Agnieszka Caban poniedziałek
Marta Karwacka 1215-1600
Karolina Michalska TŻiŻCz
Patrycja Szczepaniak
BIAŁKA
Data wykonania ćwiczenia: 15.10.2012r
Wstęp
Białka są podstawowym cząsteczkowym elementem każdej żywej komórki
i uczestniczą niemal we wszystkich procesach biologicznych. Pełnią funkcje strukturalne jak również funkcjonalne.
Białka zbudowane są z 100 – 10000 aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Wszystkie białka mają zbliżony skład pierwiastkowy, są wrażliwe na wysoką temperaturę i inne czynniki denaturujące, pochłaniają promieniowanie UV (dzięki obecności tyrozyny i tryptofanu), skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo. Ulegają wysalaniu z roztworu pod wpływem dużych stężeń soli, mają własności amfoteryczne
i zdolność wiązania jonów.
Ze względu na kształt wyróżniamy białka globularne (sferoproteiny) mające postać kłębuszków i białka fibrylarne (skleroproteiny) występujące w postaci włókienek.
Ze względu na strukturę chemiczną możemy podzielić białka na proste (homoproteiny) i złożone (heteroproteiny). Białka proste składają się wyłącznie z reszt aminokwasów, a złożone zawierają w cząsteczce składnik niebiałkowy, np. fosforanowy, cukrowy, chromoforowy.
Podział wg kryterium rozpuszczalności:
albuminy – dobrze rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych kwasach, zasadach
i roztworach soli, maja mały moment dipolowy i wysoką hydrofilność
globuliny – nierozpuszczalne wodzie (silny moment dipolowy, skłonności do agregacji), do rozpuszczania wymagają niewielkich ilości dobrze dysocjującej soli (wsalanie)
prolaminy – rozpuszczalne tylko w 70% etanolu
gluteiny – rozpuszczalne w rozcieńczonych roztworach kwasów lub zasad
Cel ćwiczenia
Zapoznanie się z właściwościami białek tj. (rozpuszczalność, procesy wsalania
i wysalania, amfoteryczność, charakter koloidalny, niszczenie struktury natywnej białka - denaturacja).
Część doświadczalna
1.1 Ekstrahowanie albumin i globulin
Wykonanie ćwiczenia:
1 g mączki grochowej ekstrahowałyśmy 25 ml 0,5 M roztworem KCl, w kolbie erlenmayarce przez 15 min, po czym całość odwirowałyśmy i uzyskaną ciecz nadosadową analizowałyśmy w następujący sposób:
a) próba biuretowa
Wykonanie:
Do 2 ml badanego roztworu dodałyśmy 2 ml 10% roztworu NaOH oraz kilka kropli 0,5% roztworu CuSO4.
Obserwacje:
Próba badana:
Powstało fioletowe zabarwienie roztworu.
Próby kontrolne:
Woda – nie zmieniła koloru.
Białko jaja kurzego – obserwujemy fioletowe zabarwienie.
Wnioski:
Fioletowa barwa świadczy o dodatnim odczynie reakcji. W badanej próbie, jak i w białku jaja kurzego wykryto obecność białka, natomiast w wodzie nie wykryto białka.
b) stwierdzenie obecności albumin i globulin
Wykonanie:
Do dwóch probówek odmierzyć po 1 ml ekstraktu mączki, następnie do jednej dodać 8 ml wody, a do drugiej 8 ml 0,5 M roztworu KCl. Porównać wygląd prób, do tej, gdzie nastąpi zmętnienie, dodać niewielką ilość (parę kropli) roztworu KCl.
Obserwacje:
Próbka 1 (z wodą) – obserwujemy wyraźne zmętnienie, które znika po dodaniu paru kropli KCl
Próbka 2 (z KCl) – nie obserwujemy zmętnienia, od razu następuje rozpuszczenie białka
Wnioski:
Pojawienie się zmętnienia świadczy, że w badanej próbie obecne były globuliny, które są nierozpuszczalne w wodzie z powodu małego momentu dipolowego. Dopiero dodatek soli umożliwia rozpuszczenie globulin w roztworze. Można wywnioskować, że więcej było globulin niż albumin.
Wydzielenie glutenu
Wykonanie:
Z 30 g maki pszennej i wody przygotowałyśmy twarde ciasto, odstawiłyśmy na 30 min celem uwodnienia i spęcznienia białek. Następnie wypłukiwałyśmy z ciasta skrobię, wygniatając je w strumieniu zimnej bieżącej wody. Otrzymaną pozostałość o gumowatej, ciągnącej konsystencji rozpuściłyśmy w 30 ml 0,2 M roztworu NaOH. Pobrałyśmy pipetą odpowiednią ilość roztworu i wykonałyśmy próbę biuretową.
Obserwacje:
Próba badana:
Pojawia się fiołkowe zabarwienie roztworu.
Próby kontrolne:
Woda – nie obserwujemy reakcji
Białko jaja kurzego –fioletowa barwa roztworu
Wnioski:
Pozytywny odczyn reakcji biuretowej świadczy o obecności białka w badanej próbie. Wiemy, że to białko to gluten, który, jak wynika z doświadczenia, jest rozpuszczalny
w rozcieńczonych roztworach zasad.
Wysalanie białek
Wykonanie:
Do 10 ml roztworu białka jaja kurzego dodałyśmy porcjami stały preparat (NH4)2SO4 aż do nasycenia roztworu soli. Osad wysolonego białka oddzieliłyśmy na sączku i rozpuściłyśmy (bezpośrednio na sączku) roztworem KCl. W uzyskanym roztworze sprawdziłyśmy obecność białka reakcją biuretową. Do przesączu uzyskanego po oddzieleniu osadu białka dodałyśmy 2- 3 krople kwasu trójchlorooctowego.
Obserwacje:
Próby badane:
Przesącz – dodanie TCA nie powoduje wytrącenia osadu. Rozpuszczone białko – po wykonaniu reakcji biuretowej uzyskujemy fioletowe zabarwienie roztworu
Próby kontrolne:
Woda – brak widocznej reakcji
Białko jaja kurzego – roztwór zabarwia się na fioletowo
Wnioski:
Dodawanie do roztworu (NH4)2SO4 powoduje obniżenie rozpuszczalności białka i wypadanie go z roztworu (wysalanie). TCA jest używany do usuwania białek z roztworów. Brak osadu świadczy więc o całkowitym wysoleniu białka z roztworu .Dodatni odczyn reakcji biuretowej oznacza, że w badanej próbce było białko.
Białka jako koloidy
Wykonanie:
Do dwóch probówek odmierzyłyśmy po 1 ml roztworu AgNO3. Do jednej próby dodałyśmy
1 ml roztworu białka a do drugiej tej samą ilość wody. Po wymieszaniu wprowadziłyśmy do każdej probówki roztwór NaCl.
Obserwacje:
Próba z wodą – po dodaniu NaCl nastąpiło zmętnienie, powstał biały osad AgCl
Próba z białkiem – po dodaniu NaCl nastąpiło powstanie klarownego roztworu
Wnioski:
Białko jako koloid hydrofilowy narzuca swój charakter hydrofobowemu układowi AgCl, pełni funkcję ochronną i zapobiega wypadaniu osadu soli z roztworu. Białko utrzymało charakter hydrofilowy i nie wydzielił się osad.
Amfoteryczność białek
Wykonanie:
Do trzech probówek odmierzyłyśmy po 2 ml roztworu białka jaja kurzego o odpowiednim pH. Do poszczególnych probówek dodawałyśmy kroplami, unikając nadmiaru odczynnika w próbie wymienione roztwory soli.
Obserwacje:
| Odczynnik | 1% roztwór białka jaja kurzego |
|---|---|
| pH=8 | |
| 10% CuSO4 | + |
| 10% (CH3COO)2Pb | + |
| 10% NaWO4 | - |
+ - obserwujemy osad
- - nie obserwujemy osadu
Wnioski:
Punkt izoelektryczny roztworu białka jaja kurzego występuje przy pH=4,7. Białko występuje w formie polianionu przy pH większym od pI. W tej formie może łączyć się z kationami metali ciężkich tworząc białczan. Przy pH mniejszym od pI białka występują w postaci polikationu
i mogą się łączyć z anionami. Osad powstaje tylko w odpowiednich wartościach pH.
W powstałych związkach występują połączenia typu „sól”.
1.6 Wpływ kwasów organicznych na białka
Wykonanie:
Do trzech probówek odmierzyłyśmy po 1 ml 1% roztworu białka jaja kurzego, po czym dodałyśmy po 1 ml odpowiednich roztworów kwasów organicznych.
Obserwacje:
| KWAS | OBSERWACJE |
|---|---|
| 6% kwas sulfosalicylowy | + |
| 10% kwas trójchlorooctowy | + |
| 5% kwas octowy | - |
+ - obserwujemy osad
- - nie obserwujemy osadu
Wnioski:
Kwas sulfosalicylowy i TCA dają trwałe, nierozpuszczalne połączenie z białkiem jaja kurzego. Powodują jego denaturację. Kwas octowy nie powoduje denaturacji białka jaja kurzego.
1.7 Denaturacja termiczna
Wykonanie:
Do trzech probówek odmierzyłyśmy po 2 ml roztworu białka jaja kurzego o odpowiednim pH. Próby umieściłyśmy na 15 min we wrzącej łaźni wodnej, po czym schłodziłyśmy i dodałyśmy po 5 ml buforu octanowego do prób o pH 3 oraz 8.
Obserwacje:
Po podgrzaniu w probówce o:
pH = 4,7 powstał biały osad;
pH = 8 powstał osad;
pH = 3 brak osadu.
Po dodaniu buforu octowego w probówce o:
pH = 8 wytrącił się osad
pH = 3 nastąpiło lekkie zmętnienie roztworu.
Wnioski:
Denaturacja nastąpiła we wszystkich trzech próbach. W probówce o pH = 4,7 (pH = pI) nastąpiła koagulacja, czyli agregacja rozwiniętych łańcuchów polipeptydowych. Dodatek buforu octanowego miał na celu doprowadzenie pH do pI niezdenaturowanego białka. Wyraźny osad w probówce o pH = 8 świadczy, że pI denaturowanego białka jest zbliżone do pI roztworu białka jaja kurzego przed denaturacją. Natomiast przy pH = 3 pI uległ zmianie po denaturacji, dlatego obserwujemy tylko zmętnienie roztworu.