SPRAWOZDANIE Z BIOCHEMII

WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI HYDROLAZ

Teoria:

Do klasy hydrolaz zaliczamy enzymy katalizujące proces rozpadu substratu z udziałem cząsteczki wody. Można wymienić grupy:

• esterazy

• glikozydazy

• peptydazy

• amidazy

Hydrolazy estrów rozkładają wiązania estrowe, np. lipaza katalizująca hydrolizę tłuszczów do glicerolu i kwasów tłuszczowych. Lipazy wskazują niewielką specyficzność i katalizują rozpad estrów utworzonych przez kwasy o krótkim i długim łańcuchu, nasycone i nienasycone, oraz alkohole posiadające łańcuch krótki albo długi, jedno- lub wielowodorotlenowe.

Hydrolazy glikozydowe rozszczepiają wiązania glikozydowe glikozydów kilku- i wielocukrów. Są to enzymy o dużej swoistości działania. Glikozydazy dzielimy na oligosacharydazy i polisacharydazy.

Hydrolazy peptydowe rozszczepiają hydrolityczne wiązania peptydowe. Znaczna część peptydaz to enzymy trawienne, dzielą się na: endopeptydazy i egzopeptydazy. Endopeptydazy działają na cząsteczki białek i polipeptydów, rozbijając wiązania peptydowe utworzone wyłącznie przez określone aminokwasy, niezależnie od ich położenia w łańcuchu peptydowym. Egzopeptydazy mogą odszczepiać jedynie aminokwasy skrajne. Do najważniejszych enzymów trawiennych należy pepsyna i trypsyna. Pepsyna atakuje głównie wiązania peptydowe, w których jest grupa aminowa aminokwasów aromatycznych, a ponadto leucyny i aminokwasów kwaśnych. Trypsyna hydrolizuje tylko te wiązania peptydowe, które zostały utworzone z grupy karboksylowej należącej do lizyny lub argininy.

Hydrolazy amidowe rozkładają hydrolityczne wiązania amidowe. Na uwagę zasługują ureazy rozkładające mocznik na CO₂ i NH₃, które w roztworze wodnym tworzą węglan amonu.

Inwertaza (β-fruktofuranozydaza, β-fruktozydaza, sacharaza, EC 3.2.1.26) – enzym z klasy hydrolaz i podklasy glikozydaz, który katalizuje hydrolizę wiązania fruktofuranozydowego (+)-sacharozy z wytworzeniem (+)-glukozy i (−)-fruktozy. Procesowi towarzyszy zmiana kierunku skręcania płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego z dodatniej na ujemną, tzw. "inwersja sacharozy", co jest źródłem nazwy enzymu.

Optymalne pH działania inwertazy wynosi około 5. Występuje głównie w komórkach roślinnych, gdzie związana jest ze ścianą komórkową. Wytwarzana jest też przez pszczoły, hydrolizując sacharozę podczas powstawania miodu. Produkty dostępne handlowo uzyskiwane są z drożdży.

Amylazy, diastazy (EC 3.2.1) – grupa enzymów zaliczanych do hydrolaz, rozkładających skrobię i inne polisacharydy. Występują w soku trzustkowym (amylaza trzustkowa) i w ślinie (amylaza ślinowa). Amylazy są także syntezowane w owocach wielu roślin podczas dojrzewania (powoduje to, że stają się one słodsze) oraz podczas kiełkowania ziaren zbóż. Amylaza z ziaren ma istotne znaczenie przy produkcji słodu. W przyrodzie występują 3 rodzaje amylazy: α (EC 3.2.1.1), β (EC 3.2.1.2) i γ (EC 3.2.1.3), natomiast u człowieka i innych zwierząt tylko amylazy α i γ. W surowicy stwierdzono występowanie 8 izoenzymów pochodzących z:

• trzustki: P1, P2, P3

• błony śluzowej jelita cienkiego: P2

• gruczołów ślinowych: S1, S2, S3

• gruczołów mlecznych: P2, S1, S2

• komórek jajników i jąder: O2, O1

Ureaza (EC 3.5.1.5) – enzym z klasy hydrolaz. Katalizuje reakcję hydrolitycznego rozkładu mocznika na amoniak i dwutlenek węgla:

H₂N-CO-NH₂ + H₂O → 2 NH₃ + CO₂

Optymalne warunki reakcji to 40 °C i pH 7.

W centrum aktywnym zawiera jony niklu.

Występuje w bakteriach, drożdżach i niektórych roślinach wyższych. Była pierwszym enzymem otrzymanym w 1926 w postaci krystalicznej z nasion kanawalii mieczokształtnej przez J. Sumnera.

1. β-fruktofuranozydaza (sacharoza, inwertaza)

1. Sporządzanie wyciągu enzymatycznego

5g drożdży ucieramy w moździerzu z piaskiem i 50cm³ H₂O destylowanej przez kilkanaście minut. Następnie odstawiamy na 15 minut powstałą zawiesinę i odwirowujemy.

1. Jakościowe wykrywanie aktywności inwertazy

Do trzech probówek wlewamy po 5cm³ wyciągu z drożdży. Następnie do dwóch probówek dodajemy odpowiednio:

- do probówki 1 - 5cm³ 1% sacharozy,

- do probówki 2 - 5cm³ wody destylowanej.

Roztwór w trzeciej probówce zagotowujemy, studzimy i dodajemy 5cm³ 1% sacharozy.

Zawartość wszystkich trzech probówek mieszamy i po 5 minutach wykonujemy próbę Fehlinga na cukry redukujące – dodajemy po 2cm³ mieszaniny roztworów Fehlinga I i II, po czym je gotujemy.

Ceglasto-czerwony osad wytrącił się w probówce numer 1.

Wnioski:

Ceglasto-czerwony osad świadczy o obecności cukrów redukujących w roztworze. Inwertaza rozłożyła obecną w probówce 1 sacharozę do glukozy i fruktozy. W probówce 3 reakcja nie zaszła, ponieważ wysoka temperatura unieczynniła inwertazę.

1. Amylazy

1. Otrzymanie α-amylazy śliny

Wodą o temperaturze około 40^oC płuczemy usta. Następnie kilkakrotnie nabieramy w usta po kilkanaście cm³ ciepłej wody, trzymamy około 1 minuty, po czym wypluwamy do zlewki.

1. Jakościowe wykrywanie aktywności amylaz

Przygotowujemy 6 probówek, do każdej odmierzamy po 2,9 cm³ wody destylowanej i 1cm³ 0,5% skrobi w 0,9% NaCl.

Do pierwszej probówki dodajemy 1,1cm³ zagotowanego preparatu α-amylazy śliny i wstawiamy do inkubacji na 30 minut w temperaturze 37^oC.

Do pozostałych probówek również dodajemy tego samego preparatu, ale nie zagotowanego. Mieszamy i wstawiamy do inkubacji w temperaturze 37^oC, następnie po czasie 0, 5,10, 20, 30 minut wyjmujemy z termostatu kolejno probówki i wstawiamy do zlewki z wrzącą wodą.

Po wyjęciu wszystkich probówek, zawartość każdej z nich dzielimy na dwie części. Z jedną częścią wykonujemy próbę na obecność cukrów redukujących (próba Fehlinga), z drugą próbę z jodem na obecność skrobi i dekstryn.

Uzyskane zabarwienia przedstawiamy w tabeli:

Numer probówki	Próba Fehlinga	Próba z jodem
1	zielono-pomarańczowy	granatowy
2	pomarańczowy	bezbarwny
3	pomarańczowy	bezbarwny
4	pomarańczowy	bezbarwny
5	pomarańczowy	bezbarwny
6	żółto-zielony	bezbarwny

Wnioski:

W probówce numer 1 próba z jodem dała barwę granatową, co świadczy o obecności skrobi w roztworze. Oznacza to, że α-amylaza poddana wysokiej temperaturze uległa denaturacji. Kolor bezbarwny w pozostałych probówkach świadczy o braku skrobi w roztworach, a więc α-amylaza rozłożyła ją.

1. Ureaza

1. Przygotowanie wyciągu ureazy z mąki sojowej – nie wykonaliśmy tego ćwiczenia ze względu na posiadany gotowy preparat wyciągu ureazy.

2. Rozkład mocznika

Do dwóch probówek nalewamy po 3cm³ 1% roztworu mocznika, następnie dodajemy:

- do probówki 1 - 2cm³ surowego wyciągu z ureazy soi

- do probówki 2 - 2cm³ zagotowanego wyciągu ureazy z soi

Zawartość obu probówek mieszamy, dodajemy po 2-3 krople roztworu fenoloftaleiny i wstawiamy do inkubacji w temperaturze 40^oC.

W probówce numer 1 nastąpiła zmiana zabarwienia z bezbarwnego na różowy.

Wnioski:

Ze względu na charakter białkowy enzym w temperaturze 100^oC ulega unieczynnieniu i nie może przeprowadzać rozkładu mocznika. W probówce 1 powstało różowe zabarwienie, ponieważ surowy wyciąg z ureazy soi rozłożył mocznik na CO₂ i NH₃, które w roztworze wodnym tworzą węglan amonu o odczynie zasadowym, który daje różowe zabarwienie z fenoloftaleiną.