WSTĘP

Potencjał spoczynkowy jest stabilnym potencjałem, który charakteryzuje stan błony komórkowej, na którą nie działa żaden bodziec, na której nie występują skutki wcześniejszego zadziałania bodźca i która nie wykazuje spontanicznej aktywności elektrycznej.

Potencjał spoczynkowy błony ma wartość ujemną, co jest wynikiem różnicy liczby ładunków elektrycznych między wnętrzem komórki a środowiskiem zewnętrznym. Na stabilny stan polaryzacji błony istotny wpływ wywiera działanie pompy sodowo – potasowej, która poprzez swoją aktywność przyczynia się do utrzymania właściwego gradientu stężeń jonów.

Wartość potencjału spoczynkowego błony z dużą dokładnością można przewidzieć na podstawie równania Goldmana, gdyż uwzględnia ono gradient stężeń jonów i przepuszczalność błony komórkowej dla tych jonów. Przedstawia się ono wzorem:

Wzór 1. Równanie Goldmana.

Potencjał czynnościowy jest wynikiem otwarcia potencjałozależnych kanałów sodowych i potasowych, których znaczna populacja znajduje się we wzgórku aksonalnym neuronu. Na otwarcie kanałów potencjałozależnych wpływ ma depolaryzacja- im większa, tym większe będzie prawdopodobieństwo otwarcia tych kanałów, w związku z tym większy będzie dokomórkowy prąd sodowy.

Jeżeli dokomórkowy prąd sodowy będzie miał choćby minimalnie większe natężenie niż dokomórkowy prąd potasowy, wówczas będziemy obserwowali zwiększającą się depolaryzację związaną ze wzrostem liczby kationów po wewnętrznej stronie błony.

Postępująca depolaryzacja powoduje otwarcie kolejnych potencjałozależnych kanałów sodowych, zwiększając tym samym przepuszczalność błony komórkowej dla jonów sodu i potęgując dokomórkowy prąd sodowy- opisaną zależność nazywamy cyklem Hodkina. Jego zaistnienie warunkuje wystąpienie potencjału czynnościowego.

Parametrem, który w powyższym ujęciu charakteryzuje potencjał czynnościowy jest bodziec progowy. Jest to najmniejszy bodziec zdolny do wywołania cyklu Hodkina.

Jednym z etapów potencjału czynnościowego jest refrakcja względna. Refrakcja względna jest to czas, w którym może powstać kolejny potencjał czynnościowy, ale bodziec potrzebny do jego wystąpienia musi być większy niż bodziec progowy dla błony znajdującej się w stanie spoczynku.

Wiedząc, że kluczowe znaczenie dla utrzymania wartości potencjału spoczynkowego błony komórkowej ma gradient stężeń jonów, w tym jonów sodu, stąd nasuwa się pytanie- jak na wartość potencjału spoczynkowego błony wpłynie zmiana gradientu stężenia jonów sodu?

Istotną rolę w zainicjowaniu potencjału czynnościowego błony mają potencjałozależne kanały sodowe, dlatego należy zastanowić się jak zmiana gradientu stężenia jonów sodu wpłynie na takie parametry wyżej wymienionego potencjału jak: wartość bodźca progowego oraz moment rozpoczęcia i zakończenia refrakcji względnej?

METODA

• materiał

Najodpowiedniejszym materiałem, który będzie stanowił obiekt obserwacji kluczowych zmian dla naszego eksperymentu będzie wyizolowana komórka nerwowa, ponieważ charakteryzuje się ona:

-pobudliwością – pod wpływem określonych bodźców reaguje zmianą potencjału błonowego;

-dużą gęstością potencjałozależnych kanałów potasowych w aksonie neuronu, co jest szczególnie istotne w generowanie potencjałów czynnościowych.

• metoda

Spośród znanych nam metod bezpośredniego pomiaru własności elektrofizjologicznych komórek, metodą z wyboru, która pozwoli wyjaśnić wyżej postawione pytania jest „ current clamp”

Metoda „current clamp” służy do określania wartości bodźca progowego oraz badania właściwości kodu cyfrowego.

Ryc. 1 Schemat metody „current clamp”

Zmienną obserwowana jest potencjał błony, z kolei zmienną kontrolowaną jest bodziec elektryczny podawany do ciała komórki elektrodą stymulująca. W środowisku zewnątrzkomórkowy, umieszczona jest elektroda odniesienia, a we wnętrzu komórki (aksonie) znajduje się elektroda rejestrująca – elektrody te pozwolą na odczytanie wartości potencjału błonowego z ekranu oscyloskopu.

Zdecydowaliśmy się na tę metodę ponieważ, w pierwszym doświadczeniu badamy wartość potencjału spoczynkowego błony komórkowej, a w drugim wartość bodźca progowego oraz czas trwania refrakcji względnej, w których to doświadczeniach zmieniamy gradient stężeń jonów sodowych oraz wartość bodźca działającego na komórkę.

• protokół

W pierwszym eksperymencie chcąc zbadać wartość potencjału spoczynkowego błony komórkowej dla danego gradientu jonów sodu zwiększaliśmy bądź zmniejszaliśmy stężenie jonów sodu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej i odczytywaliśmy wartość ustalonego potencjału spoczynkowego z ekranu oscyloskopu.

Aby ustalić wartość progową bodźca dla danego gradientu stężeń jonów sodu, metodą prób i błędów stymulowaliśmy komórkę bodźcami o różnej wartości obserwując jednocześnie na ekranie oscyloskopu jaka będzie minimalna wartość bodźca zdolnego do wywołania potencjału czynnościowego dla danego gradientu stężeń.

W celu zbadania momentu rozpoczęcia refrakcji względnej, stymulowaliśmy komórkę silnym bodźcem o wartości 1000 μA/cm² . Metodą prób i błędów odszukaliśmy punkt na osi czasu, w którym badana refrakcja względna ma początek . Natomiast, aby wyznaczyć koniec refrakcji względnej badaliśmy najwcześniejszy moment, w którym bodziec progowy będzie zdolny do wywołania kolejnego potencjału czynnościowego.

WYNIKI

Gradient stężeń jonów sodu	Wartość potencjału spoczynkowego (mV)
0,1	-63,5
0,2	-63
0,3	-62,5
0,4	-62,5
0,5	-62
0,6	-61,5
0,7	-61
0,8	-60,5
0,9	-60,1
1	-60
1,1	-59
1,2	-59
1,3	-59
1,4	-59
1,5	-59
1,6	-59
1,7	-59
1,8	-59

Tabela 1. Wartość potencjału spoczynkowego w zależności

od gradientu stężeń jonów sodu.

Gradient stężeń jonów sodu	Wartość bodźca progowego μA/cm²	Refrakcja względna (ms)
		Czas rozpoczęcia
0,1	164	7
0,2	127	-
0,3	110	-
0,4	98	7,4
0,5	90	-
0,6	84	-
0,7	78	8,1
0,8	73	-
0,9	68	-
1	64	8,2
1,1	61	-
1,2	57	-
1,3	54	8,2
1,4	51	-
1,5	48	-
1,6	45	9,5
1,7	42	-
1,8	39	-
1,9	36	10,8

Tabela 2. Zestawienie zmian parametrów potencjału czynnościowego w zależności od zmiany gradientu stężeń jonów sodu.

Wykres 1. Zależność wartości bodźca progowego od gradientu stężeń jonów sodu.

Ryc. 2 Porównanie wykresów potencjałów czynnościowych przy skrajnych wartościach gradientów stężeń jonów sodu - odpowiednio 0,1(z lewej) oraz 1,9 (z prawej).

DYSKUSJA

Ogólnym stwierdzeniem jakie można sformułować bazując na powyższych wynikach jest to, że gradient stężenia jonów sodowych wywiera istotny wpływ na wartości parametrów badanych przez nas potencjałów błonowych, a mianowicie potencjału spoczynkowego i potencjału czynnościowego.

Doświadczenie 1.

W miarę wzrostu stężenia zewnątrzkomórkowego jonów sodu względem stężenia fizjologicznego wartość potencjału spoczynkowego błony komórkowej staje się mniej ujemna. Natomiast w miarę spadku stężenia zewnątrzkomórkowego jonów sodu względem stężenia fizjologicznego wartość potencjału spoczynkowego staje się bardziej ujemna

Aby zinterpretować powyższe wyniki należy odwołać się do sił działających na jony sodu: siły chemicznej oraz siły elektrycznej.

W stanie spoczynku stężenie jonów sodu jest wyższe w środowisku zewnątrzkomórkowym, niż we wnętrzu komórki.

Zgodnie z prawem dyfuzji, siła chemiczna działająca na jony sodu ma kierunek w poprzek błony, a zwrot dokomórkowy. Z kolei jony sodu będące nośnikami dodatnich ładunków elektrycznych, zgodnie z prawem Coulomba, generują siłę elektryczną o zwrocie również dokomórkowym, z racji tego że potencjał środowiska wewnętrznego komórki w stosunku do środowiska zewnątrzkomórkowego jest bardziej ujemny (taki rozkład ładunku jest efektem działania pompy sodowo-potasowej).

Zmieniając stężenie zewnątrzkomórkowe sodu, wpływamy jednocześnie na obie siły działające na jony sodu. Zwiększenie tego stężenia powoduje wzrost wartości siły chemicznej oraz elektrycznej, dlatego jony sodu napływają do komórki, co powoduje zwiększenie ilości ładunków dodatnich wewnątrz komórki , a co za tym idzie ustalenie nowej wartości potencjału spoczynkowego, która jest mniej ujemna niż przy stężeniu fizjologicznym.

Natomiast zmniejszające się stężenie zewnątrzkomórkowe spowodowało zmniejszenie siły chemicznej z powodu zmniejszenia gradientu stężenia jonów sodu pomiędzy środowiskiem zewnętrznym a wewnętrznym komórki, a także zmniejszenie siły elektrycznej, ponieważ zmniejszona została ilość ładunków dodatnich środowiska zewnętrznego komórki. Obserwowana coraz bardziej ujemna wartość potencjału błony jest spowodowana działaniem pompy sodowo-potasowej, której działanie przewyższa w tym wypadku dokomórkowy napływ jonów sodu.

Ponadto wpływ zmiany gradientu stężeń jonów sodu na zmianę wartości potencjału spoczynkowego błony komórkowej można uzasadnić równaniem Goldmana. Wynika z niego, że zwiększenie gradientu stężeń jonów sodu w stosunku do gradientu fizjologicznego spowoduje ustalenie się nowego wyższego potencjału równowagi dla jonów sodu. Potencjał ten będzie jednocześnie wpływał na wypadkowy potencjał spoczynkowy błony komórkowej, powodując zmniejszenie jego ujemności. Z kolei zmniejszenie gradientu jonów sodu względem gradientu fizjologicznego powodować będzie także ustalenie się nowego, lecz tym razem niższego potencjału równowagi dla jonów sodu, który będzie wpływał na wypadkowy potencjał spoczynkowy błony komórkowej, powodując zwiększenie jego ujemności.

Doświadczenie 2.

Opierając się na wynikach doświadczenia pierwszego możemy stwierdzić, że wraz ze wzrostem stężenia zewnątrzkomórkowego jonów sodu wartość bodźca progowego maleje. Jest to spowodowane faktem, że im mniej ujemny jest potencjał spoczynkowy błony komórkowej tym niższa jest wartość minimalnego bodźca zdolnego do wywołania potencjału czynnościowego, czyli bodźca progowego.

Kolejną obserwacją jaką poczyniliśmy jest następująca zależność: zwiększanie gradientu stężeń jonów sodu powoduje opóźnienie momentu rozpoczęcia oraz końca refrakcji względnej. Jest to spowodowane faktem, że przy zmianie gradientu stężeń jonów sodu ustala się nowy potencjał spoczynkowy błony.

Im wyższy jest ten gradient, tym mniej ujemną wartość ma potencjał spoczynkowy błony i tym wyższą wartość przyjmuje nowo ustalony potencjał równowagi dla jonów sodu.

Zwiększenie zewnątrzkomórkowego stężenia jonów sodu powoduje zwiększoną siłę chemiczną dla tego jonu. Aby zrównoważyć tę siłę, potencjał równowagi dla jonów sodu staje się wyższy. Dzięki temu w czasie otwarcia potencjałozależnych kanałów sodowych do komórki napływa większa ilość jonów sodu powodując większą depolaryzację jej błony.

Moment rozpoczęcia refrakcji względnej występuje na początku okresu hiperpolaryzacji. Czas od momentu rozpoczęcia inaktywacji sodowej do chwili rozpoczęcia refrakcji względnej przy różnych gradientach stężeń jonów będzie różny. Moment rozpoczęcia inaktywacji sodowej np. dla gradientu [0,1] będzie miał miejsce wcześniej niż dla gradientu [1,9], dlatego w miarę wzrostu gradientu stężeń zauważamy opóźnienie rozpoczęcia refrakcji względnej (por. Ryc. 2). Maksymalna wartość hiperpolaryzacji jest stała ze względu na, że w przeprowadzonym eksperymencie nie manipulowaliśmy gradientem stężeń dla jonów potasu.

Momentu zakończenia refrakcji względnej opóźnia się w miarę wzrostu gradientu stężeń jonów sodu. Spowodowane jest to faktem, że im wyższy jest gradient stężeń jonów sodu tym mniej ujemny jest potencjał spoczynkowy błony komórkowej. Koniec refrakcji względnej następuje w momencie osiągnięcia potencjału spoczynkowego. Maksymalna wartość hiperpolaryzacji jest niezmienna, bez względu na wartość gradientu stężeń jonów sodu, dlatego osiągnięcie potencjału spoczynkowego o mniej ujemnej wartości następuje później niż osiągnięcie wartości potencjału spoczynkowego przy fizjologicznym gradiencie stężeń jonów sodu, którego wartość jest bardziej ujemna.