TYPY MUTACJI
mutacje obejmujące zmianę liczby lub struktury chromosomow
mutacje genowe (delecje, duplikacje, insercje)
mutacje punktowe, związane ze zmianą jednego nukleotydu: tranzycje (puryny w purynę
lub pirymidyny w pirymidynę) i transwersje (puryny w pirymidynę lub pirymidyny w purynę):
mutacje transkrypcyjne (w obrębie promotora)
mutacje translacyjne
- mutacje zmiany sensu (missens)
- mutacje nonsensowne (nonsens), dające jeden z trzech kodonow stop w mRNA (UAA, UAG, UGA)
- mutacje ramki odczytu (frameshift), związane z insercją lub delecją pojedynczego nukleotydu
- mutacje milczące (sillent)
w obszarach regulacyjnych genu (mutacje RNA)
- mutacje miejsc cięcia (splicing)
- mutacje w miejscach donorowych lub akceptorowych genu
Mutacje dynamiczne
(zwielokrotnienie trojnukleotydowych powtorzeń):
CGG fra X
CTG dystrofia miotoniczna typu 1
CAG choroba Huntingtona
CCTG dystrofia miotoniczna typu 2
ATTCT ataksja rdzeniowo-możdżkowa typu 10
Antycypacja:
stopniowe obniżanie się wieku występowania objawow chorobowych
oraz wzrost liczby powtorzeń w kolejnych pokoleniach
polimorfizm genowy
jednoczesne występowanie w populacji rożnych form allelicznych danego genotypu
• zmiana sekwencji nukleotydow z częstością powyżej 1%
• występuje szczegolnie w niekodującym DNA
• może dotyczyć pojedynczego nukleotydu lub dłuższej sekwencji
• większość polimorfizmow nie powoduje zmian fenotypu
Markery genetyczne mogą być wykorzystane do:
określania prawdopodobieństwa asocjacji genow choroby w rodzinie lub u pojedynczych chorych
• ustalania pokrewieństwa
• ustalania genetycznej zgodności krwi, nasienia czy tkanki
• mapowania genow w określonym regionie chromosomow poprzez analize sprzężeń
• diagnostyce prenatalnej chorob genetycznych
• wykrywaniu heterozygotycznych nosicieli chorob genetycznych
• określaniu ryzyka zachorowań u osob z predyspozycjami do chorob typu:
choroby serca, cukrzyca, nowotwory
• badaniu zygotyczności bliźniąt (monozygotyczne bliźnięta mają identyczne allele we wszystkich badanych loci, dwuzygotyczne rożnią się między sobą w znaczącej liczbie loci)
• ustalaniu ojcostwa
• medycynie sądowej do określania pochodzenia krwi, nasienia lub probek tkanek uzyskanych na miejscu przestępstwa i porownaniu z materiałem pobranym od podejrzanego
• identyfikacji osob zaginionych. Porownanie markerow genetycznych osoby zaginionej z markerami rodzicow i innych członkow rodziny umożliwia ustalenie rzeczywistego biologicznego pokrewieństwa
• typowania tkankowego do transplantacji organow lub tkanek
STRATEGIA DIAGNOSTYKI MOLEKULARNEJ
Duże zmiany genowe: delecje, duplikacje, insercje
metoda Southerna lub PCR-Multiplex,metoda MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification. W duplikacjach najczęściej stosuje się metody ilościowe Q-PCR.
Przykład: dystrofia mięśniowa Duchenne’a
Znane mutacje w miejscu restrykcyjnym
analiza RFLP (analiza polimorfizmu długości fragmentow restrykcyjnych), ktora może wykazać odmienny układ fragmentow DNA po cięciu określonym enzymem restrykcyjnym.
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia, trombofilia.
Znane mutacje punktowe poza miejscem restrykcyjnym
strategia wykrywania opiera się na metodzie ASO (allele specific oligonucleotide) lub ASA (Allele specific amplification) , czyli wykorzystaniu znajomości mutacji do skonstruowania odpowiednich sond lub starterow, ktore wykryją zarowno allel prawidłowy, jak i zmutowany.
Przykład: mukowiscydoza
Nieznane mutacje - techniki przesiewowe
Sekwencjonowanie
Analiza sprzężeń - kiedy nie znamy genu związanego z występowaniem określonej choroby genetycznej.
RODZAJE DIAGNOSTYKI W ZALEZNOSCI OD ZRODLA MATERIALU GENETYCZNEGO
Preimplantacyjna
-źrodłem są komorki zarodka lub linii płciowej
Prenatalna
- komorki trofoblastu lub płynu owodniowego
- wolne komorki płodowe w surowicy matki
- MACS (ang. magnetic assisted cell sorting)
- FACS (ang. fluorescence activated cell sorting)
- wolne płodowe DNA w surowicy matki
Postnatalna
- dowolne komorki jądrzaste
PODEJSCIA METODYCZNE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHOROB DZIEDZICZNYCH
Analiza bezpośrednia
opiera się na wykrywaniu znanych mutacji (głownie delecje, duplikacje i insercje),
jak rownież na podstawieniach pojedynczych nukleotydow lub mutacjach punktowych
Analiza bezpośrednia jest dodatkową podstawą rozpoznania klinicznego.
Analiza pośrednia
śledzenie sposobu dziedziczenia zmutowanych i prawidłowych genow w obrębie rodziny na podstawie analizy sprzężeń - zestaw markerow polimorficznych sprzężonych z locus choroby i dziedziczących się łącznie z chorobą - haplotyp markerowy choroby .Analiza pośrednia bazuje na rozpoznaniu klinicznym, nie służy więc do jego weryfikacji Informacyjny wynik badania umożliwia określenie nosicielstwa zmutowanego genu i diagnostykę prenatalną choroby.
TYPOWA DLA GENU MUTACJA
Rdzeniowy zanik mięśni (SMA)
delecja eksonu 7 genu SMN1 (5q13)
dziedziczenie autosomalne recesywne
Choroba Huntingtona (HD)
ekspansja kodonu CAG w genie HD (4p16.3)
dziedziczenie autosomalne dominujące
Anemia sierpowata
mutacja punktowa Glu_Val (11p15.5) w genie łańcucha β (HBB) hemoglobiny
dziedziczenie autosomalne recesywne
Zespół Nijmegen
delecja 5 nukleotydow 657-661 (8q21) w genie NBS1
ETAPY RUTYNOWEJ ANALIZY DNA
izolacja DNA
amplifikacja PCR
przesiewowe metody wykrywania mutacji
sekwencjonowanie
DZIEDZICZENIE AUTOSOMALNE RECESYWNE
mukowiscydoza
rdzeniowy zanik mięśni
fenyloketonuria
galaktozemia
homocystynuria
wrodzony przerost kory nadnerczy
zespoł Smitha, Lemlego i Opitza
niedobor α1-antytrypsyny (α1-AT)
DZIEDZICZENIE AUTOSOMALNE RECESYWNE
• zespoł Aperta
• zespoł Marfana
• achondroplazja
• choroba Huntingtona
• ataksje rdzeniowo-możdżkowe
DZIEDZICZENIE RECESYWNE SPRZEZONE Z CHROMOSOMEM X
dystrofia mięśniowa Duchenne’a/Beckera
hemofilia A i B
zespoł Huntera
daltonizm
zespoł niewrażliwości na androgeny
DZIEDZICZENIE DOMINUJACE SPRZEZONE Z CHROMOSOMEM X
• zespoł Retta
• krzywica hipofosfatemiczna
• zespoł kruchego chromosomu X
• zespoł Blocha-Sulzbergera
MUKOWISCYDOZA CF
• choroba uwarunkowana autosomalnie recesywnie
• częstość występowania 1:2500 żywo urodzonych
• częstość nosicieli zmutowanego genu 1:25
• zmiany morfologiczne cechują się dużym polimorfizmem występują przede wszystkim w o obrębie narządow zawierających gruczoły wewnątrzwydzielnicze
• spowodowana mutacjami w genie CFTR
(ang. Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator)
ROZPOZNANIE CF
- podwyższone stężenie sodu (powyżej 60 mmol/l) oraz chloru (powyżej 70 mmol/l0 w pocie)
- brak trypsyny w treści dwunastniczej
- pomiar przeznabłonkowej rożnicy potencjałow w nosie
ROKOWANIE CF
- niewydolność wewnątrzwydzielnicza trzustki (ok. 85-90%) chorych nawracające infekcje drog oddechowych - przyczyną przewlekłej choroby płuc
- wypadanie błony śluzowej odbytu oraz niedrożność smołkowa (5-10%)
- marskość wątroby (1-5%)
- męska niepłodność (95-98%)
- średni wiek przeżycia 30 lat
- zrożnicowany stopień ekspresji klinicznej choroby
GEN CTFR
• lokalizacja - chromosom 7q31-32
• wielkość - 250kb
• zbudowany z 27 eksonow
• koduje białko CFTR (masa cząsteczkowa ok. 170 kDa) - pełni w komorkach rolę kanału chlorkowego, aktywowanego przez cAMP
• wykryto ponad 1600 rożnych mutacji
- mutacje punktowe (missens i nonsens) - 57% wszystkich mutacji
- względnie małe delecje lub wstawki w sekwencji genu - 25%
- mutacje składania RNA - 17%.
DYSTROFIA MIESNOWA DUCHENNE’A
• Częstość 1:3500
• objawy w 90% przypadkow poniżej 5 roku życia, opoźnienie samodzielnego chodzenia, postępujące osłabienie mięśni proksymalnych kończyn
• 7-13 lat utrata zdolność chodzenia, rzekomy przerost mięśni łydek
• wiek nastoletni, niewydolność oddechowa, kardiomiopatia, skolioza
• podwyższone stężenie kinazy kreatynowej w surowicy krwi
• brak specyficznego białka w mięśniach - dystrofiny
rokowanie
• u 25% chorych cechy upośledzenia umysłowego
• ok. 90% chorych traci zdolność samodzielnego poruszania się przed 20 rokiem życia
DYSTROFIA MIESNIOWA BECKERA
• Częstość 1:18000
• (defektywna dystrofina o częściowo, w rożnym stopniu, zachowanej funkcji)
rokowanie
• chorzy często dopiero po 25 latach od wystąpienia objawow poruszają się na wozkach
• czas przeżycia może być prawidłowy
GEN DMD
• lokalizacja - chromosom Xp21
• wielkość - 2.5 mln par zasad, 79 eksonow
• koduje glikoproteinę - dystrofinę (DMD)
wykryto następujące mutacje:
• rożnej wielkości delecje 65% („hot spots”: egzony 44 - 52 i 3 -10)
• duplikacje 5% -10%
• mutacje punktowe 30-35%
Mutacje naruszające fazę odczytu prowadzą do DMD, mutacje nie naruszające
fazy odczytu prowadzą do BMD
Diagnostyka prenatalna w rodzinach dotkniętych DMD/BMD
• ustalenie płci płodu (amplifikacja genu amelogeniny (PCRamel)
• u płodow płci męskiej poszukiwanie wykrytej wcześniej u chorych członkow rodziny mutacji
• lub śledzenie dziedziczenia się zmutowanego allelu.
TERAPIA DMD
• terapia sterydami we wczesnych etapach może opoźniać postęp choroby
• nowoczesne metody rehabilitacji, połączone z zabiegami ortopedycznymi, mogą wydłużyć
zdolność do utrzymywania pozycji stojącej.
• modyfikacja składania mRNA i syntezy dystrofiny. Podejście to zwane „exon skipping” polega na ingerencji w proces składania mRNA, w taki sposob, aby przywrocić fazę odczytu i tym samym zamienić ostrą postać choroby DMD w typ łagodniejszy – a więc w BMD
• zastosowanie preparatu nazwanego ataluren (uprzednio PTC124™), powodującego
pomijanie podczas translacji przez rybosomy powstałego na skutek mutacji, kodonu stop.
ZESPOL RETTA
typowe objawy
• prawidłowy rozwoj od urodzenia do 6 -18 miesiąca życia
• utrata sprawności manualnej i zdolności mowienia
• ataksja (zaburzenia
• niski wzrost, małe ręce i głowa (wtorna mikrocefalia)
• stereotypowe ruchy rąk (klaskanie, stukanie, wkładanie do ust, przypominające mycie), zgrzytanie zębami, napady śmiechu lub płaczu
• problemy z kontaktami społecznymi, ataki paniki, unikanie kontaktu wzrokowego,
nadwrażliwość na dźwięki, napady gniewu
• napady padaczkowe w 81%
• problemy żołądkowo-jelitowe i oddechowe
• boczne skrzywienie kręgosłupa
• przykurcze mięśniowe
DIAGNOSTYKA MECP 2
• gen MECP2 z locus Xq28 (75 tyś. par zasad, 4 eksony)
• białko MECP2 (methyl CpG- binding protein 2) o funkcji represora transkrypcji
innych genow
• mutacje najczęściej de novo (w ok. 99%) najczęściej na chromosomie ojcowskim,
rodzinne występowanie rzadkie
• mutacje punktowe genu MECP2 ( u 80% dziewcząt manifestujących postać
klasyczną zespołu i u ok. 40% postaci nietypowych)
• w ok. 8% przypadkow postaci klasycznej i ok. 3% postaci nietypowej wykrywana
jest duża delecja części lub całości genu.
• nietypowe mutacje, w innych regionach genu, lub mutacje innych genow,
zwykle nie badane rutynowo, np. CDKL5 (ang. cyclin-dependent kinase-like 5)
w postaciach atypowych)
• zespoł Retta w klasycznej postaci dotyczy wyłącznie kobiet, dla większości
mężczyzn mutacja genu MECP2 jest wadą letalną i prowadzi do śmierci na etapie
rozwoju płodowego
• w nielicznych przypadkach chłopcy z mutacjami MECP2 mogą dożyć wieku
dorosłego wykazując niepełnosprawność intelektualną, bez okresu względnie
prawidłowego rozwoju wczesno niemowlęcego
• zespoł Retta często jest mylnie rozpoznawany jako autyzm, porażenie mozgowe
czy ogolne zaburzenia rozwoju intelektualnego
• aktualnie nie istnieje żadna sprawdzona metoda leczenia przyczynowego; dzięki
intensywnej rehabilitacji (opieka logopedy i psychologa dziecięcego, odpowiednia
dieta) 2% - 15% pacjentek może samodzielnie funkcjonować
FRA-X – ZESPOL LAMLIWEGO CHROMOSOMU X
• po zespole Down’a najczęstsza przyczyna upośledzenia umysłowego
• obecność tzw. łamliwego chromosomu X - fra(X)(q27.3)
• częstość występowania u płci męskiej wynosi 1:1250
• mutacje w genie FMR1- ekspansja niestabilnej sekwencji CGG w końcu 5’
pierwszego eksonu i metylacja pobliskiej wyspy CpG
6 - 52 powtorzeń (średnio 30) - u osob zdrowych
60 - 200 powtorzeń u mężczyzn (nosicieli) z premutacją
powyżej 200 - pełna mutacja
• częstość premutacji 1:500-1500 u mężczyzn i 1:255-510 u kobiet
• zjawisko antycypacji
Diagnostyka cytogenetyczna
Wykazanie achromatycznego przewężenia lub złamania chromatyd w regionie q27.3
w specyficznych warunkach hodowli. Nie identyfikuje negatywnych cytogenetycznie
nosicieli zmutowanego genu tj. ok.70% bezobjawowych nosicielek i 100% bezobjawowych
nosicieli premutacji płci męskiej.
Diagnostyka molekularna
• analiza DNA metodą PCR, jako wstępne badanie przesiewowe na obecność
prawidłowych alleli
• analiza mutacji metodą hybrydyzacji (np. technika Southern’a); metoda ta pozwala na
precyzyjne określenie defektu molekularnego, identyfikując pełne mutacje i premutacje,
jak rownież ostatecznie weryfikuje wynik nieinformacyjny uzyskany w badaniu
przesiewowym.
PIETNOWANIE GENOMOWE – GENOMIC IMPRINTING
Zróżnicowana ekspresja genów w zależności od ich rodzicielskiego pochodzenia
• dotyczy fragmentow chromosomow lub pojedynczych alleli genow zaangażowanych
w proces rożnicowania i rozwoju na poziomie zarodkowym
• w komorce diploidalnej tylko jeden gen z pary alleli ulega ekspresji, ekspresja drugiego
z pary alleli jest hamowana na skutek metylacji; do metylowango nukleotydu nie mogą
się przyczepić czynniki transkrypcyjne, co powoduje wyciszenie genu
• dotyczy 01-1% genow
CHOROBY Z NIEPRAWIDLOWEGO IMPRINTINGU
• zaśniad groniasty nowotwor embrionalny; 2n pochodzi tylko od ojca, materiał genetyczny od matki jest eliminowany
• potworniak jajnika - 2n pochodzi tylko od matki, brak zapłodnienia
• zespół Prader’a- Williego i zespół Angelmana - zaburzenia imprintingu 15(q11q13) - brak imprintingu ojcowskiego powoduje zespoł Pradera-Williego, a brak imprintingu matczynego zespoł Angelmana
• zespół Beckwitha-Wiedemanna - mikrodelecja w obrębie chromosomu 11 pochodzenia ojcowskiego
ZESPOL PRADERA-WILLIEGO
70% delecja regionu 15q11-q13 pochodzenia ojcowskiego
kariotyp: 46,XX lub 46,XY,del(15)(q11-q13)pat
25% matczyna disomia jednorodzicielska chromosomu 15 (UPD)
do 5% zaburzenia imprintingu ((ID-Imprinting defect
• okres przedurodzeniowy: obniżenie napięcia mięśniowego, słabe ruchy płodu
• okres noworodkowy/wczesnoniemowlęcy: słaby odruch ssania, trudności w karmieniu, opoźniony rozwoj psychoruchowy
• 1-6 r. życia: nienasycony apetyt / otyłość, dysmorfia twarzy (wąskie czoło, migdałowate szpary powiekowe, wysokie podniebienie), labilność emocjonalna, opoźnienie rozwoju mowy
• kilkunastoletni pacjenci:
- niski wzrost, małe dłonie i stopy, otyłość -cukrzyca, nadciśnienie,
- hipogonadyzm zmieniający się z wiekiem
- rożnego stopnia upośledzenie umysłowe, bezpłodność
ZESPOL ANGELMANA
65-75% delecja regionu 15q11-q13 pochodzenia matczynego
kariotyp: 46,XX lub 46,XY,del(15)(q11-q13)mat
3-7% ojcowska disomia chromosomu 15
2-3% zaburzenia imprintingu (ID-Imprinting defect)
5-11% mutacje UBE3A
5-11% delecje w centrum piętnowania(IC-Imprinting center)
5-11% inne mechanizmy
• trudności w ssaniu, słaby przyrost masy
• małogłowie i krotkogłowie
• dysmorfia twarzy (głęboko osadzone gałki oczne, duże usta z wąską wargą gorną, duża żuchwa, duże zęby)
• wystający język, jasna karnacja skory, blond włosy , jasnetęczowki
• upośledzenie umysłowe, zaburzenia mowy
• padaczka
• zaburzenie chodu
• częsty śmiech i ekscytacja
DIAGNOSTYKA PWS/AS
• wzór metylacji (delecje, UPD & ID)
- testy metylacji (MS-PCR, RFLP-PCR, MLPA)
• delecje
- FISH (Fluorescence in situ Hybridization
- CMA (Chromosomal microarrays)
- southern hybrydyzacja
• disomia jednorodzicielska
- analiza mikrosatelitarna
• mutacje
- sekwencjonowanie
46 XY DYSGENEZJA GONAD
• żeński fenotyp
• niedorozwoj zewnętrznych narządow płciowych
• obustronnie szczątkowe gonady
• prawidłowy lub wysoki wzrost
• pierwotny brak miesiączki
• niepłodność wynikająca z niedorozwoju gonad.
• czasami: powiększenie łechtaczki, hirsutyzm
• geny zaangażowane w proces rożnicowania płci:
SRY, RSPO1, SOX9, NR5A1, WT1, NR0B1 and WNT4
• gen SRY (Yp11.3) indukuje rożnicowanie gonady pierwotnej w kierunku jądra
• w przypadku mutacji lub nieobecności genu SRY dochodzi do rozwoju zarodka
w kierunku żeńskim
DIAGNOSTYKA
• badanie kariotypu - metody cytogenetyczne
• potwierdzenie obecności genu SRY (PCR, elektroforeza, FISH)
• poszukiwanie mutacji w SRY, SOX9, NR5A1(SF1), WT1, DHH
• poszukiwanie duplikacji: NROB1 (DAX1) i WNT4
qRTPCR (guantitative Real Time PCR)
MLPA (Multiple Ligation dependent Probe Amplification)
aGH (array Genome Hybridization)
ZESPOL NIEWRAZLIWOSCI NA ANDROGENY
• choroba recesywna sprzężona z X
• częstość 1 / 65000
• kariotyp 46,XY i niepłodność
• płeć gonadalna męska ale żeńskie narządy płciowe
• występuje w trzech postaciach
-CAIS Complete AIS
komorki są całkowicie niewrażliwe na androgeny (fenotyp żeński)
-PAIS Partial AIS
komorki są częściowo niewrażliwe (fenotyp niecałkowicie męski)
-MAIS Milde AIS
łagodna postać (prawidłowo zbudowani niepłodni mężczyźni)
• mutacje w genie AR receptora androgenowego
CAIS
• żeński fenotyp, dobrze rozwinięte piersi
• budowa ciała typu kobiecego
• skąpe owłosienie pachowe i łonowe
• krotka ślepo zakończona pochwa
• brak macicy i jajowodow
• jądra umiejscowione w wargach sromowych większych, kanałach pachwinowych lub jamie brzusznej
• pierwotny brak miesiączki
Często pierwszym objawem zespołu może być obecność przepuklin
pachwinowych, sromowych lub kroczowych
METODY DIAGNOSTYKI PRENATALNEJ
Diagnostyka inwazyjna:
- biopsja kosmowki (CVS) – 11-14 hbd
- amniopunkcja (AC) – (15)16-18(20) hbd
- kordocenteza (przy niepowodzeniu w/w lub w poźniejszym etapie ciąŜy)
- biopsja tkanek płodu (obecnie rzadko, zastąpiona przez badania molekularne)
Diagnostyka nieinwazyjna:
- badania ultrasonograficzne (I lub II trymestr)
- badania biochemiczne markerow w surowicy matki
- analiza komorek plodowych w krwiobiegu matki
ALFA FETO PROTEINA
wzrost stęzenia AFP w płynie owodniowym w przypadku otwartych wad OUN płodu
wzrost stęzenia AFP w surowicy krwi kobiety cięzarnej w przypadku otwartych wad
OUN płodu
niski poziom AFP w surowicy krwi matki w przypadkach trisomii płodu
hCG- GONADOTROPINA KOSMOWKOWA
wzrost stęzenia hCG i obu jej wolnych podjednostek α i β w surowicy krwi
matki w przypadku ciąz z zespołem Downa (Bogart i wsp;1987)
test podwojny - jednoczasowe oznaczanie stęzenia AFP i hCG
(DR 55% przy FPR 5%)
TEST POTROJNY
_ AFP, hCG i uE3 + wiek matki
_ 15-20 hbd
_ wiek ciązy według badania USG
(BPD-wymiar dwuciemieniowy, FL-długość kości udowej)
_ około 70% przypadkow ZD u płodu, przy około 5% wynikow fałszywie pozytywnych
_ czułość oraz odsetek wynikow fałszywie pozytywnych rosną wraz z wiekiem cięzarnej
_ kwalifikacja cięzarnej do grupy wysokiego lub niskiego ryzyka
TEST PAPPA
11,0 – 13,6 hbd
Uwzględnia:
_ wiek matki
_ PAPP-A,
_ wolne β-hCG (fβ-hCG),
_ przezierność karkowa NT (Nuchal Translucency)
Czułość dla ZD około 85% przy FPR 5%.
Czułość dla ZE wynosi około 90% przy FPR 2%.
Czułość oraz odsetek wynikow fałszywie pozytywnych rosną
wraz z wiekiem cięzarnej.
Badanie materiału z poronienia samoistnego
_ badanie kariotypu
_ QF-PCR badanie aneuploidii chromosomowych
_ test aneuploidii MLPA
_ test subtelomerowy MLPA
_ test mikrodelecyjny MLPA
_ detekcja mutacji (PCR, sekwencjonowanie)