LABORATORIUM Z BIOCHEMII

Aminokwasy

Aminokwasy – są małocząsteczkowymi związkami organicznymi, które zawierają dwie grupy funkcyjne:

aminową (-NH₂), oraz kwasową (karboksylową –COOH); są zatem aminowymi pochodnymi niższych kwasów tłuszczowych.

Ich podstawową biologiczną funkcją jest udział w tworzeniu białek, które są ważnym składnikiem każdej żywej komórki.

• Aminokwasy proteinogenne – są to aminokwasy niezbędne w biosyntezie białka, standardowe aminokwasy białek. Aminokwasy proteinogenne można podzielić na endogenne (takie, które produkowane są przez organizm człowieka, np. alanina, cysteina, glicyna), egzogenne (nie są syntetyzowane przez organizm człowieka, muszę być dostarczane wraz z pożywieniem, np. fenyloalanina, leucyna, lizyna).

• Asymetryczny atom węgla (chiralny) – atom węgla połączony z czterema różnymi podstawnikami (hybrydyzacja sp³). Atom taki stanowi centrum chiralności cząsteczki. Jeżeli w cząsteczce występuje tylko jeden asymetryczny atom węgla to cały układ nie ma płaszczyzny symetrii ani środka symetrii i wykazuje czynność optyczną.

• Amfoteryczność aminokwasów – ważną właściwością aminokwasów jest ich amfoteryczny charakter. Związkami amfoterycznymi (amfoterami, amfolitami) określane są substancje, które zachowują się zarazem jak kwas i zasada. Aminokwasy spełniają ten warunek dzięki jednoczesnej obecności w cząsteczce grup kwasowych (protonodawców) oraz zasadowych (protonobiorców).

Aminokwasy, podobnie jak kwasy i zasady, ulegają dysocjację i występują w postaci cząsteczek naładowanych. W zależności od odczynu środowiska roztworze aminokwasu przeważa albo obdarzona ładunkiem dodatnim forma kationowa (słaby kwas) albo ujemnie naładowana forma anionowa (słaba zasada) lub postać jonu obojnaczego (amfijonu), posiadająca wypadkowy ładunek równy zero (ilość ładunków dodatnich i ujemnych cząsteczki jest taka sama).

• Punkt izoelektryczny (pI) aminokwasu – to taka wartość pH, przy której roztwór aminokwasu wykazuje najniższe przewodnictwo elektryczne.

pH<pI kation (AK⁺) (słaby kwas) pH=pI (AK⁰) (amfijon) pH<pI anion (AK^-) (słaba zasada)

Podział aminokwasów ze względu na właściwości łańcucha bocznego.

• aminokwasy niepolarne (o alifatycznym łańcuchu bocznym: glicyna, alanina, walina, leucyna, izoleucyna oraz prolina i aromatyczna fenyloalanina)

• aminokwasy polarne lecz nie zjonizowane (zawierające siarkę: cysteina i metionina; posiadające grupę hydroksylową: seryna, treonina, tyrozyna oraz tryptofan z ugrupowaniem indolowym)

• aminokwasy „kwasowe” (zawierające dodatkową grupę karboksylową: kwas asparaginowy i glutaminowy)

• aminokwasy „zasadowe” ( z dodatkową grupą aminową lizyna, arginina z ugrupowaniem guanidynowym oraz histydyna z silnie zasadowym pierścieniem imidazolowym).

Zasady oznaczeń aminokwasów.

Odczyn ninhydrynowy.

Odczyn ninhydrynowy należy do metod ogólnych analizy aminokwasów. Istotą oznaczenia jest złożona reakcja aminokwasów z ninhydyrną, obejmująca dwa etapy. W pierwszym etapie pod wpływem ninhydyrny cząsteczka aminokwasu utlenia się i przemienia do uboższego o jeden atom węgla aldehydu. Wydziela się amoniak i dwutlenek węgla. Następnie w wyniku kondensacji, za pośrednictwem uwolnionej z aminokwasu cząsteczki amoniaku, cząsteczek zredukowanej i utlenionej ninhydyrny powstaje barwny związek. Intensywność zabarwienia próby jest wprost proporcjonalna do ilości uwolnionego amoniaku, a w konsekwencji do zawartości aminokwasu w próbie.

Reakcja z kwasem azotowym wg. Van Slyke’a.

Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego (III), tworzącego się według reakcji pierwszej, ulegają reakcji deaminacji, której produktami są: azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas. Deaminacja α- aminokwasu przebiega zgodnie z drugą reakcją:

Reakcja ksantoproteinowa. (dla aminokwasów aromatycznych)

Podczas ogrzewania aminokwasów aromatycznych ze stężonym kwasem azotowym pierścień aromatyczny ich łańcucha bocznego ulega nitrowaniu. Powstałe nitrowe pochodne wykazują w środowisku zasadowym intensywnie żółtopomarańczowe zabarwienie.

Reakcja Millon’a. (dla tyrozyny)

Reakcja Millona jest charakterystyczna dla tyrozyny. Badany roztwór zabarwia się na czerwono. W przypadku białek zawierających tyrozynę powstają pomarańczowe lub czerwone strąty. Następuje reagowanie jonów rtęciowych ze słabo kwaśną grupą fenolową. Należy pamiętać, że dodatnią reakcję z odczynnikiem Millona dają fenole. Jest to tzw. rtęciowanie pierścienia fenolowego. Odczynnik Millona zawiera azotan rtęciowy, azotan rtęciawy i wolny kwas azotowy.

Reakcje charakterystyczne dla tryptofanu. A – reakcja wg. Rosenheim’a, B – reakcja wg. Adamkiewicza Hopkins’a.

Pierścień indolowy, charakterystyczny dla łańcucha bocznego tryptofanu, tworzy w obecności czynnika utleniającego barwne produkty kondensacji, powstające za pośrednictwem reszty aldehydu mrówkowego lub kwasu glioksalowego.

Odczyn Pauly’ego dla histydyny.

Reakcja prowadząca do otrzymania barwnej pochodnej diazowej powstałej w wyniku sprzęgania wytworzonego z kwasu sulfanilowego diazozwiązku ze składową azową, którą stanowi reszta histydyny zawierająca silnie zasadowy pierścień imidazolowy. Wytworzony produkt wykazuje intensywnie czerwone (o odcieniu żółtoczerwonym) zabarwienie. Podobny odczyn daje również tyrozyna.

Reakcja cystynowa.

W trakcie ogrzewania białek z ługiem dochodzi do ich hydrolizy, zaś zawarta w cystynie i cysteinie siarka ulega uwolnieniu w postaci jonów siarczkowych, które to z jonami Pb²⁺ dają czarny osad PbS. Metionina (inny aminokwas siarkowy) nie daje dodatniego wyniku, gdyż jej atom siarki jest osłonięty grupą metylenową i w warunkach oznaczenia nie odłącza się od cząsteczki.