LABORATORIUM Z BIOCHEMII

Kwasy nukleinowe.

Kwasy nukleinowe należą do podstawowych składników komórek zwierzęcych, roślinnych i drobnoustrojów. Są wielocząsteczkowymi polimerami nukleotydów.

Rozróżnia się:

• Kwas rybonukleinowy (RNA) zawierający β-D- rybofuranozę.

• Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) zawierający 2-deoksy- β- D- rybofuranozę.

β - D- rybofuranoza 2 – detoksy – β - D- rybofuranoza

NUKLEOTYD – podstawowa jednostka strukturalna kwasów nukleinowych, składa się z zasady azotowej (purynowej lub pirymidynowej), składnika cukrowego – pentozy (rybozy lub deoksyrybozy) oraz kwasu ortofosforowego.

Do podstawowych zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych należą adenina, guanina, cytozyna, uracyl i tymina.

Zasady purynowe: Ade, Gua. Zasady pirymidynowe: Cyt, Ura, Thy.

Połączenie zasady azotowej ze składnikiem cukrowym nosi nazwę NUKLEOZYDU. W nukleozydach wiązanie glikozydowe łączy C-1 pentozy z atomem N-1 zasady pirymidynowej lub atomem N-9 zasady purynowej.

NUKLEOZYD - połączony wiązaniem estrowym z resztą kwasu ortofosforowego tworzy nukleotyd.

Kwas rybonukleinowy (RNA) jest skupiony w komórkach głównie w rybosomach, a kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) przede wszystkim w jądrze komórkowym.

Większość kwasów nukleinowych występuje w kompleksach z białkami, czyli w formie NUKLEOPROTEIN. Łagodne postępowanie umożliwia izolowanie takich połączeń, jednak już w roztworach stężonych soli, nukleoproteiny dysocjują na kwasy nukleinowe i białka.

Wolne kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczają się w środowisku zasadowym, słabo w wodzie, rozcieńczonych kwasach i alkoholach. Obecność kwasy fosforowego nadaje tym związkom charakter kwaśny.

• Wykazywanie obecności kwasów opiera się na charakterystycznych reakcjach ich składników, uwalnianych w wyniku hydrolizy.

• Uwolnienie zasad purynowych i pirymidynowych, pentoz i kwasu fosforowego następuje pod działaniem mocnych kwasów i podwyższonej temperatury.

DNA można odróżnić od RNA na podstawie analizy składnika cukrowego.

Reakcją ogólną na wykrycie pentoz jest reakcja orcynolowa Biala, do odróżniania obu pentoz stosuję się reakcję DISCHIEGO z difenyloaminą. Reakcje te są wykorzystywane w analizie ilościowej kwasów nukleinowych.

Zasady purynowe i pirymidynowe tworzą sole zarówno z kwasami, jak i z jonami metali.

• Sole zasad purynowych z metalami ciężkimi w środowisku słabo kwaśnym wytrącają się w postaci krystalicznej.

• Sole zasad pirymidynowych w tych warunkach nie strącają się, ale można je otrzymać w stanie krystalicznym po alkalizacji.

• Produkty żywnościowe zawierają na ogół niewielkie ilości kwasów nukleinowych. Do wyjątków należą: ikra i mlecz ryb, wątroba i biomasa drobnoustrojów. Niezbyt dużo kwasów występuje w mięsie zwierząt rzeźnych i ryb.

Zasady purynowe zawarte w kwasach spożywanych produktów w obecności swoistych enzymów są utleniane poprzez hipoksantynę i ksantynę do kwasu moczowego, który wydalany jest z organizmu z moczem.

Zaburzenia w przemianie puryn odgrywają dużą rolę w powstawaniu takich zmian patologicznych jak dna (podagra), artretyzm, kamica moczanowa.

• Zasady purynowe stanowią składnik wielu surowców roślinnych, stosowanych jako produkty spożywcze, tj. herbata, kawa, kakao.

• W tych produktach występują etylowane zasady purynowe: kofeina, teofilina, teobromina.

1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych.

Wytrącanie się osadu po dodaniu do probówek HCl z roztworami DNA i RNA wynika z tego, że kwasy wykazują bardzo niską rozpuszczalność w środowiskach kwaśnych. Kwasy nukleinowe wykazują odczyn kwaśny.

Rozpuszczanie osadu po dodaniu do próbek z roztworem DNA i RNA NaOH wykazuję na to, że kwasy dobrze rozpuszczają się w zasadach.

2. Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych.

Kwasy DNA i RNA pod wpływem ogrzewania w H₂SO₄ ulegają hydrolizie do wolnych zasad purynowych i nukleotydów pirymidynowych.

3. Wykrywanie pentoz w hydrolizach kwasowych.

Reakcja orcynolowa:

Zawarte w nukleozydach pentozy ogrzewane w środowisku kwaśnym ulegają odwodnieniu przechodząc w furfural, który w wyniku kondensacji z orcyną i jonami żelaza tworzy zielone kompleksy

Reakcja Dischego:

Deoksyryboza wolna i związana w reakcji z odczynnikiem difenylowym ulega odwodnieniu pod wpływem działania kwasu octowego zawartego w odczynniku, przechodząc w formę aldehydu ω- hydroksylewulinowego, potem tworzy barwny kompleks z difenyloaminą.

Wykrywanie kwasu fosforowego:

Po podgrzaniu próbek wytrącił się żółty osad, co świadczy o obecności fosforanów. Wytrącenie się osadu świadczy o utworzeniu trudno rozpuszczalnej soli fosfomolibdenianu amonu oraz o obecności reszt kwasu fosforowego w kwasach nukleinowych.

4.Wykrywanie zasad purynowych (adenina, guanina).

Wytrącił się nierozpuszczalny w amoniaku biały osad soli srebrowych puryn. Zasady purynowe zawarte w kwasach nukleinowych tworzą sole z jonami metali.

5. Oznaczenie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną

Najlepsza kostka ta, która zawiera najmniej zasad purynowych.

6.Oznacznie zawartości DNA metodą difenyloaminową.

Deoksyryboza będąca składnikiem DNA z odczynnikiem difenyloaminowym zawierający stężony kwas octowy daje niebieskie zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do ilości DNA w próbie.