Ćwiczenie nr 7
Cytologia ginekologiczna
Wykonanie wymazu
Utrwalenie
Barwienie metodą Papanicolau lub Schorra. Ocena przydatności wykonanego i wybarwionego rozmazu do różnicowania (obecność pojedynczych komórek, brak zlepów, prawidłowość barwienia, czytelność)
Określenie stopnia czystości pochwy
Ocena grupy cytologicznej wg Papanicolau
Diagnostyka cytohormonalna – oznaczenie M.I., K.I.,E.I.
Cytodiagnostyka
W ginekologii cytologia exfoliatywna jest podstawową metodą w profilaktyce raka szyjki macicy w badaniach skriningowych.
Komórki, które wyścielają kanał rodny złuszczają się podlegając procesowi wzrostu, dojrzewania i degeneracji. W stanach patologii w złuszczonych komórkach można zaobserwować różnego rodzaju zmiany.
Kanał pochwy wysłany jest nabłonkiem wielowarstwowym płaskim nierogowaciejącym, a jama macicy jednowarstwowym walcowatym z migawkami. Wymaz do celów cytodiagnostyki onkologicznej pobiera się między 10 a 14 dniem cyklu z tylnego sklepienia pochwy(tzw. tarczy) oraz ujścia pochwowego szyjki macicy. Miejscem, które jest najbardziej narażone i najbardziej podatne na uszkodzenia – to miejsce przejścia sklepienia pochwy w ujście pochwowe szyjki macicy. W tym miejscu w patologii dochodzi do wypierania nabłonka wielowarstwowego płaskiego przez nabłonek jednowarstwowy cylindryczny(nadżerka – erosio colli uteri). Komórki nabłonka wielowarstwowego płaskiego z kanału pochwy są bogate w glikogen i nie zawierają produktów rogowacenia.
Nadżerka nieleczona traktowana jest jako stan przedrakowy. Jednocześnie jest stanem zapalnym, który może prowadzić do samozagojenia(pęcherzyki Nabotha) lub ulec procesowi kanceracji. Do innych stanów przedrakowych należy leukoplakia i dysplazja.
LeukoplakIa jest stanem zastąpienia nabłonka wiel. płaskiego nierogowaciejącego nabłonkiem rogowaciejącym(jaśniejsza plama na tarczy), wymaga potwierdzenia próbą Schillera.
Dysplazja polega na złym różnicowaniu komórek, tj. nie w kierunku ich dojrzewania, a kierunku kanceracji. Zmiany dysplastyczne mogą dotyczyć całej komórki, lub tylko jądra albo tylko cytoplazmy. Najważniejsze dla diagnostyki są zmiany w obrębie jądra( macronucleosis, macrocystis, polinucleosis, heteronucleosis, hyperchromatosis, vacuolisatio).
Cytodiagnostyka jest metodą diagnostyki wprowadzoną w 1941 roku przez Papanicolau. Opiera się na fizjologicznej właściwości złuszczania się komórek nabłonkowych, szczególnie nabłonka wielowarstwowego płaskiego pokrywającego pochwę i część pochwową szyjki macicy. Oprócz komórek nabłonkowych w rozmazach z pochwy stwierdza się inne elementy: krwinki białe(limfocyty, granulocyty, kom. plazmatyczne), krwinki czerwone, histiocyty oraz florę bakteryjną „fizjologiczną” (pałeczki kwasu mlekowego) lub patologiczną (bakterie, grzyby, rzęsistki pochwowe).
Badanie cytologiczne, zależnie od miejsca pobrania rozmazu oraz metody barwienia, może spełniać dwa zasadnicze zadania i służyć ocenie cytoonkologicznej i cytohormonalnej.
Pobranie rozmazu
Rozmaz do oceny cytologicznej powinien być pobrany przed badaniem ginekologicznym
W pierwszej połowie cyklu miesiączkowego kobiety między 10 a 14 dniem cyklu
Przez 3 dni nie należy zakładać do pochwy żadnych leków
Nie należy wykonywać płukania pochwy i nie odbywać stosunków płciowych
Badanie cytologiczne powinno być poprzedzone badaniem na stopień czystości pochwy
Do badań cytohormonalnych należy pobrać materiał z części pochwowej macicy i bocznych sklepień pochwy za pomocą wacika lub szpatułki (unikać nadmiernej ilości śluzu, ponieważ zlepia komórki)
Do badań onkologicznych pobiera się materiał z tarczy części pochwowej, z kanału szyjki i trzonu macicy za pomocą wacika lub szpatułki albo szczoteczki Brash (unikać nadmiernej ilości śluzu, ponieważ zlepia komórki)
Pobrany rozmaz rozprowadza się równomiernie na dwa oznaczone szkiełka, utrwala w mieszaninie alkoholu 96% eteru (15 minut do 15 dni) lub utrwalaczem Cytofix (suszyć). Utrwalone preparaty barwi się metodą Papanicolau lub Shorra wg instrukcji. Po barwieniu należy ocenić przydatność preparatu do różnicowania.
Badanie na stopień czystości pochwy
Badanie cytologiczne powinno być poprzedzone badaniem na stopień czystości pochwy.
Stopnie czystości pochwy
I STOPIEŃ – obecne nabłonki i pałeczki kwasu mlekowego
II STOPIEŃ – komórki powierzchniowe z jądrami pyknotycznymi, liczne pałeczki kwasu mlekowego, pojedyncze leukocyty i bakterie.
III STOPIEŃ – komórki powierzchniowe z jadrami pyknotycznymi, liczne leukocyty i bakterie, pojedyncze pałeczki kwasu mlekowego
IV STOPIEŃ – komórki nabłonka wszystkich warstw, brak pałeczek kwasu mlekowego, liczne bakterie, grzyby, rzęsistki.
Cytodiagnostyka hormonalna
Nabłonek błony śluzowej pochwy jest nabłonkiem wielowarstwowym płaskim, nierogowaciejącym, który podlega zmianom pod wpływem działania hormonów steroidowych. Obraz cytologiczny może być różny zależnie od okresu życia kobiety i fazy cyklu. Zmiany w nabłonku występują równolegle do faz cyklu miesiączkowego w błonie śluzowej macicy. Badania cytohormonalne pozwalają więc na ocenę czynności dokrewnej jajników.
Rozmaz cytohormonalny służy do
Oceny fazowości cyklu miesiączkowego (owulacja, płodność)
Oceny czynności hormonalnej jajników wyrażonej zmianami w nabłonku pochwy w okresie: pokwitania, pełnej dojrzałości, przekwitania oraz starczym.
Oceny reakcji organizmu na stosowane leczenie hormonalne.
Oceny zaburzeń endokrynologicznych u dzieci i kobiet.
Ocena cytohormonalna
Ocena cytohormonalna opiera się na wskaźnikach, które uzyskujemy z kolejno liczonych 100 komórek z co najmniej 5 pól widzenia oglądanego rozmazu.
WSKAŹNIK DOJRZEWANIA – Index maturus - M.I.- najważniejszy, daje orientacyjną ocenę stanu hormonalnego kobiety, odsetkowo przedstawia zawartość komórek wg kolejności: parabazalne, intermedialne, superficjalne.
WSKAŹNIK KARIOPYKNOZY – Index cariopycnosis - K.I.- określa procentowy stosunek dojrzałych komórek powierzchniowych o jądrze pyknotycznym do dojrzałych komórek pośrednich o jądrze pęcherzykowatym niezależnie od ich reakcji barwienia. Świadczy o działaniu estrogenów. K.I.=95% oznacza, że na 100 komórek 95% to komórki powierzchniowe o jądrach pyknotycznych i 5% komórek z warstw głębokich o jądrach pęcherzykowatych.
WSKAŹNIK EOZYNOFILII- Index eozynofilus - E.I. – oznacza procentową proporcję komórek eozynofilnych, kwasochłonnych (różowych, czerwony, pomarańczowych, żółtych) do komórek cyjanofilnych, zasadochłonnych (niebieskich, zielonych) wśród dużych komórek wielobocznych niezależnie od pyknozy jądra.
WSKAŹNIK ZWIJANIA SIĘ – F.I- określa proporcję między komórkami zwiniętymi i nie zwiniętymi wśród komórek dużych, wielobocznych, niezależnie od pyknozy jądra i wybarwienia (oznaczany od o do +++)
WSKAŹNIK GRUPOWANIA KOMÓREK – C.I. – określa proporcję między komórkami zgrupowanymi a nie zgrupowanymi, niezależnie od pyknozy jadra i wybarwienia (oznaczany od 0 do +++). Zgrupowanie stanowią co najmniej cztery komórki.
M.I.- 0/15/85- czyli z dużą zawartością komórek powierzchniowych, wysokie wskaźniki K.I. i E.I. są typowe dla fazy estrogenowej czyli owulacyjnej oraz dla działania preparatów estrogenowych w leczeniu.
M.I- 0/92/8 i wysoka wartość F.I. i C.I z przewagą komórek pośrednich są typowe dla fazy lutealnej i okresu ciąży i działania preparatów progesteronowych.
M.I.- 70/30/0 – duża ilość komórek warstw głębokich, świadczą o bardzo małym stężeniu estrogenów. Rozmazy atroficzne charakterystyczne są dla okresu dzieciństwa i senium.
Histologiczna budowa nabłonka pochwy:
Zdrowy nabłonek składa się z około 40 warstw. Kolejne warstwy spoczywające na tkance łącznej to:
Warstwa podstawowa-bazalna - komórki walcowate ściśle ułożone obok siebie z owalnym jądrem
Warstwa przypodstawowa-parabazalna – komórki owalne, okrągłe lub wieloboczne z pęcherzykowym jądrem (kilka rzędów)
Warstwa pośrednia – intermedialna – komórki wieloboczne, wydłużone z ciemniejszą na obwodzie cytoplazmą, pęcherzykowate wydłużone jądra (kilka rzędów komórek)
Warstwa powierzchniowa - superficjalna – duże wieloboczne spłaszczone komórki i małe, ciemne jądro. Jest to warstwa czynnościowa najbardziej reagująca na zmiany hormonalne.
Wydzielina pochwy zawiera:
- komórki nabłonka pochwy z powierzchniowych warstw nabłonka, duże, wieloboczne, kwasochłonne z małym intensywnie barwiącym się jadrem i komórki zasadochłonne z jaśniejszym, większym, pęcherzykowatym jądrem.
W obrębie tych komórek ich liczba, barwliwość, układ pojedynczy lub grupowy, wygląd jądra zmienia się zależnie od stanu hormonalnego.
U dojrzałej płciowo kobiety składa się z kolejnych warstw komórek podstawnych, przypodstawnych, pośrednich i powierzchniowych. U dziewczynek i kobiet po menopauzie nabłonek składa się tylko z komórek warstw głębokich: podstawnych i przypodstawnych.
Fizjologiczny obraz rozmazu wydzieliny pochwowej w różnych okresach życia kobiety:
1. noworodek – w rozmazie komórki powierzchniowe i pośrednio kwaso i zasadochłonne, jądra pyk toniczne.
2. po kilku dniach obraz się zmienia, pojawiają się komórki warstw głębokich o zabarwieniu zielononiebieskim. Typowy rozmaz przy zmniejszonej ilości estrogenów.
3. w czasie dojrzewania, przy pełnej czynności gruczołów rozmaz wygląda następująco:
- najwięcej jest dużych, wielobocznych komórek warstwy powierzchniowej z małym, ciemnym jądrem, częściej kwasochłonnych niż zasadochłonnych.
- komórki warstw pośrednich o połowę mniejsze od poprzednich o kształcie owalnym lub łódkowatym. Ich cytoplazma barwi się zasadochłonnie a jądra są owalne, okrągłe z jasna chromatyną
- komórki warstwy podstawnej i przypodstawnej fizjologicznie najrzadsze najmniejsze z dużym, ciemnym jądrem, zasadochłonną cytoplazmą.
4. ciąża – przewaga komórek zasadochłonnych
Stadia cyklu miesiączkowego (7 faz) na podstawie wskaźnika E.I:
(wymaz pobiera się co 2 dni)
1. Faza miesiączkowa – erytrocyty, leukocyty, komórki złuszczającego się nabłonka – 10% komórek kwasochłonnych (różowych) i 90% komórek zasadochłonnych (zielono-niebieskich)
2. Faza pomięsiączkowa –zwiększa się liczba komórek kwasochłonnych do 25%.
3. Faza przedowulacyjna – pojawia się więcej komórek kwasochłonnych z pyknotycznymi jądrami – 50%
4. Faza owulacyjna – większość obrazu stanowią komórki kwasochłonne z pyknotycznymi jadrami 60-70% - wpływ estrogenów
5. Faza poowulacyjna – komórek kwasochłonnych mniej niż 60%, wzrasta ilość komórek zasadochłonnych o pęcherzykowatych jądrach – jest to wczesna faza luteinowa
6. Faza luteinowa – 20% komórek kwasochłonnych
7. faza przedmiesiączkowa spadek komórek kwasochłonnych i przewaga komórek zasadochłonnych. Komórki kwasochłonne nie tworzą skupisk a brzegi cytoplazmy są zawinięte. Dalszy spadek stężenia estrogenów.
Rozmazy cytologiczne oceniamy w V grupach Papanicolau. Preparat ocenia się ogólnie, przeprowadza szczegółową ocenę nabłonka na podstawie budowy jądra komórki, cytoplazmy. W preparacie obserwuje się komórki złuszczonego nabłonka, ich kształt, wielkość, barwliwość, proporcję jądra do cytoplazmy, obecność wodniczek, obecność przejaśnienia wokół jądra, kształt, wielkość, barwliwość jądra.
1. I grupa – komórki prawidłowe nabłonka wielowarstwowego płaskiego i pojedyncze komórki nabłonka gruczołowego jeżeli wymaz został wykonany głęboko z kanału szyjki, mogą być pojedyncze leukocyty.
2. II grupa tzw. „grupa zapalna” – zmiany zapalne (widoczne cechy zmian zapalnych) i komórki metaplastyczne (komórki z głębokich warstw nabłonka przedwcześnie dojrzałe), histiocyty i komórki plazmatyczne, liczne leukocyty.
3. III grupa – obecność pojedynczych komórek dysplastycznych obok innych elementów komórkowych stwierdzonych w stopniu II.
Grupa III – zobowiązuje do podjęcia leczenia przeciwzapalnego i pobrania powtórnego kontrolnego wymazu do badania cytologicznego. Jeżeli nie nastąpiła poprawa i kwalifikacja grupy nie uległa zmianie konieczne jest badanie histopatologiczne(pobranie wycinka). Jeżeli kwalifikacja grupy po leczeniu zmienia się na II, kolejne badanie należy przeprowadzić w terminie 6 miesięcy.
4. IV grupa – obecność w rozmazie niewielkiej liczby komórek atypowych obok komórek dysplastycznych.
5. V grupa – bardzo liczne komórki bezwzględnie atypowe (rakowe), perła rakowa.
Zależnie od rozpoznania cytologicznego ustala się dalsze postępowanie: - w grupie I, II (określa się je jako ujemne) przeprowadza się leczenie i kontrolę - w grupie III, IV, V – (grupy dodatnie) konieczna jest dalsza diagnoza poprzez pobranie wycinków celowanych pod kontrolą kolposkopu. Badania tego nie można pominąć, ponieważ badanie cytologiczne nie jest badaniem ustalającym rozpoznanie i nie może stanowić podstawy do podjęcia leczenia. |
|---|
Obecnie zarzucono system Pappanicolau oceniający stan cytologiczny narządu rodnego , obowiązuje system BETHESDA opracowany przez Narodowy Instytut Onkologii USA, który zawiera 3 punkty:
A – określenie, czy wymaz zawiera odpowiedni materiał do oceny
B – ogólne stwierdzenie, czy obraz cytologiczny jest prawidłowy czy nie
C – dokładny opis stwierdzonych zmian zgodnie z terminologią stosowaną w patomorfologii.
Komórki zmienione zapalnie (metaplastyczne) charakteryzują się:
słabszą barwliwością, wodniczkami w cytoplazmie, przejaśnieniami wokół jądra, tzw. halo, zmianami zwyrodnieniowymi jądra (jądro powiększone, blade, dwujądrzaste, rozpad jądra). Komórki metaplastyczne są różnokształtne, silnie wybarwione i mają cechy komórki mało zróżnicowanej.
Cechy dysplazji komórkowej:
Macrocytosis – powiększenie się całej komórki
Macronucleosis – nieproporcjonalne powiększenie się jądra w stosunku do cytoplazmy, duże jądro i mały rąbek cytoplazmy.
Polynucleosis – zwiększona liczba jąder w jednej komórce
Hyperchromatosis – nadmierna barwliwość jądra komórkowego
Vacuolisatio – wodniczkowatość cytoplazmy
Dysplazja może dotyczyć komórek wszystkich warstw nabłonka płaskiego, jak i gruczołowego. Są to zmiany trudno odwracalne.
Cechy komórki atypowej:
Wielkość – komórki i jądra większe niż komórek prawidłowych
Kształt jądra – różnorodny, nieregularny.
Kształt komórki - komórki różne i dziwaczne np. kijankowate, wrzecionowate – typowe komórki rakowe, komety
Stosunek jądra do cytoplazmy zaburzony na korzyść jądra
Nadmierna ilość chromatyny rozłożona w jądrze w formie grubych, nieregularnych grudek z tendencją do odkładania się wokół błony jądrowej, chromatyna grudkowata, szprychowata (heteronucleosis).
Wyraźnie zaznaczone, często zniekształcone jąderka
Perły rakowe – komórki atypowe w skupisku w kształcie róży
Nieprawidłowe mitozy
Obecność więcej niż jednego jądra (heteropolinucleosis)
Obecność w cytoplazmie zmienionych komórek wodniczek
INSTRUKCJA DO BARWIENIA CYTOLOGICZNEGO METODA PAPANICOLAU
Rozmaz utrwalić w mieszaninie – alkohol 96% - eter (1:1)
Alkohol 96% I – 1 minuta
Alkohol 96% II – 1 minuta
H₂O destylowana – 0,5 – 1 minuta
Hematoksylina Harrisa – 5 minut
H₂O destylowana I – 1 minuta
H₂O destylowana II – 1 minuta
HCL 1:200 – pojedynczo 3 zanurzenia
H₂O destylowana – opłukać
H₂O bieżąca – ok. 1 minuta (do zniebieszczenia)
H₂O destylowana – 1 minuta
Alkohol 96% I – 1 minuta
Alkohol 96% II – 1 minuta
Alkohol 96% III – 1 minuta
Alkohol 96% IV – 1 minuta
Oranż G – 3 minuty
Alkohol 96% I – płukanie
Alkohol 96% II – płukanie
EA – 3 minuty
Alkohol 96% I – płukanie
Alkohol 96% II – płukanie
Alkohol 96% III – 1 minuta
Ksylen I – 1 minuta Gdyby zmętniało to dłużej przetrzymać w ksylenie lub
Ksylen II – 1 minuta dodatkowo ksylen IV.
Ksylen III – 1 minuta
Zatopić w balsamie kanadyjskim
WYNIKI BARWIENIA:
- komórki kwasochłonne – żółte, pomarańczowe, różowe
- komórki zasadochłonne – zielone, szare, niebieskie
- jadra – fioletowe
- pałeczki Döderleina (pałeczki kw. mlekowego) – niebiesko-zielone