Oczyszczanie ludzkiego białka P2 na drodze chromatografii powinowactwa

Rybosomalne białko P2 Homo sapiens poddane heterologicznej ekspresji w układzie pET (opartym o komórki E. coli) produkowane było w postaci białka fuzyjnego z dołączoną etykietą histydynową (6xHis-tag), umożliwiającą jego późniejsze oczyszczanie na drodze chromatografii powinowactwa. Etykieta histydynowa jest krótkim homopeptydem zbudowanym z 6 reszt histydynowych dołączonych do C- lub N- końca białka rekombinowanego. Przyłączenie etykiety odbywa się na etapie konstrukcji wektora ekspresyjnego, kiedy to do sekwencji DNA kodującej białko poddawane heterologicznej ekspresji dołącza się fragment DNA kodujący 6 reszt histydyny.

Chromatografia powinowactwa jest jedną z odmian chromatografii cieczowej. W najszerszej definicji chromatografia jest to technika separacji cząsteczek chemicznych (m.in. białek) wykorzystująca różnice w oddziaływaniu poszczególnych składników mieszaniny ze złożem chromatograficznym. Oczyszczanie białek poprzez chromatografię powinowactwa opiera się na zjawisku naturalnego powinowactwa etykiety, jaka dołączona jest do białka rekombinowanego, do specyficznego liganda zimmobilizowanego na złożu chromatograficznym. Złoże chromatograficzne może być upakowane w specjalnej kolumnie chromatograficznej (chromatografia kolumnowa) lub pozostawać zawieszone w naczyniu laboratoryjnym (chromatografia typu „batch”)

Oczyszczanie białka fuzyjnego zawierającego etykietę histydynową opiera się na powinowactwie pierścieni imidazolowych zawartych w resztach histydyny do zimmobilizowanych na złożu chromatograficznym jonów metali (Ni, Co, Zn). Poniżej zawartych jest kilka podstawowych informacji dotyczących oddziaływania etykiety 6xHis-tag ze złożem niklowym.

Celem ćwiczenia jest oczyszczenie rekombinowanego ludzkiego białka P2 zawierającego etykiete 6xHis na drodze chromatografii powinowactwa na złożu niklowym NiNTA)-

IMAC (ang. immobilized metal affinity chromatography).

Opisana procedura oczyszczania jest wariantem oczyszczania w warunkach natywnych. Preparatem wyjściowym będzie frakcja rozpuszczalnych białek cytoplazmatycznych (supernatant po wirowaniu S-100). Preparat ten po rozmrożeniu należy odwirować (12tyś. rpm./10 min./4⁰C) w celu usunięcia powstałych w trakcie zamrażania/ rozmrażania agregatów wytrąconego białka.

1. Przygotowanie złoża chromatograficznego NiNTA

- pobrać 1 ml (50% zawiesiny złoża NiNTA do probówki eppendrorfa 1.5 ml)

- odwirować próbkę 1.5 tyś. rpm/45 sek./temperatura pokojowa)

- supernatant usunąć, a osad złoża delikatnie zawiesić w 500 μl buforu do lizy (50mM NaH₂P0₄ , 300mMNaCl, 10mM imidazol; pH 8.0)

- próbkę odwirować (jak wyżej) i usunąć supernatant

2. Wiązanie białka do złoża, płukanie i elucja:

- do przygotowanego złoża NiNTA należy dodać 800μl preparatu rozpuszczalnych białek cytoplazmatycznych, delikatnie wymieszać, a następnie inkubować w lodzie 20 min.

- po tym czasie preparat odwirować jak wyżej, a supernatant zebrać do nowej probówki jako tzw. frakcja białek nie wiążących się ze złożem (ang. flow through)

- osad złoża należy przepłukać 1.5 ml buforu płuczącego (50mM NaH₂P0_4, 300mM NaCl, 20mM imidazol; pH 8) w celu oddzielenia białek niespecyficznie wiążących się ze złożem

- zawiesinę delikatnie wymieszać i następnie odwirować (jak wyżej)

- supernatant zebrać do nowej probówki jako tzw. frakcja białek odpłukanych ze złoża (ang. wash)

- osad złoża należy zawiesić w 400μl buforu elucyjnego (50mM NaH₂P0_4, 300mM NaCl, 300mM imidazol; pH 8) w celu uwolnienie specyficznie związanego białka

- Po wymieszaniu inkubujemy mieszaninę w lodzie przez 15 min., a następnie wirujemy jak wyżej.

- supernatant zbieramy jako preparat białek wypłukanych z kolumny (elucja), a złoże zbieramy do wspólnego naczynia w celu jego późniejszej regeneracji.

Zagadnienia dodatkowe do przygotowania:

1. Alternatywne etykiety białkowe wykorzystywane w chromatografii powinowactwa- GST, MBP

2. Metody elucji białek ze złoża NiNTA- wypłukiwanie imidazolem, zmiana pH-zasada działania