (Thr) Try (Trp) Tyr Wal (Val)

W nawiasach podano symbole zalecane przez Unię Biochemiczną.

¹ również Cys Cys

Szczegółowe nazwy peptydów są albo zwyczajowe, albo mają charakter systematycznych nazw chemicznych określających je jako aminoacyloaminokwasy. Na przykład tripeptyd zbudowany z glicyny, alaniny i cysteiny nosi nazwę glicyloalanylocysteiny. Nazwa ta podaje skład aminokwasowy peptydu i jednocześnie kolejność łączenia się aminokwasów. I tak tripeptyd wspomniany wyżej jest zupełnie różnym od alanyloglicylocysteiny, peptydu zbudowanego z identycznych aminokwasów, ale połączonych w innej kolejności.

W celu uproszczenia zapisywania wzorów peptydów i uniknięcia długich nazw, ustalono, by rodniki aminoacylowe oznaczać pierwszymi trzema literami nazwy aminokwasu. W tabeli 1.2 podano nazwy i symbole rodników najpospolitszych α-aminokwasów.

Przy pisaniu wzorów peptydów symbole łączy się krótką kreską, przy czym lewa strona symbolu odpowiada grupie aminowej, a jego prawa strona - grupie karboksylowej. Wzory przytoczonych wyżej tripeptydów można więc zapisać symbolicznie: Gli-Ala-Cys oraz Ala-Gli-Cys. Jeżeli zachodzi specjalna potrzeba wyraźnego wskazania kierunku, w jakim połączone są ze sobą cząsteczki aminokwasów w peptydzie (np. przy przedstawianiu struktury peptydów pierścieniowych) wówczas zaznacza się strzałką → kierunek powstawania wiązań od grupy karboksylowej do aminowej: Gli→Ala→Cys. Jeżeli kolejność łączenia się aminokwasów nie jest znana dla jakiegoś fragmentu łańcucha polipeptydowego, to fragment ten ujmuje się w nawiasy, wewnątrz których symbole oddziela się przecinkami, np. Gli-Ala-Cys-(Arg, Tyr, Leu)-Pro-Ala-Fen. Końcowy aminokwas z wolną grupą aminową, tzw. N-terminalny aminokwas, symbolizuje się dopisaniem litery H- lub H₂N-, zaś końcowy aminokwas z wolną grupą karboksylową, czyli C-terminalny aminokwas, dodaniem liter -OH lub -COOH: H-Gli-Ala-Cys-OH lub H₂N-Gli-Ala-Cys-COOH.

2.3.2.3. Ważniejsze peptydy naturalne

W ciągu ostatnich 20 lat liczba peptydów znalezionych w materiale zwierzęcym, roślinnym i bakteryjnym ogromnie wzrosła. Większość znajdowanych w przyrodzie peptydów składa się wyłącznie z aminokwasów, które zwykle spotykamy w białkach. Jednak w naturalnych peptydach często występują inne proste aminokwasy, takie jak β-alanina i kwas γ-aminomasłowy.

Najprostszym i jednocześnie najwcześniej poznanym dipeptydem wyodrębnionym z tkanek była karnozyna, czyli β-alanylohistydyna. Obok niej w mięśniach kręgowców spotyka się także anserynę: β-alanylo-N-metylohistydynę. Rola obydwu dipeptydów jest do dzisiaj nie poznana.

Glutation (GSH) jest tripeptydem, który szeroko rozpowszechniony jest w zarówno w tkankach zwierzęcych jak i roślinnych. Zawiera on kwas glutaminowy, cysteinę i glicynę. Był pierwszym znanym peptydem zawierającym wiązanie inne niż α-peptydowe.

Związek ten łatwo ulega odwracalnym przemianom oksydacyjno-redukcyjnym. Reakcja utlenienia jest katalizowana solami Cu i Fe. Redukcja disulfidu i przekształcenie do GSH katalizowane jest przez reduktazę glutationową.

Funkcje biochemiczne glutationu są bardzo różne. Jest to koenzym hydrolazy hydroksyacyloglutationowej, dehydrogenazy formaldehydowej, tautomerazy indolilopirogronianowej, izomerazy maleiloacetooctanowej i innych enzymów. Stanowi on również grupę prostetyczną dehydrogenazy fosfogliceroaldehydowej oraz odgrywa pewną rolę w działaniu dehydrochlorynazy DDT, którą odkryto w odpornych na DDT muchach domowych. Glutation jest także bardzo ważnym związkiem w wielu biologicznych reakcjach redox, ponieważ może stabilizować wolne grupy - SH.

Biosynteza glutationu zachodzi następująco:

Glu + Cys +ATP → Glu(Cys) + ADP + H₃PO₄ I

Gly + Glu(Cys) + ATP → Glu(Cys-Gly) + ADP + H₃PO₄ II

Reakcja I jest katalizowana przez syntetazę γ-glutamylocysteinową, a reakcja II przez syntetazę glutationową.

Hormony peptydowe

Hormony są substancjami chemicznymi, produkowanymi w specjalnych organach lub tkankach i przynoszonymi do miejsca działania poprzez układ krwionośny. Ta chemicznie zróżnicowana grupa substancji - regulatorów, między innymi, obejmuje pewną liczbę peptydów i białek. Znaczna liczba hormonów peptydowych i białkowych produkowana jest w gruczołach wydzielania wewnętrznego (podwzgórze, przysadka, tarczyca, przytarczyce, komórki Langerhansa w trzustce, itp.). Pozostała część jest produkowana w specjalnych tkankach. Na tej podstawie rozróżniamy hormony gruczołowe i tkankowe.

Wiele ze znanych hormonów peptydowych ma prekursory białkowe, z których w skutek działania enzymów następuje uwalnianie aktywnych związków. Typowymi przykładami są angiotensyna, bradykinina, kalidyna i insulina. Przypuszcza się, że podobne metaboliczne prekursory istnieją dla wazopresyny, gastryny, glukagonu, hormonu paratyreotropowego i ACTH. Najpierw, na rybosomach zachodzi synteza biologicznie nieaktywnych prekursorów o dużej masie cząsteczkowej. Następnie jeden lub więcej enzymów uwalnia hormony lub prohormony. Okres półtrwania wolnych hormonów nie przekracza zwykle 30 min. Są one dezaktywowane przez różne egzo i endopeptydazy.

Angiotensyna II zaliczana do oligopeptydów jest oktopeptydem wytwarzanym w nerkach o wzorze: H-Asp-Arg-Wal-Tyr-Ileu-His-Pro-Fen-OH. Hormon ten powoduje wzrost ciśnienia krwi i pobudza wytwarzanie hormonów kory nadnercza. Jest to jeden z najefektywniejszych regulatorów ciśnienia krwi. Związek ten wywołuje silny skurcz naczyń krwionośnych, przez co automatycznie zwiększa się ciśnienie krwi.

Peptydy regulacyjne

Od czasów odkrycia pierwszych hormonów rośnie stale liczba „chemicznych posłańców”, czyli związków niosących określoną informację biologiczną od komórek wydzielniczych do komórek docelowych. Ostatnie 20 lat przyniosło wiele doniesień na temat nieznanych dotąd peptydów o aktywności: hormonalnej, neuromodulacyjnej, immunoregulacyjnej i mitogennej. Wszystkie te peptydy określane są często wspólną nazwą peptydów regulacyjnych.

Przyjmuje się obecnie trzy podstawowe sposoby przekazywania informacji międzykomórkowej z udziałem peptydów regulacyjnych: endokrynny, parakrynny i autokrynny.

Transport endokrynny, w którym peptyd syntetyzowany przez wyspecjalizowane komórki wydzielany jest do krwioobiegu i przenoszony z krwią do komórek docelowych. Ten sposób transportu jest typowy dla hormonów dokrewnych.

Hipoteza transportu parakrynnego zakłada, że peptydy regulacyjne przenoszone są w drodze dyfuzji międzykomórkowej. Przypuszczalnie wiele peptydów działa lokalnie tą drogą. Podobny sposób transportu (neuroparakrynny) przyjmuje się w przypadku przenoszenia sygnału przez synapsy chemiczne w obrębie układu nerwowego.

Hipoteza regulacji autokrynnej przyjmuje, że komórkami docelowymi są te same komórki, które syntetyzują peptyd regulacyjny. Regulacja autokrynna ma przypuszczalnie istotne znaczenie w kontroli wzrostu komórek neoplastycznych, aczkolwiek autoregulacja jest zjawiskiem stwierdzonym wielokrotnie w hodowlach komórek nietransformowanych.

Antybiotyki o budowie peptydowej

Liczne antybiotyki wytwarzane przez mikroorganizmy mają budowę peptydową. Niektóre z nich produkowane są na skalę przemysłowa w oparciu o wgłębną hodowlę bakterii Bacillus. Jako przykład można wymienić gramicydynę S, pierścieniowy dziesięciopeptyd wytwarzany przez Bacillus brevis. Gramicydynę S stosuje się jako składnik maści i roztworów używanych zewnętrznie do leczenia owrzodzeń oraz zainfekowanych ran i oparzeń.

Bakterie Bacillus brevis wytwarzają jeszcze inne antybiotyki, m.in. tyrocydyny A, B i C, będące również cyklicznymi oligopeptydami, zawierającymi -D-fenyloalaninę, podobnie jak gramicydyna S. Znanych jest obecnie ponad 25 antybiotyków wytwarzanych przez różne szczepy tych bakterii.

Innym przykładem antybiotyku o budowie peptydowej jest bacytracyna, wytwarzana na skalę przemysłową (m.in. w PZF „POLFA” w Pabianicach) w oparciu o hodowlę bakterii Bacillus subtilis.

Poszczególne szczepy bakterii Bacillus subtilis produkują ponad 65 antybiotyków o budowie polipeptydowej. Z kolei Bacillus polymyxa wytwarza polimyksyny. Wszystkie te antybiotyki działają na bakterie gramujemne, gramdodatnie i grzyby. Ich działanie jest różne. Niektóre blokują syntezę ściany komórkowej lub zakłócają funkcje błon biologicznych, inne, mniej liczne, zakłócają replikację, transkrypcję lub translację.

Aktynomycyny (nazywane chromopeptydami gdyż zawierają chromofor) są bardzo toksycznymi antybiotykami produkowanymi przez różne gatunki Streptomyces. Wydzielono i wykrystalizowano więcej niż 20 różnych związków należących do tej grupy. Różnią się one jedynie sekwencja aminokwasową układu cyklicznego zbudowanego z dwóch pierścieni laktonowych przyłączonych do aktynocyny wiązaniami amidowymi. W tej grupie antybiotyków, aktynomycyna C₁ wykazuje najsilniejsze działanie przeciwbakteryjne.

Penicylina jest najstarszym i najlepiej poznanym antybiotykiem - mówi się o niej, że jest prototypem antybiotyków. Jej budowa ma jednak mało wspólnego z peptydami, tym niemniej rozpatruje się ją przy okazji omawiania antybiotyków o budowie peptydowej. W niektórych publikacjach mówi się o pseudopeptydowej budowie penicyliny:

Wytwarzana jest przez pleśń Penicillium notatum. Biogeneza jej wynika z połączenia waliny oraz cysteiny. W jej cząsteczce występuje silnie napięty czteroczłonowy pierścień β-laktamowy oraz drugi pierścień zawierający siarkę. Grupa aminowa cysteiny jest N-acylowana, przy czy rodnik R kwasu acylującego może mieć różną naturę. Np. benzylopenicylina zawiera rodnik benzylowy.

Depsipeptydy

Nazwa depsipeptyd, jest kombinacją terminów depsyd (ester hydroksykwasu) i peptyd. Nazwę tę zaproponował Szemiakin w 1953 roku w celu określenia związków, które zawierają zarówno wiązania estrowe jak i peptydowe.

R₁ R₂ R₁ R₂ R₁

│ │ │ │ │

- NH - CH - CO - O - CH - NH - CH - CO - O - CH - CO - NH - CH - CO -

R₁- reszty aminokwasu

R₂ - reszta hydroksykwasu

Związki cykliczne tego rodzaju wykryto w dużych ilościach w mieszaninie produktów metabolizmu bakterii. Wykazują one zadziwiająco duża aktywność antybiotyczną. Szersze zastosowanie tych związków w medycynie jest ograniczone ze względu na to, że wiązania estrowe bardzo łatwo ulęgają rozszczepieniu w warunkach sprzyjających hydrolizie.

Do depsipeptydów, zawierających wyłącznie aminokwasy (często także ich pochodne N-metylowe i D-aminokwasy) i hydroksyaminokwasy, zaliczamy: eniatyny, amidomycynę, walinomycynę, sporydesmolidy, serratomolid i esperynę.

W innych depsipeptydach mogą istnieć wiązania estrowe utworzone z udziałem grup hydroksylowych hydroksyaminokwasów, takich jak seryna i treonina. Depsipeptydy mogą także zawierać skomplikowane jednostki strukturalne, których nigdy nie wykryto w białkach. Do tej grupy należą: pektynomycyny, etamycyna i echinomycyna. Depsipeptydy w zależności od ich struktury dzieli się na O-peptydy, peptolidy i laktony peptydowe.

Najprostszym, występującym w przyrodzie depsipeptydem jest fitopatogenetyczna toksyna z Pseudomonas tabaci. Cząsteczka tego związku składa się z cząsteczek kwasu mlekowego i 2,5-diaminoadypinowego, związanych ze sobą w taki sposób, że powstaje pierścień dioksomorfolinowy:

Struktura innego depsipeptydu, amidomycyny jest do tej pory nie wyjaśniona. Wiadomo tylko, że depsipeptyd ten składa się z kwasu D-hydrosywalerianowego i D-waliny. Jego działanie antybiotyczne polega na hamowaniu wzrostu niektórych mikroorganizmów wywołujących choroby roślin oraz niektórych typów drożdży.

Walinomycyna, nazywana tak ze względu na dużą zawartość waliny, jest cyklicznym dwunastopeptydem. Działa ona na M.tuberculosis

Serratomolid, cykliczny tetradepsipeptyd, oraz esperyna zawierają β-hydroksykwasy. W wyniku całkowitej hydrolizy serratomolidu stwierdzono, że zawiera on L-serynę i kwas D-β-hydroksydekanowy.

Protaminy

Do peptydów zalicza się również protaminy, polipeptydy o masie cząsteczkowej rzędu 1÷6 kDa wyizolowane z jąder plemników ryb. Zawierają one znaczne ilości argininy, przekraczające połowę wszystkich aminokwasów w cząsteczce, stąd wybitnie zasadowe właściwości.

Toksyny peptydowe

Śmiercionośne toksyny zawarte w kapeluszu muchomora Amanita phalloides dzieli się na fallatoksyny (falloidyna, falloina i fallacydyna) i amatoksyny (α-, β-, γ- amanidyny), które są bardziej toksyczne, ale działają wolniej. Związki te są cyklicznymi siedmiopeptydami.

Fallacydyna zamiast jednostki Ala-D-Thr, wchodzącej w skład falloidyny, zawiera kwas Val-D-erytro-β-hydroksyasparaginianowy.

Amatoksyny, które składają się wyłącznie z L-aminokwasów są także siedmiopeptydami cyklicznymi. Zamiast grupy tioeterowej występuje grupa sulfotlenkowa. O toksyczności stanowi obecność grupy γ - hydroksylowej w łańcuchu bocznym izoleucyny. Amanulina nie zawiera tej grupy hydroksylowej i mimo to, że pod względem struktury jest bardzo podobna do γ-amatyliny, jest nietoksyczna.

Można się całkowicie zabezpieczyć przed działaniem tych toksyn jedynie wtedy, gdy w tym samym czasie, co toksynę spożyje się odpowiednią dawkę antamanidyny. Zabezpieczające działanie antamanidyny i niektórych jej analogów związane jest z ich działaniem na błony. Związki te tworzą kompleksy z jonami K⁺ i Na⁺, analogicznie do tworzenia eniatyny i walinomycyny.

Peptydy strepogeninowe

Strepogeniny pobudzają wzrost bakterii, głównie bakterii kwasu mlekowego. Ich obecność stwierdzono np. w ekstraktach z wątroby, soku pomidorowym i częściowych hydrolizatach enzymatycznych, uzyskanych z insuliny, kazeiny, rybonukleazy, itp.

Wzorcową jednostka aktywności strepogeninowej jest przyrost tempa wzrostu Lactobacillus casei, spowodowany przez działanie 1 mg wzorcowego ekstraktu z wątroby. Aktywność strepogeninowa produktów syntetycznych związana jest z obecnością cysteiny. Najwyższą aktywność stwierdzono w przypadku, gdy cysteina jest albo powiązana z N-końcową leucyną, albo umieszczona między dwoma resztami leucynowymi.

Peptydy endorfinowe

Endorfiny to peptydy będące ligandami receptorów opiatowych, tzn. działających podobnie jak morfina. Najważniejsze z nich - enkefaliny - są pentapeptydami. Obok naturalnie znajdowanych enkefalin (np. Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu), w ostatnim czasie wytwarzane są syntetyczne ich analogi:

2.3.3. Białka (proteiny)

Białka, w zasadzie, są olbrzymimi polipeptydami (makropeptydami). Jako kryterium podziału pomiędzy polipeptydami a białkami umownie przyjmuje się ilość aminokwasów wchodzących w ich skład. Związki zbudowane z ponad 100 aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi zalicza się do białek. Poprawniejsze jest jednak założenie, że masa cząsteczkowa białek jest większa od 10 kDa. Jednakże, w kilku przypadkach, o przynależności do klasy białek decydują właściwości polipeptydu i jego biologiczna funkcja. Ta koncepcja podziału ma coraz więcej zwolenników. Rozwiązuje wiele sprzecznych i problematycznych przypadków. Na przykład, wspomniane w poprzednim rozdziale protaminy, pomimo masy cząsteczkowej od 1000Da do 6000Da, wygodnie i rozsądniej jest rozpatrywać w kategorii białek.

Składnikami większości białek zwykle jest 20 różnych aminokwasów w rozmaitych kombinacjach (a ściślej permutacjach), plus Pro(OH) i Liz(OH) w kolagenie oraz cystyna powstająca z dwóch cystein połączonych mostkiem disiarczkowym. Charakterystyczne jest, że wszystkie aminokwasy występujące w białkach mają konfigurację L. Warto zauważyć, że już z 4 różnych aminokwasów można otrzymać 24 różne peptydy. Różną kolejnością wiązania się poszczególnych aminokwasów (tzw. sekwencją aminokwasów), tłumaczy się zjawisko ogromnej różnorodności białek, zarówno pod względem właściwości fizycznych, chemicznych i biologicznych. Struktura przestrzenna białek zdeterminowana jest właśnie sekwencją aminokwasów (a tak na marginesie, ta z kolei zdeterminowana jest sekwencją nukleotydów w DNA).

Białka można podzielić na dwie zasadnicze grupy: proteiny i proteidy.

Proteiny to białka właściwe (inaczej, białka proste), wśród których można wyróżnić:

albuminy - białka rozpuszczalne w wodzie i w rozcieńczonych roztworach soli; występują w białku jaj ptasich oraz w nasionach roślin strączkowych,

globuliny - występują w surowicy krwi, w nasionach roślinnych oraz tkance mięśni,

prolaminy i gluteliny - to są białka wyłącznie roślinne,

skleroproteiny -z kolei białka wyłącznie zwierzęce; wśród których dalej można wyróżnić:

kolagen - zasadniczy składnik białkowy tkanki kostnej,

keratyna - główny składnik substancji rogowatych (włosy, paznokcie, skóra),

elastyna - główny składnik komórek w tkankach elastycznych.

Proteidy to białka złożone, zawierające oprócz aminokwasów składniki chemiczne niebiałkowe (tzw. grupy prostetyczne). Do proteidów zalicza się m.in.:

nukleoproteidy - główny składnik białkowy jąder żywych komórek,

glikoproteidy - związki białek właściwych z węglowodorami,

lipoproteidy - połączenia białek z tłuszczami,

chromoproteidy - połączenia białek z barwnymi związkami (np. flawoproteidy).

metaloproteidy - połączenie białka z jonami metali.

Wiele białek będących enzymami należy do proteidów. W skład ich centrum katalitycznego wchodzą witaminy lub atom metalu. Enzymy, z uwagi na ich rolę i specyficzne właściwości zostaną omówione oddzielnie w dalszej części podręcznika.

W zależności od budowy przestrzennej cząsteczki białka dzieli się na dwie podstawowe grupy:

1. białka fibrylarne (włókienkowe),

2. białka globularne (kuliste).

Umownym kryterium tego podziału jest stosunek liczbowy osi dłuższej (l) cząsteczki białka do osi krótszej (d). Białka, dla których ten stosunek osiowy ma wartość nie większą niż 20 (l/d<20), zalicza się do białek globularnych. Ich rozmiary są rzędu kilku do kilkunastu tysięcy nm. Ich kształt przypomina elipsoidy obrotowe. Kuliste cząsteczki spotyka się rzadko, głównie w przypadku lipoproteidów.

Białka o stosunku osiowym większym od 20 (l/d>20) zalicza się do fibrylarnych. Długość ich cząsteczek przekracza nierzadko sto tysięcy nm, przy średnicy włókna nie większej niż kilkaset nm.

2.3.3.1. Zasady organizacji strukturalnej cząsteczek białek

Cząsteczka białka stanowi trójwymiarowe ułożenie jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych. Jej przestrzenna struktura jest hierarchicznie uporządkowana i można w niej wyróżnić cztery poziomy uporządkowania, z których każdy wykazuje odmienność i zależność od różnych typów wiązań między atomami. W latach pięćdziesiątych Lindestrom Lang badając budowę białek wprowadził pojęcie ich struktury pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowej później uzupełnione o strukturę czwartorzędową.

Poziom I (czyli struktura pierwszorzędowa) w hierarchicznym skonstruowaniu cząsteczki białkowej determinuje poziomy następne (tzw. strukturę wtórną), czyli strukturę przestrzenną danego białka zwaną też konformacją łańcuchową, która z kolei decyduje o jego funkcji biologicznej.

Struktura I-rzędową mówi o kolejności, czyli sekwencji aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Ta struktura uwarunkowana jest wiązaniami peptydowymi. W strukturze pierwszorzędowej uwzględnia się również położenie wszystkich innych wiązań kowalencyjnych. Są to głównie wiązania disiarczkowe między resztami cysteiny, sąsiadującymi ze sobą w przestrzeni.

Struktura II-rzędowa białka określa przestrzenne wzajemne ułożenie płaszczyzn wiązań peptydowych (ściśle biorąc, atomów tworzących te wiązania).

Uwarunkowana jest przede wszystkim wiązaniami wodorowymi głównie między grupami karbonylowymi i aminowymi łańcucha polipeptydowego oraz planarnością wiązania peptydowego. Można rozpatrywać tę strukturę jako lokalne uporządkowanie w przestrzeni fragmentów łańcucha peptydowego o identycznej konformacji. Elementami tej konfiguracji w białkach globularnych mogą być: α- helis, struktura β-fałdowa oraz zakręty. W kolagenie indywidualnie występuje struktura kolagenu.

Struktury α-helis, β-fałdowa i kolagenu zostaną szczegółowo przedstawione w dalszej części podręcznika przy okazji omawiania białek fibrylarnych. Zakręt beta (β-zakręt) jest to element struktury drugorzędowej łańcucha polipeptydowego zapewniający zmianę - odwrócenie - kierunku w jego przebiegu. Ma postać ciasnej pętli, w której tlen z grupy karbonylowej jednego aminokwasu jest połączony wiązaniem wodorowym z wodorem grupy aminowej czwartego z kolei aminokwasu. Regiony łańcucha polipeptydowego pozbawione regularnej struktury drugorzędowej chętnie przyjmują postać zakrętu beta. Taką postać może przyjąć nawet połowa łańcucha polipeptydowego typowego białka.

Struktura III-rzędowa cząsteczki białka lub jej podjednostki określa ułożenie w przestrzeni łańcucha polipeptydowego (a ściślej, rozlokowanie w przestrzeni wszystkich jego atomów). To przestrzenne upakowanie łańcucha polipeptydowego wywołane jest wewnątrz cząsteczkowymi wzajemnymi oddziaływaniami łańcuchów bocznych aminokwasów oraz miedzy tymi łańcuchami a cząsteczkami wody. Czynnikami warunkującymi powstawanie i utrzymywanie w białkach struktury III-rzędowej są wiązania chemiczne wszystkich typów, w tym wspomniane wcześniej wiązanie disiarczkowe i wodorowe, a ponadto oddziaływania jonowe, hydrofobowe i siły van der Waalsa.

Struktura IV-rzędowa jest to sposób ułożenia w przestrzeni kilku łańcuchów polipeptydowych stanowiących podjednostki cząsteczki białka oraz zespół oddziaływań między nimi

Czynniki strukturotwórcze białek

Rola wiązań peptydowych w budowie białek jest oczywista. Omówione teraz zostaną krótko wszystkie pozostałe wiązania i oddziaływania chemiczne ogrywające rolę w powstawaniu i utrzymaniu właściwej konformacji łańcucha polipeptydowego cząsteczki białka. Kolejność ich omawiania wynika z roli i znaczenia, jakie pełnią.

Oddziaływania hydrofobowe (efekt hydrofobowy). Cząsteczki niepolarne nie zawierają spolaryzowanych wiązań ani atomów - powoduje to, że są one nierozpuszczalne w wodzie. Właściwość tą nazywa się hydrofobowością. W środowisku wodnym oddziaływanie z polarnymi cząsteczkami H₂O doprowadzi do takiego układu, w którym fragmenty hydrofobowe będą "unikały" kontaktu z wodą grupując się razem, natomiast części hydrofilowe "chętnie" będą z nią oddziaływać. Źródłem energii oddziaływań hydrofobowych jest niechęć cząsteczek wody zwiększenia stopnia organizacji.

Efekt tych oddziaływań sprawia, że syntetyzowany wewnątrz komórki w środowisku wodnym łańcuch polipeptydowy fałduje się spontanicznie w ten sposób, że większość jego hydrofobowych rodników bocznych (przede wszystkim waliny, leucyny, izoleucyny, alaniny i fenyloalaniny) zostaje skierowana do wnętrza powstającej struktury, a większość jego polarnych, obdarzonych ładunkiem bocznych łańcuchów znajduje się na powierzchni.

Wiązania disiarczkowe (mostki disiarczkowe). Najsilniejszym wiązaniem (pomijając peptydowe) jest kowalencyjne wiązanie disiarczkowe(SS) powstające pomiędzy dwoma grupami —SH sąsiadujących ze sobą w przestrzeni dwóch reszt cysteiny w tym samym łańcuchu lub łącząc dwa różne łańcuchy.

Energia wiązania disiarczkowego wynosi 300 kJ/mol, a odległość między atomami siarki S—S jest nie większa niż 0,15nm.

Wiązanie to odgrywa znaczną rolę jako czynnik strukturotwórczy keratyn, łącząc między sobą sąsiadujące łańcuchy polipeptydowe, jednocześnie uodparniając te białka na działanie czynników chemicznych. W cząsteczce β-keratyny ilość tych wiązań może sięgać nawet kilkudziesięciu.

Natomiast w białkach globularnych mostek disiarczkowy odgrywa jedynie rolę strukturotwórczą w odniesieniu do pewnych fragmentów łańcucha polipeptydowego. Bez wątpienia usztywnia jednak kształt tych białek i zwiększa ich termostabilność. W wielu enzymach reszty cysteiny tworzące mostki disiarczkowe pełnią rolę aminokwasów pomocniczych (patrz: budowa centrum aktywnego enzymów). Ilość wiązań disiarczkowych w cząsteczce białka globularnego jest rzędu kilku. Znanych jest ponadto wiele białek (zwłaszcza pozakomórkowych enzymów), które nie posiadają mostków disiarczkowych. Ta cecha czyni cząsteczki tych białek bardziej plastycznymi, co ma niewątpliwie znaczenie przy ich sekrecji (wydzielaniu poza komórkę). Do takich enzymów należą rybonukleaza czy subtilizyna

Wiązania jonowe. Wiązania te są wywołane elektrostatycznym przyciąganiem się jonów o przeciwnych znakach. W białkach wiązania jonowe tworzone są pomiędzy dodatnio naładowanymi grupami amoniowymi łańcuchów bocznych lizyny i argininy oraz naładowanymi ujemnie grupami karboksylanowymi kwasu glutaminowego i asparaginowego (—NH₃^+....-OOC—). Ponadto udział w powstaniu tego wiązania w pewnym stopniu może mieć dodatnio naładowany rodnik histydyny.

Energia tych wiązań waha się w granicach 14-29 kJ/mol, ich zasięg wynosi ponad 1 nm, a siła oddziaływania jest odwrotnie proporcjonalne do r². Tak więc, wiązania te są względnie silne. Ich ilość w cząsteczce białka może dochodzić nawet do kilkudziesięciu. Na przykład we wspomnianej subtilizynie (pozakomórkowej endopeptydazie serynowej z Bacillus subtilis) na powierzchni cząstki enzymu występuje 16 krzyżowych wiązań jonowych stabilizujących skutecznie trzeciorzędową strukturę białka. U enzymów tych brak jest mostków disiarczkowych, a mimo to są one odporne na działanie wielu czynników denaturujących.

Wiązania wodorowe. Tworzą się one pomiędzy atomem wodoru związanym kowalencyjnie z atomem o dużej elektroujemności a atomem z wolnymi parami elektronowymi (np. w białkach najczęściej: >C=O···H—N< lub —O—H···O=C<). Wiązanie to symbolizowane we wzorach jest kropkowaną linią, jak to widać w prezentowanych układach. Wiązanie wodorowe wykazuje wyraźne ukierunkowanie. Jest ono tym silniejsze, im bardziej linearnie są ułożone wszystkie trzy tworzące je atomy. Dla struktury białek, istotne wiązania wodorowe mają zasięg oddziaływania rzędu 0,26-0,31 nm, a energia pojedynczego wiązania waha się w granicach od 12 do 29 kJ/mol - a więc są to słabe oddziaływania. Wiązania wodorowe mogą powstawać zarówno między atomami tej samej cząsteczki jak i atomami różnych cząsteczek.

Pomimo, że wiązania wodorowego należą do słabych oddziaływań, są one chyba najważniejszymi siłami, które utrzymują przestrzenną konformację cząsteczki białka. Wynika to z faktu, iż w cząsteczce białka występują tysiące wiązań wodorowych, w sumie mają więc one dużą wartość energetyczną.

Ogólnie należy stwierdzić, że wiązania wodorowe są niezmiernie ważnym elementem strukturalnym układów biologicznych. Biorą one udział w tworzeniu struktur cząsteczek białek, kwasów nukleinowych i polisacharydów. Powstawanie wiązań wodorowych między cząsteczkami wody i cząsteczkami substancji rozpuszczonej jest warunkiem rozpuszczania w wodzie wielu związków organicznych. Nadto tworzenie się i rozpad wiązań wodorowych warunkuje szereg tak ważnych biologicznie funkcji, jak np. działanie enzymów.

Siły van der Waalsa są wynikiem wzajemnego oddziaływania elektronów i jąder w cząsteczkach, są więc przykładem oddziaływań elektrostatycznych. Ogólnie biorąc energia wiązań powstałych na bazie sił van der Waalsa jest bardzo mała, rzędu 4-8 kJ/mol. Mechanizm powstawania tych oddziaływań może być różny. Rozróżnia się m.in. efekt dyspersyjny, efekt indukcyjny czy efekt kierunkowy.

Efekt dyspersyjny (siły dyspersyjne) pojawia się jedynie wtedy, gdy cząsteczki znajdują się bardzo blisko siebie, tak że prawie się stykają. W wyniku ruchu elektronów walencyjnych gęstość ładunku ujemnego na zewnętrznej powłoce atomów ulega szybkim fluktuacjom wzbudzając podobną fluktuację w powłoce walencyjnej sąsiednich atomów. Powstają szybkozmienne dipole, które wzajemnie przyciągają się zwiększając, w miarę zbliżania się, wzajemną polaryzację elektronową. Siły te występują przez bardzo krótki czas (rzędu 10^-9 s) i są bardzo słabe (ok. 4 kJ/mol).

Efekt indukcyjny polega na oddziaływaniu indukowanych dipoli (jego znaczenie jest niewielkie).

Efekt kierunkowy związany jest z asymetrią elektryczną cząsteczek (dipole) powodującą oddziaływanie orientacyjne i przyciąganie odpowiednio utrwalających się dipoli.

Siły van der Waalsa maleją odwrotnie proporcjonalnie z siódmą potęgą odległości (r⁷) i są one bardzo małe w porównaniu do innych omówionych wiązań. Tym niemniej, sumując się wywołują efekty o dużym znaczeniu dla stabilizacji niektórych struktur białka.

Do czynników strukturotwórczych, według autora, można też zaliczyć białka zwane molekularnymi opiekunkami.

Molekularne opiekunki (chaperones). Nawet cząsteczki białka, którym udało się uzyskać prawidłowy kształt w fazie posttranslacyjnej (po zakończeniu biosyntezy), mogą w każdej chwili ulec deformacji wskutek działania różnych czynników denaturujących. Od lat zadawano sobie pytania:

• Jak ludzkie komórki radzą sobie z rozpoznawaniem białek, które mają złą strukturę przestrzenną?

• Czy takie źle zwinięte białka mogą powrócić do prawidłowego kształtu?

• Co dzieje się, kiedy cząsteczka białka jest tak beznadziejnie zniekształcona, że już w żaden sposób nie może przybrać prawidłowej konformacji?

W ostatnich latach częściowo znaleziono odpowiedź na te pytania. Okazuje się, że w tych przypadkach wkracza do akcji specjalna grupa białek: białka opiekuńcze, zwane też przyzwoitkami.

Białka opiekuńcze łączą się z odkształconymi białkami i pomagają im w uzyskaniu odpowiedniej struktury trójwymiarowej. Często wymaga to zużycia pewnej ilości energii zmagazynowanej w ATP. Następnie komórkowe opiekunki odłączają się od białek, które uzyskały odpowiedni kształt, i zajmują się innymi cząsteczkami białek o nieprawidłowej konformacji. Same białka opiekuńcze są bardzo odporne na denaturację.

Białka opiekuńcze są bardzo wszędobylskie. Można je znaleźć w cytoplazmie (tam biorą udział w nadawaniu kształtu białkom wytwarzanych w procesie translacji oraz w naprawianiu zdeformowanych białek), w jądrze komórkowym, w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej (gdzie uczestniczą w kształtowaniu białek przeznaczonych do wydzielenia przez komórkę) oraz w pobliżu błon białkowo-lipidowych (białka opiekuńcze są potrzebne w procesie transportu innych białek przez błony biologiczne: z jednej strony błony jedna przyzwoitka rozwija białko i wpuszcza je do kanału w błonie, a po przeciwnej stronie błony białkowo-lipidowej inna przyzwoitka odbiera transportowany łańcuch polipeptydowy i nadaje mu odpowiednią konformację). Bez udziału białek opiekuńczych wiele procesów metabolicznych nie mogłoby przebiegać prawidłowo, a naprawienie popsutej cząsteczki białka przekraczałoby możliwości komórki.

2.3.3.2. Białka fibrylarne

Białka fibrylarne (skleroproteiny) to białka o budowie włókienkowej, nierozpuszczalne w wodzie, rozcieńczonych kwasach, alkoholu; odporne na działanie enzymów proteolitycznych i czynników chemicznych. Są głównym składnikiem substancji podporowych i strukturalnych organizmu, np. skóry i kości (kolagen), ścięgien i wiązadeł (elastyna), paznokci, piór, włosów (keratyna), jedwabiu naturalnego (fibroina), rzęsek bakterii (flagellina), pancerzy owadów (sklerotyna). Białka te nie mają wartości odżywczych.

Białka fibrylarne wykazują wysoki stopień regularności i uporządkowania struktury. Obok wiązań peptydowych podstawowym czynnikiem strukturotwórczym białek fibrylarnych są wiązania wodorowe. Długie łańcuchy polipeptydowe tych białek przyjmują najczęściej regularną strukturę drugorzędową, w której szkielet skręcony jest wokół własnej osi, tak że powstaje przestrzenna możliwość utworzenia stabilizujących układ wiązań wodorowych między atomami oddalonych od siebie ugrupowań peptydowych.

Struktura kolagenu. Kolagen jest głównym składnikiem białek skóry, tkanki łącznej (m.in. wiązadła i ścięgna) oraz białek wchodzących w skład chrząstek i kości. Kolagen odznacza się dużą wytrzymałością na rozciąganie. Jego skład aminokwasowy jest następujący: glicyna 33%, prolina 12%, hydroksyprolina 9%, ponadto 9,5% Ala, 3% Wal, l,5% Liz(OH); przy absolutnym braku Cys i Try. Ustalono, że we włókienkowych cząsteczkach kolagenu trzy podstawowe aminokwasy tworzą łańcuch peptydowy układający się wzdłuż linii śrubowej o bardzo dużym skoku (3,3 reszty aminokwasowe na 1 skręt), a trzy takie łańcuchy splatają się ze sobą na kształt liny (rysunek obok). Poszczególne łańcuchy łączą się między sobą wiązaniami wodorowymi tworzonymi przez atomy azotu i tlenu wiązań peptydowych.

O przestrzennej strukturze kolagenu decyduje przede wszystkim jego niezwykły skład aminokwasowy. Periodyczna struktura pierwszorzędowa wygląda następująco: -Gly-X-Y-Gly-X-Y-. X często jest proliną (nigdy hydroksyproliną), Y jest często hydroksyproliną. Należy sobie uświadomić, że wiązania peptydowe utworzone z udziałem proliny i hydroksyproliny są „zdeformowane” (patrz: rysunek powyżej) na skutek pierścieniowej budowy tych aminokwasów. Stąd kąt rozwarcia płaszczyzn wiązań peptydowych za proliną wynosi 110°, podczas gdy normalnie wynosi on około 100°.

Hydroksyprolina (Hyp) i hydroksylizyna (Lys-OH) nie są wbudowywane w łańcuch podczas syntezy. Oba te aminokwasy powstają w gotowych łańcuchach prokolagenu z proliny i lizyny pod działaniem dioksygenaz - enzymów wbudowujących atomy tlenu z wytworzeniem grup hydroksylowych.

Trzy enzymy modyfikują prokolagen: 4-dioksygenaza prokolageno-prolinowa (EC 1.14.11.2), 3-dioksygenaza prokolageno-prolinowa (EC 1.14.11.7) i 5-dioksygenaza prokolageno-lizynowa (EC 1.14.11.4).

Struktura fałdowa. Białka zwane β-keratynami stanowią składniki naskórka, włosów, paznokci, kopyt. Podobnie jak kolagen są nierozpuszczalne wodzie i cechuje je odporność na czynniki chemiczne. Ich cząsteczki są zbudowane głównie z aminokwasów o hydrofobowych łańcuchach bocznych i aminokwasów zasadowych oraz znacznych ilości cysteiny.

Keratyna rozciągniętego włosa (β-keratyna) charakteryzuje się regularną strukturą. Struktura ta zwana jest fałdową, inaczej: strukturą pofałdowanej kartki, harmonijkową lub beta fałdową. Między różnymi łańcuchami polipeptydowych lub różnymi częściami tego samego łańcucha powstają wiązanie wodorowe wytworzone głównie w obrębie wiązań peptydowych. Płaskie wiązanie peptydowe sprawia, że łańcuch przyjmuje postać pofałdowanej kartki z łańcuchami bocznymi znajdującymi się poniżej lub powyżej tej płaszczyzny. Łańcuchy boczne sterczą teraz niemal pionowo w górę, względnie w dół, jak widać na modelu przedstawionym poniżej. Łańcuchy sąsiadujące ze sobą mogą być równoległe lub antyrównoległe zależnie czy przebiegają one odpowiednio: w tym samym kierunku lub kierunku przeciwnym (rysunek poniżej).

A - Struktura fałdowa, B - układ peptydów równoległy, C - układ peptydów antyrównoległy

Struktura α-helisy. Helisa (z grec. heliks, helikos = skręcony) to linia śrubowa, linia leżąca na powierzchni walca (poprawniej: cylindra). Strukturę α-helisy w 1951 roku zaproponowali Pauling i Corey. α-Helisa w przypadku struktury białek to łańcuch polipeptydowy płaszczyznowo nawijający się na hipotetyczny walec (rysunek poniżej). Sposób jego ułożenia umożliwia utworzenie się wewnątrz łańcuchowych wiązań wodorowych pomiędzy atomami wiązań peptydowych w kolejno po sobie następujących zwojach helisy. Grupa >C=O każdego aminokwasu wiąże się wiązaniem wodorowym z grupą HN< aminokwasu, zajmującego w sekwencji liniowej pozycję wysuniętą do przodu o cztery reszty aminokwasowe. Ostatecznie wszystkie grupy >NH i >C=O łańcucha głównego łączą się wiązaniami wodorowymi. Każda reszta aminokwasowa jest przesunięta w stosunku do sąsiedniej o 0,15 nm wzdłuż osi helisy i obrócona o kąt 100° wokół osi. Na jeden obrót helisy przypada więc 3,6 reszt aminokwasowych. W ten sposób, co czwarte reszty aminokwasowe w α-helisie znajdują się przestrzennie blisko siebie. Łańcuchy boczne aminokwasów wystają na zewnątrz cylindra w ułożeniu śrubowym. Prolina „deformuje” α-helisę. Odmiana helisy prawoskrętna jest bardziej stabilna dla łańcuchów polipeptydowych.

3,6Å

5,4Å

Struktura α-helisy charakterystyczna jest dla niezbyt długich łańcuchów polipeptydowych takich, jakie występują w α-keratynie (białko fibrylarne) lub mioglobinie (białko globularne).

Włókienka α-keratyny zbudowane są z dwóch typów łańcuchów polipeptydowych. Oba mają budowę α-helisy, ale oś jednego (I) jest prosta, drugiego (II) zaś tworzy linię śrubową o znacznie większym skoku aniżeli w α-helisie. Łańcuch typu I stanowi trzon, wokół którego oplata się 6 śrubowych łańcuchów typu II.

2.3.3.3. Białka globularne

Omawiane poprzednio białka fibrylarne stanowią agregaty wielocząsteczkowe o uporządkowanej budowie. W przeciwieństwie do nich białka globularne w stanie naturalnym to pojedyncze, niezależne od siebie cząsteczki, przypominające „kłębuszki poplątanej wełny”. Łańcuch polipeptydowy białek globularnych jest z reguły nieregularne poskręcany i pofałdowany. Brak w strukturze trzeciorzędowej tych białek wyraźnej regularności i uporządkowania. Na rysunku przedstawiono schematyczny model cząsteczki białka globularnego. Wewnątrz „kłębuszka” znajduje się strefa hydrofobowa, a na zewnątrz strefa hydrofilowa, co decydująco wpływa na właściwości tych białek.

Schematyczny model cząsteczki białka globularnego.

W białkach globularnych występują jedynie dwa typy struktur drugorzędowych: α-helisa i β-fałdowa. W wielu białkach globularnych fragmenty łańcucha polipeptydowego o strukturze α-helisy są poprzedzielane strukturą β-fałdową. Ponadto obie te struktury mogą oddziaływać pomiędzy sobą tworząc bardziej złożone struktury „ponad” drugorzędowe zwane motywami. Motywy strukturalne, powstają wskutek asocjacji α-helisy lub struktury β-fałdowej. Powszechnie występującym motywem β, czyli powstałym jedynie na bazie struktury β-fałdowej jest motyw „szpilki do włosów”. Ten motyw zbudowany jest z jednego łańcucha polipeptydowego, przyjmującego antyrównoległą strukturę typu harmonijki. Innym przykładem bardziej złożonej struktury opierającej się na strukturze β-fałdowej jest motyw „klucza greckiego”. Jest to bardziej rozbudowany motyw „szpilki do włosów”, gdzie jeden łańcuch polipeptydowy tworzy ze sobą cztery struktury β-fałdowe ułożone względem siebie antyrównoległe. Struktura α-helisy podobnie jak harmonijkowa tworzy własne motywy strukturalne. Najczęściej jest to motyw „helisa-pętla-helisa". Innym przykładem motywów α, są struktury tzw. „suwaków leucynowych”, zbudowanych z dwóch oplecionych ze sobą α-helis, bogatych w leucynę. Oprócz motywów β lub α, występują struktury mieszane typu α / β. Za przykład może posłużyć motyw βαβ, w którym pomiędzy dwoma ułożonymi równolegle łańcuchami struktury β-fałdowej znajduje się α-helisa. Hydrofobowa strona łańcuchów β jest ciasno upakowana i kontaktuje się z hydrofobową stroną α-helisy.

Wszystkie omówione motywy dotyczą białek globularnych zbudowanych jedynie z jednego łańcucha polipeptydowego. Jednakże wiele białek zbudowanych jest z kilku łańcuchów polipeptydowych, fałdujących się niezależnie od siebie i pomiędzy którymi również formują się swego rodzaju motywy, zwane domenami. Domeny można zdefiniować, jako precyzyjnie splecione ze sobą fragmenty łańcuchów polipeptydowych, tworzących w przestrzeni szczególnie regularne rejony. Zbudowane są one ze 100 do 400 reszt aminokwasowych. Można za przykład podać domenę składającą się z czterech α-helis tworzących złożony motyw „helisa-pętla-helisa", ułożonych wzajemnie równolegle, w ten sposób, że reszty aminokwasowe poszczególnych łańcuchów zazębiają się między sobą tworząc przestrzeń hydrofobową w centralnej części domeny. Inną, bardzo podobną strukturą, charakterystyczną dla białek globularnych jest domena „globinowa”. Powstaje ona w wyniku dopasowania grzbietów jednej α-helisy w grzbiet drugiej. Domeny często są składnikami części funkcjonalnych białek.

Niektóre białka mają niezwykle skomplikowaną strukturę trzeciorzędową, nawet z kilkunastoma motywami i kilkoma domenami, jak np. dystrofina.

Dystrofina jest białkiem kodowanym przez gen leżący na chromosomie X. Mutacje tego genu wywołują choroby zwane dystrofiami mięśniowymi Duchenne'a i Becker'a. Dystrofina zbudowana jest z 3685 aminokwasów (M_cz = 427 kDa). Podzielona jest na cztery domeny - pierwsza domena na N-końcu o masie cząsteczkowej 30 kDa jest homologiem α-aktyniny, domena centralna zbudowana z 25 powtórzonych motywów potrójnych helis podobnych do występujących w spektrynie, domena bogata w cysteiny (280 reszt) oraz C-końcowa domena. C-końcowa domena zawiera kilka charakterystycznych motywów - domenę WW (posiadają dwie konserwatywne reszty tryptofanu), motyw „EF hands”, domenę ZZ (motyw wiążący cynk) oraz dwie α-helisy.

Allosteria (z grec. allos = obcy, inny; stereos = stanowiący bryłę) to innokształtność przestrzenna, czyli zmiana konformacji łańcuchowej. Cząsteczki większości białek globularnych odznaczają się względnie dużą elastycznością. Trzeciorzędowa struktura wielu z nich może ulegać odwracalnym „odkształceniom” na skutek niekowalencyjnego przyłączenia jakiejś innej cząsteczki (tzw. ligandu). Takie białka nazywa się białkami allosterycznymi. Efekt allosteryczny polega na odwracalnej zmianie konformacji białka w pewnym ściśle określonym obszarze jego cząsteczki na skutek przyłączenia ligandu (efektora allosterycznego) w innym miejscu. Ta zmiana konformacji pociąga za sobą zaburzenia aktywności biologicznej białka. Najlepiej poznanym białkiem allosterycznym jest hemoglobina. Wiele enzymów również jest białkami allosterycznymi. Na zasadzie allosterii działają aktywatory i inhibitory niektórych enzymów (porównaj rozdz. 4.2.7).

Hemoglobina zawarta w erytrocytach działa jako przenośnik tlenu we krwi oraz odgrywa decydującą rolę w transporcie dwutlenku węgla i jonów wodorowych (pokrewnym białkiem jest mioglobina, odpowiedzialna za transport tlenu w mięśniach). Kształt cząsteczki hemoglobiny jest zbliżony do kuli o średnicy 5,5 nm. Hemoglobina jest białkiem złożonym. Składa się z dwóch łańcuchów α (po 141 aminokwasów) i dwóch łańcuchów β (po 146 aminokwasów). Łańcuchy te są upakowane w formę czworościanu. Oddziałują ze sobą za pośrednictwem wiązań niekowalencyjnych tworząc charakterystyczny tetramer oznaczany jako α-β-α-β lub α₂β₂. Oba typy łańcuchów mają bardzo zbliżoną strukturę trzeciorzędowa i zawierają taką samą niebiałkową grupę prostetyczną — cząsteczkę hemu. Grupy hemowe są umiejscowione, pojedynczo w każdej podjednostce, w zagłębieniach na ich powierzchni. Hem jest związkiem kompleksowym, w którym atom żelaza dwuwartościowego (Fe²⁺) znajdujący się w środku układu porfirynowego tworzy wiązania koordynacyjne z czterema atomami azotu porfiryny. Atom żelaza może przyłączyć cząsteczkę O₂ bez zmiany swojej wartościowości, tworząc tzw. utlenowaną formę hemoglobiny (zwaną też oksyhemoglobiną) o jasnoczerwonym kolorze. Cztery miejsca wiązania tlenu są znacznie od siebie oddalone; odległość między dwoma najbliżej położonymi atomami żelaza wynosi 2,5 nm. Przyłączanie tlenu jest odwracalne i zależy od ciśnienia cząstkowego tlenu w narządach.

Przyłączenie tlenu (będącego w stosunku do hemoglobiny ligandem) do jednego z protomerów zwiększa zdolność przyłączania O₂ przez pozostałe protomery. W miarę postępującego utlenowania hemoglobiny jej protomery łączą się coraz łatwiej z tlenem na skutek zmian konformacyjnych wywołanych efektem allosterycznym. Utlenowana cząsteczka hemoglobiny jest bardziej upakowana. Na przykład, w wyniku utlenowania odległość między atomami żelaza zmniejsza się z 4,0 do 3,3 nm. Reszty aminokwasów C-terminalne wszystkich czterech łańcuchów mają prawie całkowitą swobodę rotacji. Terminalne grupy karboksylowe i łańcuchy boczne aminokwasów na końcach C tworzą wiązania jonowe, które krępują tetramer. Ze względu na obecność ośmiu wiązań jonowych cząsteczka nieutlenowanej hemoglobiny jest bardziej napięta i skrępowana niż hemoglobiny utlenowanej.

Właściwości białek globularnych

Białka, które posiadają określone właściwości biologiczne (tzn. wypełniają określone funkcje w komórce), i te właściwości nadal zachowują niezależnie od tego, czy są wewnątrz komórki czy też zostały z niej wyizolowane określa się nazwą białka natywne (rodzime). Białka natywne wykazują kilka charakterystycznych właściwości.

Punkt izoelektryczny. Cechą charakterystyczną każdego białka jest jego punkt izoelektryczny. Jest to takie pH, w którym ilość ładunków dodatnich i ujemnych cząsteczki białka jest jednakowa. Taka cząsteczka, oczywiście, nie wędruje w polu elektrycznym.

Denaturacja. Część białek natywnych należy do grupy związków bardzo delikatnych. Pod wpływem wielu czynników zarówno fizycznych, jak i chemicznych, np. wysokiej temperatury, znacznych zmian pH, promieni ultrafioletowych, rozpuszczalników organicznych itp., struktura białek ulega trudno odwracalnym lub całkowicie nieodwracalnym zmianom połączonym z utratą natywnych właściwości biologicznych (m.in. białka będące enzymami tracą swoje właściwości katalityczne). Proces ten nazywa się denaturacją.

Denaturację białka można więc zdefiniować jako utratę natywnych właściwości biologicznych lub innej indywidualnej cechy charakterystycznej tego białka spowodowaną zniszczeniem jego struktury wtórnej (przy zachowaniu struktury pierwszorzędowej). W wyniku denaturacji białka mogą wystąpić zmiany rozpuszczalności i przesunięcie punktu izoelektrycznego. Rozwinięcie łańcucha peptydowego może prowadzić do wzrostu lepkości, a także zmian absorpcji w nadfiolecie. Obserwuje się również często procesy agregacji i wytrącania, co jest związane ze zmianami stopnia hydratacji i rozpuszczalności zdenaturowanych białek.

Ogólnie biorąc, mechanizm denaturacji związany jest ze zniesieniem oddziaływań czynników strukturotwórczych, które odpowiedzialne są za stabilizację struktury przestrzennej cząsteczki białka. Podczas denaturacji rozrywane mogą być wiązania wodorowe, jonowe, disulfidowe oraz niszczone oddziaływania elektrostatyczne van der Waalsa. I tak:

• działanie podwyższonej temperatury doprowadza do zerwania wiązań wodorowych oraz zniesienia oddziaływań van der Waalsa, co w konsekwencji skutkuje zniszczeniem struktur II-, III- i IV-rzędowej białka,

• pod wpływem roztworu mocznika (6-8 mol/dm³) lub chlorku guanidyny (4 mol/dm³ ) i innych związków chemicznych silnie polarnych zerwaniu ulegają wiązania wodorowe,

• jony metali ciężkich (Hg²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺, itp.) powodują zerwanie mostków disiarczkowych, a ponadto częściowo wiązań jonowych, co w niektórych przypadkach może prowadzić do wbudowania się tych jonów w cząsteczkę białka,

• na skutek działania kwasów lub zasad (wartość pH poniżej 3 lub powyżej 9) zerwaniu ulegają wiązania jonowe i w pewnym stopniu wodorowe, co przede wszystkim skutkuje zniszczeniem III-rzędowej struktury białka,

• promieniowanie (nadfioletowe, rentgenowskie i radioaktywne) w skrajnych przypadkach może nawet prowadzić do rozrywania wiązań kowalencyjnych,

• innymi czynnikami mogącymi wywoływać denaturację białek są: intensywne mieszanie, wytrząsanie lub działanie ultradźwiękami.

Wpływ pH i stężenia elektrolitu na rozpuszczalność białek globularnych. Ze względu na rozpuszczalność w wodzie białka globularne dzieli się na dwie grupy:

1. albuminy - rozpuszczalne w wodzie,

2. globuliny - rozpuszczalne w rozcieńczonych elektrolitach (np. w 0,1-1%-owych roztworach NaCl).

Białka najmniejszą rozpuszczalność posiadają w punkcie izoelektrycznym. Im pH roztworu jest bardziej oddalone od pI białka, tym lepsza jest jego rozpuszczalność. Zjawisko to można wyjaśnić następująco. W roztworach o pH różnym od pI cząsteczki białka posiadają ładunek (dodatni lub ujemny). Dwa ładunki jednoimienne odpychają się (m.in. tym silniej im większy jest ten ładunek). Nic więc dziwnego, że naładowane cząsteczki białka też się odpychają, co ułatwia ich hydratację i w efekcie zwiększa rozpuszczalność. Podobnie podczas wysalania (o czym będzie mowa poniżej) jednoimiennie naładowane cząsteczki białka znacznie trudniej ulegają agregacji i trudniej wytrącić je w postaci osadu.

Wpływ pH i stężenia elektrolitu na rozpuszczalność modelowego białek globularnych o pI = 6.

W wielu przypadkach niewielkie stężenie elektrolitu - np. 0,8% wodny roztwór NaCl, czyli sól fizjologiczna - znacznie poprawia rozpuszczalność wielu białek (tzw. proces wsalania białek). Niektóre białka w ogóle nie rozpuszczają się w wodzie i wprowadzenie ich do roztworu wymaga obecności jonów elektrolitu. Mechanizm zjawiska polega na tym, że niezależnie od ogólnego (sumarycznego) ładunku molekuły, cząstkowe ujemne i dodatnie ładunki nie są równomiernie rozmieszczone na powierzchni cząsteczki białka. W efekcie cząsteczki białka są dipolami. W punkcie izoelektrycznym dipol taki posiada znaczny moment, kilkaset razy większy od mementu dipolowego wody. Zjawisko to wpływa na silne, wzajemne przyciąganie pomiędzy molekułami białka. Dodatek NaCl sprawia, że w roztworze pojawiają się jony Na⁺ i Cl^-, które neutralizując te cząstkowe ładunki na powierzchni białka znoszą efekt przyciągania się cząsteczek, tym samym ułatwiają ich rozpuszczanie się.

Przekroczenie pewnego progowego stężenia elektrolitu powoduje wytrącanie się białka z roztworu w postaci osadu (tzw. proces wysalania białek), co po oddzieleniu od cieczy i wysuszeniu pozwala otrzymać białko w stanie stałym. Dobrym odczynnikiem wysalającym białka jest siarczan amonu. Okazuje się, że zarówno jony NH₄⁺, jak i SO₄^2- mają bardzo duże powinowactwo do cząsteczek wody i odrywają je od otoczki hydratacyjnej białka.

Frakcjonowane wysalanie białek. Dobierając odpowiednio pH i stężenie elektrolitu można na drodze wysalania z grubsza rozdzielić mieszaninę białek na pojedyncze frakcje, zawierające znacznie podczyszczone indywidualne białka.

Wytrącanie białek globularnych rozpuszczalnikami organicznymi. Niektóre rozpuszczalniki organiczne o silnych właściwościach hydrofilowych, takie jak np. etanol, aceton mają zdolność wytrącania białka z roztworu. Związki te mają bardzo silne powinowactwo do wody i wyrywają jej cząsteczki z otoczki hydratacyjnej białka. Niestety, część molekuł białka ulega denaturacji. Skuteczność procesu wytrącania aktywnego biologicznie białka, czyli niezdenaturowanego, można poprawić poprzez obniżenie temperatury wytrącania do 4°C, dbania o względnie niskie stężenie rozpuszczalnika wobec cząsteczek białka, (co, m.in. zapewnia dozowanie rozpuszczalnika do roztworu białka!) i maksymalnie możliwe skrócenia czasu kontaktu rozpuszczalnika z cząsteczkami białka. W ten sposób można z dużą wydajnością (sięgającą nawet 86%) skutecznie wytrącać natywne białko z roztworu. Za takim sposobem otrzymywania białka w stanie stałym, w porównaniu z wysalaniem, przemawia łatwość regeneracji odczynnika wytrącającego. [Od autora: siarczan amonowy stosowany do wysalania białek jest trudny do regeneracji, a jego obecność w ściekach powoduje bardzo groźną korozję wszelkich elementów betonowych (umocnień wałów przeciwpowodziowych, filarów mostów, itp.)].

Suszenie rozpyłowe. W ostatnich latach, dzięki zastosowaniu ultrafiltracji, białko w stanie stałym (m.in. enzymatyczne) korzystnie jest otrzymywać z zastosowaniem suszenia rozpyłowego. Wydajność tego procesu sięga nawet 94%, a otrzymane białko w stanie stałym może być jednocześnie znacznie podczyszczone.

Odbiałczanie roztworów. W niektórych sytuacjach nieodzowne jest pozbycie się białka z roztworu wodnego. Można efekt taki osiągnąć stosując odczynniki odbiałczające, m.in. 5% roztwór kwasu trichlorooctowego lub 10% roztwór kwasu sulfosalicylowego. Oba te związki prawie ze 100% skutecznością wytrącają zdenaturowane białko z wodnych roztworów.

Roztwory koloidalne białek. Roztwory wodne białek globularnych mają charakter koloidów hydrofilowych. I jako takie, posiadają charakterystyczne cechy koloidów hydrofilowych, o których naucza chemia fizyczna. M.in. obniżają napięcie powierzchniowe, wykazują znaczną lepkość, są silnie uwodnione, żelatynują, wykazują słabą opalescencję i mały efekt Tyndala, itp.

Dializa. Białka są olbrzymimi molekułami i jako takie nie dializują, tzn. nie wykazują zdolności do dyfundowania przez błony półprzepuszczalne. Zjawisko to wykorzystuje się m.in. do odsalania roztworów białek. Wszystkie związki niskocząsteczkowe (np. jony, sole, mono- i disacharydy, aminokwasy, peptydy, itp.) ulegają dializie, tzn. dyfundują przez błonę półprzepuszczalną woreczka dializacyjnego do otaczającego go roztworu, natomiast białko pozostaje wewnątrz woreczka.

Elektroforeza. Cząsteczki białka zawieszone w roztworze wodnym o pH różnym od ich pI (punktu izoelektrycznego) posiadają ładunek elektryczny. Oczywiście, ładunek ten jest tym większy, im większa różnica pomiędzy pH roztworu a pI. Takie białko umieszczone w polu elektrycznym zacznie wędrować w kierunku elektrody o przeciwnym znaku, z prędkością tym większą, im większy posiada ładunek.

Punkty izoelektryczne białek są dość zróżnicowane. Istnieje duże prawdopodobieństwo, że w mieszaninie białek zawieszonych w buforze o jakimś dobranym pH, część cząsteczek naładowana zostanie dodatnio, część ujemnie, a nadto znajdą się i takie, które nie będą miały ładunku. Jeżeli taką mieszaninę umieści się w polu elektrycznym, to cząsteczki białek zaczną wędrować w kierunku elektrod o przeciwnych znakach (oczywiście, te bez ładunku pozostaną w punkcie startowym). Umożliwia to na skuteczne rozdzielenie mieszaniny białek. Ogólnie rozpowszechnionymi metodami elektroforezy są elektroforeza bibułowa lub płytkowa cienkowarstwowa.

Oczyszczanie białek. W obecnej dobie istnieje wiele metod pozwalających szybko i skutecznie wyizolować białko z mieszaniny różnych związków (w tym, innych białek) i oczyścić je do stanu homogenności (jednolitości). Metody te opisywane są w fachowej literaturze dotyczącej omawianego problemu.

2.4. Tłuszczowce (lipidy)

Do grupy związków objętych nazwą tłuszczowce lub lipidy zalicza się estry wyższych kwasów tłuszczowych z mono- lub wielowodorotlenowymi alkoholami. Są one nierozpuszczalne w wodzie.

Dzieli się je na dwie podstawowe grupy:

• lipidy proste, w skład których wchodzą wyłącznie alkohole i kwasy,

• lipidy złożone, zawierające oprócz tych podstawowych składników inne związki.

Lipidy proste dzieli się na:

1. Tłuszcze właściwe (zwane w skrócie tłuszczami), są estrami kwasów tłuszczowych i glicerolu. Stanowią one substancje zapasowe żywych organizmów. Są szeroko rozpowszechnione w świecie roślinnym, jak i zwierzęcym. Pod względem budowy chemicznej stanowią mieszaninę estrów glicerolu z kwasami tłuszczowymi

gdzie: R-CO- reszta acylowa wyższego

kwasu tłuszczowego

ogólny wzór tłuszczów właściwych

Wszystkie kwasy tłuszczowe, wchodzące w skład tłuszczów występujących w przyrodzie, poza nielicznymi wyjątkami, mają parzystą ilość atomów węgla (co jest zrozumiałe, biorąc pod uwagę sposób ich syntezy). W zależności od budowy chemicznej kwasy tłuszczowe dzieli się na 2 grupy:

• kwasy tłuszczowe nasycone - nie zawierające wiązań podwójnych,

• kwasy tłuszczowe nienasycone - zawierające wiązania podwójne.

W przyrodzie tłuszcze występują przeważnie jako glicerydy mieszane, o różnym składzie kwasowym, głównie zawierające trzy różne kwasy tłuszczowe.

Przykłady wyższych kwasów tłuszczowych:

C₁₅H₃₁ COOH kwas palmitynowy,

C₁₇H₃₅ COOH kwas stearynowy,

C₁₇H₃₃ COOH kwas olejowy (kwas nienasycony),

a ponadto rycynolowy (hydroksylowa pochodna kwasu olejowego), a także inne wielonienasycone linolowy, linolenowy, arachidonowy.

Kwasy wielonienasycone występują szczególnie obficie w olejach roślinnych. Niektóre ssaki nie posiadają zdolności syntetyzowania tych związków i w takim przypadku stanowią one nieodzowny składnik ich pożywienia (tzw. związki egzogenne) i stąd noszą nazwę witaminy F.

2. Woski - estry kwasów tłuszczowych z wyższymi alkoholami jednowodorotlenowymi, głównie alifatycznymi, np.

C₃₀H₆₁-CO-O C₁₆H₃₃ melisynian cetylowy

Lipidy złożone również dzielą się na kilka grup w zależności od dodatkowych składników nietłuszczowych, np. fosfolipidy, sfingomieliny, glikolipidy, itp. Do tłuszczowców zalicza się, ze względu na niektóre podobne cechy, również sterydy, które są estrami kwasów tłuszczowych i jednowodorotlenowych wielkocząsteczkowych alkoholi pierścieniowych.

Wśród tłuszczowców złożonych na uwagę zasługują fosfolipidy (zwane też fosfatydami). Głównym reprezentantem tej grupy jest lecytyna (fosfatydylocholina). Zbudowana jest ona z glicerolu, którego dwie grupy wodorotlenowe zestryfikowane są kwasami tłuszczowymi, zaś trzecia - kwasem fosforowym połączonym z choliną.

Z kolei wśród sterydów na uwagę zasługuje cholesterol, występujący niemal we wszystkich komórkach ludzkiego organizmu. Jego stężenie we krwi wynosi od 140 do 250 mg%.

* * *

Bardziej szczegółowe informacje dotyczące dotychczas omówionych związków można znaleźć w wielu popularnych, łatwo dostępnych podręcznikach (np. z zakresu chemii organicznej, biochemii, itp.).

ROZDZIAŁ 3. PODSTAWY GENETYKI

Wprowadzenie

Genetyka to nauka zajmująca się badaniem zjawisk dziedziczenia, czyli przekazywania cech potomstwu oraz zmiennością organizmów żywych, które są oparte na informacji zawartej w podstawowych jednostkach dziedziczności, czyli genach.

Za twórcę genetyki uważa się G.Mendla, który w 1866 pierwszy opisał podstawowe prawa dziedziczenia cech (prawa Mendla). W kolejnych etapach rozwoju genetyki powstała chromosomowa teoria dziedziczenia Morgana. Ustalono, że kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) to podstawowy związek przechowujący informację genetyczną. Wyjaśniono mechanizmy dziedziczenia u żywych organizmów. Powstała koncepcja genu jako źródła informacji, która rządzi wzrostem i zachowaniem istot żywych oraz decyduje o ich cechach. W latach 70-tych XX wieku wyodrębniono genetykę molekularną, która m.in. doprowadziła do rozszyfrowania kodu genetycznego. Stosunkowo niedawno ukształtowała się genetyka populacyjna, analizująca zjawiska dziedziczności w odniesieniu do populacji.

Słowo genetyka występuje w całej grupie nauk:

• Genetyka molekularna to dział biologii molekularnej rozpatrujący zagadnienia genetyczne na poziomie molekularnym (cząsteczkowym) w detalach jako kompleksowe procesy biokatalitycznych rekcji wyjaśniających powstawanie, ekspresję i przekazywanie informacji genetycznej.

• Genetyka populacyjna (zwana też ilościową) zajmuje się badaniem mechanizmów powstawania i utrzymywania się zmienności genetycznej w populacjach pod wpływem mutacji, selekcji, migracji i innych czynników.

• Inżynieria genetyczna - ingerencja w materiał genetyczny organizmów, w celu zmiany ich właściwości dziedzicznych. Polega ona na wprowadzaniu do komórek organizmu, którego cechy chcemy zmienić (biorcy), określonego odcinka DNA innego organizmu (dawcy). W zakres badań inżynierii genetycznej wchodzi: m.in. klonowanie zwierząt, namnażanie materiału genetycznego (tzw. klonowanie genów), genetyczne modyfikacje roślin, terapię genową, modyfikację bakterii np. w celu produkcji ludzkiej insuliny, lub antybiotyków.

3.1. Kwasy nukleinowe

Kwasy nukleinowe stanowią około 1% składu organizmu. Są to wielkocząsteczkowe biopolimery (polinukleotydy). Elementami składowymi, czyli monomerami są nukleotydy. Z punktu widzenia chemicznego nukleotydy są estrami nukleozydów i kwas fosforowego. Zbudowane są z trzech podstawowych składników:

1. zasady azotowej - pirymidynowej lub purynowej,

2. pentozy, którą najczęściej jest D-ryboza lub 2-deoksy-D-ryboza,

3. 
   reszty kwasu fosforowego.

Rybonukleotydy zawierają rybozę, a deoksyrybonukleotydy zawierają deoksyrybozę. Większość nukleotydów kwas fosforowy ma przyłączony wiązaniem estrowym w pozycji 5' pentozy.

3.1.1. Nukleozydy

Nukleozydy są związkami powstałymi z połączenia zasady purynowej lub pirymidynowej z pentozą. Oba związki są połączone wiązaniem β-N-glikozydowym. Wyjątkiem jest pseudourydyna będąca C-glikozydem. Ryboza lub deoksyryboza przyłączone są do azotu N⁹ puryny lub N¹ pirymidyny.

Rys.3.1.1. Budowa nukleozydów

W naturalnie występujących nukleozydach purynowych dominuje konfiguracja anty, co ma istotne znaczenie z punktu widzenia komplementarności zasad w DNA. Jednakże z przyczyn czysto technicznych [dla wygody edytorskiej] na rysunkach nukleozydy i nukleotydy przedstawia się w konfiguracji syn.

Niektóre zasady pirymidynowe i purynowe występują w komórkach znacznie częściej aniżeli inne i stąd zwyczajowo mówi się o nich podstawowe (główne) w odróżnieniu od rzadziej spotykanych drugorzędnych (pomniejszych).

Zasady pirymidynowe. Do głównych zasad pirymidynowych należą: cytozyna, uracyl i tymina.

Zasady te wykazują zjawisko tautomerii ketono-enolowej: formy ketonowe z grupami =O to laktamy, zaś formy enolowe z grupami -OH to laktymy. Również w niewielkim stopniu wykazują one tautomerię aminowo-iminową: istotne dla nukleotydów są formy aminowe pochodnych pirymidyny W warunkach fizjologicznych dominującą ilościowo postacią tautomeryczną tyminy i uracylu jest laktam, natomiast cytozyny laktym.

Mutagenny efekt tautomerii zasad pirymidynowych wynika z faktu, że laktym tyminy tworzy komplementarną parę z guaniną, a nie z adeniną.

W DNA i tRNA obecne mogą być również drugorzędne zasady pirymidynowe. Należy do nich m.in. 5-metylocytozyna (występująca w kwasach nukleinowych zarówno u prokariota, jak i eukariota) i 5-hydroksymetylocytozyna (obecna w DNA fagów). Inny nietypowy nukleozyd to pseudourydyna, oznaczana grecką literą ψ (psi). Różni się od urydyny pozycją wiązania glikozydowego. W pseudourydynie wiązanie β-C-glikozydowe łączy atom węgla C¹ rybozy z piątym atomem węgla (C⁵) uracylu.

Zasady purynowe. Puryny zawierają pierścień pirymidynowy skondensowany z pierścieniem imidazolowym. Podobnie jak w przypadku zasad pirymidynowych występują formy tautomeryczne laktymowa i laktamowa. Istotne dla nukleotydów są formy ketonowe i aminowe pochodnych puryn.

Do głównych zasad purynowych należą adenina i guanina, a także hipoksantyna i ksantyna, choć te dwie ostatnie z punktu widzenia genetyki mają drugorzędne znaczenie. Ksantyna i hipoksantyna to metabolity pośrednie przemian guaniny oraz adeniny. Z ksantyny powstaje kwas moczowy, końcowy produkt katabolizmu puryn u człowieka i zwierząt mięsożernych.

W tRNA wirusów stwierdzono obecność zasad purynowych nietypowych, np. N-metylowych pochodnych 6-N-metylo- i 6-N,N-dimetyloadeniny. Hipoksantyna w połączeniu z pentozą tworzy nukleozyd - inozynę.

Również w mRNA można znaleźć drugorzędne zasady purynowe np. wspomniane już metylowe pochodne adeniny, a ponadto 7-N-metyloguaninę.

Metylowane puryny są obecne również u roślin; poza kwasami nukleinowymi występują one jako tzw. zasady roślinne (alkaloidy). Należą do nich między innymi kofeina, teofilina i teobromina. Wszystkie mają zastosowanie farmakologiczne.

W warunkach fizjologicznych guanina, ksantyna i hipoksantyna głównie występują w formie laktamowej, natomiast dominującą formą adeniny jest laktym.

Nazewnictwo nukleozydów wywodzi się od nazwy zasady azotowej w nich występującej. Nazwy rybonukleozydów pirymidynowych tworzy się, dodając do początkowego członu nazwy zasady, końcówkę „-dyna”, tj. cytydyna oraz urydyna. W przypadku deoksyrybonukleotydów również dodaje się końcówkę -dyna, ale nazwę nukleotydu poprzedza się przedrostkiem deoksy-, tj. deoksycytydyna (nie dotyczy to urydyny, która występuje jedynie w RNA i nie tworzy deoksynukleotydów). Tymidyna, która zawiera deoksyrybozę, nie wymaga w nazwie przedrostka deoksy-.

Nazwy rybonukleozydów purynowych tworzy się, dodając do początkowego członu nazwy zasady, końcówkę „-zyna”, np. adenozyna, guanozyna. Deoksyrybonukleozydy odpowiednio nazywają się: deoksyadenozyna i deoksyguanozyna. Nukleozyd hipoksantyny nazywa się inozyna.

Litery A, G, C, T i U oznaczają odpowiednio nukleozydy adeniny, cytozyny, itd. Przedrostek d wskazuje, że cukrem jest 2”-deoksy-D-ryboza.

3.1.2. Nukleotydy

Mononukleotydy są estrami kwasu fosforowego i nukleozydów. Fosforan zastępuje najczęściej grupę -OH przy piątym atomie węgla (C5') rybozy lub deoksyrybozy. Wyłącznie takie nukleozydo-5'-fosforany są wykorzystywane w komórkach do biosyntezy kwasów nukleinowych. Ortofosforan może przyłączać się również przy trzecim atomie węgla (C3') rybozy lub deoksyrybozy. Tego typu naturalne nukleozydo-3'-fosforany są produktami rozpadu kwasów nukleinowych w organizmie.

Nazwy nukleotydów tworzy się od nazw nukleozydów, np. cytydyno-5'-monofosforan (skrót CMP lub w razie potrzeby 5'-CMP). Domyślnie przyjmuje się, że opuszczenie cyfry przed skrótem nazwy nukleotydu wskazuje na 5'-monofosforany. Ale adenozyno-3'-monofosforan ma skrót 3'-AMP. W pełnej nazwie nukleotydu zwyczajowo zamieszcza się cyfrę wskazującą na pozycję związanej grupy fosforanowej. Stosowane skróty trójliterowe nukleotydów wywodzą się od nazw angielskich (np. AMP to adenosine monophosphate). Potocznie o nukleotydach mówi się: nukleotyd adeninowy, nukleotyd cytozynowy, itp.

Nukleotydy adeninowe, guaninowe i cytozynowe istnieją zarówno w formie rybonukleotydów (odpowiednio AMP, GMP i CMP), jak i deoksyrybonukleotydów (odpowiednio dAMP, dGMP i dCMP).

Urydyno-5'-monofosforan (UMP) występuje wyłącznie w formie rybonukleotydu (w RNA). Z kolei tymidyno-5'-monofosforan występuje głównie w formie 2'-deoksyrybonukleotydu (dTMP w DNA) i wyjątkowo w formie fosforybotyminy (TMP) w cząsteczce tRNA. Fosforybotymina powstaje dopiero posttranskrypcyjnie w wyniku reakcji metylacji urydynomonofosforanu.

Nukleotyd wywodzący się od inozyny to inozyno-5'-monofosforan (IMP), będący nie tylko składnikiem kwasów rybonukleinowych, lecz także koenzymem.

W potocznym języku nukleotydy nazywane są kwasami. I tak, AMP to kwas adenylowy mięśniowy (znaleziono go, bowiem, w stanie wolnym w mięśniach), 3'-AMP to kwas adenylowy drożdżowy (uzyskano go z produktów hydrolizy RNA drożdżowego). Również pozostałe nukleotydy mają odpowiednie nazwy wywodzące się od kwasów, np. guanylowy, cytydylowy, urydylowy, itp.

Cykliczne nukleotydy

Cykliczny AMP (cAMP, czyli adenozyno-3',5'-monofosforan) jest wewnątrzkomórkowym wtórnym przekaźnikiem działania wielu hormonów. Powstaje z ATP w reakcji katalizowanej przez cyklazę adenylanową (EC 4.6.1.1.). Aktywność cyklazy adenylanowej jest regulowana przez skomplikowane oddziaływania wewnątrzkomórkowe, w których biorą udział receptory hormonów w błonie komórkowej. Hormon wydzielany do przestrzeni pozakomórkowej (np. adrenalina), oddziałując ze specyficznymi receptorami błonowymi stymuluje w komórce syntezę cAMP, poprzez aktywację cyklazy adenylanowej.

Stężenie cAMP w komórce reguluje wiele procesów metabolicznych. Proces transkrypcji mRNA kontrolowany jest stężeniem cAMP (porównaj: represja kataboliczna). cAMP aktywuje m.in. niespecyficzną serynowo/treoninową kinazę białek (porównaj: rozdział 4.2.7. - aktywacja fosforylazy b), co reguluje metabolizm komórki. cAMP odgrywa ponadto kluczową rolę w powstawaniu wrażeń węchowych.

Enzymatyczna hydroliza 3',5'-cAMP, katalizowana przez fosfodiesterazę 3',5'- cyklicznych-nukleotydów (EC 3.4.1.17) prowadzi do powstania 5'-nukleotydów. Enzym wykazuje szeroką specyficzność i działa również na inne 3',5'-cykliczne nukleotydy.

U drożdży i niektórych bakterii (np. Salmonella, Escherichia coli) w komórkach występuje również adenozyno-2',3'-monofosforan (dla odróżnienia od 3'5'-cAMP, który zapisuje się krótko - cAMP, ten drugi zawsze zapisuje się jako 2'3'-cAMP). Ponadto w komórkach występują inne cykliczne nukleotydy, np. cdAMP, cIMP, cGMP, cCMP. Te cykliczne nukleotydy działają wewnątrz komórki jako regulatory różnych procesów biochemicznych. Np. cykliczny cGMP jest pobudzającym informatorem w procesie widzenia. Powstaje pod działaniem cyklazy guanylanowej.

Di- i trifosforany nukleotydów

Mononukleotydy mogą do swojej 5'-reszty fosforanowej przyłączyć dodatkowo jedną lub dwie (niekiedy nawet więcej) cząsteczek kwasu fosforowego. Powstają wtedy di- lub trifosforany nukleotydów (np. adenozyno-5'-difosforan, czyli ADP lub adenozyno-5'-trifosforan, czyli ATP). Te nowo przyłączone reszty fosforanowe wiążą się z AMP wiązaniami wysokoenergetycznymi - szczegółowo tę problematykę omówiono w Rozdziale 4.2.2. - Koenzymy i grupy prostetyczne: Nukleozydofosforany.

ADP i ATP uczestniczą jako substrat i produkt w fosforylacjach oksydacyjnej i substratowych. ATP jest głównym wewnątrzkomórkowym źródłem wolnej energii.

GDP bierze udział w reakcji utleniania α-ketoglutaranu do sukcynylo~ScoA, w wyniku fosforylacji substratowej powstaje GTP. Jest on niezbędny do aktywacji cyklazy adenylanowej przez niektóre hormony (jest allosterycznym regulatorem). Ponadto dostarcza energii w syntezie białek na polisomach.

Pochodne nukleotydów

Nukleotydy są jednostkami budulcowymi całej grupy koenzymów (głównie AMP), m.in. koenzymu A (CoA-SH), kilku dinukleotydów (m.in. NAD, NADP, FAD, itp.). Szczegółowo ten aspekt wykorzystania AMP w komórce opisano w Rozdziale 3.2.2. - Koenzymy i grupy prostetyczne.

Pochodne uracylu, np. UDPG (UDP-glukoza) lub inny UDP-sacharyd biorą udział w biosyntezie di- i polisacharydów oraz w reakcjach epimeryzacji.

CTP w komórkach tkanek zwierzęcych jest wykorzystywany podczas biosyntezy niektórych fosfoglicerydów, a CDP-cholina uczestniczy w biosyntezie sfingozydów.

Syntetyczne analogi nukleotydów. Są to pochodne pirymidyn, puryn i ich nykleozydy, w których celowo zmieniono pewne charakterystyczne dla naturalnych nukleotydów cechy (np. strukturę heterocyklicznego pierścienia lub pentozy) w celu uzyskania zmiany działania biologicznego związku na inne, które może być wykorzystane do celów terapeutycznych w medycynie.

3.1.3. Polinukleotydy

Polinukleotydy (zwane również kwasami nukleinowymi) są liniowymi biopolimerami zbudowanymi z nukleotydów. Kolejne nukleotydy są połączone ze sobą mostkami diestrowymi - poprzez kwas fosforowy, który jedną grupą -OH łączy się z C3' pentozy jednego nukleotydu, a drugą grupą -OH z C5' pentozy następnego nukleotydu. Łańcuch główny kwasu nukleinowego stanowią ułożone przemiennie cząsteczki pentozy i kwasu fosforowego, podczas gdy zasady pozostają na zewnątrz łańcucha. Przedstawicielami tych związków są w komórce DNA i RNA.

3.1.3.1. DNA

DNA jest polinukleotydem zbudowanym z 4 nukleotydów: adeninowego (A), tyminowego (T), guaninowego (G) i cytozynowego (C). Zdecydowana większość cząsteczek DNA jest dwupasmowym (dwuniciowym) polinukleotydem, zbudowanym z dwóch łańcuchów leżących naprzeciwko siebie. W 1953 r. Watson i Crick zaproponowali model struktury przestrzennej DNA. Założyli, że dwa łańcuchy polinukleotydowe skręcone są w podwójną spiralę, o kształcie helisy. Łańcuchy główne utworzone są z pentozy i kwasu fosforowego. Natomiast zasady są zwrócone do wnętrza spirali, niczym do cylindra utworzonego przez dwa łańcuchy. Zasady te są ułożone prostopadle do osi cylindra, jedna nad drugą i oddziałują wzajemnie na siebie za pomocą wiązań wodorowych i sił van der Waalsa, które stabilizują spiralną strukturę. Oba łańcuchy mają przeciwną polarność, końcowi 5` jednego łańcucha odpowiada koniec 3` drugiego łańcucha i odwrotnie.

Oba łańcuchy wzajemnie się dopełniają pod względem składu i kolejności występowania zasad. Kolejność zasad w jednym łańcuchu DNA ściśle określa ich kolejność w drugim, bowiem na przeciw adeniny musi występować tymina, a na przeciw guaniny cytozyna.

Wiązania wodorowe powstają miedzy parami zasad azotowych wg bardzo prostych reguł wynikających z ich struktury. Adenina zawsze łączy się z tyminą, zaś cytozyna z guaniną. W ten sposób jedna nić DNA wyznacza budowę drugiej nici, mówimy zatem, że dwie nici są komplementarne, czyli wzajemnie się uzupełniają. Ze względu na formę przestrzenną dwuniciowa cząsteczka DNA nosi nazwę podwójnej helisy.

Komplementarność dwóch łańcuchów DNA stwarza możliwość replikacji (skopiowania) potomnych cząsteczek DNA o identycznej budowie. Każdy pojedynczy łańcuch DNA zawiera pełną informację o syntezie drugiego, komplementarnego w stosunku do niego łańcucha (jest to zasada komplementarności zasad).

W dwuniciowym DNA informacja genetyczna zlokalizowana jest na jednym łańcuchu, zwanym pasmem matrycowym (3'→5', odpowiedzialnym m.in. za transkrypcję mRNA); przeciwlegle do niego ułożony drugi łańcuch (5'→3', stabilizujący) zwany bywa myląco (!) pasmem kodującym.

Lokalizacja DNA. W komórkach eukariotycznych DNA zlokalizowane jest w jądrze komórkowym. Długie, liniowe cząsteczki DNA ponawijane są na specjalne białka histonowe tworząc nukleosomy. Długie sznury nukleosomów ułożone w skomplikowane włókna nazywa się chromatyną. Podczas podziału komórki upakowanie DNA jeszcze bardziej się zwiększa - ze zwiewnych i cieniutkich włókien chromatynowych powstają krótkie i grube chromosomy. Jądro otoczone jest podwójną białkowo-lipidową błoną. Poprzez występujące w niej pory do cytoplazmy przenoszone są tylko fragmenty RNA; DNA nie opuszcza jądra. Pewna ilość DNA, tzw. mtDNA (DNA mitochondrialne) w postaci kolistej cząsteczki zlokalizowane jest w matrix mitochondrium.

Organizmy bezjądrowe (Procaryota) nie mają liniowych chromosomów, lecz koliste cząsteczki DNA. Twór ten zwany chromosomem bakteryjnym, nukleoidem lub genoforem nie jest oddzielony od pozostałych elementów komórki żadną błoną.

Chromosomy to elementy jądra komórkowego, zawierające ułożone kolejno geny, warunkujące właściwości dziedziczne. Chromosomy są nosicielami cech dziedzicznych. Chromosomy zawarte w komórce płciowej organizmu tworzą garnitur chromosomowy - haploidalną (najmniejszą) podstawową liczbę chromosomów. Pojedynczy, monoploidalny zespół chromosomów wraz z podstawowym zestawem zawartych w nim genów nosi nazwę genomu. Innymi słowy genom to suma wszystkich genów zawartych w podstawowym, monoploidalnym zestawie chromosomów.

U organizmów prokariotycznych genom to zespół wszystkich genów zawartych w genoforze.

Plazmidy. Są to koliste cząsteczki dwuniciowego DNA, zawierające specyficzny materiał genetyczny, występujące pozachromosomowo w cytoplazmie, mające zdolność do samodzielnej replikacji. Niektóre plazmidy mają zdolność do wbudowania się w chromosom bakteryjny (określane są wtedy mianem episomów) i ich replikacja podlega wtedy kontroli bakterii.

Plazmidy występują u organizmów bezjądrowych, tj. bakterii i sinic, a także u niektórych drożdży. Zawierają one geny kodujące cechy o znacznej często wartości przystosowawczej dla danego organizmu, np.: produkcję toksyn, uodpornienie komórki gospodarza na antybiotyki i inne substancje toksyczne, biodegradację nietypowych substratów - ksenobiotyków np. pestycydów, kontrolę procesu koniugacji (wyznaczają m.in. jego płeć). Obecność plazmidów w komórce może mieć znaczny wpływ na jej fenotyp np. u Rhizobium plazmidy umożliwiają współdziałanie z roślinami motylkowymi w procesie nitrogenezy.

3.1.3.2. RNA

Większość kwasów nukleinowych w komórce to RNA. Jest go 5÷10 razy więcej niż DNA. Są trzy podstawowe rodzaje RNA: rRNA (rybosomalny RNA), mRNA (informacyjny RNA, inaczej matrycowy RNA; przedrostek „m” pochodzi od jego angielskiej nazwy messenger) i wreszcie tRNA (transportujący RNA). Najliczniejszym spośród nich jest rRNA, który spotyka się w komórce w kilku różnych odmianach. Ich struktura u różnych gatunków może być odmienna. Natomiast u danego gatunku konkretny typ rRNA zawsze jest identyczny (ma zawsze taką samą ściśle określoną sekwencję nukleotydów).

Budowa RNA. Cząsteczki RNA są zwykle jednoniciowe (ssRNA). Ale mogą również występować w formie dwuniciowej (dsRNA). Nić RNA odpowiada pojedynczej nici DNA. Jednakże monosacharyd zawarty w RNA jest rybozą (w DNA występuje deoksyryboza) i po drugie, zamiast tyminy (T) RNA zawiera uracyl (U). Niektóre rodzaje RNA zawierają krótkie fragmenty łańcucha o komplementarnej sekwencji do innych fragmentów tej samej cząsteczki. Takie komplementarne sekwencje mogą tworzyć wiązania wodorowe, kiedy odpowiednie fragmenty nici zbliżą się do siebie na odpowiednią odległość i utworzyć stabilne przestrzenne struktury. Często struktury takie mają zasadnicze znaczenie dla pełnionych przez RNA funkcji. Nici RNA mają różną długość: od około 100 do kilku tysięcy nukleotydów.

Rodzaje RNA i ich funkcje. RNA występuje w jądrze komórkowym i w cytoplazmie. Pełni funkcje związane z procesem ekspresji informacji genetycznej (konkretnie, procesem biosyntezy białek):

• mRNA - (tzw. informacyjny) uczestniczy w przekazywaniu informacji genetycznej z DNA do rybosomów, gdzie odbywa się biosynteza białka,

• tRNA - bierze udział w translacji: rozpoznaje aminokwasy i po przyłączeniu transportuje je na miejsce biosyntezy, a tam odczytuje kod genetyczny zapisany na mRNA i zgodnie z nim ustawia przetransportowane aminokwasy w odpowiedniej kolejności,

• rRNA - razem z białkami jest elementem budulcowym rybosomów.

mRNA

mRNA powstaje w procesie potranskrypcyjnym ze swojego prekursora, jakim jest hnRNA (wielkocząsteczkowy, jądrowy RNA). hnRNA jest syntetyzowany w jądrze komórkowym z trifosforybonukleotydów na matrycy DNA w procesie transkrypcji. Jego zasady są komplementarne w stosunku do jednej z nici chromosomowego DNA, na której jest wytwarzany. hnRNA jest pojedynczym łańcuchem owiniętym na histony. W tej formie jest transportowany do cytoplazmy, gdzie ulega przekształceniu w mRNA (w procesie splicingu). Dojrzały mRNA jest pojedynczą nicią RNA, która jest nośnikiem informacji genetycznej, zawartej w postaci sekwencji nukleotydów w łańcuchu. Na jej podstawie polimeryzowane są aminokwasy według określonej kolejności - dzięki temu procesowi powstaje produkt końcowy ekspresji informacji genetycznej, czyli białko.

Bakteryjny mRNA powstaje bezpośrednio w procesie transkrypcji. Może mieć w swojej cząsteczce zapisany kod dla całego zespołu białek. Taki mRNA jest nazywany policistronowym. Oprócz kodonów, zawiera tzw. trójki nonsensowne, które są znakami przestankowymi, umożliwiającymi syntezę wielu białek. Długość łańcucha mRNA prokariotów zależy od ilości i wielkości zakodowanych w nim białek.

mRNA eukariotów jest monocistronowy, a więc zawiera informację tylko dla jednego łańcucha polipeptydowego. Występują w nim przeważnie typowe zasady (brak nonsensownych trójek). W procesie potranskrypcyjnego dojrzewania następuje modyfikacja łańcucha hnRNA tak, aby powstał ostatecznie łańcuch mRNA zawierający jedynie informację o ściśle określonym białku.

Nić hnRNA u eukariotów jest znacznie dłuższa niż dojrzałego mRNA. Nić ta zawiera regiony kodujące, zwane eksonami, które będą tworzyły dojrzały mRNA. Eksony oddzielone są od siebie długimi sekwencjami, tzw. intronami. Jeszcze w obrębie jądra komórkowego introny, stanowiące większą część hnRNA, zostają usunięte, natomiast eksony zostają połączone i tworzą mRNA. Modyfikacji ulegają także końce łańcucha mRNA. Koniec 5' zostaje zablokowany 7-rnetyloguanozyną, natomiast do końca 3' u większości eukariotów zostaje dołączony łańcuch poli(A) zbudowany z kilkudziesięciu nukleotydów adeninowych. Liczba tych nukleotydów wpływa na szybkość degradacji mRNA na skutek działania nukleaz. Modyfikacja końców mRNA, jak również obecność białek informomerowych mają na celu ochronę informacji o cząsteczce białka zarówno podczas przebywania matrycowego RNA w jądrze komórkowym, jak i podczas jego transportu do cytoplazmy.

tRNA

Cząsteczki tRNA zbudowane są z 74÷95 nukleotydów. Stanowią one ok. 15 % całego RNA komórki. Podobnie jak mRNA wytwarzany jest w formie prekursora, tzw. pierwotnego transkryptu, który w wyniku obróbki przekształca się we właściwy tRNA. Cechą charakterystyczną tRNA jest częste występowanie zmodyfikowanych zasad azotowych i nietypowych nukleotydów (m.in. dihydrourydyny i pseudourydyny). W każdej komórce znajduje się przynajmniej 20 rodzajów tRNA i przynajmniej jeden z nich odpowiada określonemu aminokwasowi z grupy białkowych.

Cząsteczki tRNA są jednoniciowe, tym niemniej posiadają cztery obszary dwuniciowe, które sprawiają, że kształtem tRNA przypomina liść koniczyny.

W cząsteczce tRNA można wyróżnić 4 główne ramiona: ramię akceptorowe - występuje na końcu 3', zawiera sekwencję CCA. Grupa 3'-OH reszty adenylowej wiąże się wiązaniem estrowym z grupą karboksylową odpowiedniego dla danej cząsteczki tRNA aminokwasu. Ramię dihydrouracylowe (ramię DHU) - zawiera pętlę D, w której występuje nietypowy nukleotyd - dihydrourydyna. Ramię to ma znaczenie podczas rozpoznania odpowiedniego aminokwasu i syntezy aminoacylo-tRNA. Ramię rybotymidynowe (ramię TΨC) - zawiera pętlę T, w której występuje tymidyna oraz nietypowy nukleotyd - pseudourydyna. Ramię to służy do łączenia się z rybosomem i przymocowania tRNA na matrycy. Pętla ramienia antykodonowego - odpowiada za rozpoznanie określonego kodonu w mRNA i komplementarne wiązanie się z nim. Ponadto w niektórych tRNA występuje pętla dodatkowa - jej funkcja nie jest znana.

tRNA cechuje wysoka specyficzność w stosunku do aminokwasów. Każdy z aminokwasów syntetyzowanego białka może być transportowany przez jeden, a niektóre przez kilka różnych tRNA. Po przyłączeniu reszty aminoacylowej do końca 3' powstaje układ aminoacylo - tRNA. Reakcję estryfikacji końcowej reszty adenylowej tRNA odpowiednim aminokwasem katalizują ligazy - np. ligaza tyrozyna-tRNA(Tyr) - EC 6.1.1.1 (patrz również: str.66).

Dla tych aminokwasów, które mają więcej niż jeden kodon, istnieje w komórce odpowiednia ilość odmian tRNA, zwanych izoakceptorowymi tRNA. Jeden antykodon w tRNA nie jest w stanie rozpoznać często bardzo różnych kodonów dla tego samego aminokwasu. Istnieje, zatem, pewna tolerancja w układzie kodon -antykodon. Jest to tzw. zasada tolerancji Cricka, o której szczegółowo będzie mowa w rozdziale poświęconym genom.

rRNA

W komórkach prokariotycznych rybosomalny RNA, podobnie jak poprzednie rodzaje RNA, powstaje z prekursora (pierwotnego transkryptu) na drodze transformacji potranskrypcyjnej. rRNA stanowi około 80% ilości kwasów rybonukleinowych komórki. Jest głównym składnikiem rybosomu, gdzie sięga 65% zawartości (reszta to białka). rRNA zawiera typowe nukleotydy z niewielką domieszką metylowych pochodnych niektórych zasad azotowych. Jego masa cząsteczkowa osiąga 2 MDa. Jest pojedynczym łańcuchem, bardzo mocno poskręcanym, tworzącym pętle, z fragmentami dwuniciowymi połączonymi z polipeptydami wchodzącymi w skład poszczególnych podjednostek rybosomu. Istnieje kilka typów rRNA. W rybosomach komórek prokariotycznych występują rRNA: 23S, 5S oraz 16S. Typ 16S rRNA rozpoznaje miejsce startowe w cząsteczce mRNA. Typ 23S rRNA oddziałuje z ramieniem akceptorowym cząsteczki tRNA. W komórkach eukariotycznych spotyka się rRNA: 28S; 5,8S; 5S i 18S.

Rybosomy to kuliste twory komórkowe, wielkości 15-30 nm, mające charakter wieloenzymatycznego kompleksu. Rybosomy aktywnie uczestniczą w procesie syntezy białek (w translacji). W komórce występują pojedynczo lub tworzą zespoły. Rybosomy osadzone na mRNA noszą nazwę polisomów i są gotowe do translacji (tworzą aparat translacyjny). Biorąc pod uwagę stałą sedymentację, rybosomy dzieli się na dwie klasy:

• u eukariota występują rybosomy o stałej sedymentacji 80 S (8 ps),

• u prokariota występują rybosomy o stałej sedymentacji 70 S (7 ps).

Rybosom składa się z dwóch podjednostek rybosomalnych: mniejszej i większej. W rybosomach 70 S podjednostka mała ma stałą sedymentacji 30 S, a duża 50 S . W rybosomach 80 S mała podjednostka wykazuje stałą sedymentację 40 S, a duża 60 S (6 ps).

Rybozomy to substancje zbudowane z kwasu rybonukleinowego (RNA) zdolne do katalizowania niektórych reakcji chemicznych. Spełniają zatem funkcje analogiczne do enzymów białkowych.

3.2. Biochemia genów

Informacja genetyczna jest przekazywana z pokolenia na pokolenie. Ponadto w komórkach występują mechanizmy umożliwiające wykorzystanie informacji genetycznej do regulacji metabolizmu. Tymi mechanizmami są replikacja, transkrypcja i translacja.

Główne zasady genetyki molekularnej:

• Informacja genetyczna dotycząca komórki jest zakodowana w DNA.

• Przepływ informacji genetycznej w komórce odbywa się jednokierunkowo:

DNA → RNA → białka.

• Wszystkie komórki danego organizmu zawierają identyczną, pełną informację genetyczną. Zależnie od rodzaju komórki, fazy jej cyklu życiowego i warunków zewnętrznych — ekspresji ulegają inne fragmenty zapisu genetycznego.

3.2.1. Geny

Gen to odcinek DNA o określonej sekwencji nukleotydów kodujący sekwencję aminokwasów jakiegoś jednego białka jednołańcuchowego, jednego peptydu albo polipeptydu lub sekwencję nukleotydów jednej strukturalnej cząsteczki RNA. Pojedynczy gen koduje pojedynczy łańcuch polipeptydowy (ewentualnie peptydowy), jedną cząsteczkę tRNA lub rRNA, czy też jakiś rybozym. Wiele białek zbudowanych jest jednak z kilku różnych łańcuchów polipeptydowych; wtedy każdy z nich jest kodowany przez oddzielny gen. Gen traktowany jest często jako najmniejsza jednostka dziedziczności, ale jest to pewne uproszczenie pochodzące z czasów, gdy nie znano struktury DNA i mechanizmów jego replikacji, transkrypcji i translacji.

W genomie człowieka można wyróżnić kilka rodzajów genów:

Geny strukturalne to odcinki DNA, kodujące sekwencję i liczbę aminokwasów w polipeptydzie, przy czym obowiązuje zasada: 1 gen to 1 łańcuch polipeptydowy. Geny strukturalne występują najczęściej w pojedynczych kopiach lub w ich niewielkiej liczbie.

Geny regulatorowe to odcinki DNA, które nie podlegają transkrypcji, ale pełnią rolę regulacyjną tego procesu. Te specyficzne odcinki DNA są rozpoznawane przez odpowiednie białka regulacyjne.

Geny rRNA i tRNA to odcinki DNA, na których odbywa się transkrypcja rRNA i tRNA. W tym przypadku bezpośrednio syntetyzowane są odpowiednie rRNA i tRNA. Te geny występują w genomie w wielu kopiach.

Kod genetyczny

DNA zbudowany jest z 4 różnych nukleotydów: adeniny A, guaniny G, tyminy T i cytozyny C. W mRNA tyminę T zastępuje uracyl U. Zatem kod genetyczny zawarty w DNA i mRNA oparty jest o 4 litery. Zakodowaniu jednego aminokwasu w białku odpowiada trójka kolejnych nukleotydów, czyli triplet. W cząsteczkach DNA i mRNA możliwe są więc 64 triplety (zgodnie z kombinatoryką 4³), zwane kodonami.

Istnieje 20 aminokwasów proteinogennych, stąd kod dla białek jest 20-literowy. W stosunku do liczby aminokwasów istnieje więc nadmiar tripletów. Wiadomo jednak, że danemu aminokwasowi w wielu przypadkach odpowiada kilka różnych tripletów. Ustalono, iż istnieją kodony synonimowe, które najczęściej dwa pierwsze nukleotydy w mRNA mają jednakowe, trzeci zaś nukleotyd może ulec zmianie bez wpływu na kodowany aminokwas. Najczęściej zmienia się nukleotyd 3, rzadziej 1, a najbardziej stabilny jest 2. Spośród 64 kodonów, trzy z nich nie kodują żadnego aminokwasu, natomiast są sygnałem do przerwania syntezy polipeptydu podczas translacji (tzw. faza terminacji). Te głuche, przerywnikowe lub inaczej nonsensowne triplety to: UAA, UAG i UGA (patrz: tabela 3.1.).

Kod genetyczny podlega regułom Cricka:

• Każdy aminokwas określony jest specyficzną sekwencją 3 kolejnych nukleotydów (tripletem), czyli kodonem.

• Kod jest bezprzecinkowy, czyli nie istnieją specjalne znaki, które oddzielają jeden triplet od drugiego.

• Kod jest zdegenerowany: tzn. wbudowywanie tych samych aminokwasów do rosnącego łańcucha polipeptydowego determinowane może być różnymi kodonami, tzw. kodonami synonimowymi. Służy to ochronnie przed mutacjami podczas biosyntezy białka.

• Kod jest specyficzny - określony kodon bierze udział tylko we włączaniu jednego aminokwasu.

• Odczyt DNA i mRNA następuje tylko w jednym kierunku.

• Uniwersalność: kod genetyczny u wszystkich organizmów jest jednakowy.

• Aminokwasy: metionina i tryptofan są determinowane przez pojedyncze kodony: AUG - metionina, UGG - tryptofan; brak dla nich kodonów synonimowych.

Hipoteza tolerancyjna Cricka. W 1966 r. Crick wysunął hipotezę tolerancji, która zakłada, że jeden antykodon w tRNA może rozpoznawać kilka różnych kodonów synonimowych w mRNA, różniących się w 3-ciej pozycji tripletu.

Dla przypomnienia: antykodon tRNA zbudowany jest z trzech nukleotydów i jest rozpoznawany przez 3-literowy kodon mRNA. Kod zapisany w kodonie mRNA i kod na antykodonie są antyrównoległe pod względem komplementarności. Sekwencja nukleotydów na antykodonie odczytywana jest w kierunku przeciwnym, aniżeli na kodonie.

Tabela 3.1. Budowa tripletów kodujących poszczególne aminokwasy.

1-sza litera kodu	2-ga litera kodu				3-cia litera kodu
	U	C	A	G
U	UUU Fen UUC UUA Leu UUG	UCU UCC Ser UCA UCG	UAU Tyr UAC UAA^1 Amber UAG^1 Ochre	UGU Cys UGC UGA^1,4 Opal UGG Try	U C A G
C	CUU CUC Leu CUA CUG	CCU CCC Pro CCA CCG	CAU His CAC CAA Glu-NH2 CAG	CGU CGC Arg CGA CGG	U C A G
A	AUU AUC Ile AUA AUG^2 Met (Start)	ACU ACC Tre ACA ACG	AAU Asp-NH2 AAC AAA Liz AAG	AGU Ser AGC AGA Arg AGG	U C A G
G	GUU GUC Wal GUA GUG^3 (Start)	GCU GCC Ala GCA GCG	GAU Asp GAC GAA Glu GAG	GGU GGC Gli GGA GGG	U C A G

¹ UAA, UAG, UGA - sygnał zakończenia łańcucha: „Stop”

² AUG - inicjacja translacji (zapoczątkowanie łańcucha): „Start”

³ GUG - alternatywny kodon „Start” u niektórych Prokaryota

⁴ UGA - w mitochondriach i u niektórych jednokomórkowych Protista koduje tryptofan.

Hipoteza tolerancji (degeneracji kodu genetycznego) odnosi się głównie do 3-go nukleotydu w triplecie kodonowym (N₃'). Sugeruje ona, że parowanie się zasad między tym 3-cim nukleotydem a odpowiadającym mu 1-szym nukleotydem w antykodonie nie jest precyzyjne. Jedynie trzeci i drugi nukleotyd antykodonu (N₃ i N₂) tworzą właściwe pary z pierwszym i drugim (N₃' i N₂') nukleotydem kodonu.

Ponadto w antykodonach może występować nietypowy nukleotyd, jakim jest inozyno-5'-monofosforan - I.

Przy założeniu, że 2-gi (N₂) i 3-ci (N₃) nukleotyd antykodonu są prawidłowo sparowane z 1-szym (N₁') i 2-gim (N₂') nukleotydem kodonu, 1-szy (N₁) nukleotyd antykodonu może być parowany przez 3-ci nukleotyd kodonu według zamieszczonego w tabeli schematu.

tRNA 1-szy nukleotyd antykodonu (N1)	mRNA 3-ci nukleotyd kodonu (N3')
C	G
A	U
U	A lub G
G	U lub C
I	U,A lub C

Stąd, dwa kodony dla argininy AGA i AGG mogą się wiązać z tym samym tRNA o antykodonie mającym uracyl przy swoim końcu 5' (czyli jako 1 nukleotyd antykodonu - N₁). Podobnie trzy kodony dla glicyny, GGU, GGC i GGA, mogą być odczytane przez jeden i ten sam tRNA z antykodonem ICC (inozyna jest 1 nukleotydem antykodonu, ale jest parowana z 3 nukleotydem kodonu, czyli U, C lub A).

Dla aminokwasu z 4 różnymi kodonami synonimowymi istnieją w organizmach co najmniej dwa różne tRNA z dwoma różnymi antykodonami. Dla aminokwasu leucyny istnieje aż 6 różnych tRNA. U ssaków wykazano 80 różnych tRNA.

Komórki Escherichia coli K12 zawierają aż 84 różne tRNA. Aminokwasy z pojedynczymi antykodonami na tRNA, u tych bakterii, to histydyna, tryptofan i slelenocysteina. Ale z kolei, arginina i walina mają po 7 różnych tRNA, a dla leucyna istnieje aż 8 różnych tRNA.

Allele to geny zajmujące to samo miejsce (locus) w chromosomach homologicznych, czyli geny zlokalizowane naprzeciwko siebie. Podczas mejozy są rozdzielane. Determinują przeciwstawne cechy organizmu.

3.2.2. Replikacja DNA

Replikacja DNA to proces, w którym podwójna nić DNA zostaje skopiowania. Replikacja DNA programowana zgodna jest z cyklem życiowym komórki i odbywa się w fazie S (faza syntezy DNA). Istnieje też nieprogramowana synteza DNA dotycząca niewielkich jego fragmentów (tzw. synteza naprawcza, będąca następstwem uszkodzeń i mutacji pasma DNA) i nie jest ona związana z cyklem komórkowym.

Cykl komórkowy jest szeregiem zmian biofizycznych i biochemicznych zachodzących w komórce między końcem jednego i końcem następnego podziału. Obejmuje on interfazę, czyli okres między podziałami, oraz sam podział, czyli mitozę lub mejozę. W interfazie cyklu komórkowego wyróżnia się fazę S,. która przechodzi następnie w fazę G2, poprzedzającą mitozę (fazę M). Przed każdym podziałem ilość DNA obecna w jądrze podwaja się. Dokonuje się to w ograniczonym czasie interfazy zwanym fazą syntezy (S). W fazie S ulega replikacji niemal cały jądrowy DNA i jest to tzw. programowana synteza DNA.

Zasady replikacji są podobne u wszystkich organizmów, przy czym największe różnice występują pomiędzy bakteriami z jednej strony, a eukariotami z drugiej.

U bakterii replikacja zaczyna się w ustalonym miejscu i postępuje bardzo szybko, z prędkością rzędu 1000 nukleotydów na sekundę. U eukariotów replikacja jest o wiele wolniejsza, ok. 50 nukleotydów na sekundę, jednak zachodzi równocześnie w wielu miejscach.

Inicjacja replikacji zachodzi w ściśle określonych miejscach na nici DNA. Miejsca te nazywają się ori (origin - początek). Zawierają one specyficzne sekwencje nukleotydów rozpoznawalne przez replisom, czyli enzymy i białka biorące udział w powielaniu DNA. Do takiego miejsca przyłącza się helikaza (białkowy składnik replisomu). Wykorzystuje ona energię hydrolizy ATP do zmiany kształtu własnej cząsteczki, co umożliwia jej wykonanie pracy mechanicznej polegającej na rozerwaniu wiązań wodorowych między nićmi matrycowego DNA i rozpleceniu spirali DNA. Wtedy wbudowuje się białko destabilizujące, które utrzymuje oba łańcuchy w pozycji rozdzielonej. Rozplecione łańcuchy DNA tworzą tzw. "widełki replikacyjne". Helikaza przesuwa się wzdłuż dwuniciowego DNA, rozdzielając splecione łańcuchy i poszerzając widełki replikacyjne. Proces rozkręcania DNA przebiega segmentami; co ileś nukleotydów topoizomeraza DNA (EC 5.99.1.2) na moment rozcina jedną z nici DNA (w celu usunięcia naprężeń powstałych podczas rozkręcania) i ponownie, bez nakładu energii, scala obie nici. Do rozplecionych końców DNA, na zasadzie komplementarności, zostają wbudowane primery - starterowe odcinki RNA, które zakończone są wolną grupą -OH, na końcu 3' rybozy. Za wbudowywanie tych odcinków odpowiedzialne są primazy (inny białkowy składnik replisomu). W ten sposób tworzą się krótkie odcinki dwóch dwuniciowych DNA-RNA, do których przyłącza się polimeraza DNA III i rozpoczyna się elongacja DNA.

Replisom (replikacyjny kompleks białkowy), czyli grupa białek biorących udział w replikacji. Obejmuje dwie polimerazy DNA III, białko DnaA (inicjatorowe), białko DnaB (primazę), białko DnaG (DNA helikazę) i inne. Najważniejszy enzym kompleksu to polimeraza DNA III (polimeraza DNA ukierunkowana na DNA - EC 2.7.7.7). Zbudowana jest z trzech podjednostek, jedna z aktywnością polimeryzacyjną, druga z uzdolnieniami korekcyjnymi i trzecia, która stymuluje te korektorskie uzdolnienia. Helikaza (DNA helikaza ATP-zależna - EC 3.6.1.?) i primaza (podjednostka IV alfa polimerazy DNA) stanowią składniki primosomu, rozpoczynającego replikację. Primaza jest aktywowana przez helikazę DNA i po aktywacji syntezuje na obu niciach DNA krótkie (9-11 zasad) komplementarne odcinki (primery) startowego RNA.

Elongacja replikacji, czyli synteza nowego łańcucha DNA. Polimeraza DNA III dobudowuje nowy łańcuch DNA. Substratami do jego syntezy są trifosforany deoksyrybonukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP). Dołączenie każdego z nich do budowanego DNA wiąże się z rozerwaniem wiązań bezwodnikowych i odłączeniem pirofosforanu. Dostarcza to energii niezbędnej do wytworzenie wiązania estrowego miedzy grupą 3'-OH deoksyrybozy od strony budowanego DNA, a resztą fosforanową deoksyrybonukleotydu. Trifosfonukleotydy dobudowywane są zgodnie z regułą komplementarności zasad; nowy łańcuch do każdego z pojedynczych łańcuchów pierwotnych. Czyli obok starego łańcucha powstaje nowy. Jest to semikonserwatywny (półzachowawczy) mechanizm replikacji DNA. Polimeraza DNA III działa od końca 3` primeru (stąd nowy łańcuch zawsze jest syntezowany w kierunku 5'→3'). Z tego powodu jedna z nici, tzw. prowadząca (lub inaczej wiodąca) jest syntezowana w sposób ciągły, zaś druga, tzw. opóźniona, syntezowana jest fragmentami (tzw. fragmenty Okazaki).

Schemat replikacji DNA u eukariota

Synteza opóźnionej nici DNA (drugiego łańcucha DNA) u Eucaryota przebiega w sposób nieciągły. Druga nić również musi powstawać w kierunku 5'→ 3', ponieważ polimeraza DNA nie potrafi przyłączać nukleotydów od strony 5'-rybozy. Ta druga nić nosi nazwę nici opóźnionej i jest wytwarzana w postaci krótkich fragmentów, które noszą nazwę fragmentów Okazaki. Fragmenty Okazaki są wytwarzane w kierunku 5'→3'. Każdy fragment Okazaki składa się z primera RNA i krótkiego odcinka DNA o długości około 200 nukleotydów (u prokariota 1000-2000 par zasad). Po zakończeniu replikacji całej cząsteczki DNA primery są wycinane z nowych nici przy udziale polimeraz z aktywnością egzonukleaz (np. polimerazy I) lub przez egzonukleazy. Powstałe "dziury" są wypełniane przez polimerazę DNA III, a końce tych fragmentów są łączone w jeden łańcuch przez ligazę DNA (ATP) - EC 6.5.1.1. Spajanie DNA następuje poprzez wytworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy końcem z grupą 3`-OH, a końcem 5`-fosforowym komplementarnych nukleotydów przy udziale ATP, jako dawcy energii.

W fazie elongacji procesu replikacji u organizmów prokariotycznych bierze udział kilka polimeraz (np. u Escherichia coli aż 5), różniących się pełnioną funkcją, np.:

• polimeraza I - jej rolą jest usuwanie odcinków starterowych z fragmentów Okazaki oraz wycinanie uszkodzonych odcinków DNA w procesie naprawy,

• polimeraza II - funkcja tego enzymu nie jest zbyt dobrze poznana, wiadomo jednak, że wykazuje aktywność egzonukleolityczną,

• polimeraza III - jest właściwą polimerazą DNA, jej główną funkcją jest wstawianie nowych nukleotydów na końcu 3' nowopowstającej nici DNA.

Replikacja u bakterii rozpoczyna się od ori i przebiega w obu kierunkach jednocześnie przesuwając widełki replikacyjne, co prowadzi do powstania specyficznej struktury theta (struktura ta przypomina literę θ). Superskręcenia w rozplatanej nici DNA są niwelowane przy udziale topoizomerazy DNA ATP-hydrolizującej (EC 5.99.1.3). Replikacja u bakterii kończy się wówczas, gdy widełki replikacyjne rozpoznają specjalne sekwencje terminatorowe (u eukariotów mechanizm terminacji replikacji nie jest jeszcze poznany). U prokariota po zakończeniu procesu syntezy DNA dwie potomne, koliste cząsteczki są ze sobą splecione. Ich rozdzielenie jest możliwe dzięki topoizomerazie.

Replikacja DNA komórek eukariotycznych zachodzi jedynie w fazie S cyklu komórkowego. Istnieją specjalne mechanizmy molekularne, które pilnują, żeby cząsteczki DNA nie zostały skopiowane więcej niż raz przed każdym podziałem komórki oraz nie pozwalają komórce dzielić się przed zakończeniem replikacji DNA.

Replikacja DNA jest procesem bardzo dokładnym: polimeraza DNA rzadko popełnia błędy, a jeśli się pomyli i wbuduje zły nukleotyd w nową cząsteczkę DNA, potrafi rozpoznać swój błąd, wyciąć zły nukleotyd i na jego miejsce wbudować prawidłowy. Mimo tych mechanizmów ochronnych czasem zdarzają się przypadkowe błędy w replikacji (ich prawdopodobieństwo jest rzędu 1 błąd na 10⁹ nukleotydów). Takie błędy mogą doprowadzić do powstania mutacji.

Replikacja DNA nieprogramowana jest niezależna od cyklu komórkowego i jej głównym celem jest naprawa uszkodzonego DNA. Uszkodzony fragment DNA jest wówczas wycinany przez endo- i egzonukleazy. Na bazie matrycy (tj. drugiego łańcucha DNA), zgodnie z zasadą komplementarności zostaje odtworzony wycięty odcinek DNA przy udziale polimerazy. Powstały odcinek DNA jest następnie wbudowany w miejsce wycięcia przy pomocy ligazy DNA.

3.2.3. Transkrypcja

Transkrypcja to proces przepisania informacji zawartej w DNA na mRNA lub, w przypadku eukariota, na hnRNA (pre-mRNA). Jednostką transkrypcji jest operon, a proces katalizowany jest przez polimerazę RNA zależną od DNA (EC 2.7.7.6). W procesie transkrypcji powstają cząsteczki wszystkich trzech typów RNA, tj. rRNA, tRNA, mRNA.

Przed omówieniem procesu transkrypcji, konieczne jest zapoznanie się z budową operonu. Dzisiejsza wiedza (2006), wskazuje, że operony występują jedynie u organizmów prokariotycznych.

Model operonu

Kompletna cząsteczka białka zbudowana może być z kilku polipeptydowych podjednostek elementarnych (ewentualnie ze składników niepeptydowych, niekodowanych na DNA). Aby złożyć je w jedną całość potrzebne są wszystkie jej elementy składowe, czyli łańcuchy polipeptydowe. Każdy z nich może być kodowany przez inny gen strukturalny. Z punktu widzenia „komórki”, logiczne się wydaje, aby geny kodujące polipeptydy jednostkowe dla jednego białka były pod wspólną kontrolą (posiadały wspólny operon). Podobnie, proces biochemiczny katalizowany ściśle powiązanymi czynnościowo i zależnymi od siebie enzymami powinien być pod wspólną kontrolą, czyli posiadać wspólny operon.

Dla zobrazowania mechanizmu regulacji katabolizmu Jocob i Monod zaproponowali w 1961r. model operonu, wyjaśniający działanie genów odpowiedzialnych za metabolizm rozmaitych związków obecnych w komórce. W jego skład wchodzą: gen promotor „P”, za nim gen operator „O”, a następnie za nimi gen lub geny strukturalne, w ich sąsiedztwie lub zupełnie w innym miejscu DNA występuje gen regulatorowy „i” i jego promotor P_i,.

Gen regulatorowy „i”. Ten fragment DNA koduje budowę związku chemicznego zwanego represorem. Do promotora Pi przyłącza się polimeraza RNA i syntetyzuje represor „i”. Związek ten odwracalnie łączy się z operatorem „O”. Przy negatywnej regulacji, represor wiąże się z genem operatorem hamując transkrypcję. Przy pozytywnej regulacji, represor musi zostać uaktywniony efektorem i dopiero wtedy po związaniu się z operatorem inicjuje transkrypcję. Działanie operonu zależy, więc od obecności w środowisku (w komórce) związków chemicznych zwanych efektorami (induktorami transkrypcji). Są to związki chemiczne niskocząsteczkowe o właściwościach ligandów allosterycznych. Induktor jest najczęściej substratem dla jednego z enzymów kodowanych przez geny strukturalne danego operonu i stąd proces nazywany bywa indukcją substratową.

Gen promotor „P” to miejsce operonu, do którego przyłącza się polimeraza RNA w celu transkrybowania genu strukturalnego lub genów strukturalnych w postaci jednej nici mRNA (w tym drugim przypadku, mamy do czynienia z policistronowym mRNA). Aby polimeraza RNA mogła przyłączyć się w miejscu promotorowym potrzebny jest kompleks utworzony przez tzw. białkowy kataboliczny aktywator genu (CAP) z cAMP. Kompleks ten działa jako regulator dodatni, czyli w jego obecności zachodzi efektywna transkrypcja.

Gen operator „O”. O rozpoczęciu syntezy mRNA przez gen strukturalny decyduje specyficzny odcinek DNA, zwany genem operatorem. Locus operatora jest jedynie starterem i nie ulega transkrypcji. Jeden operator może być starterem dla kilku genów strukturalnych.

Geny strukturalne. Są to geny kodujące strukturę konkretnego białka (czyli jego budowę, a ściślej biorąc, sekwencję aminokwasów, które w nim występują). Jeżeli białko jest wielołańcuchowe, każdy ze sprzężonych genów kodujących jego budowę jest przepisywany na wielką cząsteczkę mRNA, która zawiera liczne i niezależne kodony startu translacji (AUG) i zatrzymania translacji (UAA) dla każdego polipeptydu składowego. Taki typ cząsteczki mRNA nazywa się policistronowym mRNA. Policystronowe mRNA występują głównie w organizmach prokariotycznych.

Hipoteza Jacoba i Monoda odnosi się do regulacji transkrypcji komórek prokariotycznych (np. u bakterii). Organizmy wyższe (eukariotyczne) wytwarzają znacznie więcej różnorodnych enzymów; zatem, regulacja metabolizmu komórkowego u nich jest bardziej złożona. Wiadomo, że u Eucaryota brak jest genu „i” i stąd represora. Regulacja genetyczna metabolizmu komórek jądrowych odbywa się prawdopodobnie zgodnie z hipotezą Brittena i Davidsona (1967 r.). Odpowiednikiem genu struktury jest producer gen. W producer genie zawarta jest informacja genetyczna i odbywa się transkrypcja RNA wszystkich rodzajów. Obok producer gen znajduje się receptor gen, który powoduje rozpoczęcie transkrypcji przez producer gen. Receptor gen jest odpowiednikiem operatora w hipotezie Jacoba-Monoda.

Mechanizm działania operonu

Zostanie on omówiony na przykładzie budowy i działania operonu laktozy u bakterii Escherichia coli. Operon laktozowy u E.coli jest systemem regulującym stężenie enzymów odpowiedzialnych za rozkład laktozy. Laktoza jest disacharydem zbudowanym z galaktozy i glukozy, połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym; ulega rozkładowi na monosacharydy składowe pod wpływem enzymu β-galaktozydazy. W przypadku braku laktozy w środowisku bytowania tych bakterii, system utrzymuje w komórkach E.coli niski poziom β-galaktozydazy. Natomiast w momencie, gdy w środowisku pojawi się laktoza, w komórkach następuje szybki wzrost stężenia β-galaktozydazy i pozostałych enzymów zaangażowanych w jej katabolizm (tj. permeazy β-galaktozydowej i transacetylazy β-galaktozydowej). Każdy z tych enzymów jest kodowany przez oddzielny gen jednak ich ekspresja ulega wspólnej regulacji. Operon laktozowy (operon lac) u E.coli zbudowany jest z 7-miu genów. W jego skład wchodzą (patrząc od 3'): gen regulatorowy „lac i” i jego promotor P_i, w ich sąsiedztwie występuje gen promotor „P”, za nim gen operator „O”, a następnie ułożone liniowo obok siebie trzy geny strukturalne „lac z”, „lac y” i „lac a”.

Geny strukturalne operonu lac odpowiedzialne są za syntezę trzech enzymów związanych z katabolizmem laktozy:

• lac „z” koduje β-gaktozydazę (EC 3.2.1.23), hydrolizującą laktozę do glukozy i galaktozy;

• lac „y” koduje permeazę laktozową, odpowiedzialną za transport laktozy do komórki;

• lac „a” koduje transacetylazę β-galaktozydazową (EC 2.3.1.18), biorącą udział w hydrolizie laktozy, o bliżej jeszcze nie znanej funkcji.

Gen regulatorowy „lac i” koduje białkowy represor transkrypcji operonu laktozowego. Ekspresja genu „lac i” jest konstytutywna (jest nieregulowana) i stąd zachodzi na stałym poziomie; w jej wyniku powstaje cząsteczka represora lac o budowie tetramerycznej. Cząsteczka ta zbudowana jest z 4 identycznych podjednostek o M.cz. 38kDa. W każdej komórce E.coli na 1 operon lac przypada normalnie 20÷40 cząsteczek tetramerowego represora. Przejawia ona wybitne powinowactwo do nukleotydów locus operatora laktozowego oraz do laktozy.

Gdy gen „lac i” jest zmutowany (np. celowo przez biotechnologa) i jego produkt - represor lac - nie wykazuje powinowactwa do operatora, wówczas wszystkie trzy białka kodowane w genach strukturalnych operonu lac są syntetyzowane konstytutywnie; ich biosynteza nie podlega kontroli przez indukcję substratową.

Locus operatora laktozowego jest to region dwuniciowego DNA o długości 27 par nukleotydów, mający 2-osiową symetrię rotacyjną (oś symetrii na rysunku wyróżniono czerwonym kolorem) w regionie obejmującym 21 par zasad:

5' AAT TGT GAG CGG ATA ACA ATT

3' TTA ACA CTC GCC TAT TGT TAA

W kierunku 3' od operatora znajduje się promotor, do którego przyłącza się polimeraza RNA w momencie rozpoczynania transkrypcji. Sekwencja operatora „nachodzi” kilkoma nukleotydami na sekwencję promotora. Dlatego, jeżeli do operatora przyłączony jest represor, polimeraza RNA zostaje zablokowana i transkrypcja genów strukturalnych jest uniemożliwiona.

Indukcja substratowa. Biosynteza wielu enzymów (zwłaszcza uczestniczących w katabolizmie lub biodegradacji) jest możliwa wyłącznie w obecności właściwego dla nich substratu lub jego strukturalnego analogu - są to tzw. enzymy indukcyjne. Do takich enzymów należy β-galaktozydaza wytwarzana przez E.coli.

Przy braku laktozy w podłożu hodowlanym bakterii E.coli represor lac dociera do locus operatora i wytwarza z nim połączenie, które uniemożliwia przesuwanie się polimerazy RNA wzdłuż nici DNA od miejsca promotora do genów strukturalnych. W tym przypadku transkrypcja genów strukturalnych jest zablokowana. Ten represor działa jako regulator negatywny (ujemny). Odblokowanie transkrypcji może nastąpić pod wpływem laktozy, która łącząc się z represorem, zmienia strukturę jego cząsteczek i powoduje ich oderwanie od operatora. Laktoza działa w tym układzie jako induktor substratowy, a mechanizm ten nosi nazwę indukcji substratowej.

Istotą mechanizmu regulacyjnego operonu laktozowego jest więc zdolność łączenia się represora z odcinkiem operatorowym lub jeszcze silniej z laktozą, jeżeli jest obecna w komórce bakterii. Pojawienie się laktozy w środowisku, umożliwia tym samym syntezę mRNA (oraz ekspresję genów kodujących enzymy rozkładające laktozę). Po wyczerpaniu substratu (w tym przypadku laktozy), niezmodyfikowane już cząsteczki represora znów łączą się z operatorem, przywracając wyjściową sytuację.

Małe ilości substratu (określane mianem induktora poronnego - w przypadku operonu lac laktozy lub jej analogu) są zdolne wniknąć do komórki nawet pod nieobecność permeazy. Te niewielkie ilości wystarczają do zapoczątkowania zjawiska indukcji substratowej, która narasta lawinowo. Induktor wywołuje derepresję operonu lac i wyzwala transkrypcję genów strukturalnych, co pozwala komórce na syntezę enzymów niezbędnych do katabolizmu laktozy.

Tak więc, enzymy indukcyjne powstają w komórce zawsze, ale pod nieobecność substratu w nieznacznych ilościach (tzw. poziom bazowy). Ta minimalna ilość enzymu wystarcza do oddziaływania na egzogenny substrat (jeśli jest on obecny w podłożu) i po jego degradacji uwolnienia bezpośredniego induktora, który wnika do komórki i włącza się w mechanizm transkrypcji. W tym przypadku ilość syntetyzowanego enzymu może wzrosnąć nawet 1000-krotnie. W momencie wyczerpania się substratu, ilość produkowanego enzymu zmniejsza się do poziomu bazowego. Z reguły natychmiast po wprowadzeniu substratu do podłoża (o ile komórka zwolniona jest z represji katabolicznej) uruchamiany jest mechanizm indukcyjny.

Mechanizm indukcji substratowej tłumaczy, dlaczego komórki E.coli produkują tylko tyle β-galaktozydazy, ile jest im potrzebne. Jednak w hodowlach bakterii sytuacja może stać się nieco bardziej skomplikowana, np. w przypadku, kiedy komórki bakterii mogą jednocześnie otrzymać laktozę i glukozę. Dla bakterii korzystniejsze jest zużywanie glukozy aniżeli laktozy, ponieważ glukoza może być natychmiast wykorzystywana w katabolizmie, a laktoza musi zostać najpierw dostarczona do wnętrza komórki i dalej rozłożona na monosacharydy składowe.

Dlatego też powstał mechanizm tzw. represji katabolicznej (zwany też "efektem glukozowym"), który umożliwia komórkom drobnoustrojowym zużywanie najpierw glukozy, a dopiero po jej zużyciu, laktozy. Na podobnych przesłankach oparty jest mechanizm blokowania syntezy enzymów biorących udział w katabolizmie wielu związków, w przypadku, gdy komórka posiada duży nadmiar energii zgromadzonej w postaci ATP lub innych trifosforanów nukleotydów.

Mechanizm represji katabolicznej polega na tym, że polimeraza RNA łączy się z promotorem znacznie efektywniej w obecności swoistego białka CAP (z ang. catabolite gene activator protein),
które musi być związane ze specyficznym miejscem operonu tzw. CBS (z ang. CAP binding site). Białko CAP wiąże się z tym miejscem tylko w formie kompleksu z cząsteczką cAMP. Jak już wcześniej opisano (rozdział 2.1.2. - cykliczne nukleotydy), cAMP powstaje z ATP pod działaniem cyklazy adenylanowej; enzym ten jest aktywowany niektórymi hormonami (np. adrenaliną), ale z kolei skutecznie hamowany glukozą.

Tak więc, jeżeli glukoza jest obecna w podłożu hodowlanym bakterii E.coli spada poziom cAMP, białko CAP zmienia kształt, nie wiąże się z CBS, polimeraza RNA słabiej wiąże się z promotorem i w konsekwencji biosynteza enzymów biorących udział w katabolizmie laktozy zostaje spowolniona.

Po wyczerpaniu glukozy z podłoża hodowlanego bakterii, wytwarzanie cAMP jest z powrotem przywrócone i jeżeli w podłożu jest obecna laktoza uruchomiona zostaje biosynteza enzymów odpowiedzialnych za jej katabolizm. Ponadto istnieje mechanizm, który skłania bakterie do gromadzenia cAMP w komórce, w przypadku braku łatwo przyswajalnego źródła węgla (np. glukozy, glicerolu, itp.).

Inne mechanizmy regulacji transkrypcji. Wiele wskazuje na to, że represja kataboliczna u części gatunków bakterii z rodzaju Bacillus może być związana ze zmianą powinowactwa polimerazy RNA do matrycy DNA. Centralną rolę regulatora globalnych procesów komórkowych u tych bakterii pełni gen spo0A Pod pozytywną kontrolą tego genu znajduje się gen spo0H (sig H), który odpowiedzialny jest za syntezę podjednostki sigma^H polimerazy RNA (podjednostka sigma polimerazy RNA inicjuje transkrypcję rozpoznając promotora). Najwydajniej działa polimeraza RNA z podjednostką sigma^H, podczas gdy inne odmiany podjednostki sigma są mniej efektywne. Gen spo0A jest kontrolowany przez poziom GTP w komórce, a ten z kolei zależy od stężenia glukozy. Wysoki poziom GTP w komórce lub obecność glukozy hamują ekspresję genu spo0A i tym samym biosyntezę podjednostki sigma^H.

Model regulacji rozkładu laktozy w operonie lac jest jednym z wielu, jakie funkcjonują w komórkach bakteryjnych. Jest to przykład pozytywnej regulacji ekspresji gdyż obecność substratu w pożywce indukuje produkcję enzymów.

Znane są również modele regulacji ekspresji genów związane z dążeniem komórki do efektywnego wykorzystania surowców, ale jednocześnie blokujące nadprodukcję jakiejś substancji bez wyraźnej potrzeby. Do tego typu mechanizmów regulacji należy represja na zasadzie sprzężenia zwrotnego, czyli hamowanie syntezy enzymów szlaku biosyntetycznego w odpowiedzi na nadmiar końcowego produktu. Przykładem operonu regulowanego w ten sposób jest operon tryptofanowy (trp).

Operon ten zawiera pięć genów (E,D,C,B,A) kodujących enzymy, które prowadzą do syntezy tryptofanu. W przypadku operonu tryptofanowego również mamy do czynienia z cząsteczką represora kodowaną w niewielkiej odległości od operonu. Cząsteczka represora trp podobnie jak lac może istnieć w dwóch konformacjach: jedna powoduje łączenie z operatorem i zablokowanie transkrypcji, natomiast druga konformacja nie pozwala na związanie się represora z operatorem i umożliwia zajście transkrypcji. W obecności tryptofanu cząsteczka represora wiąże się z nim i zmienia konformację, na taką, która umożliwia związanie się z operatorem i zablokowanie syntezy enzymów. Jeżeli tryptofan jest nieobecny, represor nie może związać się z operatorem. Dochodzi wtedy do przyłączenia polimerazy RNA i syntezy enzymów, które w następstwie doprowadzą do syntezy tryptofanu.

Oba opisane mechanizmy regulacji ekspresji genów, czyli indukcja operonu lac i represja operonu trp są przykładami na kontrolę negatywną. Oznacza to, że ekspresja genów podlegających takiej kontroli zachodzi dopóki nie zostanie wyłączona przez cząsteczkę represora.

Istnieje jeszcze model pozytywnej regulacji ekspresji genów, co z kolei oznacza, że geny znajdujące się pod taką kontrolą ulegają ekspresji dopiero pod wpływem działania specyficznego białka regulatorowego. Przykładem tego typu regulacji może być opisana już wcześniej aktywacja kompleksu promotor-polimeraza RNA operonu lac przez wiązanie się białka CAP do CBS.

Innym przykładem regulacji pozytywnej jest katabolizm maltozy u E.coli. Enzymy do rozkładu maltozy są syntetyzowane dopiero po dodaniu maltozy do pożywki. Ich synteza jest regulowana na poziomie transkrypcji przez białko aktywujące (AP-activator protein). AP nie może związać się z DNA dopóki nie połączy się z cząsteczką maltozy. Gdy AP zwiąże się z cząsteczką maltozy, kompleks taki łączy się z DNA i umożliwia polimerazie RNA rozpoczęcie transkrypcji. Aktywator podobnie jak represor rozpoznaje specyficzną sekwencję DNA tzw. miejsce wiązania aktywatora. Geny potrzebne do katabolizmu maltozy znajdują się w kilku operonach wobec czego aktywator kontroluje więcej niż jeden operon. Grupa operonów regulowanych przez jedno białko aktywujące nazywana jest regulonem.

Atenuacja. Atenuacja jest typem regulacji biosyntezy niektórych aminokwasów w organizmach prokariotycznych. Najlepiej poznanym przykładem atenuacji jest kontrola biosyntezy tryptofanu. Operon tryptofanowy trp, poza wspomnianymi już wcześniej genami strukturalnymi (E,D,C,B,A) kodującymi enzymy niezbędne do syntezy tryptofanu, zawiera tzw. sekwencję liderową. W jej obrębie znajduje się region atenuatora kodujący polipeptyd zawierający przy końcu kodony tryptofanu.

Transkrypcja i translacja w komórkach bakterii zachodzą praktycznie jednocześnie. Sekwencja liderowa jako pierwsza ulega transkrypcji i gdy następne fragmenty mRNA są dopiero transkrybowane, rozpoczyna się już translacja. Jednakże mRNA sekwencji liderowej po uwolnione z DNA i połączeniu się z rybosomem zaraz po zsyntetyzowaniu peptydu liderowego ulega sfałdowaniu w podwójną pętlę. W konsekwencji powoduje to zatrzymanie transkrypcji dalszych genów tryptofanowych.

Przy niedoborze tryptofanu w komórce peptyd liderowy nie powstaje. Nie dochodzi do translacji mRNA sekwencji liderowej, gdyż zostaje ona zatrzymana na kodonie tryptofanowym. W konsekwencji konformacja mRNA nie ulega niekorzystnemu sfałdowaniu i nie dochodzi do zablokowania polimerazy RNA, która przechodzi dalej do transkrypcji genów tryptofanowych.

Podobne modele atenuacji odkryto w innych szlakach metabolicznych bakterii np. w biosyntezie histydyny czy fenyloalaniny.

Mechanizm transkrypcji

Proces transkrypcji można podzielić na trzy etapy:

• inicjację transkrypcji,

• elongację łańcucha RNA (pre-mRNA),

• terminację.

Inicjacja transkrypcji. Rozpoczęcie transkrypcji polega na związaniu się polimerazy RNA zależnej od DNA ze specjalną sekwencją nukleotydów promotora. Polimeraza przeszukuje DNA (u bakterii, przesuwając się po DNA z prędkością ok.1000 par zasad na sekundę) i kiedy natrafi na sekwencję promotorową, związuje się z nią i rozsuwa nici DNA (na odcinku kilkunastu nukleotydów). Na tym odcinku DNA chwilowo przestaje być dwuniciowe, zostaje rozplecione na dwa pasma - pasmo matrycowe i pasmo kodujące, wiązania wodorowe pomiędzy pasmami DNA zostają rozerwane.

Schemat przebiegu transkrypcji

Polimerazy RNA u bakterii są skomplikowanymi enzymami składającymi się z kilku podjednostek. Enzym zawiera przeważnie 4 podstawowe podjednostki: α - w dwóch kopiach, β i jej odmianę β' oraz dodatkowo podjednostkę σ (sigma). Ta oststnia jest luźno związana z pozostałymi i łatwo może oddysocjować. Podjednostka σ bierze udział tylko w tworzeniu początkowego kompleksu polimerazy RNA z DNA i jest odpowiedzialna za rozpoznanie sekwencji nukleotydów promotora: sekwencji -35 od miejsca inicjacji i sekwencji Pribnowa (5'-TATAAT-3') w regionie -10 od miejsca inicjacji (właściwa transkrypcja zaczyna się od nukleotydu +1). Rozsunięcie nici DNA na odcinku kilkunastu nukleotydów pozwala na wstawianie kolejnych nukleotydów tworzonego łańcucha mRNA. Substratami są trifosforany rybonukleozydów (ATP, GTP, CTP, UTP). Transkrypcja zaczyna się od wytworzenia kilku krótkich transkryptów (każdy z reguły zbudowany z kilku nukleotydów). Dopiero po oddysocjowaniu podjednostki σ rozpoczyna się kolejny etap transkrypcji, czyli elongacja (wydłużanie mRNA).

Elongacja transkrypcji polega na syntezie łańcucha mRNA, komplementarnego do matrycowego pasma DNA. Bakteryjna polimeraza RNA składa się z dwóch części: rdzeniowej i katalitycznej. Część rdzeniowa polimerazy odpowiada za wyszukanie na zasadzie komplementarności odpowiedniego nukleotydu RNA i przyłączenie go do DNA nietrwałymi wiązaniami wodorowymi. Katalityczna część polimerazy odpowiada za wytworzenie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy nukleotydami RNA. Polimeraza przesuwa się wzdłuż DNA, rozplatając obie nici i syntetyzując komplementarną cząsteczkę RNA. Powstająca cząsteczka mRNA (transkrypt) wydłuża się (początek jest od strony 5') i stopniowo odrywa od DNA, które wraca do wyjściowej postaci (obie nici DNA łączą się ze sobą). Etap elongacji kończy się, gdy polimeraza RNA dotrze do terminatora.

Terminacja transkrypcji. W momencie, gdy polimeraza RNA dotrze do terminatora, czyli sekwencji nukleotydów na DNA wyznaczającej zakończenie transkrypcji, zatrzymuje się i odczepia od DNA. Powstały transkrypt odłącza się od matrycowego pasma DNA, zaś DNA wraca do dawnej postaci.

Znane są dwa mechanizmy terminacji transkrypcji:

• Sekwencja terminatora bogata jest w zasady C i G, co umożliwia tworzenie się na zsyntetyzowanym fragmencie RNA struktury tzw. "szpilki do włosów" (hairpin), która zatrzymuje polimerazę RNA, co powoduje rozpad kompleksu polimeraza - DNA - RNA.

• Do określonej sekwencji nukleotydów na DNA przyłącza się białko ρ (rho) zwane czynnikiem uwalniającym, które po związaniu z DNA uniemożliwia dalszą elongację.

3.2.4. Translacja

Translacja to proces biosyntezy białka, polegający na przetłumaczeniu (z ang. translate) sekwencji nukleotydów zawartej w mRNA (czyli kodu przepisanego z DNA) na sekwencję aminokwasów w tworzonym białku. Proces zachodzi w cytoplazmie i wymaga obecności rybosomów (rRNA), mRNA, energii (pochodzącej ze związków wysokoenergetycznych, np. ATP, GTP), aktywnych aminokwasów połączonych z tRNA (aminoacylo-tRNA) oraz rozmaitych faktorów.

Translacja przebiega w kilku etapach: inicjacja, elongacja, terminacja i wreszcie uwolnienie oraz sfałdowanie powstałego polipeptydu przy wykorzystaniu całej maszynerii, jaką jest rybosom.

Są dwie ważne reguły dotyczące kierunku translacji: po pierwsze translacja postępuje od 5' do 3' końca mRNA, po drugie białko rośnie od końca aminowego do karboksylowego.

Zgodnie z regułami tego podręcznika opis procesu translacji zostanie ograniczony do organizmów prokariotycznych (ponadto w znacznym uproszczeniu).

Dla przypomnienia: u Prokaryota rybosomy składają się z dwóch podjednostek: 30S i 50S dających w połączeniu rybosom 70S. Aktywacja aminokwasów (tworzenie aminoacylo-tRNA) odbywa się przy udziale ATP i ligaz (dawniej: syntetaz) amino-acylo-tRNA - porównaj: str.55.

Inicjacja. U prokariotów pierwszym kodonem na mRNA ulegającym translacji jest AUG lub wyjątkowo u niektórych bakterii GUG (tzw. kodony startu), kodujące formylometioninę (u Prokaryota synteza dowolnego łańcucha polipeptydowego rozpoczyna się zawsze od wbudowania formylometioniny).

Inicjacja biosyntezy polipeptydu zaczyna się od uformowania kompleksu składającego się z:

• podjednostki 30S rRNA,

• formylometionylo-tRNA,

• czynników inicjatorowych (IF1 do IF5),

• związków wysokoenergetycznych,

• oraz najważniejszego składnika, czyli mRNA właściwego dla syntezy konkretnego białka.

Związanie mRNA z rybosomem zależy od tzw. sekwencji Shine-Dalgarno (3 do 9 nukleotydów zlokalizowanych przed kodonem inicjacyjnym na mRNA). Ta sekwencja jest komplementarna do 3' końca 16S RNA rybosomu i pozwala komórkom prokariotycznym na translację policystronowego mRNA.

Do kompleksu inicjującego przyłącza się następnie duża podjednostka rybosomalna (50S). Przyłączenie dużej podjednostki wymaga obecności IF2 oraz jonów magnezu (niezbędna energia pochodzi z wcześniej przyłączonego GTP). W efekcie powstaje pełny aparat translacyjny. W aparacie tym można wyróżnić dwa centra: centrum peptydylowe P i centrum akceptorowe A. Pierwszy aktywny aminokwas - czyli formylometionylo-tRNA - ulokowany zostaje w centrum peptydylowym P.

Inicjacja translacji u Eucaryota odbywa się nieco inaczej. Najpierw rybosomy ulegają zdysocjowaniu na dwie podjednostki: na małą 40 S i dużą 60 S. Przy udziale jonów magnezu Mg²⁺ i IF 1 (faktor inicjujący 1), mRNA zostaje przyłączony do podjednostki 40S oraz zostaje związany GTP. Według hipotezy Bretschera inicjacja translacji u Eucaryota rozpoczyna się od metioniny (kod AUG). Według tej hipotezy podjednostka rybosomalna 40S zanim zwiąże się z mRNA, łączy się z metionylo-tRNA. Dopiero potem, przy udziale energii z ATP i IF 2÷5 zostaje przyłączony mRNA. W związku z tym, w czasie syntezy białek metionina jest transportowana przez dwa różne tRNA: metionylo-tRNA_Front i metionylo-tRNA_Middle. Met.-tRNA_Middle wbudowuje metioninę wewnątrz łańcucha polipeptydowego (czyli aminokwas ten rzeczywiście wchodzi w skład tworzonego białka). Natomiast Met.-tRNA_Front jest wyłącznie punktem startowym biosyntezy dowolnego białka. Do kompleksu inicjującego przyłącza się następnie duża podjednostka rybosomalna (60S), co tworzy pełny aparat translacyjny. Pozostałe aspekty translacji są identyczne jak u Prokariota.

Elongacja - czyli wydłużanie syntetyzowanego łańcucha polipeptydowego. Po złożeniu rybosomu w całość, tj. przyłączeniu większej podjednostki rRNA, do powstałego układu dostarczane są kolejne aminoacylo-tRNA (aktywne aminokwasy) i umieszczane w centrum akceptorowym A. Rybosom przesuwa się stopniowo wzdłuż nici mRNA, do której na zasadzie komplementarności dopasowują się cząsteczki aminoacylo-tRNA. Dopasowanie to polega na odnalezieniu odpowiedniego kodonu na mRNA przez antykodon tRNA. I tak przykładowo kod AGU odnajdzie tRNA zawierający antykodon UCA niosący serynę.

Tak więc, drugi aminokwas łańcucha polipeptydowego jest dostarczany do miejsca translacyjnego rybosomu przez tRNA, którego antykodon pasuje do drugiego kodonu mRNA. Ten drugi aminoacylo-tRNA umieszczony zostaje w centrum akceptorowym A. Transpeptydaza przenosi acyl pierwszego aminokwasu (czyli formylometioniny) na grupę -NH₂ aminokwasu umiejscowionego w centrum akceptorowym A, przy udziale faktora EF 2 i GTP dostarczającego niezbędną energię. W tym samym momencie od rybosomu odszczepia się pierwszy tRNA (ten startowy, kodujący formylometioninę), a powstały dipeptyd wraz z przytrzymującym go tRNA przesuwa się do centrum peptydylowego P. Wolne centrum akceptorowe A aparatu translacyjnego wiąże kolejny amino-acylo-tRNA odpowiedni do kodonu mRNA. Zatem elongacja to kolejne przyłączanie aminokwasów do tworzonego polipeptydu.

Ogólny schemat translacji

Podczas tłumaczenia każdego kodonu do wydłużającego się łańcucha polipeptydowego dodawany jest jeden aminokwas. Proces ten powtarza się aż do momentu, gdy wszystkie kodony sekwencji kodującej ulegają translacji. Gotowy łańcuch polipeptydowy uwalniany jest z chwilą, gdy aparat translacyjny dotrze do sygnału końca translacji, czyli do jednego z trzech kodonów stop (UAA, UAG lub UGA).

Terminacja. W centrum akceptorowym A pojawia się mRNA z nonsensowną trójką rybonukleotydów, np. UAA, która nie koduje żadnego aminokwasu i tym samym nie ma dla siebie tRNA z odpowiednim antykodonem. Tak więc, centrum A zostaje puste. Polipeptyd z centrum peptydowego P zostaje przesunięty do centrum A i nie znajduje tam dla siebie akceptora - aminoacylo-tRNA - ulega więc odczepieniu od aparatu translacyjnego. Przy udziale TF (termination factor) i energii z GTP następuje rozpad aparatu translacyjnego i uwolnienie polipeptydu. Białko wytworzone w translacji posiada strukturę I-rzędową.

3.3. MUTACJE GENÓW

Mutacje, czyli trwałe zmiany informacji genetycznej zapisanej w DNA powielane podczas kolejnych replikacji. Są one najczęściej wynikiem błędu w działaniu polimerazy DNA naprawiającej uszkodzenia cząsteczki DNA. Te błędy mogą powstawać w wyniku działania czynników chemicznych (np. analogów zasad azotowych, azotynów, benzopirenu, nitrozoaminy), fizycznych (np. promieniowania UV lub jonizującego), biologicznych (działanie wirusów) albo pojawiają się zupełnie spontanicznie np. podczas replikacji DNA.

Mutacje zmieniające sekwencję nukleotydów jednego genu nazywamy mutacjami genowymi. Znanych jest kilka typów mutacji genów.

Substytucja. Jedna z zasad azotowych w DNA zostaje zamieniona na inną. Na przykład:

...CAGTCT... → ...CAATCT....

W wyniku tej mutacja, guanozyna G została zamieniona na adenozynę A.

Kiedy zasady purynowe (A,G) lub pirymidynowe (C,T) przechodzą nawzajem w siebie (np. G→A, T→C, itp.), to taką mutację nazywamy tranzycją.

Kiedy natomiast zasady purynowe przechodzą w pirymidynowe lub odwrotnie (np. A→T, A→C, T→G, itp.), to mamy do czynienia z transwersją.

Najczęstszą mutacją, zachodzącą w DNA jest tranzycja: G→A.

Konsekwencje mutacji typu substytucji mogą być różnorodne. Zależą one od miejsca wystąpienia w genie lub od genu, w którym one zachodzą.

I tak w podanym przykładzie: ...CAGTCT... → ...CAATCT..., jeżeli ta tranzycja zaszła w genie promotorowym operonu, może nie mieć żadnego znaczenia, ale może też zupełnie zablokować transkrypcję (np. zniekształcając sekwencję nukleotydów miejsca przyłączania polimerazy RNA).

Ta sama mutacja w locus operatora, może rozregulować proces indukcji substratowej - białko represorowe nie będzie przyłączać się do operatora i biosynteza danych białek stanie się konstytutywna.

Jeszcze poważniejsze zmiany mogą wystąpić, gdy miejsce tej mutacji leży w obszarze DNA kodującym biosyntezę tRNA lub rRNA.

Jednakże najciekawsze efekty obserwować będzie można, jeśli omawiana mutacja zaszła w obszarze genów strukturalnych operonu; jej skutkiem może być zmiana właściwości białka kodowanego w tym obszarze. Istotne jest przy tym, który nukleotyd kodonu uległ tranzycji (lub transwersji). Jeśli jest to trzeci nukleotyd (N₃' po transkrypcji na mRNA), istnieje duże prawdopodobieństwo, że kodowany aminokwas nie zmieni się (odsyłam do hipotezy tolerancyjnej Cricka). Jeśli jest to drugi nukleotyd kodu (N₂'), aminokwas w łańcuchu polipeptydowym najprawdopodobniej zmieni się. Ale i w tym przypadku zmiana właściwości białka niekoniecznie musi być istotna - np. zamiana leucyny na izoleucynę lub na walinę nie powinna prowadzić do jakiś istotnych zmian biologicznych właściwości białka. Ale zmiana np. Ser na Ala, His na Gli, itp. może mieć kluczowe znaczenia dla utraty właściwości biologicznych tego białka.

Delecja lub insercja. Delecja zachodzi, kiedy jeden lub więcej nukleotydów gubiony jest w sekwencji DNA. Insercja, kiedy wstawiony zostaje jeden lub więcej nukleotydów do sekwencji DNA.

Wstawienie lub zgubienie jednego lub dwóch nukleotydów w sekwencji DNA, prowadzi do zmiany całej sekwencji nukleotydów od miejsca delecji lub insercji. Podobny efekt będzie obserwowany, jeśli zostaną wbudowane trzy nukleotydy, pomiędzy nukleotydy należące do tego samego tripletu lub zgubione trzy nukleotydy należące do sąsiadujących tripletów. Oczywiście, że takie białko od tego miejsca będzie posiadało zupełnie inną sekwencję aminokwasów aniżeli białko „normalne”. Tym niemniej, jeśli ta zmiana przypada na końcowe fragmenty łańcucha polipeptydowego, „nowe” białko może zachować właściwości biologiczne białka „normalnego”, może zmienić się nieco specyficzność substratowa enzymu (jeśli to jego białko było kodowane), natomiast jego właściwości fizyko-chemiczne (np. optymalne pH działania, pI, termostabilność, itp.) mogą się nawet znacznie różnić.

Zupełnie inny efekt będzie obserwowany, jeśli trzy nukleotydy zostaną wstawione bezpośrednio za jakimś tripletem (trójką nukleotydów kodujących dany aminokwas). Spowoduje to wstawienie dodatkowego aminokwasu między aminokwasy "prawidłowego" łańcucha polipeptydowego. Podobnie delecja trzech nukleotydów kodujących jakiś aminokwas spowoduje jedynie skrócenie łańcucha polipeptydowego o jeden aminokwas, nie zmieniając sekwencji aminokwasów ani przed, ani po zgubionym aminokwasie.

Przykładem delecji trzech nukleotydów w DNA kodujących dany aminokwas są subtilizyny. Subtilizyny typu BPN' (m.in. z Bacillus subtilis) posiadają 275 reszt aminokwasowych, a subtilizyna typu Carlsberg (m.in. z Bacillus licheniformis) posiada 274 reszty aminokwasowe. Subtilizyny Carlsberg i BPN mają różne reszty aminokwasowe w 84 miejscach oraz brak aminokwasu w subtilizynie Carlsberg w 56 pozycji. Pomimo tych różnic subtilizyny mają identyczne centrum aktywne i przejawiają identyczny mechanizm działania.

Dimeryzacja - kiedy dwie sąsiednie zasady azotowe w DNA utworzą dimer. W DNA zasady C i T mają tendencję do tworzenia dodatkowych wiązań między sobą pod wpływem promieniowania ultrafioletowego. Powstają wtedy dimery typu: TT lub CT. Na rysunku obok przedstawiono strukturę dimeru TT powstałego na jednej z nici DNA. Grubymi liniami zaznaczono 2 wiązania typu cyklobutanu między położonymi obok siebie resztami tyminy.

Zapis w DNA staje się w miejscu dimeryzacji nieczytelny podczas replikacji i transkrypcji. Światło słoneczne zawiera sporo promieni UV i naświetlane długo komórki skóry mogą, wskutek mutacji, stracić ważne informacje w swym materiale genetycznym, co może prowadzi do powstania raka skóry.

Wszystkie omówione dotąd mutacje zachodziły w pojedynczym genie. W zapisie genetycznym mogą jednak pojawiać się większe mutacje, dotyczące całych genów, a nawet chromosomów. Te zagadnienia wchodzą w zakres problematyki omawianych na poziomie biologii molekularnej, a także biochemii klinicznej (wiedzy przeznaczonej dla przyszłych lekarzy).

ROZDZIAŁ 4. ELEMENTY ENZYMOLOGII

Enzymy są swoistymi białkami, katalizującymi reakcje chemiczne zachodzące w ożywionej przyrodzie. Pod pojęciem katalizy enzymatycznej rozumie się zwiększenie szybkości reakcji termodynamicznie możliwych (nawet milionkrotne), jedynie poprzez zmniejszenie energii aktywacji cząsteczek substratu bez naruszania stanu końcowej równowagi. Enzym w zasadzie pozostaje w stanie nie zmienionym po zakończeniu reakcji; choć w niektórych przypadkach jego części składowe, a konkretnie koenzymy mogą być kosubstrami reakcji i ulec zmianie po jej zakończeniu.

Zdecydowana większość enzymów ma budowę białkową. Niektóre z nich są białkami prostymi, zbudowanymi wyłącznie z aminokwasów (np. większość hydrolaz). Jednak w przeważającej liczbie składają się one z części białkowej (apoenzymu) i niebiałkowej tzw. grup prostetycznych i koenzymów. Pod nazwą grupa prostetyczna rozumie się różnorodne niebiałkowe niskocząsteczkowe związki chemiczne (sacharydy, żelazoporfiryny, itp.) silnie związane z apoenzymem i jony metali. Koenzymy zaś są witaminami lub ich pochodnymi. Ich połączenie z apoenzymem określa się mianem holoenzymu. Trwałość tego połączenia jest różna; obecnie (2007) przyjmuje się, że typowe koenzymy łatwo oddysocjowują od apoenzymu (bywają często kosubstratem reakcji enzymatycznej); natomiast koenzymy trwale związane z apoenzymem uważa się za grupy prostetyczne (występują one zazwyczaj w kompleksach enzymatycznych).

Apoenzym jest czynny wyłącznie w połączeniu z koenzymem lub grupą prostetyczną i decyduje o swoistości substratowej enzymu, a niekiedy również kierunkowej, np. dekarboksylację i transaminację aminokwasów katalizują enzymy o różnych apoenzymach i tych samych koenzymach.

Dla porządku należy wspomnieć, iż aktywność biokatalityczną mogą również wykazywać cząsteczki kwasów nukleinowych (Nagroda Nobla w 1989 roku dla G. Altmana i T. Czecha).

4.1. Ogólne właściwości katalityczne enzymów

Szczególną cechą enzymów jest ich duża specyficzność (określana także jako wybiórczość czy swoistość) zarówno pod względem rodzaju katalizowanej reakcji chemicznej - tzw. specyficzność kierunkowa, jak i wobec związków (substratów) biorących w niej udział - tzw. specyficzność substratowa. Swoistość idzie często tak daleko, że enzym rozróżnia odmianę stereoizomeryczną substratu, działając wyłącznie na jedną z nich - tzw. stereospecyficzność. Nic więc dziwnego, iż enzymy mogą katalizować w sposób wybiórczy takie przekształcenia, których trudno lub wręcz nie można dokonać w inny znany sposób.

Specyficzność kierunkowa. Określony enzym katalizuje na ogół jeden typ reakcji chemicznych (np. utlenienie, hydrolizę, syntezę, itp.). Dokonuje on niejako selekcji wśród możliwych reakcji, wybierając jedną z nich. Na przykład cząsteczka glukozo-6-fosforanu może w komórce ulec wielu różnym przemianom, w tym utlenieniu (do laktonu kwasu 6-fosfoglukonowego), izomeryzacji (do fruktozo-6-fosforanu) czy też mutarotacji (do glukozo-1-fosforanu).

Każda z tych reakcji jest katalizowana przez inny enzym: pierwszą katalizuje dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu, drugą - izomeraza heksozofosforanowej, wreszcie trzecią - fosfoglukomutaza.

Specyficzność substratowa. Od specyficzności działania enzymu należy odróżnić jego specyficzność substratową, polegającą na katalizowaniu przez dany enzym przemiany chemicznej tylko jednego określonego substratu lub ograniczonej ich liczby. Znane są enzymy, wykazujące absolutną wybiórczość wobec substratu: np. ureaza działa tylko i wyłącznie na mocznik powodując jego rozpad, dehydrogenaza metanolowa utlenia jedynie metanol. Jednakże nie wszystkie enzymy wykazują tak daleko posuniętą specyficzność substratową, np. endopeptydazy, lipazy czy amylazy hydrolizują większość swoich substratów tj. odpowiednio białek, lipidów oraz pochodnych α-glukanu niezależnie od specyficznych cech budowy tych związków. O tych enzymach mówi się, że wykazują szeroką specyficzność (są mało specyficzne). Ich przeciwieństwem są enzymy o wąskiej specyficzności (wysoko specyficzne).

Stereospecyficzność. W Rozdziale 1 tego podręcznika omówiono zjawisko izomerii związków chemicznych. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub trans, α- lub β-, D- lub L-, itp. Klasycznym przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa, która przekształca bursztynian^* do fumaranu (odmiana trans kwasu etenodikarboksylowego-1,2). Kwas maleinowy (odmiana cis kwasu etenodikarboksylowego-1,2) nie tylko, że nie powstaje w tej reakcji, lecz ją hamuje.

Innym przykładem, który dobrze obrazuje zagadnienie stereospecyficzności enzymów, jest α-glukozydaza. Ta hydrolaza działa na wszystkie α-D-glukopiranozydy, nie biorąc jednak udziału w reakcjach hydrolizy innych glikozydów (np. β-D-glukopiranozydów, fruktofuranozydów, itp.). Z kolei subtilizyna (serynowa endopeptydaza z B.subtilis) z mieszaniny racemicznej estrów N-acetyloaminokwasów hydrolizuje jedynie formę L-aminokwasu.

Znane są enzymy wykazujące regioselektywność. Rozpoznają one miejsce w cząsteczce związku chemicznego (np. atom węgla, grupę funkcyjną, itp.), w którym pod działaniem enzymu następuje przekształcenie właściwe dla jego specyficzności kierunkowej. Takie właściwości przejawiają m.in. monooksygenazy, które mogą selektywnie wbudowywać atom tlenu w jedno, ściśle określone miejsce cząsteczki, hydroksylując ją. Niektóre z nich, hydroksylujące np. progesteron, mogą przejawiać jednocześnie stereospecyficzność. To, czy hydroksylowanie nastąpi w pozycji  lub  oraz w którym pierścieniu i przy którym atomie węgla zależy, z jakiego drobnoustroju pochodzi enzym. Monooksygenazy bakterii B.megaterium ATCC, jako jedne z nielicznych, hydroksylują progesteron przy 15 atomie węgla w pozycji  i  Monooksygenazy szczepu B.megaterium KM hydroksylują progesteron w kilku pozycjach: 15  i , 6  oraz 11.

Natomiast tautomerazy, epimerazy lub Δ-izomerazy przekształcają jeden izomer w drugi. Przykładem może być epimeraza UDP-glukozowa przekształcająca UDP-1-glukozę w UDP-1-galaktozę.

4.2. Istota katalizy enzymatycznej

Według aktualnej wiedzy, katalityczne działanie enzymów związane jest ze zjawiskiem międzycząsteczkowych oddziaływań. Enzym (E) i substrat (S) - ewentualnie substraty - tworzą przejściowo połączenie ES, w którym na skutek specyficznych właściwości centrum katalitycznego enzymu następuje aktywacja cząsteczki substratu z jednoczesnym osłabieniem niektórych jego wiązań kowalencyjnych. Uaktywniony kompleks ES przekształca się w połączenie EP, gdzie P oznacza produkt reakcji. W końcowym etapie połączenie EP rozpada się na wolny enzym i produkt reakcji. Schematycznie reakcję taką można zapisać równaniem:

Dokładne poznanie natury oddziaływań odpowiedzialnych za katalizę enzymatyczną jest przedmiotem badań i rozważań w literaturze naukowej od wielu lat. Pionierami w tej dziedzinie byli E. Fischer, pierwszy sugerujący komplementarność centrów aktywnych enzymów do substratów, oraz L.Pauling, autor koncepcji silnej stabilizacji stanu przejściowego przez centrum aktywne. Od tego czasu, pojawiało się wiele alternatywnych propozycji jak teoria naprężeń sterycznych, optymalnego nałożenia orbitali, elektrostatycznego klucza i zamka, itp.

Jedno z bardziej nowoczesnych opracowań na temat czynników odgrywających rolę w katalizie enzymatycznej zawarł w swojej książce Warshel. Na drodze rozważań teoretycznych (półempirycznych) dochodzi on do wniosku o dominującej roli oddziaływań o naturze elektrostatycznej w katalizie enzymatycznej. Warshel rozpatruje następujące czynniki, które w różnych modelach teoretycznych proponowano jako źródło aktywności katalitycznej enzymów:

• naprężenia steryczne;

• desolwatację reagentów;

• optymalne nakładanie orbitali (OS);

• wiązania wodorowe o niskiej barierze przeniesienia protonu (LBHB);

• efekty dynamiczne;

• zmiany entropii w wyniku wiązania z enzymem,

• oddziaływania elektrostatyczne w preorientowanym, polarnym centrum aktywnym.

Zmiany energii swobodnej podczas reakcji niekatalizowanej i enzymatycznej można przedstawić schematycznie (rysunek obok). Wielkość energii swobodnej tworzenia stanu przejściowego wyznacza barierę energetyczną dla całej reakcji. Ta bariera dla reakcji enzymatycznej jest wyraźnie niższa (o ∆G_E) niż bariera energetyczna dla reakcji niekatalizowanej. Enzymy: zmniejszając energię swobodną tworzenia stanu przejściowego znacznie przyspieszają przekształcenie substratów w produkty.

4.2.1. Mechanizm działania enzymów

W czasie reakcji enzymatycznej cząsteczka substratu jest wiązana w określonym obszarze do cząsteczki enzymu w tzw. centrum aktywnym, przez co tworzy się kompleks enzym-substrat. Dzięki specyficznemu rozkładowi grup chemicznych w centrum, enzym oddziałuje na ugrupowania chemiczne substratu rozluźniając konkretne wiązanie chemiczne. W wyniku rozerwania tych wiązań substrat przekształca się w produkt, który uwalniany jest z kompleksu z enzymem. Enzym po powrocie do formy pierwotnej (w enzymach złożonych po przyłączeniu przenoszonych grup do innego związku) tworzy nowy kompleks z następną cząsteczką substratu itd. 

Mechanizm łączenia enzymu z substratem tłumaczy się obecnie indukowanym dopasowaniem, polegającym na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu i przekształceniu go w produkt. Przy tym enzym może zniekształcić substrat wymuszając w nim konformację podobną do stanu przejściowego. Przykładem może być wiązanie glukozy z heksokinazą.

Centrum aktywne enzymów. Centrum aktywne to określony obszar cząsteczki białka enzymatycznego, w którym podczas katalizy następuje wiązanie substratu i następnie jego przekształcenie w produkt względnie produkty reakcji. Specyficzność kierunkowa i substratowa enzymów, a także wiele ich właściwości, zdeterminowanych jest budową centrum aktywnego. Przyjmuje się, że centrum aktywne enzymów zlokalizowane jest w głębi globularnej cząsteczki białka w kieszonce kształtem przypominającej szczelinę lub rowek. Obszar centrum aktywnego w przeważającej ilości tworzą reszty aminokwasów o właściwościach hydrofobowych, a co za tym idzie, panują w tym obszarze warunki hydrofobowe. Tak więc, jest to mikrośrodowisko o małej stałej dielektrycznej, a stąd o zwielokrotnionych oddziaływaniach elektrostatycznych. Dzięki temu możliwe jest rozluźnienie określonych wiązań kowalencyjnych w cząsteczce substratu i ich przekształcenie w inne układy wiązań.

Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego - z uwagi na funkcję, jaką pełnią - dzieli się na cztery kategorie:

1. aminokwas lub aminokwasy bezpośrednio działające; w enzymach złożonych ich rolę pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne,

2. aminokwasy wspomagające,

3. aminokwasy kontaktowe, zwane również wiążącymi,

4. aminokwasy pomocnicze.

Aminokwasy pomocnicze nie biorą bezpośredniego udziału w katalizie, lecz niezbędne są do utrzymanie właściwej konformacji przestrzennej pozostałych aminokwasów centrum aktywnego (można je traktować, jako czynniki strukturotwórcze centrum aktywnego).

Aminokwasy kontaktowe (wiążące) odpowiedzialne są za rozpoznanie substratu i „wciągniecie” go do kieszonki centrum aktywnego. Z reguły są zlokalizowane na obrzeżach kieszonki. Odpowiedzialne są za specyficzność substratową enzymów.

Rola aminokwasu bezpośrednio działającego i aminokwasów wspomagających zostanie wyjaśniona na przykładzie centrum katalitycznego endopeptydaz serynowych. Enzymy te hydrolitycznie rozszczepiają wiązania peptydowe w białkach. Omawiane aminokwasy zlokalizowane są w głębi kieszonki; w przestrzeni znajdują w bliskiej od siebie odległości przyjmując z góry ściśle określoną konfigurację (tak, jak to pokazano na rysunku).

Mechanizm działania centrum katalitycznego endopeptydaz serynowych (opis w tekście).

W centrum katalitycznym wszystkich endopeptydaz serynowych występuje triada aminokwasów. Aminokwasem bezpośrednio działającym jest seryna, która w subtilizynach zajmuje pozycję 221 w łańcuchu polipeptydowym, a np. w chymotrypsynie 195. Aminokwasami wspomagającymi są histydyna i kwas asparaginowy. W środowisku alkalicznym zdysocjowana, silnie ujemna grupa karboksylanowa rodnika aspartylowego wywołuje efekt indukcyjny, który w wyniku rezonansu przenosi się poprzez rodnik imidazolowy histydyny i na azocie 3 pojawia się silny ładunek ujemny; w konsekwencji wodór grupy hydroksylowej seryny zostaje przeniesiony na azot i jednocześnie powstaje ujemny jon alkoholanowy seryny. Jeżeli w jego pobliżu znajdzie się odpowiednio ustawiony przestrzennie węgiel wiązania peptydowego - naładowany dodatnio - to oba przeciwnie naładowane atomy zaczną się zbliżać do siebie. Na skutek silnych oddziaływań elektrostatycznych panujących w tym obszarze wiązanie peptydowe ulegnie rozerwaniu. Proton z cząsteczki wody przyłączy się do atomu azotu grupy aminowej i ten fragmentu łańcucha peptydowego odłączy się od centrum aktywnego. Drugi fragment łańcucha peptydowego przejściowo utworzy wiązanie estrowe z resztą seryny centrum aktywnego, by po chwili ulec hydrolizie pod działaniem wolnej grupy OH^- i też oddzieli się od centrum aktywnego endopeptydazy.

4.2.2. Enzymy złożone - koenzymy i grupy prostetyczne; kofaktory i kosubstraty reakcji enzymatycznych

Enzymy złożone zbudowane są z części białkowej (apoenzymu) i części niebiałkowej: koenzymu lub grupy prostetycznej. Sam apoenzym, a także koenzym lub grupa prostetyczna nie wykazują aktywności katalitycznej; taką aktywność przejawia dopiero holoenzym, czyli połączenie apoenzymu z koenzymem lub grupą prostetyczną.

W enzymach złożonych koenzymy lub grupy prostetyczne pełnią zazwyczaj rolę aminokwasu bezpośrednio działającego. Spełniają one rolę przenośników elektronów, atomów lub niewielkich grup chemicznych. Często biorą udział w 2 kolejnych reakcjach enzymatycznych: w pierwszej pobierają z jednego substratu grupę chemiczną, w drugiej oddają ją drugiemu substratowi, odtwarzając się w pierwotnej postaci, po czym proces się powtarza. Przenoszenie takie może również odbywać się w obrębie tej samej cząsteczki i mamy wtedy do czynienia z izomeryzacją substratu.

Koenzymy to niskocząsteczkowe, niebiałkowe organiczne komponenty - często o nukleotydowej budowie, zawierające w swoim składzie witaminy lub ich pochodne - luźno związane z apoenzymem.

Przykładami koenzymów są: NAD i NADP - oba uczestniczą w transporcie elektronów i protonów, kwas foliowy - przenoszący grupy formylowe, metylowe lub metylenowe, koenzym A transportujący grupy acylowe lub S-adenozylometionina przenosząca grupę metylową.

Grupy prostetyczne to - w przeciwieństwie do koenzymów - silnie związane z apoenzymem (kowalencyjnie lub koordynacyjnie) specyficzne niebiałkowe składniki determinujące biochemiczną aktywność enzymów. Jak już wspomniano grupy prostetyczne występują zwykle w centrum aktywnym i są bezpośrednio zaangażowane w katalizę; podczas reakcji enzymatycznej nie opuszczają centrum aktywnego.

Grupy prostetyczne mogą mieć charakter zarówno organiczny (np. witaminy i ich pochodne, hem, kompleksy organiczne metali), jak i nieorganiczny (najczęściej jony metali).

Przykładem organicznych grup prostetycznych są związki flawinowe (FAD, FMN, itp.), hemowe, lipoamid czy molibdopteryna biorące udział w reakcjach redoks; fosforan pirydoksalu - biorący udział w transaminacji i deaminacji; biotyna - karboksylacja, itd. W przypadku organicznych grup prostetycznych, które są witaminami lub ich pochodnymi (m.in. FAD, FMN, lipoamid, biotyna, difosfotiamina, fosforan pirydoksalu i kobalamina) dopuszczalne jest nazywanie ich koenzymami.

Do nieorganicznych grup prostetycznych należą jony metali (Cu²⁺, Zn²⁺, Fe³⁺, itp.) - występujące w centrach aktywnych wielu enzymów; klastery żelazowo-siarkowe - występujące w białkach żelazowo-siarkowych, będących składnikami wielu enzymów oksydoredukcyjnych, w tym Kompleksów enzymatycznych.

Kompleksy enzymatyczne to wieloskładnikowe układy, zlokalizowane najczęściej w błonach komórkowych i wykazujące ściśle określoną aktywność enzymatyczną. W skład takich kompleksów może wchodzić kilka do kilkudziesięciu podjednostek zbudowanych z białek oraz kilka do kilkunastu grup prostetycznych. Przykładem mogą być Kompleksy I÷V łańcucha oddechowego chemoorganotrofów (porównaj rozdział 5.2.2.1. - łańcuch oddechowy).

Układy wieloenzymatyczne (multienzymy) są to zespoły kilku enzymów o różnej specyficzności kierunkowej, połączonych chemicznie ze sobą w jeden kompleks, ściśle ze sobą współpracujących, katalizujących wspólnie razem jedną określoną przemianę chemiczną. Przykładem może być układ wieloenzymatyczny katalizujący dekarboksylację oksydacyjna pirogronianu. W jego skład wchodzą trzy podjednostki enzymatyczne: dehydrogenaza pirogronianowa (acetyl-przenosząca) - EC 1.2.4.1, acetylotransferaza reszty dihydrolipoilolizynowej - EC 2.3.1.12 oraz dehydrogenaza dihydroliponylowa - EC 1.8.1.4. Układ ten transformuje pirogronian do acetylo-CoA (szczegóły patrz rozdział 5.4.?).

W tabeli 4.1. zestawiono ważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne, których budowa chemiczna i mechanizm działania zostaną omówione dalej.

Kofaktory reakcji enzymatycznych to związki organiczne, kompleksy organiczne metali lub jony (przeważnie jony metali), które są potrzebne enzymom do katalizowania konkretnych reakcji chemicznych (niezbędne dla osiągnięcia pełnej aktywności enzymu). Mogą nimi być koenzymy lub aktywatory enzymów (luźno związane z apoenzymem) lub grupy prostetyczne (silnie związane).

Tabela 4.1. Ważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne.

Nazwa koenzymu lub grupy prostetycznej	Skrót	Przenoszone grupy lub charakterystyczna cecha
Koenzymy oksydoreduktaz Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy Fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego Dinukleotyd flawinoadeninowy Mononukleotyd flawinowy Metaloflawoproteidy Flawoproteidy transportujące elektrony Ubichinon Liponian Porfiryny Koenzymy transferaz Adenozynometionina Adenozynotrifosforan Biotyna Difosfotiamina Fosforan pirydoksalu Koenzym A Koenzym B12 Kwas foliowy Siarczan fosfoadenilowy Urydynodifosforan	NAD NADP FAD FMN Me-Fp ETF Q - - ATP - DPT TPP CoASH B12 FH4 PAPS UDP	Atomy wodoru i epimeryzacja Atomy wodoru Atomy wodoru i koenzym oksydaz Atomy wodoru Transport elektronów Transport elektronów Transport elektronów Atomy wodoru i grupy acylowe Cytochromy, oksydaza cytochromowa koenzym katalazy i peroksydaz Grupy metylowe Grupy fosforanowe, pirofosforanowe i AMP CO2 (koenzym karboksylaz) Grupy aldehydowe lub dekarboksylacja Przemiany aminokwasów (w tym deaminacja) Grupy acylowe Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie grupy -COOH Grupy formylowe, hydroksymetylowe, formimidowe Reszta kwasu siarkowego Grupy glikozylowe

Koenzymy często traktuje się jako kosubstraty reakcji enzymatycznych, ponieważ ulegają one zmianom chemicznym w trakcie działania enzymów (np. w trakcie działania dehydrogenaz sprzężonych z NAD, koenzym przyjmuje jon wodorkowy H^- i ulega redukcji do NADH).

Ale dla niektórych enzymów koenzym może być jedynie kofaktorem reakcji. Przykładem tego może być α-galaktozydaza (melibiaza - EC 3.2.1.22) dla której kofaktorami są NAD i jony Mg²⁺ (NAD w tym przypadku nie przyjmuje jonu wodorkowego i nie ulega redukcji do NADH). Innym przykładem może być 2,3-aminomutaza tyrozynowa (EC 5.4.3.6) dla której ATP też jest jedynie kofaktorem (cząsteczka ATP nie ulega w tym przypadku żadnym zmianom chemicznym). Należy również pamiętać, że FAD zawsze traktowany jest jako kofaktor reakcji enzymatycznej, pomimo że często w zapisie reakcji (nad strzałką) podaje się, iż uległ on redukcji do FADH₂. Dla podkreślenia faktu, iż koenzym jest jedynie kofaktorem reakcji zapisuje się go nad strzałką w nawiasie.

Koenzymy i grupy prostetyczne oksydoreduktaz

Nukleotydy nikotynamidowe. Koenzymem wielu dehydrogenaz, czyli enzymów odrywających lub przyłączających atomy wodoru do substratów, jest dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD⁺) lub jego fosforan - NADP⁺. Jak wskazuje nazwa, koenzymy te są dinukleotydami zbudowanymi z nukleotydu adeninowego i nukleotydu nikotynamidowego lub jego fosforanu. Podstawowym składnikiem nukleotydu nikotynamidowego jest amid kwasu nikotynowego. Kwas nikotynowy, (znany także jako niacyna), jest pochodną pirydyny i jest jedną z witamin z grupy B o nazwie witamina PP.

Niedobór witaminy PP w organizmie człowieka powoduje zaburzenia czynności przewodu pokarmowego oraz ośrodkowego układu nerwowego a także powoduje zmiany skórne znane jako pelagra. Kwas nikotynowy w wystarczających dla człowieka ilościach występuje w mięsie, rybach oraz nasionach zbóż. Dzienne zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi około 30mg.

Postać utleniona dinukleotydu nikotynamidoadeninowego przedstawiana jest skrótem NAD⁺, a jego forma zredukowana NADH + H⁺. Umownie, dla wygody, dopuszcza się również symboliczne zapisy NAD (zamiast NAD⁺) i NADH₂ (zamiast NADH+H⁺).

Poznano przeszło 200 dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP. Właściwości i działanie obu koenzymów jest analogiczne. Stężenie NAD w komórkach jest znacznie większe niż NADP i stąd dehydrogenazy sprzężone z NAD są liczniejsze. Ogólnie można przyjąć, że NAD pełni w żywej komórce rolę akceptora wodoru, natomiast jego fosforan jest donorem wodoru (pełni rolę reduktora). W wielu przemianach enzymatycznych oba koenzymy mogą być nawzajem wymieniane. Ale znane są przemiany, w których różnice pomiędzy NAD i NADP są bardzo wyraźne. Np. dehydrogenaza alkoholowa z NAD (EC 1.1.1.1) jest 10000 razy aktywniejsza niż z NADP (EC 1.1.1.2); stąd rozróżnienie w klasyfikacji enzymów. Istnieje możliwość wymiany H pomiędzy obu koenzymami:

Zredukowane formy NADH₂ - wyjątkowo również NADPH₂ - w żywych komórkach regenerowane (utleniane) są w łańcuchu oddechowym. Ale NADH₂ może też regenerować się w reakcjach, w których staje się donorem wodoru (w tym, jako donor wodoru dla oksygenaz z pod-podklas EC 1.14.12. i EC 1.14.13.). Większość reakcji katalizowana przez dehydrogenazy sprzężone z NAD jest odwracalna. Jeżeli reakcja redukcji ma przewagę nad reakcją utlenienia, enzym nazywa się reduktazą, np. przyłączenie atomów wodoru do podwójnego wiązania w kwasie fumarowym katalizuje reduktaza fumaranowa (sprzężona z NAD - EC 1.3.1.6). Identyczną reakcję tyle, że biegnącą głownie w przeciwnym kierunku katalizuje dehydrogenaza bursztynianowa (sprzężona z FAD - EC 1.3.99.1).

Swoistość substratowa dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zależy od rodzaju apoenzymu. Nie jest ona jednak absolutna. W wielu przypadkach wyraża się bardzo dużymi różnicami szybkości katalizowanych reakcji, np. dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego utlenia również aldehyd glicerynowy, ale około 1000 razy wolniej.

Apoenzymy licznych dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zawierają związane jony metali Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺. Jony te są aktywatorami działania tych dehydrogenaz. Np. jony Mg²⁺ lub Zn²⁺ odgrywają ważną rolę podczas utleniania alkoholi, ułatwiając powstawanie jonu alkoholanowego.

Niektóre dehydrogenazy sprzężone z NAD lub NADP podczas swojego „właściwego” działania, czyli utleniania substratu mogą równocześnie prowadzić do jego dekarboksylacji. Takiej reakcji ulegają jedynie α-ketokwasy lub α-hydroksykwasy. Utlenianie α-ketokwasów połączone z ich dekarboksylacją nazywa się dekarboksylacją oksydacją i katalizowane jest przez układy wieloenzymatyczne (sprzężone z lipoamidem, DPT, FAD, CoASH i NAD). Przykładem jest przemiana pirogronianu do acetylo~SCoA katalizowana przez dehydrogenazę pirogronianową (przenoszącą acetyl), o której będzie mowa w rozdz. 5.3. Natomiast przykładem dekarboksylacji α-hydroksykwasów podczas ich utlenienia jest działanie dehydrogenaz jabłczanowych (dekarboksylujących). Ogólnie znane są aż cztery dehydrogenazy jabłczanowe sprzężone z NAD lub NADP, w tym trzy o właściwościach dekarboksylujących:

EC 1.1.1.37 - dehydrogenaza jabłczanowa - znana z cyklu Krebsa, sprzężona z NAD, utlenia jabłczan do szczawiooctanu,

EC 1.1.1.38 - dehydrogenaza jabłczanowa (szczawiooctan-dekarboksylująca) - sprzężona z NAD, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność dekarboksylacji szczawiooctanu,

EC 1.1.1.39 - dehydrogenaza jabłczanowa (dekarboksylująca) - sprzężona z NAD, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; nie posiada zdolności dekarboksylacji szczawiooctanu,

EC 1.1.1.40 - dehydrogenaza jabłczanowa (szczawiooctan-dekarboksylująca) - sprzężona z NADP, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność dekarboksylacji szczawiooctanu.

Nukleotydy flawinowe. W skład tych nukleotydów wchodzi ryboflawina. Związek ten zbudowany jest z heterocyklicznej izoalloksazyny i przyłączonego do niej rybitolu, pięciowodorotlenowego alkoholu, będącego pochodną rybozy. Ryboflawina jest witaminą B₂.

Ryboflawina posiada charakterystyczne żółte zabarwienie. Jej niedobór w organizmie człowieka powoduje zmiany chorobowe w obrębie jamy ustnej; m.in. pękanie kącików ust i śluzówki, obrzęki warg i ich łuszczenie się, zmiany zapalne języka a także zaburzenia ze strony narządu wzroku. Duże ilości tej witaminy występują w drożdżach, w ziarnach zbóż i jajach. Zapotrzebowanie człowieka wynosi 2mg na dobę.

Fosforan ryboflawiny - mononukleotyd flawinowy - zapisuje się symbolicznie FMN, a jego połączenie z nukleotydem adeninowym - dinukleotyd flawinoadeninowy - oznacza się skrótem FAD. Oba nukleotydy flawinowe są nierozerwalnie związane z odpowiednimi białkami enzymatycznymi, tworząc flawoproteidy, będąc jednocześnie przykładem grup prostetycznych.

FMN i FAD są grupami prostetycznymi dehydrogenaz, przenoszących głównie atomy wodoru. Ich cechą charakterystyczną jest zdolność odrywania atomów wodoru od dwóch sąsiadujących ze sobą atomów węgla, tworząc podwójne wiązanie: -CH₂-CH₂-→ -CH=CH-. Przykładem może być wspomniana już dehydrogenaza bursztynianowa (EC 1.3.99.1). Zredukowaną formę FAD symbolicznie zapisuje się FADH₂. Podobnie jak zredukowany NADH₂, zredukowany FADH₂ w komórce regeneruje się (utlenia) w łańcuchu oddechowym.

Ale FMN i FAD mogą być również koenzymami oksydaz: enzymów posiadających zdolność bezpośredniego przenoszenia oderwanych od substratu atomów wodoru na tlen - uaktywnianie cząsteczki tlenu prowadzą in situ, tj. w miejscu zetknięcia się enzymu z cząsteczką tlenu. Reakcja ta przebiega bez zmiany formy grup prostetycznych na ich formy zredukowane. Przykładem takiego enzymu może być oksydaza aminowa zawierająca FAD (EC 1.4.3.4). Reakcję taką symbolicznie zapisuje się z FAD ujętym w nawias dla podkreślenia, że nie zmienia się jego forma po zakończeniu reakcji. Dla podkreślenia roli FAD lub FMN w tego typu reakcjach, nazywa się je kofaktorami reakcji utlenienia.

FAD jest również elementem składowym systemu enzymatycznego cytochromu P450. Zredukowany FADH₂ może z kolei być donorem wodoru dla oksygenaz z podpodklasy EC 1.14.14.

Dość często apoenzym oksydoreduktaz, sprzężonych z FMN lub FAD, zawiera w swojej budowie jony metali Fe²⁺, Zn²⁺ lub Mo²⁺, które współdziałają podczas reakcji utleniania i redukcji; enzymy tego typu nazywa się metaloflawoproteidami i oznacza symbolem Me-Fp. Transportują one przede wszystkim elektrony.

Ubichinon (koenzym Q). Przenośnikiem atomów wodoru może być również ubichinon, zywany też koenzymem Q. Związek ten pod względem budowy przypomina witaminy E i K, choć sam witaminą nie jest, gdyż w komórkach zwierzęcych jest syntetyzowany (z tyrozyny). Łańcych boczny zbudowany jest z jednostek izoprenoidowych. Ich liczba bywa rózna w zależności od źródła pochodzenia ubichinonu. Np. ubichinon z serca świni ma ich 50, a z serca wołu 10, co zapisuje się symbolicznie Q-50 i odpowiednio Q-10. Ilośc jednostek izoprenoidowych w ubichinonach drobnoustrojowych waha się od 5 do 13.

Mechanizm przenoszenia atomów wodoru przez ubichinon polega na utlenianiu i redukcji pierścienia chinonowego.

Ubichinon jako koenzym dehydrogenaz bądź reduktaz spotykany jest rzadko. Jednym z nielicznych przykładów może być dehydrogenaza NADH (ubichinonowa) - EC 1.6.5.3, która katalizuje reakcję utlenienia NADH₂ do NAD z jednoczesną redukcją ubichinonu do ubichinolu. Ciekawym enzymem jest dehydrogenaza metanolowa (EC 1.1.99.8) znaleziona u niektórych metylotrofów, której grupą prostetyczną jest ubichinonoproteina (kofaktor PQQ).

Natomiast ubichinon w komórkach pełni bardzo ważną rolę, będąc elementem składowym łańcucha oddechowego.

Związki porfirynowe. Porfiryny to związki, w których 4 pierścienie pirolowe połączone są ze sobą mostkami metinowymi (=CH-). Przy atomach węgla β (3 i 4) pierścieni pirolowych zamiast atomów wodoru występują różne grupy chemiczne (metylowe, winylowe, octanowe i inne). W celu ujednolicenia zapisu związków tego typu Fisher zaproponował symboliczny, uproszczony ich wzór. Pominięto w nim mostki metinowe a pierścienie pirolowe zaznaczano kodem kreskowym. Pierścienie ponumerowano cyframi rzymskimi od I do IV, atomy węgla w pierścieniach od 1 do 8, a mostki metinowe literami alfabetu łacińskiego od α do δ, jak to przedstawiono na rysunku obok.

Z uwagi na możliwość podstawiania atomów wodoru 1-8 w pierścieniach pirolowych różnymi podstawnikami, istnieje teoretycznie olbrzymia ilość izomerów pochodnych porfiryny. Jednakże w naturalnych systemach biologicznych głównie występuje izomer typu III, w którym podstawniki przy IV pierścieniu pirolowym są ułożone asymetrycznie w stosunku do innych pierścieni. Oznaczony i nazwany jest on przez Fishera protoporfiryną IX. Izomer ten jest prekursorem metaloporfiryn wchodzących w skład hemoprotein i chlorofili.

Metaloporfiryny to pochodne protoporfiryny IX z atomem metalu (żelaza, magnezu, miedzi) centralnie wbudowanym w układ porfirynowy za pośrednictwem atomów azotu pierścieni pirolowych. Metaloporfiryny z wbudowanym żelazem (hem i heminy) występują jako grupy prostetyczne w hemoproteinach. Metaloporfiryny z wbudowanym Mg²⁺ są składnikami chlorofilu.

Hemoproteiny to białka zawierające jako grupę prostetyczną hem lub heminę.

Hem to połączenie żelaza występującego na II stopniu utlenienia (Fe²⁺) z protoporfiryną IX. Hem jest barwną grupą prostetyczną hemoglobiny i mioglobiny. W organizmach zwierząt, hemoglobina - czerwony barwnik krwi - uczestniczy w transporcie tlenu, CO₂ a także jonów wodorowych. Mioglobina uczestniczy w transporcie tlenu w mięśniach i w jego magazynowaniu.

Heminy to połączenia protoporfiryny IX z jonem żelaza występującym na III stopniu utlenienia (Fe³⁺). Heminy we wszystkich organizmach pełnią funkcję przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym (układ cytochromów), a także są grupami prostetycznymi wielu oksydoreduktaz, m.in. peroksydaz (w tym katalazy). Powstają z hemoglobiny pod wpływem kwasu solnego, a reakcja ta służy w medycynie sądowej do wykrywania śladów krwi.

Cytochromy to hemoproteiny, które dzięki odwracalnej zmianie stopnia utlenienia żelaza grupy heminowej (z Fe²⁺ na Fe³⁺) stanowią układ przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym w żywych organizmach. Na podstawie budowy chemicznej, widma absorpcyjnego i przede wszystkim miejsca w łańcuchu oddechowym, cytochromy dzieli się na grupy: a, b i c (np. cytochromy b) oraz podgrupy (np. cytochromy a₃). Kompleks hemoprotein a + a₃ jest enzymem znanym jako oksydaza cytochromu c.

Oksydaza cytochromu c (EC 1.9.3.1) to enzym będący kompleksem hemoprotein a i a₃, składający się z kilku łańcuchów polipeptydowych o różnej masie cząsteczkowej, 2 grup heminowych oraz 2 atomów miedzi. Oksydaza cytochromowa jest końcowym enzymem łańcucha oddechowego; aktywuje tlen atomowy do przyłączenia atomów wodoru, przenosząc na niego elektrony.

Chlorofile, pochodne protoporfiryny IX, zielone barwniki występujące u fotosyntetyzujących roślin, glonów i bakterii (bakteriochlorofil). Chlorofile pełnią rolę grupy prostetycznej chromoproteidu zwanego chloroplastyną. Są to metaloporfiryny, zawierające wbudowany w centrum jon magnezu (Mg²⁺). Połączone są wiązaniem estrowym z fitolem. Rozróżnia się 4 rodzaje chlorofilu. U wszystkich roślin wyższych i glonów występuje chlorofil a (niebieskozielony, co najmniej w 3 formach: P700, Ca680, Ca670 - liczby oznaczają długość fali świetlnej, przy której występuje maksimum absorpcji światła). Chlorofil b - żółtozielony, występujący u roślin wyższych i niektórych glonów. Chlorofil c — występuje w małych ilościach w czerwono zabarwionych roślinach wodnych (m.in. z rodzaju Alternanthera), brunatnicach, niektórych okrzemkach i wiciowcach. Chlorofil d znajdowany jest u krasnorostów. Chlorofil a absorbuje głównie światło fioletowe i czerwone, oraz żółtozielone, chlorofil b absorbuje głównie światło niebieskie i pomarańczowe. Chlorofile z karotenoidami wchodzą w skład fotosystemów PS-I i PS-II.

Lipoamid. Amid kwasu liponowego (kwasu 6,8-ditiolooktanowego) uczestniczy w transporcie elektronów, a także w przenoszeniu grup acylowych w reakcjach dekarboksylacji oksydacyjnej α-ketokwasów (α-ODC). Jest elementem składowym kompleksów wieloenzymatycznych wraz z DPT, CoASH, FAD i NAD, np. w dehydrogenazie pirogronianowej (przenoszącej acetyl) - EC 1.2.4.1. Łatwo ulega odwracalnemu utlenieniu i redukcji.

Jak już wspomniano, lipoamid jest składnikiem układów wieloenzymatycznych. W układach tych, jako kosubstrat, transportuje rodniki acylowe.

Koenzymy i grupy prostetyczne transferaz

Adenozynometionina. Jest to koenzym transferaz przenoszących jednowęglową grupę -CH₃. Grupa metylowa w tym układzie jest wybitnie reaktywna (tzw. „aktywny metyl”). I dlatego, w formie jonu CH₃⁺, może być przenoszona na elektroujemnie naładowane inne grupy chemiczne (najkorzystniej z wolną parą elektronową). Koenzym ten bierze udział w wielu szlakach anabolicznych, metylując m.in. grupę aminową (np. w biosyntezie choliny).

„Aktywny siarczan”. ATP uczestniczy w „aktywacji” reszty siarczanowej. „Aktywny siarczan” to adenozyno-3'-fosfo-5'-fosfosiarczan (PAPS, czyli 3'-fosfoadenylilosiarczan). Tak uaktywniony siarczan jest włączany w wiązanie estrowe siarczanów proteoglikanów.

Kwas foliowy. Koenzym ten jest pochodną pteryny, która z kolei jest pochodną heterocyklicznego dipierścieniowego związku (pterydyny), do którego bocznej gupy metylowej przy C6 przyłączona jest cząsteczka kwasu p-aminobenzoesowego i dalej poprzez wiązanie amidowe jedna lub więcej cząstwczek kwasu glutaminowego. Kwas foliowy jest witaminą. Jej niedobór w ustroju człowieka może prowadzić do pojawienia się trombocytopenii i pokrewnych odmian niedokrwistości. Do organizmu człowieka dostarczany jest przez bakterie jelitowe.

Kwas foliowy - a właściwie produkt jego redukcji, kwas 5,6,7,8-tetrawodorofoliowy (H₄folian) - jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących jednowęglowe rodniki typu:

• CH₃-

• HOCH₂-

• -CH₂-

• -CH=

• HOC-

• HN=CH-

Miejscem przyłączenia grup C₁ są atomy N-5 lub N-10 tetrawodorofolianu. Natomiast źródłem ich pochodzenia są przemiany aminokwasów: histydyny, tryptofanu, seryny i metioniny.

Biotyna. Biotyna jest grupą prostetyczną karboksylaz i dekarboksylaz. Przyłączenie grupy -COO^- do substratu wymaga dostarczenia energi chemicznej; jej dawcą jest ATP.

Biotyna jest witaminą H. Jej brak w organizmie człowieka wywołuje zaburzenia skórne oraz zmiany psychomotoryczne: depresję, brak łaknienia i snu, itp. Witamina ta jest wytwarzana przez bakterie jelitowe.

Koenzym A. Na pierwszy rzut oka przypomina on opisane wcześniej dinukleotydy. Jednakże koenzym ten nie jest zaliczany do dinukleotydów. Zbudowany jest z adenozyno-3'-fosforanu-5'-pirofosforanu połączonego wiązaniem estrowym z kwasem pantotenowym, a ten z kolei wiązaniem peptydowym z cystoaminą. Cysteoamina jest produktem dekarboksylacji cysteiny. Kwas pantotenowy jest amidem kwasu 2,4-dihydroksy-3,3-dimetylomasłowego i β-alaniny. Symbolicznie koenzym A zapisuje się jako CoASH.

Kwas pantotenowy jest witaminą B₅. Niezbędna jest ona do prawidłowego metabolizmu białek, cukrów i tłuszczów oraz do syntezy niektórych hormonów, uczestniczy w regeneracji tkanek i przyspiesza gojenie ran, zapobiega przemęczeniu i usprawnia układ sercowo-naczyniowy, nerwowy i pokarmowy, bierze udział w wytwarzaniu tłuszczów, cholesterolu, poprawia pigmentację i stan włosów. Kwas pantotenowy wytwarzany jest w organizmach roślin, drobnoustrojów, a także niektórych pleśni. Bogatym źródłem tego związku są drożdże, grzyby, groch, wątróbka, otręby pszenne, ryby (np. śledzie, makrele, pstrągi), mleko pełne, mięso kurczaka, mleczko pszczele, pestki słonecznika, sery, orzechy, jajka, owoce awokado, pomarańcze, ziemniaki, brokuły, ciemny ryż, melony, pełnoziarnisty chleb, soja, masło orzechowe, banany.

Koenzym A odgrywa podstawową rolę podczas aktywacji i przenoszenia rodników acylowych. Reakcje przyłączenia CoASH do kwasu karboksylowego katalizują ligazy (zwane też syntetazami), które do swego działania wymagają dostarczenia energii, której źródłem jest ATP. Powstałe wiązanie tioestrowe jest wiązaniem wysokoenergetycznym (zaznaczane we wzorach chemicznych tyldą „~”). Przykładem może być synteza acetylo~SCoA z kwasu octowego, katalizowana przez syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).

Difosfotiamina. Tiamina jest związkiem zbudowanym z pierścienia pirymidynowego połączonego z heterocyklicznym pierścieniem tiazolowym grupą metylenową. W difosfotiaminie grupa hydroksylowa łańcucha bocznego pierścienia tiazolowego jest zestryfikowana pirofosforanem. Z apoenzymem wiąże się właśnie przez ugrupowanie pirofosforanowe. Symbolicznie diosfotiaminę zapisuje się jako DPT.

Tiamina jest witaminą B₁. Skutkami jej niedoboru są zaburzenia czynności centralnego układu nerwowego (uczucie osłabienia i zmęczenie, możliwy oczopląs, zaburzenia pamięci i koncentracji a nawet depresja), niewydolność krążenia (przyspieszona akcja serca, powiększenie wymiarów serca, obrzęki kończyn), zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego (utrata łaknienia, nudności, wymioty, biegunki, bóle brzucha, brak apetytu, spadek wagi). W przypadku silnej awitaminozy B₁ może wystąpić choroba Beri-beri, objawiająca się bólami kończyn, osłabieniem mięśni i ich drżeniem oraz wyraźną niewydolnością układu krążenia. Etanol powoduje rozkład tego związku, o czym powinni pamiętać ludzie nadużywający alkoholu i dbać o dostarczanie jej do organizmu. Źródłem tej witaminy są produkty zbożowe, mięso, groch, fasola, drożdże, orzechy, ryby, owoce i warzywa. Zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi ok. 1,5 mg na dobę.

Difosfotiamina jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących aldehydy: glikolowy, octowy i semialdehyd bursztynowy.

Jako grupa prostetyczna ketolaz, DPT przenosi aldehyd glikolowy, który odrywa od ksylulozo-5-fosforanu i transportuje go na erytrozo-4-fosforan.

Jako element kompleksów wieloenzymatycznych; podczas dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu lub α-ketoglutaranu zachowuje się jak transferaza, a równocześnie jak liaza. Jako dehydrogenaza pirogronianowa (przenosząca acetyl) - EC 1.2.4.1, prowadzi dekarboksylację pirogronianu do aldehydu octowego, a jako dehydrogenaza ketoglutaranowa (przenosząca sukcynyl) - EC 1.2.4.2, dekarboksyluje α-ketoglutaran do semialdehydu bursztynowego, które dalej przenosi na amid kwas liponowego.

Pirydoksyna. Mieszanina trzech naturalnych związków: pirydoksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy. Są one pochodnymi pirydyny.

5-Fosforan pirydoksalu (PLP) jest koenzymem lub grupą prostetyczną przeszło 50 enzymów. Bierze udział w przemianach aminokwasów. Przede wszystkim współdziała z aminotransferazami przenoszącymi grupę aminową z aminokwasów na α-ketokwasy i odwrotnie. Jest koenzymem dekarboksylaz aminokwasów. Uczestniczy ponadto w przemianie tryptofanu w amid kwasu nikotynowego, transformacji glicyny w serynę i w biosyntezie cysteiny. Szczegóły dotyczące reakcji transaminacji i dekarboksylacji aminokwasów zostaną opisane w rozdziale omawiającym metabolizm aminokwasów.

Mieszanina pirydoksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy nazywana jest witaminą B₆. Wszystkie trzy związki ulegają w organizmie wzajemnym przekształceniom i wykazują podobne działanie biologiczne. Niedobór witaminy B6 występuje tylko wyjątkowo, np. u małych dzieci karmionych sztucznymi odżywkami lub karmionych przez matki, które długo przyjmowały doustne środki antykoncepcyjne oraz u alkoholików i ich potomstwa. Do najczęściej spotykanych objawów należą stany zapalne skóry (łojotokowe zmiany na twarzy), podrażnienie języka i błon śluzowych jamy ustnej (języka, kącików warg) zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym (apatia, bezsenność, nadwrażliwość, napady drgawek), zwiększona podatność na infekcje. Witamina B₆ wytwarzana jest przez florę bakteryjną przewodu pokarmowego, w dużych występuje w wątrobie, jajach, jarzynach i mięsie.

Cyjanokobalamina. Jej nazwa wywodzi się od jonu cyjankowego połączonego koordynacyjnie z atomem kobaltu, wbudowanym w rdzeń porfirynowy. Rdzeń porfirynowy wraz z jonem kobaltu noszą nazwę kobalaminy. Zamiast jonu CN^-, z kobalaminą może być połączony inny anion, np. hydoksylowy, chlorkowy czy azotynowy. W tym ostatnim przypadku związek nosi nazwę nitrokobalaminy, a znajdowany jest w podłożach hodowlanych Streptomyces griseus.

Cyjanokobalamina jest koenzymem niektórych dehydrataz, amoniako-liaz i mutaz.

Witamina B₁₂, znana jako czynnik przeciwdziałający niedokrwistości złośliwej lub jako czynnik przeciwanemiczny. Brak tej witaminy powoduje charakterystyczne zmiany w obrazie krwi, związane z anemią złośliwą. Obserwuje się również zmiany zapalne języka oraz brak kwasu solnego w żołądku. Organizmy roślin i zwierząt nie produkują cyjanokobalaminy. Zdolność tą mają niektóre gatunki bakterii (choć, u niektórych mikroorganizmów jest ona także czynnikiem wzrostowym). Zwierzęta mięsożerne zapotrzebowanie na tę witaminę pokrywają, spożywając mięso innych zwierząt. Szczególnie obfita w cyjanokobalaminę jest wątroba. Zwierzęta roślinożerne wykorzystują cyjanokobalaminę wytwarzaną przez florę bakteryjną ich przewodu pokarmowego. Źródło to jest czasem niewystarczające i u niektórych gatunków zwierząt dochodzi niekiedy do zjadania własnych odchodów, co prowadzi do zwiększenia ilości tej witaminy w organizmie. Organizm dorosłego człowieka potrzebuje ok. 3 mg cyjanokobalaminy dziennie. Zapotrzebowanie to jest w zupełności pokrywane przez normalną dietę.

Nukleozydofosforany. Nukleotydy, które do swojej reszty fosforanowej dodatkowo mają przyłączoną jedną lub dwie cząsteczki kwasu fosforowego, czyli nukleozydodi- i trifosforany są koenzymami, a właściwie poprawnie definiując kofaktorami czy też kosubstratami reakcji katalizowanych przez liczne enzymy. Zaliczane są one do związków wysokoenergetycznych, z tzw. wiązaniem makroergicznych lub niepoprawnie zwanych także związkami bogatymi w energię (porównaj: rozdz. 5.1.). Wśród nich najczęściej kosubstratem w reakcjach enzymatycznych bywa adenozynotrifosforan - ATP. Jest on kosubstratem większości ligaz (enzymów z klasy EC 6.), kinaz (transferaz z podklasy EC 2.7., przenoszących grupę fosforanową na różne substraty) czy wreszcie niektórych karboksykinaz (enzymów z pod-podklasy EC 4.1.1.).

Termodynamika reakcji enzymatycznych. Zgodnie z prawami termodynamiki reakcje endoergiczne nie mogą przebiegać spontanicznie, nawet jeśli są katalizowane przez enzymy. Tego typu reakcje muszą być sprzężone z inną reakcją silnie egzoergiczną, tak by suma ich energii swobodnej ΔG była równa zero lub ujemna. Przykładowo reakcja glukozy z kwasem fosforowym jest reakcją endoergiczną; zmiana energii swobodnej ΔG = 12 kJ/mol. Stąd równowaga tej reakcji jest silnie przesunięta na lewą stronę; glukozo-6-fosforan praktycznie nie powstaje. Reakcja hydrolizy ATP do ADP + P_i^* jest z kolei silnie egzoergiczna; ΔG = −29 kJ/mol. Przy tak dużej ujemnej wartości ΔG jest to reakcja praktycznie nieodwracalna. W przypadku enzymatycznego sprzęgnięcia obu tych reakcji suma energii swobodnej ΔG = −17 kJ/mol. W takim układzie równowaga reakcji przesunięta jest zdecydowanie na prawą stronę i praktycznie cała pula glukozy jest przemieniona w glukozo-6-P.

W ATP pierwsza cząsteczka kwasu fosforowego przyłączona jest do grupy -OH rybozy zwykłym wiązaniem estrowym. Energia swobodna jego hydrolizy wynosi ΔG = −14 kJ/mol. Natomiast kolejne cząsteczki kwasu fosforowego wiążą się ze sobą wiązaniem bezwodnikowym. Energia swobodna ich hydrolizy odpowiednio wynosi:

Stąd ATP i ADP (adenozynodifosforan) należą do związków bogatych w energię chemiczną. Natomiast AMP (adenozynomonofosforan) jest związkiem niskoenergetycznym. Przyjmuje się, że dolną wartością energii swobodnej hydrolizy, która decyduje o zaliczeniu wiązania do makroergicznego jest ΔG równe −25 kJ/mol.

W tabeli 4.2. przykładowo podano przybliżone średnie wartości energii swobodnej hydrolizy kilku związków zawierających grupę fosforanową. Energia swobodna hydrolizy ATP do ADP+P_i wynosi ΔG = −29 kJ/mol, co sprawia, że ten nukleozydotrifosforan wraz z ADP i pirofosforanem należą do grupy fosforanów znajdujących się pośrodku listy cytowanych związków wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych. Dlatego ATP może być donorem fosforanów dla związków niskoenergetycznych znajdujących na liście poniżej, o ΔG >−29 kJ/mol. Z tego samego powodu ADP może być akceptorem wysokoenergetycznego fosforanu od związków znajdujących się na tej liście powyżej, o ΔG <−29 kJ/mol.

Należy jeszcze dodać, że wiązania bezwodnikowe w ATP łatwo ulegają rozerwaniu. Oderwana reszta fosforanowa lub pirofosforanowa może być przenoszona na różne substraty, tym łatwiej, iż rozkład ATP jednocześnie dostarcza energii swobodnej niezbędnej dla takich reakcji.

Tabela 4.2. Energia swobodna hydrolizy niektórych fosforanów

Nazwa związku	ΔG [kJ/mol]^1
Fosfoenolopirogronian Karbamoilofosforan 1,3-difosfoglicerynian Fosfokreatyna Acetylo~SCoA	−52 −51 −49 −43 −34
ATP→AMP+PP ATP→ADP+P ADP→AMP+P PP (pirofosforan)	−31 −29 −28 −27
Glukozo-1-fosforan AMP Glukozo-6-fosforan	−21 −14 −13

¹ cytowane dane są przybliżonymi wartościami ΔG

ATP zawiera dwa wysokoenergetyczne wiązania bezwodnikowe. Oderwanie fosforanu, prowadzące do powstania ADP, powoduje utratę jednego z nich (ΔG =−29 kJ/mol). Oderwanie fosforanu od ADP prowadzi do powstania AMP (ΔG =−28 kJ/mol). Teoretycznie wyliczona, sumaryczna energia swobodna takiej dwuetapowej przemiany ATP do AMP obniża się więc o ΔG =−57 kJ/mol. Ale od ATP może być oderwany również pirofosforan, jednoetapowo prowadząc do powstania AMP. Zmiana energii swobodnej ΔG  takiej przemiany równa jest −31 kJ/mol. Dla pełnego jej bilansu należy jednak uwzględnić dodatkowo energię swobodną zawartą w pirofosforanie (ΔG =−27 kJ/mol), co po podsumowaniu daje ΔG =−58 kJ/mol^*. Ta swobodna energia zawarta w PP_i jest uwalniana podczas jego enzymatycznej hydrolizy pod działaniem pirofosfatazy nieorganicznej (EC 3.6.1.1).

W komórkach żywych organizmów pomiędzy ATP, ADP i AMP istnieje pewnego typu specyficzna równowaga. Kinaza adenylanowa (EC 2.7.4.3) przenosi jeden z wysokoenergetycznych fosforanów z ATP na AMP, co prowadzi do powstania dwóch cząsteczek ADP, tak jak to przedstawiono na rysunku obok.

Dla pełnego obrazu należy jeszcze wspomnieć, że w komórkach ATP uczestniczy w reakcjach enzymatycznych w postaci kompleksu z jonem Mg²⁺. Stąd jony Mg²⁺ są aktywatorami enzymów współdziałających z ATP.

Reasumując, rola ATP jako kosubstratu w reakcjach enzymatycznych jest następująca:

1. ATP jako donor energii swobodnej w reakcjach syntez katalizowanych przez ligazy. W większości takich przypadków ATP ulega rozkładowi do AMP + PP_i. Jak już wspomniano, ilość energii swobodnej dostarczona do takiego układu jest równoważna ΔG =−58 kJ/mol, co wystarcza do przeprowadzenia rozmaitych syntez, niekiedy nawet związków wysokoenergetycznych. Za przykład niech posłuży synteza acetylo~SCoA katalizowana przez syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).

ATP dużo rzadziej, jako koenzym ligaz, ulega podczas reakcji rozkładowi do ADP. Tym niemniej znanych jest sporo i takich przypadków. Dla podkreślenia, że ATP rozkłada się jedynie do ADP w nazwie ligazy w nawiasie umieszcza się (ADP-tworząca). Jako przykład podana zostanie syntetaza acetylo-CoA (ADP-tworząca) - EC 6.2.1.13. Wybrano ją celowo, gdyż tylko wyjątkowo niektóre bakterie posiadają ten enzym, a z energetycznego „punktu widzenia” komórki jest on korzystniejszy od wcześniej opisanej syntetazy acetylo-CoA.

2. 
   ATP jako donor ortofosforanu. Odpowiednie transferazy (kinazy) przenoszą rodnik fosforanowy na rozmaite substraty, np. na monosacharydy, glicerol, nukleozydy, itp. Za przykład posłuży synteza NADPH z NADH katalizowana przez kinazę NADH (EC 2.7.1.86).

Na marginesie omawianego zagadnienia warto zwrócić uwagę na fakt, że w wyjątkowych sytuacjach źródłem ortofosforanu może być pirofosforan. Nie powinno to budzić większego zdziwienia, bowiem energia swobodna jego hydrolizy ΔG =−27 kJ/mol. Przykładem może być kinaza octanowa (pirofosforanowa) - EC 2.7.2.12, katalizująca przeniesienie fosforanu z PP_i na kwas octowy z wytworzeniem acetylofosforanu.

3. 
   ATP jako donor pirofosforanu. W niektórych przypadkach konieczne jest przyłączenie do substratu rodnika pirofosforanowego. Jego donorem jest ATP, a reakcję katalizują pirofosfokinazy. Jako przykład może posłużyć synteza difosfotiaminy z tiaminy. Reakcję katalizuje pirofosfokinaza tiaminowa (EC 2.7.6.2).

4. ATP jako donor rodnika adenylilowego. Adenylacja to reakcja przeniesienia rodnika adenylilowego z ATP na substrat z jednoczesnym odłączeniem PP_i. Reakcja ta ma podstawowe znaczenie dla syntezy dinukleotydów adenilowych i związków o podobnej budowie (choćby wspomnianego wcześniej CoASH). Reakcję katalizują adenylilotransferazy (zwane zwyczajowo pirofosforylazami). Jako przykład posłuży synteza FAD z FMN katalizowana przez adenylilotransferazę FMN (EC 2.7.7.2).

Ale enzymy z pod-podklasy EC 2.7.7. mogą również transportować inne nukleotydilowe rodniki z nukleotydotrifosforanów. Jedną z takich reakcji o podstawowym znaczeniu dla procesów biochemicznych jest synteza UDPG (urydyliloglukozy). Reakcja katalizowana jest przez urydylilotransferazę glukozo-1-fosforanową (EC 2.7.7.9).

5. 
   ATP jako donor adenozyny. W pewnych szczególnych przypadkach ATP staje się donorem adenozyny. Przykładem może być synteza adenozynometioniny. Koenzym ten powstaje w reakcji metioniny z ATP, katalizowanej przez adenozynotransferazę metioninową (EC 2.5.1.6).

Niekiedy rolę ATP w omówionych wyżej reakcjach może pełnić inny z nukleozydotrifosforanów. O urydynotrifosforanie (UTP) i jego roli już wspomniano. Guanozynotrifosforan (GTP) lub inozynotrifosforan (ITP) są koenzymami syntetazy bursztynylo-CoA (patrz cykl Krebsa). Cytydynotrifosforan (CTP) bierze udział w syntezie substancji lipidowych pod postacią cytydylodifosfocholiny.

Pomiędzy ATP a pozostałymi nukleozydotrifosforanami występuje zależność:

4.2.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych

Szybkość reakcji enzymatycznej, podobnie jak każdej reakcji chemicznej, wyraża się ubytkiem stężenia jednego z substratów lub też przyrostem stężenia któregoś z produktów:

(4.1)

Równowaga reakcji enzymatycznych. Teoretycznie wszystkie reakcje chemiczne (również katalizowane enzymatycznie) są odwracalne. Po pewnym czasie ustala się równowaga pomiędzy substratami reakcji a jej produktami, objawiająca się tym, że szybkość powstawania produktów jest równa szybkości ich rewersji do substratów. Szybkość powstawania produktów v₁ jest proporcjonalna do stężeń reagujących substratów. Szybkość reakcji rewersji produktów v-₁ jest proporcjonalna do stężeń produktów. W stanie równowagi:

(4.2)

gdzie: A,B - substraty; AB - produkt; k₊₁, k_-1 - stałe szybkości reakcji

Dla przypomnienia: stałe szybkości reakcji k są charakterystyczne dla konkretnych reagentów. Rosną wraz ze wzrostem temperatury reakcji.

Zgodnie z prawem działania mas Guldberga i Waagego w stanie równowagi, stężenia reagentów spełniają zależność:

gdzie: K jest stałą równowagi konkretnej reakcji. (4.3)

Im większa jest stała równowagi K, tym większe stężenie produktu AB, czyli równowaga reakcji bardziej przesunięta na prawo. Reakcja pomiędzy A i B zachodzi tym energiczniej, im większa jest stała równowagi reakcji K.

Jeszcze raz należy wyraźnie podkreślić: obecność enzymu w układzie nie zmienia wartości stałej K. Enzym jedynie przyspiesza moment osiągnięcia równowagi przez reagenty. Jeżeli K>1 to reakcja jest spontaniczna.

Stałą K można wyrazić liczbowo, o ile znane są stężenia substratów i produktów reakcji w stanie równowagi. Wartości K można również wyliczyć na drodze termodynamicznej. Pomiędzy zmianami energii swobodnej ∆G a stałą równowagi reakcji K istnieje zależność:

gdzie: R - stała gazowa, T - temperatura bezwzględna (4.4)

Z zależności tej wynika prosta formuła potwierdzająca wcześniejsze stwierdzenia: im większa stała równowagi reakcji K, tym większa różnica pomiędzy wartościami energii swobodnej substratów i produktów. I odwrotnie: im większe ∆G, tym równowaga reakcja jest bardziej przesunięta na korzyść produktów. W krańcowych przypadkach, gdy ujemna wartość ∆G jest bardzo duża cały substrat ulega przekształceniu w produkt, a reakcja praktycznie staje się nieodwracalna.

Z kolei pomiędzy zmianami energii swobodnej ∆G (w chemii fizycznej znanej pod słuszną nazwą potencjału termodynamicznego), entalpią układu i zmianami entropii występuje zależność:

(4.5)

Szybkość początkowa reakcji enzymatycznej. Szybkość początkowa reakcji v jest to szybkość wyznaczona przed powstaniem dostatecznie dużej ilości produktu, który by umożliwiał zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji enzymatycznej jest zawsze proporcjonalna do stężenia enzymu. Stąd oznaczenie ilości enzymu (jego aktywności) powinno być oparte, o ile jest to możliwe, na pomiarach początkowej szybkości reakcji przy znacznym nadmiarze substratu S. W takim układzie szybkość reakcji nie zależy od stężenia substratu i reakcja jest rzędu zerowego.

Aktywność enzymatyczna. Oznaczenie bezwzględnej ilości enzymu (np. w gramach lub molach) jest trudne do wykonania, gdyż wiąże się z oczyszczeniem białka enzymatycznego do stanu homogenności. Stąd umówiono się, że za miarę ilości enzymu w biopreparatach przyjmuje się jego aktywność katalityczną (enzymatyczną), czyli szybkość, z jaką w założonych warunkach preparat enzymatyczny przekształca określoną ilość wybranego arbitralnie substratu. Miarą tej szybkości jest ubytek substratu lub przyrost produktów reakcji enzymatycznej w przeliczeniu na jednostkę czasu. Zdefiniowano również oficjalnie obowiązujące standardowe jednostki enzymatyczne.

Pierwszą z nich, obowiązującą w układzie SI, nazwano katalem (Kat). 1 Kat to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy w temperaturze 30°C.

Druga z tych oficjalnie obowiązujących jednostek, rekomendowana przez Międzynarodową Unię Biochemiczną, nazwana została międzynarodową jednostką enzymatyczną (w skrócie m.j.e.). 1 m.j.e. to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmola substratu w ciągu 1 minuty w temperaturze 30°C.

Jednakże dla wielu enzymów obie te oficjalne obowiązujące jednostki nie znalazły praktycznego zastosowania. Natomiast powszechnie przyjęły się jednostki enzymatyczne skojarzone z odpowiednimi metodami oznaczania aktywności opracowanymi dla całej gamy konkretnych enzymów a nawet grup enzymów.

Teoria Michaelisa-Menten. W 1913 roku L.Michaelis i M.L.Menten przedstawili swoją koncepcję katalizy enzymatycznej. Model  Michaelisa-Menten opiera się na założeniu powstawania przejściowego kompleksu enzymu-substrat:

(4.6)

Zgodnie z tym równaniem, przy niewielkich stężeniach substratu - równoważnym stężeniom enzymu - reakcja enzymatyczna staje się reakcją I rzędu i jej szybkość staje się proporcjonalna do stężenia zarówno substratu [S], jak i enzymu [E]. Przy stałym stężeniu enzymu [E] szybkość reakcji będzie zależała jedynie od stężenia substratu. Wpływ stężenia substratu [S] na początkową szybkość reakcji enzymatycznej przy stałym stężeniu enzymu przedstawia poniższy wykres.

Dla pewnych stężeń substratu - równoważnym ilościom dostępnych centrów aktywnych enzymu - reakcja osiągnie szybkość maksymalną V_max. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie przyspiesza jego przemiany. Jak już wspomniano wcześniej szybkość reakcji enzymatycznej zależy od łatwości tworzenia kompleksu enzymu z substratem. Z równania (4.6) wynika, że w stanie równowagi szybkość tworzenia kompleksu ES jest równa szybkości jego rozpadu:

(4.7)

(4.8)

Po podstawieniu zależności (4.8) do równania (4.7) i po prostych matematycznych przekształceniach otrzymuje się:

(4.9)

Uwzględniając fakt, że na początku reakcji [P] ⇒ 0 oraz po dalszych prostych przekształceniach równania (4.9), otrzymuje się:

(4.10)

Wielkość K_m nosi nazwę stałej Michaelisa. Jest ona charakterystyczna dla danego układu enzym-substrat. Łatwo zauważyć, że im mniejsza wartość K_m, tym większe stężenie kompleksu przejściowego [ES].

Analizując równania (4.6) ÷ (4.10) należy zauważyć, że

1. Stężenie enzymu [E] w równaniu (4.10), w rzeczywistości jest stężeniem enzymu wolnego w danym momencie reakcji, czyli niezwiązanego w kompleks przejściowy ES. Na każdym etapie reakcji część enzymu wyjściowego [E₀] obecnego w układzie reakcyjnym jest związana w ES. Stąd [E]= [E₀]-[ES].

2. Szybkość reakcji enzymatycznej v, czyli szybkość powstawania produktu P, zależy tak naprawdę od szybkości rozpadu kompleksu ES, czyli od v₊₂. Stąd: v = v₊₂=k₊₂ × [ES].

3. Gdy cały enzym jest w kompleksie z substratem, czyli [E₀]=[ES] szybkość reakcji enzymatycznej osiąga maksymalną szybkość V_max.

Uwzględniając powyższe założenia w równaniu (4.10) otrzymuje się równanie matematyczne Michaelisa-Menten:

(4.11)

Równanie (4.11) pozwala w prosty sposób zdefiniować stałą Michaelisa K_m:

gdy: v= 1/2×V_max to K_m = [S]

Stała Michaelisa K_m jest to takie stężenie substratu [S], przy którym szybkość reakcji enzymatycznej równa się połowie szybkości maksymalnej V_max.

Łatwo wykazać, że:

1. Jeśli [S]<<K_m (czyli przy małych stężeniach substratu), to reakcja jest I rzędu: v= f([S]),

2. Jeśli [S]=K_m, to v=1/2×V_max

3. Jeśli [S]>>K_m, to reakcja jest 0 rzędu i v=V_max.

Odwrotność stałej Michaelisa 1/K_m nazywana jest powinowactwem danego enzymy do substratu. Im mniejsza stała Michaelisa K_m, tym większe powinowactwo enzymu do substratu, co pokazuje poniższy rysunek. Celowo dla obu substratów - S₁ i S₂ - przyjęto identyczne szybkości maksymalne reakcji V_max. K_m2>K_m1, co oznacza, że ten enzym wykazuje większe powinowactwo do substratu S₁ aniżeli do S₂. Oznacza to, że szybciej przekształca on substrat S₁ aniżeli S₂.

Wpływ rodzaju substratu na szybkość reakcji Wykres Lineweavera-Burka

enzymatycznej

Stałe Michaelisa K_m dla różnych układów enzym-substrat mogą mieć różne wartości; nawet od 10^-2 mola/dm³ do 10^-7mola/ dm³.

Stałą K_m można wyznaczyć graficznie korzystając ze wzoru Lineweavera-Burka..

(4.13)

Reakcje enzymatyczne z kilkoma substratami. Gdy enzym ma więcej niż jeden substrat, określenie wartości K_m i V_max dla danego substratu możliwe jest tylko pod warunkiem, że pozostałe substraty będą uczestniczyły w reakcji w stężeniach przewyższających 5-10 razy wartości ich K_m. Interpretacja otrzymanych parametrów dla reakcji wielosubstratowych jest inna niż dla modelu Michaelisa-Menten, ponieważ są one funkcjami wielu stałych szybkości reakcji.

Enzymy oligomeryczne. Prędkość reakcji katalizowanej przez enzymy oligomeryczne (np. fosforylazę nukleozydów purynowych - EC 2.4.2.1) jest dość skomplikowaną funkcją stężenia substratów. Wynika to ze zjawiska kooperatywności, tzn. asocjacja substratu z centrum aktywnym jednego monomeru, objawia się zwiększeniem lub zmniejszeniem powinowactwa substratu do centrum aktywnego sąsiedniego monomeru. Odpowiednio nazywa się to kooperatywnością dodatnią lub ujemną. W przypadku kooperatywności następują odchylenia od kinetyki hiperbolicznej. Dla kooperatywności dodatniej hiperbola przechodzi w funkcję sigmoidalną. Dla funkcji typu Edie-Hofstee, dodatnia lub ujemna kooperatywność powoduje odpowiednio wypukłość lub wklęsłość funkcji liniowej.

W przypadku wystąpienia zjawiska kooperatywności, dla określenia jej typu i stopnia stosuje się równanie Hilla:

(4.14)

gdzie: h - współczynnik Hilla.

Dla h=1 występuje brak kooperatywności. Wtedy równanie przechodzi do postaci podanej przez Michaelisa-Menten. Dla h>1 występuje kooperatywność dodatnia, a dla h<1 kooperatywność ujemna. Im wartość h jest mniejsza od 1, tym silniejsze jest zjawisko kooperatywności. Zjawisko kooperacji jest podstawą allosterii.

Szczegółowo kinetyką reakcji enzymatycznych zajmuje się enzymologia i tam można znaleźć więcej danych odnośnie tematu.

4.2.4. Klasyfikacja i nomenklatura enzymów

Pierwotne nazewnictwo enzymów było nieuporządkowane i dopuszczało stosowanie dowolnych nazw takich, jak pepsyna, papaina, subtilizyna. W późniejszym okresie nazwę enzymu wywodzono od typu reakcji lub substratu, na który działał, przy czym za charakterystyczną dla enzymów uznano końcówkę -aza (np. reduktaza, lipaza, itp.).

Od 1964 roku Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej zaleciła stosowanie systematycznych nazw enzymów, składających się przeważnie z dwu części. Pierwsza jest utworzona od nazwy katalizowanej reakcji i określa jej rodzaj (np. oksydoreduktaza, glukohydrolaza, itp.). Druga część nazwy enzymu składa się z nazwy substratu lub substratów biorących udział w reakcji. Np.:

maltohydrolaza 1,4-α-D-glukanu (zwana oficjalnie i zwyczajowo β-amylazą) - EC 3.2.1.2,

oksydoreduktaza alkohol:NAD (oficjalnie zwana dehydrogenazą alkoholową) - EC 1.1.1.1.

Nazwy systematyczne enzymów są długie i często bardzo skomplikowane. Z tego powodu ich stosowanie napotyka na spory opór ze strony biochemików. Ponadto do wielu enzymów przylgnęły nazwy stosowane pierwotnie. Dlatego zdecydowano, że obok nazwy systematycznej, dopuszczalne jest stosowanie nazw zwyczajowych. Od 2000 roku ExPASy (Expert Protein Analysis System) zrzeszający wiele renomowanych ośrodków naukowych na świecie zaleca stosowanie tzw. nazw oficjalnych enzymów. Oficjalna nazwa enzymu (rekomendowana, zalecana) wywodzi się często od nazwy zwyczajowej. I tak np. nazwy α-amylaza lub papaina są nazwami oficjalnymi enzymów sklasyfikowanych odpowiednio pod numerami EC 3.2.1.1 oraz EC 3.4.22.2.

Należy jeszcze uzupełnić, że pierwotne, zwyczajowe nazwy niektórych enzymów (np. sacharaza, maltaza) okazały się w świetle aktualnej wiedzy bez pokrycia i dla nich nie zaleca się ich stosowania. Ponadto zdarza się, że pod jedną i tą samą nazwą zwyczajową są znane nawet trzy różne enzymy, np. tyrozynaza. Nazwa „tyrozynaza” dla dwóch z nich oczywiście jest nazwą błędną.

W numerze 1 czasopisma "Postępy Biochemii" z 1985 roku zamieszczono słownik zalecanych i zwyczajowych nazw enzymów w języku polskim.

Wszystkie poznane enzymy zostały ujęte przez Komisję Enzymową w jednolity system klasyfikacji (EC). Każdy enzym w ramach tego systemu posiada odpowiedni numer złożony z czterech członów liczbowych oddzielonych kropkami (np. dehydrogenaza alkoholowa ma numer EC 1.1.1.1). Podanie tego numeru jednoznacznie określa konkretny enzym, co pozwala uniknąć nieporozumień i pomyłek. Zasady klasyfikacji i numeracji zbadanych enzymów oparte zostały o ich specyficzność kierunkową (rodzaj katalizowanej reakcji) i substratową. Wszystkie enzymy podzielono na sześć głównych klas:

• EC.1. Oksydoreduktazy - enzymy katalizujące reakcje odłączania lub przyłączania atomów wodoru, przyłączenia atomu tlenu lub przenoszenia elektronów.

• EC.2. Transferazy - enzymy przenoszące grupy funkcyjne, rodniki, fragmenty cząsteczek itp.

• EC 3. Hydrolazy - enzymy katalizujące reakcje hydrolizy.

• EC 4. Liazy - enzymy niehydrolitycznie rozrywające wiązania.

• EC 5. Izomerazy - enzymy katalizujące przemiany wewnątrzcząsteczkowe (racemizacja, izomeryzacja, przenoszenie grup itp.).

• EC 6. Ligazy - enzymy syntetyzujące, katalizujące tworzenie wiązań.

Każda klasa główna dzieli się na szereg podklas, których kolejne numery stanowią drugi człon numeru klasyfikacyjnego i wynikają, ogólnie biorąc, z uściślonej specyficzności kierunkowej. Na przykład EC.3.4. jest numerem podklasy hydrolaz peptydowych, czyli enzymów hydrolizujących wiązanie peptydowe. W obrębie podklas rozróżnia się pod-podklasy - trzeci człon numeru klasyfikacyjnego. Określa on dokładniej specyfikę katalizowanej reakcji. Dla oksydoreduktaz określa grupę funkcyjną będącą akceptorem; dla transferaz uściśla rodzaj przenoszonej grupy; dla hydrolaz - typ hydrolizowanego wiązania; dla liaz - rodzaj odszczepianej grupy; dla izomeraz - charakter przekształcenia i wreszcie dla ligaz - rodzaj powstałego związku.

Dostęp do internetowej bazy danych dotyczącej nomenklatury enzymów (Enzyme Nomenclature Database) można znaleźć pod adresem http://www.expasy.org/enzyme/. Na następnej stronie przykładowo pokazano stronę internetową ExPASy dla dehydrogenazy alkoholowej - EC 1.1.1.1.

Zasady klasyfikacji enzymów w podklasach i pod-podklasach.

Oksydoreduktazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, na jaką grupę funkcyjną lub grupę związków działa dana oksydoreduktaza. Pewnego typu odstępstwo występuje w podklasach EC 1.13. i EC 1.14. Te dwie podklasy skupiają oksygenazy - enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratów, choć oficjalnie mówi się o „oksydoreduktazach działających na pojedyncze lub podwójne donory z jednoczesnym wybudowaniem atomów tlenu”.

Poniżej przedstawiono przykłady podklas (w EC 1.13. i EC 1.14. również pod-podklas) w tej klasie enzymów.

EC 1. Oksydoreduktazy

EC 1.1. działające na grupę -CH₂-OH jako donor

EC 1.2. działające na grupę -CHO lub >C=O jako donor

EC 1.3. odrywające atomy wodoru od -CH₂-CH₂−, prowadząc do -CH=CH−

EC 1.4. działające na grupę -CH₂-NH₂ jako donor

EC 1.5. działające na grupę -CH-NH- jako donor

EC 1.6. działające na NADH lub NADPH

EC 1.7. działające na inne związki azotowe jako donory

EC 1.8. działające na związki siarki jako donory

EC 1.9. działające na grupę hemową jako donor

EC 1.10. działające na związki difenolowe i pokrewne jako donory

EC 1.11. działające na H₂O₂ jako akceptor peroksydazy

Są to peroksydazy. W tej podklasie brak jest pod-podklas, stąd ich numer zaczyna się od EC 1.11.1. Na przykład numer EC 1.11.1.6 odnosi się do katalazy.

EC 1.12. działające na wodór jako donor

EC 1.13. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, nie wymagają dodatkowego donoru wodoru

EC 1.13.11. dioksygenazy- wbudowują dwa atomy tlenu

EC 1.13.12. monooksygenazy - wbudowują jeden atom tlenu

EC 1.14. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, wymagają dodatkowego donoru wodoru

Wzór strony ExPASy dla EC 1.1.1.1 - dehydrogenaza alkoholowa.

P80222, ADH1_ALLMI;  

P49645, ADH1_APTAU;  

P06525, ADH1_ARATH;  

P41747, ADH1_ASPFL;  

P12311, ADH1_BACST;  

Q17334, ADH1_CAEEL;  

P43067, ADH1_CANAL;  

P48814, ADH1_CERCA;  

P23991, ADH1_CHICK;  

P23236, ADH1_DROHY;  

P48586, ADH1_DROMN;  

P09370, ADH1_DROMO;  

P22246, ADH1_DROMT;  

P07161, ADH1_DROMU;  

P12854, ADH1_DRONA;  

P08843, ADH1_EMENI;  

P05336, ADH1_HORVU;  

P20369, ADH1_KLULA;  

Q07288, ADH1_KLUMA;  

P00333, ADH1_MAIZE;  

P80512, ADH1_NAJNA;  

Q9P6C8, ADH1_NEUCR;  

P20306, ADH1_ORYSA;  

P12886, ADH1_PEA;  

P14219, ADH1_PENAM;  

P25141, ADH1_PETHY;  

O00097, ADH1_PICST;  

Q03505, ADH1_RABIT;  

P22797, ADH1_RANPE;  

P14673, ADH1_SOLTU;  

P80338, ADH1_STRCA;  

P13603, ADH1_TRIRP;  

P00330, ADH1_YEAST;  

Q07264, ADH1_ZEALU;  

P20368, ADH1_ZYMMO;  

P42327, ADH2_BACST;  

O45687, ADH2_CAEEL;  

O94038, ADH2_CANAL;  

P48815, ADH2_CERCA;  

P27581, ADH2_DROAR;  

P25720, ADH2_DROBU;  

P23237, ADH2_DROHY;  

P48587, ADH2_DROMN;  

P09369, ADH2_DROMO;  

P07160, ADH2_DROMU;  

P24267, ADH2_DROWH;  

P37686, ADH2_ECOLI;  

P54202, ADH2_EMENI;  

Q24803, ADH2_ENTHI;  

P10847, ADH2_HORVU;  

P49383, ADH2_KLULA;  

Official Name
Alcohol dehydrogenase.
Alternative Name(s)
Aldehyde reductase.
Reaction catalysed
An alcohol + NAD(+) <=> an aldehyde or ketone + NADH
Cofactor(s)
Zinc or Iron.
Comment(s)
Acts on primary or secondary alcohols or hemiacetals. The animal, but not the yeast, enzyme acts also on cyclic secondary alcohols.
Cross-references
Biochemical Pathways; map number(s)	D8 ; E6 ; J10
PROSITE	PDOC00058 ; PDOC00059 ; PDOC00060
BRENDA	1.1.1.1
PUMA2	1.1.1.1
PRIAM enzyme-specific profiles	1.1.1.1
Kyoto University LIGAND chemical database	1.1.1.1
IUBMB Enzyme Nomenclature	1.1.1.1
IntEnz	1.1.1.1
MEDLINE	Find literature relating to 1.1.1.1
Swiss-Prot

Schematycznie, reakcje katalizowane przez oksygenazy można przedstawić następująco:

EC 1.14.11. dioksygenazy, DH₂ = 2-ketoglutran

EC 1.14.12. dioksygenazy, DH₂ = NADH

EC 1.14.13. monooksygenazy, DH₂ = NADH

EC 1.14.14. monooksygenazy, DH₂ = FADH₂ lub zredukowany FMN

EC 1.14.15. monooksygenazy, DH₂ = zredukowane żelazowo-siarkowe białka

EC 1.14.16. - EC 1.14.20. monooksygenazy, DH₂ = inne zredukowane związki

EC 1.15. działające na ponadtlenki jako akceptory

EC 1.16. utleniające jony metali

EC 1.17. działające na grupy =CH− lub -CH₂− jako donory

EC 1.18. działające na siarkowo-żelazowe białka jako donory

EC 1.19. - EC 1.21. działające na inne związki jako donory

EC 1.97. inne oksydoreduktazy

W klasie oksydoreduktaz trzeci człon numeru - czyli pod-podklasa - wskazuje, co jest donorem lub akceptorem atomów wodoru względnie elektronów. Poniżej podano kilka przykładów pod-podklas z klasy oksydoreduktaz.

EC 1.x.1. akceptorem wodoru jest NAD lub NADP, dehydrogenazy i reduktazy

EC 1.x.2. akceptorem elektronów są cytochromy

EC 1.x.3. akceptorem wodoru jest tlen cząsteczkowy, oksydazy

Oksydazy są flawoproteidami (np. z FAD), metaloflawoproteidami bądź hemoproteidami. Znane są dwa typy oksydaz: oksydazy typu I wytwarzają podczas działania wodę, oksydazy typu II wytwarzają nadtlenek wodoru.

Przykładem oksydazy typu I jest oksydaza cytochromu-c (EC 1.9.3.1), a przykładem oksydazy typu II oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4).

EC 1.x.4. akceptorem są związki disulfidowe (min. liponian) dehydrogenazy (dekarboksylujące)

EC 1.x.5. akceptorem wodoru jest ubichinon dehydrogenazy

EC 1.x.7. akceptorem są żelazo-siarkowe białka

EC1.x.99.z innym akceptorem (najczęściej z FAD) dehydrogenazy

Transferazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, jaką grupę funkcyjną transportuje dana transferaza. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - uściśla o jaki rodnik chodzi lub wskazuje akceptor przenoszonej grupy.

EC 2. Transferazy

EC 2.1. transportujące grupy jednowęglowe (C₁)

EC 2.1.1. metylotransferazy (−CH₃)

EC 2.1.2. hydroksymetylo- i formylotransferazy (−CH₂−OH, −CHO)

EC 2.1.3. karboksy− i karbamoilotransferazy

EC 2.1.4. amidynotransferza (−CONH₂)

EC 2.2. transportujące grupy aldehydowe lub ketonowe

EC 2.3. Acylotransferazy

EC 2.3.1. transportujące grupy inne niż acetylo-aminowe wiele z nich to syntazy

EC 2.3.2. aminoacylotransferazy

EC 2.3.3. acylowe grupy przekształcane na alkilowe rodniki podczas transportu syntazy

EC 2.4. glikozylotransferazy

EC 2.4.1. heksozylotransferazy

EC 2.4.2. pentozylotransferazy

EC 2.4.99 transportujące inne glikozylowe grupy

EC 2.5. transportujące alkilowe lub arylowe grupy, inne niż metylowe grupy

EC 2.6. transportujące grupy z azotem

EC 2.6.1. Transaminazy aminotransferazy

EC 2.6.2. Oksymotransferazy

EC 2.6.99. transportujące inne grupy z azotem

EC 2.7. transportujące grupy zawierające fosfor

EC 2.7.1. Fosfotransferazy z grupą alkoholową jako akceptorem kinazy

EC 2.7.2. Fosfotransferazy z grupą karboksylową jako akceptorem kinazy

EC 2.7.3. Fosfotransferazy z grupą z azotem jako akceptorem kinazy

EC 2.7.4. Fosfotransferazy z grupą fosforową jako akceptorem kinazy

EC 2.7.6. Difosfotransferazy difosfokinazy

EC 2.7.7. Nukleotydilotransferazy

EC 2.7.8. Transferazy dla innych pochodnych grup fosforowych

EC 2.7.9. Fosfotransferazy z parą akceptorów dikinazy

EC 2.8. transportujące grupy zawierające siarkę

EC 2.8.1. Siarkotransferazy

EC 2.8.2. Siarczanotransferazy

EC 2.8.3. CoA-transferazy

EC 2.8.4. transportujące grupy tioalkylowe

EC 2.8. transportujące grupy zawierające selen

Hydrolazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju wiązanie ulega hydrolizie. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - uściśla typ hydrolizowanego wiązania.

EC 3.Hydrolazy

EC 3.1. działające na wiązanie estrowe

EC 3.1.1. Hydrolazy estrów karboksylowych esterazy, lipazy i laktonazy

EC 3.1.2. Hydrolazy tioestrów

EC 3.1.3. Hydrolazy monoestrów fosforowych fosfatazy i nukleotydazy

EC 3.1.4. Hydrolazy diestrów fosforowych fosfolipazy i fosfodiesterazy

EC 3.1.5. Hydrolazy monoestrów trifosforowych

EC 3.1.6. Hydrolazy estrów kwasu siarkowego

EC 3.1.7. Hydrolazy monoestrów difosforowych difosfatazy

EC 3.1.8. Hydrolazy triestrów fosforowych

EC 3.1.11. ÷3.1.31. Egzo- i endorybonukleazy

EC 3.2. Glikozylazy

EC 3.2.1. Glikozydazy, i inne enzymy hydrolizujące O- i S-glikozyle

EC 3.2.2. hydrolizujące związki N-glikozylowe

EC 3.3. działające na wiązanie eterowe

EC 3.3.1. Hydrolazy tioeterowe i trialkilosulfonianowe

EC 3.3.2. Hydrolazy eterowe

EC 3.4. działające na wiązanie peptydowe hydrolazy peptydowe

EC 3.4.11. Aminopeptydazy

EC 3.4.13. Dipeptydazy

EC 3.4.14. Dipeptydylo- i tripeptydylo-peptydazy

EC 3.4.15. Peptydylo-dipeptydazy

EC 3.4.16 Karboksypeptydazy serynowego typu

EC 3.4.17 Metalokarboksypeptydazy

EC 3.4.18 Karboksypeptydazy cysteinowego typu

EC 3.4.19 Omega peptydazy

EC 3.4.21. Endopeptydazy serynowe

EC 3.4.22. Endopeptydazy cysteinowe

EC 3.4.23. Endopeptydazy aspartylowe

EC 3.4.24. Metaloendopeptydazy

EC 3.4.25. Endopeptydazy treoninowe

EC 3.4.99. Endopeptydazy o nierozpoznanym mechanizmie działania

EC 3.5. działające na wiązanie C−N, inne niż peptydowe

EC 3.5.1. w linearnych amidach m.in. amidazy i deacylazy

EC 3.5.2. w cyklicznych amidach

EC 3.5.3. w linearnych amidynach

EC 3.5.4. w cyklicznych amidynach

EC 3.6. działające na bezwodniki kwasowe

EC 3.6.1. w związkach zawierających fosforanowe bezwodniki m.in. difosfatazy

EC 3.6.2. w związkach zawierających sulfonowe bezwodniki

EC 3.6.3. działające na bezwodniki kwasowe; katalizujące przenoszenie transmembranowe

EC 3.6.5. działające na GTP; związane z komórkowym transportem

EC 3.7. działające na wiązanie C−C

EC 3.7.1. w ketonowych substancjach

EC 3.8. działające na halogenkowe wiązania

EC 3.8.1. w związkach C−halogen

EC 3.9. działające na wiązanie fosforo-azotowe

EC 3.10. działające na wiązanie siarkowo-azotowe

EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-fosforowe

EC 3.11. działające na wiązanie siarkowo-siarkowe

EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-siarkowe

Liazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju wiązanie ulega rozerwaniu. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - uściśla typ rozrywanego wiązania.

EC 4. Liazy

EC 4.1. Liazy węgiel-węgiel

EC 4.1.1. karboksy-liazy dekarboksylazy

EC 4.1.2. aldehydo-liazy

EC 4.1.3. liazy ketokwasów

EC 4.1.99. inne węgiel-węgiel liazy

EC 4.2. Liazy węgiel-tlen

EC 4.2.1. hydro-liazy dehydratazy

EC 4.2.2. działające na polisacharydy

EC 4.2.3. działające na fosforany syntazy

EC 4.2.99 inne węgiel-tlen liazy

EC 4.3. Liazy węgiel-azot

EC 4.3.1. amoniako-liazy

EC 4.3.2. liazy działające na amidy, amidyny, itp.

EC 4.3.3. amino-liazy

EC 4.3.99. inne węgiel-azot liazy

EC 4.4. Liazy węgiel-siarka

EC 4.5. Liazy węgiel-halogen

EC 4.6. Liazy fosfor-tlen

Izomerazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) uściśla typ katalizowanej reakcji. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - wskazuje, jakie związki lub ugrupowania ulegają izomeryzacji.

EC 5. Izomerazy

EC 5.1. Racemazy i epimerazy

EC 5.1.1. działające na aminokwasy i ich pochodne

EC 5.1.2. działające na hydroksykwasy i ich pochodne

EC 5.1.3. działające na węglowodory i ich pochodne

EC 5.1.99. działające na inne związki

EC 5.2. cic-trans izomerazy

EC 5.3. wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy

EC 5.3.1. wzajemnie przekształcające się aldozy i ketozy

EC 5.3.2. wzajemnie przekształcające się ugrupowania enolowe i ketonowe tautomerazy

EC 5.3.3. przenoszące wiązania C=C Δ-izomerazy

EC 5.3.4. przenoszące wiązania S−S

EC 5.3.99. inne wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy

EC 5.4.wewnątrzcząsteczkowe transferazy mutazy

EC 5.4.1. transportujące grupy acylowe

EC 5.4.2. fosfotransferazy fosfomutazy

EC 5.4.3. transportujące grupy aminowe

EC 5.4.99. transportujące inne grupy

EC 5.5. wewnątrzcząsteczkowe liazy

EC 5.99. inne izomerazy

Ligazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego typu wiązanie jest tworzone. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - uściśla, jakiego typu związki lub ugrupowania powstają w wyniku syntezy.

EC 6. Ligazy

EC 6.1. tworzące wiązanie węgiel-tlen

EC 6.1.1. ligazy tworzące aminoacylo-tRNA i spokrewnione związki

EC 6.2. tworzące wiązanie węgiel-siarka

EC 6.2.1. ligazy kwas-tiol syntetazy acylo-CoA

EC 6.3. tworzące wiązanie węgiel-azot

EC 6.3.1. ligazy kwas-amoniak syntetazy amidowe

EC 6.3.2. ligazy kwas- D-aminokwas syntetazy peptydowe

EC 6.3.3. cyklo-ligazy

EC 6.3.4. inne ligazy tworzące wiązanie węgiel-azot

EC 6.3.5. ligazy wiązania węgiel-azot z glutaminą, jako amido-N donorem

EC 6.4. tworzące wiązanie węgiel-węgiel

EC 6.5. tworzące wiązanie fosforowoestrowe

EC 6.6. tworzące wiązanie azot-metal chelatazy

Izoenzymy

Izoenzymy, to odmiany tego samego enzymu o identycznym centrum aktywnym i mechanizmie działania, a różniące się w niewielkim stopniu sekwencją aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Konsekwencją tego mogą być pewne różnice właściwości fizyko-chemicznych i biologicznych takich odmian enzymu, np.: różne pI, optymalne pH i temperatura działania, K_M i odczyn immunologiczny. Izoenzymy są umieszczane w Klasyfikacji i Nomenklaturze Enzymów pod tym samym numerem. Zazwyczaj w komentarzu do danego enzymu wspomina się o jego odmianach i podaje odpowiednie odnośniki literaturowe.

4.2.5. Czynniki wpływające na efektywność działania enzymów

Do podstawowych czynników określających przebieg (kinetykę) reakcji enzymatycznych należą: pH środowiska, temperatura, stężenie jonów, potencjał oksydoredukcyjny, obecność inhibitorów, aktywatorów oraz stabilizatorów (substancji hamujących lub podwyższających efektywność działania enzymu) i oczywiście tak istotne parametry procesu, jak stężenie enzymu i substratu, o czym mowa była już wcześniej.

pH środowiska.
Szybkość reakcji enzymatycznych w znacznym stopniu zależy od pH środowiska. Każdy enzym wykazuje charakterystyczne dla siebie optimum pH. Na poniższym rysunku przedstawiono wpływ pH na aktywność trzech endopeptydaz: pepsyny A (EC 3.4.23.1), bacillolizyny (EC 3.4.24.28) oraz subtilizyny (EC 3.4.21.62).

Wpływ pH na aktywność trzech różnych endopeptydaz

Jak widać, każda z tych endopeptydaz działa w zupełnie innym zakresie pH: pepsyna w środowisku kwaśnym (optymalne pH 1,8), bacillolizyna w obojętnym (optymalne pH 7,3), a subtilizyna w alkalicznym (optymalne pH 10,2). Związane jest to z wpływem stężenie jonów hydronowych na konformację centrum aktywnego każdej z nich. Pepsyna, której aminokwasem bezpośrednio działającym w centrum aktywnym jest kwas asparaginowy, wymaga jego formy niezdysocjowanej (czyli grupy -COOH). Grupa taka w przewadze występuje w środowisku kwaśnym. Endopeptydazy serynowe, których centrum aktywne opisano wyżej, wymagają do aktywnego działania zdysocjowanej formy kwasu asparaginowego (grupy karboksylanowej -COO^-), która występuje w przewadze w środowisku alkalicznym.

Należy zwrócić uwagę na to, że o ile subtilizyna jest aktywna w szerokim zakresie pH od 6 do 11, to pozostałe dwie endopeptydazy działają w bardzo wąskim przedziale pH i niewielkie jego zmiany wykazują znaczny wpływ na wzrost lub obniżenie ich aktywności. Optymalne pH niektórych enzymów (np. aktywność subtilizyny) zmieniać się może w zależności od substratu, na który działają, choć są to wahania nie większe niż 0.5 jednostki (np. subtilizyna wobec hemoglobiny optimum pH wykazuje przy 10,2, a wobec kazeiny 10,5).

Optymalna temperatura. Temperatura z jednej strony przyspiesza samą reakcję enzymatyczną, z drugiej jednak przyspiesza denaturację enzymu, co wiąże się z jego inaktywacją. Na rysunku obok przedstawiono wpływ temperatury na aktywność subtilizyny. Do osiągnięcia pewnej granicznej wielkości (w tym przypadku temperatury 60°C), szybkość reakcji katalizowanej przez ten enzym wzrasta, podobnie jak to się dzieje przy wszystkich reakcjach chemicznych, a następnie dość gwałtownie spada do wartości zerowych. Większość enzymów drobnoustrojowych najefektywniej działa w granicach 60°C. Enzymy roślinne i zwierzęce z reguły już powyżej 40-50°C ulegają denaturacji. Znane są enzymy z bakterii termofilnych, wykazujące optimum działania nawet w temperaturach sięgających 90°C.

Stabilność enzymów w roztworach wodnych. Jak już wspomniano pH środowiska i temperatura bezpośrednio wpływają na szybkość reakcji enzymatycznej. Jednakże mogą również niekorzystnie oddziaływać na sam enzym, prowadząc do jego inaktywacji. Dlatego niezbędna jest znajomość wpływu tych dwóch czynników na aktywność enzymu w warunkach rzeczywistych lub do nich zbliżonych, panujących podczas procesu prowadzonego z jego udziałem. Większość enzymów jest względnie stabilna w obszarze pH zbliżonym dla ich optymalnego działania, jakkolwiek nie jest to regułą. Na poniższym rysunku przedstawiono wpływ pH na stabilność subtilizyny.

Wpływ pH na stabilność subtilizyny w roztworach buforowych i z dodatkiem 1% CaCl₂

Jej optymalne pH działania wynosi 10,2, jednakże obszar stabilności tego enzymu rozpuszczonego w roztworach buforowych o różnym pH preinkubowanych (przetrzymywanych bez substratu) w temperaturze 45°C przez 60 minut zawarty jest w zakresie 6.5-9.5. W pH zbliżonym do optymalnego straty aktywności (w wyniku postępującej autolizy) sięgają 50% wyjściowej.

Dużo poważniejsze straty enzymu spowodowane mogą być wpływem podwyższonej temperatury reakcji. Znaczna część enzymów jest bardzo wrażliwa na ten czynnik (wyjątkiem są niektóre enzymy termostabilne, otrzymywane ze szczepów drobnoustrojów termofilnych). Na poniższym rysunku pokazano wpływ temperatury na zachowanie aktywności subtilizyny rozpuszczonej w buforze o pH 9 podczas preinkubacji w różnych temperaturach przez 120 minut. Co 15 minut pobierano próbkę roztworu enzymu i oznaczano jego aktywność.

Wpływ temperatury na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1%CaCl₂

Należy wyraźnie zaznaczyć, że subtilizyna (konsekwentnie w tekście niniejszego opracowania rozpatrywana jako enzym modelowy) jest wyjątkowo odporna na działanie wielu czynników fizyko-chemicznych, w tym temperatury. Tym niemniej w warunkach testu, po 40 minutach preinkubacji w 60°C straty jej aktywności sięgają 70%. W tym samym czasie w temperaturze 70°C enzym ulega już pełnej inaktywacji. Natomiast w 50°C po 60 minutach straty enzymu są stosunkowo niewielkie i wynoszą 36%. W temperaturze 20°C subtilizyna, podobnie jak wiele innych enzymów, jest stabilna. Przyjmuje się jednak, że enzymy w roztworach wodnych najlepiej jest przechowywać w temperaturze 4°C.

Obecność substratu w roztworze działa ochronnie na wiele enzymów i ich stabilność jest wtedy dużo większa. Przykładowo, α-amylaza z Bacillus licheniformis zachowuje aktywność przez 10 minut w roztworze 5%-owej skrobi w temperaturze 110°C.

Stabilność niektórych enzymów w roztworach wodnych zwiększyć może także dodając charakterystyczne dla danego enzymu związki chemiczne zwane stabilizatorami. W przypadku subtilizyny są to jony Ca²⁺.

Koncentracja wody. W praktyce nie wszystkie reakcje katalizowane przez enzym przebiegają do końca. Bowiem należy pamiętać, że są one odwracalne i po pewnym czasie ustala się równowaga pomiędzy reakcją przebiegającą do "przodu" i odwrotną. Jednym z czynników wpływających na ich stałą równowagi może być stężenie wody w środowisku reakcyjnym. Dotyczy to zwłaszcza przemian, w których woda jest jednym z reagentów (np. w reakcjach enzymatycznej hydrolizy). Stężenie wody decyduje o kierunku ich przebiegu. I tak, subtilizyna w środowisku wodnym katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych w białkach lub wiązań estrowych w licznych estrach, natomiast w środowisku bezwodnym lub o obniżonej koncentracji wody katalizuje rewersję tych reakcji. Dla pożądanego przesunięcia stałej równowagi takich reakcji stosuje się rozmaite zabiegi. M.in. rewersję enzymatycznej hydrolizy (czyli syntezę) osiąga się, stosując w środowisku reakcyjnym rozpuszczalniki organiczne, prowadząc proces w układzie difazowym (z rozpuszczalnikiem apolarnym nasyconym wodą), korzystnie z immobilizowaną formą enzymu itp.

4.2.6. Wpływ aktywatorów i inhibitorów na aktywność enzymów

Oprócz wymienionych wyżej czynników wpływających na działanie enzymów, istnieje grupa substancji chemicznych zdolnych do zwiększania lub hamowania szybkości reakcji enzymatycznej - są to tzw. aktywatory i inhibitory enzymów.

Aktywatory.

Aktywatorami enzymów nazywamy związki drobnocząsteczkowe, które przyspieszają przebieg reakcji enzymatycznych. Wiele enzymów wymaga obecności aktywatorów (są one uznawane za kofaktory reakcji enzymatycznej). Aktywatorami enzymów mogą być jony metali (np. Mn²⁺, Co²⁺, Zn²⁺ ), aniony (np. Cl^- ), a także związki regulujące potencjał redoks środowiska, od których zależy budowa centrów aktywnych enzymów. Niekiedy kationy dwuwartościowe mogą zastępować się wzajemnie.

Przykładowo, aktywatorami kinaz (enzymów transportujących grupy fosforanowe z ATP na substraty) są jony Mg²⁺, bowiem ATP uczestniczy w reakcjach enzymatycznych w postaci kompleksu z Mg²⁺.

Innym przykładem może być α-amylazy śliny, której aktywatorem są jony Cl^-.

Inhibitory.

Każdy związek chemiczny działający bezpośrednio na enzym zmniejszający jego aktywność katalityczną, a tym samym spowalniający lub hamujący szybkość reakcji jest określany jako inhibitor. Proces ten nazywa się inhibicją. Pewne inhibitory enzymów są normalnymi metabolitami komórkowymi, które hamują dany enzym w ramach naturalnej metabolicznej kontroli odpowiedniego szlaku. Inne inhibitory mogą być substancjami obcymi dla organizmu, takimi jak toksyny i leki, i w tym przypadku hamowanie enzymu może mieć działanie terapeutyczne, ale również letalne. W biologii inhibitory enzymów, zwane są potocznie truciznami enzymów.

Nieodwracalna denaturacja białka enzymatycznego spowodowana np. częściową hydrolizą (na skutek działania kwasów lub zasad) czy ogrzewaniem nie jest traktowana jako inhibicja..

Inhibitory mogą hamować reakcje enzymatyczne odwracalnie lub nieodwracalnie. Stąd rozróżnia się dwa główne typu inhibicji: - odwracalną oraz nieodwracalną i odpowiednio inhibitory dzieli się na działające odwracalnie oraz działające nieodwracalnie. Przy działaniu tych pierwszych aktywność enzymu można przywrócić przez usunięcie inhibitora, np. przez dializę lub prostą reakcje chemiczną. Przy nieodwracalnym działaniu inhibitorów nie jest możliwe przywrócenie aktywności enzymu.

Liczne inhibitory inaktywują enzym działając niespecyficznie, np. atakując białko enzymatyczne poza centrum aktywnym. Inne natomiast rozpoznają centrum aktywne lub pewne określone obszary białka konkretnego enzymu atakując je bezpośrednio. Stąd wyróżnia się inhibitory specyficzne i niespecyficzne.

Inhibitory specyficzne dalej dzieli się na inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne, zaś inhibicję odwracalną wywołaną działaniem inhibitorów specyficznych można dalej podzielić na:

1. kompetycyjną

2. niekompetycyjną

3. akompetycyjną
   

Inhibicja nieodwracalna (inaktywacja enzymu, inhibicja absolutna) polega na wiązaniu się inhibitora i enzymu w sposób trwały, nieodwracalny, często tworząc wiązania kowalencyjne z resztami aminokwasów, znajdujących się w centrum aktywnym lub w innych miejscach białka enzymatycznego i w ten sposób inaktywując enzym na stałe. Przykładem może być związek diizopropylofluorofosforan (DFP), sztucznie otrzymywany inhibitor specyficzny niekompetycyjny niektórych enzymów zawierających w centrum aktywnym serynę, m.in. endopeptydaz serynowych (w tym subtilizyny). Wielkość cząsteczki DFP i rozkład jej ładunków jest tak dobrany, że inhibitor idealnie dopasowuje się do centrum aktywnego tych enzymów i tworzy kowalencyjne wiązanie jedynie z aminokwasem bezpośrednio działającym, czyli Ser²²¹.

W efekcie inhibicji nieodwracalnej, przy dostatecznie dużym stężeniu inhibitora, cała pula enzymu może ulec inaktywacji i reakcja zostaje zahamowana (jeśli już zachodziła) lub w ogóle nie rozpocznie się. Przy niewielkich stężeniach inhibitora, „mniejszych” od ilości cząstek enzymu, tylko część enzymu ulegnie inaktywacji; V_max ulegnie obniżeniu, natomiast K_m pozostanie bez zmian.

Inhibitory niespecyficzne. Za niespecyficzne inhibitory reakcji enzymatycznej można uznać wszystkie substancje uszkadzające strukturę białka enzymatycznego. Dlatego do inhibitorów niespecyficznych zaliczamy wszystkie związki wywołujące denaturację białek. Do nich zalicza się jony metali ciężkich, mocznik, aldehyd mrówkowy czy glutarowy, silne utleniacze (np. nadmanganian lub chlor). Zdecydowana większość inhibitorów niespecyficznych działa nieodwracalnie. Do nielicznych, działających odwracalnie w stosunku do konkretnych enzymów należy mocznik i chlorowodorek guanidyny, które można usunąć przez dializę i reaktywować enzym (np. fosforylazę nukleotydów purynowych).

Inhibitory specyficzne, jak wskazuje ich nazwa, działają w sposób specyficzny, jedynie na konkretne enzymy lub ich grupy. Ze względu na mechanizm działania, a konkretnie z uwagi na miejsce działania, dzieli się je na:

1. kompetycyjne (konkurencyjne, I_K) - mechanizm ich działania polega na współzawodnictwie między substratem a inhibitorem o centrum aktywne enzymu,

2. niekompetycyjne (allosteryczne, I_N), - ich działanie polega na łączeniu się inhibitora z enzymem w innym miejscu niż centrum aktywne. Połączenie enzym - inhibitor (EI_N) powoduje, że zmienia się konformacja białka a tym samym ukształtowanie centrum aktywnego enzymu, wobec czego substrat nie może zostać przyłączony.

Jednakże ten podział nie uwzględnia wszystkich znanych przypadków. Przykładowo, wspomniany już DFP zaliczany jest do inhibitorów niekompetycyjnych, a przecież przyłącza się do centrum aktywnego enzymu i nie jest inhibitorem allosterycznym.

Innym kryterium podziału na inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne jest wpływ stężenia substratu na stopień inhibicji przez nie wywoływany. Jeśli spowolnienie (hamowanie) reakcji enzymatycznej ustępuje w wyniku zwiększenia stężenia substratu, inhibitor zalicza się do kompetycyjnych. Inhibicja niekompetycyjna jest niezależna od stężenia substratu. Jednak i w tym przypadku wiele inhibitorów nie wykazuje idealnych, klasycznych właściwości inhibitorów kompetycyjnych i niekompetycyjnych.

Inhibicja kompetycyjna. Inhibitor kompetycyjny I_K jest zazwyczaj strukturalnie podobny do właściwego substratu danego enzymu. Dzięki temu współzawodniczy z cząsteczkami substratu o miejsce aktywne enzymu. Ten może się wiązać albo z cząsteczkę substratu, albo cząsteczkę inhibitora, ale nie z obiema  jednocześnie. Inhibitor kompetycyjny wiąże się z miejscem aktywnym odwracalnie, ale nie jest dalej przekształcany. Przy dużych stężeniach substratu działanie inhibitora kompetycyjnego zostaje przezwyciężone, ponieważ będzie on skutecznie wypierany z centrum aktywnego przez cząsteczki substratu - na zasadzie współzawodnictwa. Nie nastąpi więc zmiana wartości V_max reakcji, natomiast zmniejszy się powinowactwo enzymu do jego substratu i dlatego wartość K_m wzrasta.

Modelowym przykładem hamowania kompetycyjnego może być dehydrogenaza bursztynianowa. Substratem dla tego enzymu jest bursztynian, który przekształcany jest do fumaranu. Inhibitorem kompetycyjnym jest malonian, który różni się od bursztynianu posiadaniem tylko jednej, a nie dwóch grup metylenowych.

Inhibitory kompetycyjne są zazwyczaj związkami naturalnie występującymi w przyrodzie. Czasami może nimi być produkt reakcji.

Działanie inhibitorów kompetycyjnych można zapisać w formie poniżej przedstawionej reakcji. Stała dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor nazywa się stałą inhibicji K_i = k_-3 = [E][I_K] / [EI_K]. Spełniona jest zależność 4.15:

(4.15)

(4.16)

gdzie: [I_K] stężenie inhibitora kompetycyjnego, a [E] i [EI_K] to odpowiednio stężenia enzymu i kompleksu enzym-inhibitor, K'_m - pozorna stała Michaelisa reakcji z inhibitorem I_K.

Dla [I_K] / K_i << 1 równanie 4.15 przechodzi do postaci równania Michaelisa-Menten. Jak już wspomniano inhibicja kompetycyjna nie zmienia prędkości maksymalnej reakcji V_max, zwiększa jednak stałą Michaelisa do K'_m (równanie 4.16), co graficznie przedstawiono na poniższych rysunkach.

Inhibicja niekompetycyjna odwracalna polega na odwracalnym przyłączaniu inhibitora niekompetycyjnego I_N do białka enzymatycznego poza centrum aktywnym, co powoduje zmianę konformacji białka, prowadzącą do obniżenia aktywności katalitycznej enzymu. W związku z brakiem współzawodnictwa substratu i inhibitora o centrum aktywne, zwiększenie stężenia substratu nie znosi inhibicji. Inhibitor I_N znacznie zmniejsza liczbę obrotów enzymu, nie ma jednak wpływu na liczbę cząsteczek enzymu wiążących substrat.

Reakcje z udziałem inhibitorów niekompetycyjnych działających odwracalnie można zapisać w formie poniżej przedstawionej reakcji.

(4.17)

(4.18)

gdzie: k_-3 -stała dysocjacji kompleksu EI_N, k_-3 = [E][I_N]/[EI_N]; k_-5 i k_-7 - stałe dysocjacji kompleksu ESI_N, k_-7 = [ES][I_N]/[ESI_N], a k_-5 = [EI_N][S]/[ESI_N]

Rozróżnia się trzy podtypy inhibicji niekompetycyjnej odwracalnej:

1. czysta: stale dysocjacji k₁ = k₅ i k₃ = k₇, a k₄ = 0

2. częściowa: k₁ = k₅ i k₃ = k₇, a k₂ > k₄

3. mieszana: k₁ >> k₅, a k₂ > k₄

W dwóch pierwszych przypadkach, przy inhibicji czystej i częściowej, stałe dysocjacji kompleksu ESI_N oraz kompleksu EI_N są jednakowe i wynoszą k_-1 = k_-5 =K_i. W obu tych przypadkach spełnione jest równanie 4.17.

Przykładem inhibicji niekompetycyjnej czystej jest hamowanie aktywności acetylocholinoesterazy (EC 3.1.1.7) przez niektóre pochodne amin, np. trimetylopentyloaminę. Częściowe odwracalne niekompetycyjne hamowanie fosforylazy nukleotydów purynowych (PNP) wywołuje chlorowodorek guanidyny. Mieszaną inhibicję niekompetycyjną cholinoesterazy (EC 3.1.1.8) wywołuje galantamina, alkaloid otrzymywany z przebiśniegu kaukaskiego (Galanthus woronowii) .

Inhibicja niekompetycyjna odwracalna obniża prędkość maksymalną reakcji V_max do V'_max (równanie 4.18), ale w przypadku inhibicji czystej i częściowej nie zmienia powinowactwa substratu do enzymu (K_m = K'_m), co dla tego typu inhibicji graficznie przedstawiono na poniższych rysunkach.

W przypadku inhibicji niekompetycyjnej mieszanej obniżeniu ulega wartość pozornej szybkości maksymalnej V'_max (V'_max<V_max), natomiast podwyższeniu ulega wartość pozornej stałej Michaelisa K'_m (K'_m > K_m) w porównaniu z wartościami rzeczywistymi.

Inhibitory I_N działające nieodwracalnie rozpatruje się zazwyczaj przy okazji omawiania inhibicji nieodwracalnej (patrz Inhibicja nieodwracalna).

Inhibicja akompetycyjna. Jest ona również niezależna od stężenia substratu. Inhibitor taki łączy się tylko z kompleksem enzym-substrat uniemożliwiając zajście reakcji. Taka inhibicja obniża zarówno szybkość maksymalną reakcji jak i powinowactwo substratu do enzymu.

4.2.7. Regulacja aktywności enzymów w komórkach

W żywej komórce występują obok siebie dwa współdziałające mechanizmy regulujące metabolizm. Jeden z nich polega na kontroli i regulacji ilości enzymu w komórce. Działanie drugiego mechanizmu polega na kontroli i regulacji stężenia czynnych enzymów, zmian ich aktywności i wreszcie przez współzawodnictwo różnych enzymów o ten sam substrat oraz przez nierównomierny rozdział enzymów i substratów w komórce.

Regulacja ilości enzymów.

Ilość enzymu w komórce kontrolowana i regulowana jest dwoma mechanizmami. Pierwszy związany jest z regulacją transkrypcji i zostanie omówiony w następnym rozdziale przy omawianiu biosyntezy białka. Drugi związany jest z regulacją szybkości degradacji swoistych enzymów poprzez proteolizę. Bez wchodzenia w szczegóły można stwierdzić, że podatność enzymów na proteolizę zależy m.in. od obecności lub braku czynników zmieniających konformację białka enzymatycznego, takich jak: substraty, koenzymy lub jony metali.

Regulacja stężenia czynnych enzymów.

Część enzymów wytwarzana jest w komórce w postaci nieczynnego prekursora nazywanego proenzymem. Powstawanie aktywnych enzymów z proenzymu wymaga jakiejś konkretnej zmiany (np. odszczepienia fragmentu cząsteczki przesłaniającej aktywne centrum enzymu).

Modyfikacja przez proteolizę polega na syntetyzowaniu w komórce nieaktywnego prekursora enzymu, który aktywowany jest w czasie i miejscu fizjologicznie właściwym przez kontrolowaną proteolizę (odcięcie fragmentu białka). W ten sposób regulowane są np. enzymy trawienne: pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna, itp.

Modelowym przykładem tego typu aktywacji proenzymu jest pepsynogen. Pepsynogen jest nieaktywną formą pepsyny (EC 3.4.23.1 - enzymu z pod-podklasy endopeptydaz aspartylowych, hydrolitycznie rozszczepiającego wiązania peptydowe w białkach i peptydach). Wydzielany jest u kręgowców przez komórki śluzówki żołądka. Przemiana pepsynogenu w pepsynę polega na stymulowanym niskim pH<6 i autokatalitycznym odcięciu peptydu blokującego centrum aktywne enzymu.

W początkowym etapie aktywacji, spontanicznie od pepsynogenu odrywa się pięć oligopeptydów. Optymalne pH reakcji równa się 2 (regulowane obecnością kwasu solnego). Pozostałe białko stanowi nieaktywne połączenie pepsyny z inhibitorem blokującym centrum aktywne. Połączenie to ulega dalej samorzutnemu rozszczepieniu w pH<5. Jeżeli pH soku żołądkowego wzrasta powyżej 5, pepsyna z powrotem łączy się z inhibitorem. Podczas trawienia pokarmu, pH w żołądku obniża się poniżej 5 i zaczyna się nagromadzać w żołądku pepsyna, która wykazuje działanie autokatalityczne na rozkład pepsynogenu oraz katalizuje nieodwracalny rozpad inhibitora na cztery oligopeptydy. W pewnym sensie pepsyna działa na zasadzie reakcji łańcuchowej: aktywowanie jednej cząsteczki pepsyny prowadzi do uruchomienia wielu innych.

Modyfikacja przez fosforylację to sposób regulacji aktywności enzymów przez odwracalne przyłączenie grup fosforanowych. Niektóre enzymy w stanie ufosforylowanym są aktywne, a inne są w ten sposób hamowane. Fosforylację przeprowadzają kinazy, defosforylację (tzn. hydrolityczne odszczepienie grup fosforanowych) - fosfatazy.

Ten sposób regulacji stężenia aktywnego enzymu w komórce dobrze ilustruje przykład fosforolizy glikogenu przy udziale fosforylazy (EC 2.4.1.1). Enzym ten występuje w mięśniach szkieletowych (stąd pospolita nazwa enzymu - fosforylaza mięśniowa) i prowadzi fosforolizę glikogenu, tj. rozpad tego polisacharydu na glukozo-1-fosforan, który w dalszych przemianach dostarcza komórkom mięśniowym energii. Enzym jest dimerem zbudowanym z dwóch identycznych monomerów; każdy z nich składa się z 841 reszt aminokwasowych. Fosforylaza występuje w komórkach w dwóch formach: w postaci nieaktywnej fosforylazy b i czynnej fosforylazy a. Przekształcenie fosforylazy b w aktywną formę katalizuje czynna kinaza fosforylazowa, która transportuje dwie grupy fosforanowe z 2ATP na 14 resztę seryny w obu monomerach. Kinaza fosforylazowa (EC 2.7.11.19). zbudowana jest z czterech tetramerów, z których każdy zawiera cztery różne podjednostki. Jej skład oznacza się jako (δ)₄. Podjednostki  i β tej kinazy są to podjednostki regulatorowe, fosforylowane przez aktywną kinazę białek zależną od cAMP. Podjednostka δ to kalmodulina wiążąca wapń, a  jest jednostką katalityczną. Nieczynna kinaza fosforylazowa może być ufosforylowana do czynnej formy tylko wtedy, kiedy Ca²⁺ pozostaje związany z podjednostką δ. Ufosforylowanie kinazy fosforylowej katalizuje kinaza białek (EC 2.7.11.1 - o oficjalnej nazwie: niespecyficzna seryno/treoninowa kinaza białek), której aktywność zależna jest od obecności cAMP. Kinaza białek w pełni aktywuje kinazę fosforylazową w wyniku szybkiego ufosforylowania podjednostki , a wolniejszego podjednostki . Z kolei cAMP, niezbędny dla działanie kinazy białek, powstaje w komórce z ATP pod działaniem cyklazy adenylanowej (EC 4.6.1.1), którą do działania aktywuje m.in. adrenalina. Całość tego skomplikowanego mechanizmu regulacji fosforolizy glikogenu przedstawiono schematycznie poniżej:

Modyfikacja przez agregację polega na łączeniu się ze sobą kilku podjednostek białka enzymatycznego w aktywną formę enzymu.

Jako przykład może posłużyć regulacja ilości czynnej dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2) w komórkach np. Klebsiella pneumoniae. Czynny enzym jest homotetramerem, który pod wpływem rozmaitych czynników może się rozpadać na nieaktywne monomery. Rozpad enzymu na monomery wstrzymywany jest m.in. przez ADP, NAD⁺ i aminokwasy, zaś rozpadowi sprzyja wysokie stężenie w komórce NADH lub ATP.

Zmiany aktywności enzymatycznej

W poprzednich rozdziałach szczegółowo omówiono czynniki wpływające na efektywność działania enzymów (wpływ stężenia substratu, pH, temperaturę, wpływ aktywatorów, inhibitorów i stabilizatorów). Te same czynniki regulują aktywność enzymów w żywej komórce.

Do dodatkowych czynników i mechanizmów wywołujących zmiany aktywności enzymów w komórce można zaliczy: stężenie koenzymów i kofaktorów reakcji, stężenie produktu, stężenie jonów i potencjał oksydacyjno-redukcyjny, efekt allosteryczny oraz stymulatory białkowe.

Efekt allosteryczny - enzymy regulatorowe. Wśród mechanizmów regulujących działanie enzymów poprzez zmiany ich aktywności na szczególną uwagę zasługuje proces, w którym decydujące znaczenia posiada zjawisko allosterii. Enzymy, których aktywność regulowana jest poprzez efekt allosteryczny, nazywa się enzymami regulatorowymi, a ligandy wywołujące efekt allosteryczny nazywa się efektorami lub modulatorami. Efektory mogą zwiększać aktywność

enzymu (efektor dodatni), czyli działać, jak aktywator. Efektory mogą również spowalniać lub hamować reakcję enzymatyczną (efektor ujemny), czyli działać, jak inhibitor (ale nie jako kompetycyjny). Przebieg reakcji katalizowanej przez enzymy regulatorowe z efektorem pokazano na rysunku obok - krzywa ma kształt sigmoidalny z wyraźnym punktem przegięcia. Jak widać na rysunku efektory nie zmieniają wartości szybkości maksymalnej reakcji.

Przykładem efektora dodatniego, zwiększającego szybkość katalizowanej reakcji jest cAMP, który aktywuje niespecyficzną seryno/treoninową kinazę białek w opisanym wyżej przykładzie aktywacji fosforylazy b.

Bardzo często ujemnymi efektorami enzymów regulatorowych są produkty ich działania. Przykładowo kinaza pirogronianowa (EC 2.7.1.40), katalizująca reakcję przeniesienia fosforanu z fosfoenolopirogronianu na ADP z wytworzeniem ATP, hamowana właśnie jest nadmiarem ATP.

Enzymy kontrolowane przez białka regulacyjne, czyli stymulatory (inhibitory i aktywatory o budowie białkowej hamujące aktywność enzymów). Przykładem może być kalmodulina - białko, które jest czujnikiem poziomu wapnia w komórce i reguluje aktywność wielu szlaków biochemicznych.

Hamowanie aktywności enzymu przez sprzężenie zwrotne. Enzym katalizujący pierwszy etap szlaku jest najczęściej hamowany przez produkt końcowy tego szlaku. Ten mechanizm regulacji aktywności nazywa się sprzężeniem zwrotnym.

Hamowanie przez sprzężenie zwrotne może mieć charakter kompetycyjny, niekompetycyjny lub inny. Hamowanie przez sprzężenie zwrotne najczęściej występuje w przypadku długich szlaków biosyntezy. Często inhibitorem zwrotnym jest produkt lub ostatni związek niskocząsteczkowy przed utworzeniem produktu wielkocząsteczkowego. Zazwyczaj regulacja przez sprzężenie zwrotne dotyczy najwcześniejszego etapu charakterystycznego dla danego szlaku biosyntezy (często jest to hamowanie aktywności enzymu katalizującego pierwszy etap szlaku).

Przykładem dobrze ilustrującym ten mechanizm jest deaminacja treoniny, zapoczątkowująca szlak biosyntezy izoleucyny. Deaminacja treoniny katalizowana jest przez amoniako-liazę treoninową (EC 4.3.1.19), hamowaną izoleucyną - końcowym produktem tego szlaku.

Dla wygody, wzory aminokwasów podano w formie niezdysocjowanej

^* Dla wygody w podręczniku grupę karboksylową zapisuje się w formie niezdysocjowanej.

^* Przypominamy, że dla wygody wzory kwasów karboksylowych podajemy w formie niezdysocjowanej.

[Warshel, A.: Computer Modelling Of Chemical Reactions In Enzymes And Solutions", John Wiley & Sohns, Inc., New York, Chichester, Brisbane, Toronto and Singapore, 1991 ]

^* Umownie P_i oznacza fosforan nieorganiczny (resztę kwasu fosforowego).

Sumaryczna energia swobodna wyzwolona w jednoetapowym i dwuetapowym przekształceniu ATP do AMP oczywiście musi być taka sama. Różnica 1 kJ/mol pomiędzy wyliczeniami wynika ze stosowania przybliżonych wartości ΔG.

39

1

106

- glicyna

- prolina

- hydroksyprolina

Struktura II-rzędowa kolagenu

B

A

C

- Rodniki hydrofobowe

- Rodniki hydrofilowe

pI

wsalanie

wysalanie

40%(NH₄)₂SO₄

20%(NH₄)₂SO₄

H₂O

1%NaCl

+ −

− +

+

+

-

-

H₂O

Molekuła białka

[S]>>[E]

reakcja enzymatyczna

substraty

produkty

ΔG_E

+

E

S

S

E

pepsyna

bacillolizyna

subtilizyna

Wpływ temperatury na aktywność subtilizyny

S+I_K

Preinkubacja: 45°C, 60min

Z dodatkiem 1% CaCl₂

stan przejściowy

V

[S]

Wpływ stężenia enzymu [E] na

szybkość reakcji enzymatycznej V

[E]

V

S₂

S₁

K_m1

K_m2

Vmax

v

[S]

Fragment Okazaki

3'

5'

Ramię

akceptorowe

A

C

C

Ramię TΨC

Ramię DHU

Antykodon

II łańcuch

DNA

I łańcuch

DNA

II łańcuch

DNA

I łańcuch

DNA

Rys.3.1.2.Fragment łańcucha polinukleotydu

5'

tgα = K_m/V_max

1

[S]

-1

K_m

1

v

α

1/V_max

w buforze

S

K_m

K'_m

Inhibitory kompetycyjne

Inhibitory niekompetycyjne

Inhibitory

niespecyficzne

Z dodatkiem

1%CaCl₂

Preinkubacja:

w buforze o pH 9

70°C

60°C

60°C

40°C

20°C

Inhibitory

specyficzne

INHIBITORY

V_max=V'_max

v

[S]

S+I_K

1

[S]

-1

K_m

1

v

S

1

V_max

-1

K'_m

S+I_N

S

K_m=K'_m

-1

K'_m

Vmax

v

[S]

V'max

1

V'_max

S+I_N

1

[S]

-1

K_m

1

v

=

1

V_max

S

v

S

bez efektora

z efektorem

+ −

− +

+

+

-

-

Pierwiastki biofilne

Inne pierwiastki

(w tym toksyczne)

Pierwiastki biogenne

Makroelementy

(CHOPKiNS)

Mikroelementy

Pierwiastki dodawane pod kontrolą do pożywek

Pierwiastki śladowe

Pierwiastki ultraśladowe

*

*

---