Sonia Szewczenko

Dominika Szewczak

Karolina Sochacka

Gr. I

Techniki analizy tkanek – protokół II

Przygotowane na poprzednich zajęciach preparaty z parafinowymi skrawkami umieszczamy w specjalnych kamerach, aby móc je odparafinować oraz zabarwić. Kamery mają na wewnętrznej stronie wcięcia „żeberka", dzięki czemu możemy naraz barwić więcej preparatów.. Zestaw naczyń przygotowanych do odparafinowania powinien zawierać następujące odczynniki:

Odparafinowywanie:

Ksylen I- 5 min

Ksylen II- 5 min

alkohol absolutny I- 5 min

alkohol absolutny II- 5 min

alkohol 96%- 5 min

alkohol 90%- 5 min

alkohol 80%- 5 min

alkohol 70%- 5 min

alkohol 50%- 5 min

alkohol 30%- 5min

destylowana H2O- 5 min

Skrawki parafinowe, naklejone na szkiełka podstawowe, przenosimy do naczynia z ksylenem I na 5 min. W tej substancji zachodzi zasadniczy proces odparafinowania skrawków ponieważ ksylen bardzo dobrze rozpuszcza parafinę. Z ksylenu I przenosimy szkiełko do ksylenu II w celu dalszego gruntownego odparafinowania skrawków, rozpuszczanie parafiny, która pozostała jeszcze na szkiełku. Po odparafinowaniu skrawków w ksylenie II zalewamy je alkoholem absolutnym I i II inkubując po 5 min w każdym, a następnie trzymamy szkiełka odpowiednio w alkoholu od najwyższego do najniższego stężenia rozpoczynając od alkoholu 96%, a kończąc na alkoholu 50%. W alkoholach zachodzi proces stopniowego uwadniania skrawków. Z alkoholu 50%Następnie skrawki przenosimy do wody destylowanej 5 min. Po dokładnym uwodnieniu skrawków musimy je starannie opłukać w wodzie destylowanej. Dopiero tak przygotowane skrawki wkładamy do odpowiednich barwników

Po odparafinowaniu preparaty można barwić jedna z wybranych metod:

Barwienie trójbarwne wg Mallory’ego:

1) r-r fuksyny kwaśnej 3-5 minuta

2) opłukać dd H2O

3) utrwalanie w kw. fosforomolibdenowym- 3-5 min

4) płukanie w dd H2O- 2 min

5) Barwienie odczynnikiem Mallorego- 10-20 min

6) różnicowanie w al. 96%

7) Odwadnianie od al. 96%

Barwienie stosowane w różnicowaniu tkanki mięśniowej, łącznej, różnicowaniu zwykle w komórek w nerce.

W procedurze udział biorą 3 barwniki. Fuksyna karbolowa - do barwienia jąder komórkowych, oraz Barwnik Mallory’ego, w którego skład wchodzi błękit anilinowy, oranż G. Oranż G do barwienia cytoplazmy i błękit anilinowy do wybiórczego barwienia kolagenu.

Główną rolę odgrywa kwas fosfomolibdenowy, pełniący rolę łącznika pomiędzy strukturami tkanek (włókna kolagenowe, błony komórkowe) a błękitem anilinowym (barwnik amfoteryczny). Drugi składnik barwnika Mallory’ego, oranż G nie reaguje z kwasem fosfomolibdenowym, dzięki czemu wybarwia wszystkie nie połączone z kwasem struktury.

W wyniku barwienia jądra komórkowe są czerwone, cytoplazma komórkowa różowopomarańczowa, włókna kolagenowe barwią się na kolor niebieski, włókna sprężyste na czerwono, mięśnie na pomarańczowoczerwony, fibryna na różowo, a śluz na niebiesko.

Zdj.1 Fragment preparatu z tkanki pijawki wybarwionego na zajęciach metodą Mallor’ego

Zdj.2 Fragment preparatu z tkanki dżdżownicy wybarwiony metodą Mallory’ego 

Barwienie Hematoksylina-Eozyna (HE)

1) Barwienie r-r Hematoksyliny- 10-20 minut

2) Płukanie w wodzie bieżącej (taki sam czas jak barwienie w hematoksynie)

3) opłukać w dd H2O

4) barwienie Eozyną- 1-3 minuty

5) płukać dd H2O- 2-3 min.

6) odwadnianie od al. 70%

Najważniejszą, rutynowo stosowaną od ponad 150 lat, standardową techniką obrazowania histologicznego jest barwienie hematoksyliną i eozyną (H+E). Jest to tzw. topograficzne barwienie przeglądowe, pozwalające ocenić całość struktury tkanki, poprzez kontrastowe zabarwienie cytoplazmy i jader komórkowych.

Hematoksylina to barwnik pochodzenia roślinnego, uzyskiwany z niebieskiej kory drzewa kampeszowego Hematoxylum campechianum. Jest substancją zasadową i barwi jądra komórkowe na kolor od fioletowego do niebieskiego. Eozyna to związek syntetyczny, który jest kwaśną pochodną fluoresceiny. Barwi cytoplazmę, włókna kolagenowe, ziarna wydzielnicze w komórkach (struktury ujemnie naładowane takie jak kationowe grupy aminowe w białkach) na różowo do czerwonego.

Zdj.3 Fragment preparatu z tkanki pijawki wybarwiony na zajęciach metodą hematoksylina-eozyna.

Zdj.4 Fragment preparatu przekroju dżdżownicy wybarwiony metodą hematoksylina-eozyna.

Barwienie metodą May-Grunwalda- Giemsy

1) barwienie rozcieńczonym 1:1 barwnikiem May- Grunwalda- 4 min

2) Płukanie w dd H2O

3) Barwienie w r-r barwnika Giemsy 1:10- 15 minut

4 płukanie w dd H2O

 

Ta metoda służy do barwienia ziarnistości i substancji wewnątrzkomórkowych. Wykorzystuje się w niej barwniki anilinowe oraz eozynę. Krwinki czerwone i komórki nabłonkowe barwią się na pomarańczowo, ziarnistości w eozynofilach zabarwiają się na czerwono, zaś jadra na ciemnoniebiesko do niebieskofioletowego. Cytoplazma zabarwia się od białego do jasnofioletowego.

Obserwowaliśmy preparat z przekroju dżdżownicy oraz pijawki.

Chcąc uzyskać trwały preparat, należy ponownie pozbawić go wody. W tym celu stosuje się szereg do odwadniania zaczynając od alkoholu i kończąc na ksylenie.

Odwadnianie:

70%- 5 min

90%- 5 min

96%- 5 min

alkohol absolutny I- 5 min

alkohol absolutny II- 5 min

Ksylen I- 5 min

Ksylen II- 5 min

W końcowym etapie preparaty są zamykane. Proces ten polega na naniesieniu na powierzchnię skrawka kropli medium zamykającego (powszechnie stosowane są żywice syntetyczne Entellan i DPX, rzadziej naturalny balsam kanadyjski) i nałożeniu szkiełka nakrywkowego tak, aby medium dokładnie rozprowadziło się pod szkiełkiem nakrywkowym i aby pod jego powierzchnią nie powstały bąbelki powietrza, które mogłyby utrudnić analizę pod mikroskopem. Po godzinie, następuje polimeryzacja

żywicy, preparat staje się trwały i gotowy do analizy mikroskopowej.