Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności
Technologia Żywności i Żywienia Człowieka
Sem. V, grupa 1,
Wtorek, 8¹⁵ – 12⁰⁰

Laboratorium z Biochemii

KWASY NUKELINOWE

Iga Białasiewicz
Sara Nastałek
Daria Woźniak

Data wykonywania ćwiczenia: 3.11.2015
Data oddania sprawozdania: 10.11.2015

1. Wstęp teoretyczny.

Kwasy nukleinowe są długimi liniowymi polimerami, które przenoszą informację przechodzącą z jednego pokolenia na drugie. Makrocząsteczki te składają się z dużej liczby połączonych ze sobą nukleotydów, z których każdy jest złożony z cukru, kwasu fosforowego i zasady. Cukry połączone fosforanami tworzą wspólny rdzeń cząsteczki, podczas gdy zasady mogą się różnić i wyróżnia się ich cztery typy.

Znane są dwa podstawowe typy naturalnych kwasów nukleinowych:

• DNA – kwas deoksyrybonukleinowy

• RNA – kwas rybonukleinowy

W DNA powtarzającymi się jednostkami są nukleotydy, zawierające cukier deoksyrybozę i cztery rodzaje zasad. Do zasad tych należą adenina, tymina, guanina i cytozyna.

DNA jest cząsteczką dziedziczności wszystkich organizmów prokariotycznych i eukariotycznych. Kwas deoksyrybonukleinowy jest źródłem informacji genetycznej, gdyż geny są fragmentami DNA kodującymi informację do syntezy białka lub kwasu RNA. DNA kieruje syntezę białek, dzięki czemu ma wpływ na wszystkie procesy, jakie zachodzą w organizmie. Kwas deoksyrybonukleinowy występuje przede wszystkim w jądrze komórkowym.

W RNA występuje cukier ryboza, a zamiast tyminy występuje uracyl. Kwas rybonukleinowy w komórkach jest skupiony głownie w rybosomach. Funkcją RNA jest pośredniczenie pomiędzy DNA i rybosomami w trakcie biosyntezy białek. W przyrodzie mamy do czynienia z kilkoma rodzajami RNA, różniącymi się długością, budową i funkcjami. Są to między innymi:

• informacyjny RNA (mRNA) – zawiera kopię kodu genetycznego,

• transportujący RNA (tRNA) – odpowiada za przenoszenie aminokwasów do rybosomów,

• rybosomalny (rRNA) – jest on składnikiem rybosomów.

Do podstawowych funkcji kwasów nukleinowych należą:

1. udział w biosyntezie białek

2. udział w podziałach komórkowych i przekazywaniu cech dziedzicznych

3. stanowią podstawowy materiał genetyczny komórki

Nukleotyd – podstawowa jednostka strukturalna kwasów nukleinowych w skład której wchodzą: zasada azotowa purynowa lub pirymidynowa, cukier (pentoza) – deoksyryboza lub ryboza w zależności z czym mamy do czynienia (DNA czy RNA), oraz grupa fosforanowa pochodząca od kwasu ortofosforowego.

Do podstawowych zasad azotowych należą adenina, guanina, cytozyna, uracyl i tymina.

Zasady purynowe: Ade, Gua.

Zasady pirymidynowe: Cyt, Ura, Thy.

Cukry występujące w kwasach nukleinowych:

β - D- rybofuranoza 2 – detoksy – β - D- rybofuranoza

Nukleozyd – jednostka składająca się z zasady połączonej z cukrem. Cztery jednostki nukleozydowe występujące w DNA to: deoksyadenozyna, deoksyguanozyna, deoksycytydyna i tymidyna, natomiast w RNA występuje: adenozyna, guanozyna, cytydyna i urydyna.

Nukleozydy i nukleotydy odgrywają ważną rolę w procesach regulacji przemian metabolicznych, a także pełnią rolę komórkowych przekaźników informacji.

2. Część doświadczalna.

1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych.

Sposób wykonania doświadczenia:

Do probówek zawierających po 0,5 ml 0,1% roztworów DNA i RNA dodano kroplami 1N kwas solny. Następnie do obu prób dodano kilka kropel wodorotlenku sodu.

Obserwacje:

Po dodaniu kwasu solnego HCl do probówek z DNA i RNA wytrącił się biały osad, który po zalkalizowaniu wodorotlenkiem sodu NaOH rozpuścił się, roztwór zrobił się bezbarwny.

2. Wykrywanie pentoz w hydrolizatach kwasowych.

Do wykrywania pentoz w przygotowanych hydrolizatach służą dwie reakcje: orcynolowa i reakcja Dischego.

2.1. Reakcja orcynolowa.

Sposób wykonania doświadczenia:

Do probówek zawierających kolejno po 1 ml: hydrolizatu RNA, hydrolizatu DNA, 0,1% roztworu RNA, 0,1% roztworu DNA, 1% roztworu rybozy, 1% roztworu deoksyrybozy, dodano po 1 ml odczynnika orcynolowego. Wszystkie próby wstawiono na 15 minut do wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje:

Po dodaniu odczynników i ogrzaniu wszystkie próby zabarwiły się na kolor zielony.

2.2. Reakcja Dischego.

Sposób wykonania doświadczenia:

Do probówek zawierających kolejno po 1 ml: hydrolizatu RNA, hydrolizatu DNA, 0,1% roztworu RNA, 0,1% roztworu DNA, 1% roztworu rybozy, 1% roztworu deoksyrybozy, dodano po 2 ml odczynnika difenyloaminowego. Wszystkie próby wstawiono na 10 minut
do wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje:

W probówkach, do których dodano roztwór hydrolizatu DNA, 0,1% roztworu DNA oraz 1% roztworu deoksyrybozy pojawiło się niebieskie zabarwienie. Roztwory w pozostałych probówkach pozostały bezbarwne.

3. Wykrywanie kwasu fosforowego.

Sposób wykonania doświadczenia

Do dwóch probówek zawierających 0,5 ml hydrolizatu RNA i 0,5 ml hydrolizatu DNA dodano trzy krople stężonego roztworu amoniaku. Następnie do probówki wlano 0,5 ml stężonego kwasu azotowego i 2 ml roztworu molibdenianu amonowego. Próbę ogrzano do wrzenia.

Obserwacje:

W obu probówkach wytrącił się żółty osad.

4. Wykrywanie zasad purynowych.

Sposób wykonania doświadczenia:

Do dwóch probówek zawierających 1 ml hydrolizatu DNA i 1 ml hydrolizatu RNA dodano sześć kropli stężonego roztworu amoniaku i 3 ml amoniakalnego roztworu jonu srebra.

Obserwacje:

W obu próbówkach wytracił się biały, kłaczkowaty osad.

5. Oznaczenie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną.

Sposób wykonania doświadczenia:

5 g kostki bulionowej rozpuszczono na gorąco w 75 ml wody destylowanej. Po przestudzeniu, wywar przesączono do kolby miarowej o pojemności 100 ml przez gazę i uzupełniono do kreski wodą destylowaną. Mieszaninę ponownie przesączono przez sączek bibułowy. Roztwór rozcieńczono dwudziestokrotnie 0,1N kwasem solnym, a następnie dokonano pomiaru absorbancji, w celu oznaczenia zawartości zasad purynowych. Pomiar wykonuje się przy trzech długościach fal: 262 nm dla adeniny, 249 nm dla guaniny (przy tych długościach wykazują maksimum pochłaniania światła nadfioletowego) oraz 290 nm dla obu zasad (przy tej długości fali wykazują minimum pochłaniania światła nadfioletowego).

Wyniki doświadczenia:

Tabela. Wyniki pomiarów absorbancji badanego roztworu oraz zawartość zasad purynowych w kostkach bulionowych.

Produkt	Adenina ΔE262-290	Guanina ΔE249-290	Zawartość adeniny [mg/g kostki]	Zawartość guaniny [mg/g kostki]
Bulion cielęcy KNOR	0,246	0,165	1,09	1,44
Rosół z kury KUCHAREK	0,247	0,247	1,08	2,16
Bulion cielęcy WINIARY	0,139	0,103	0,62	0,91
Bulion warzywny WINIARY	0,403	0,354	1,79	3,10
Bulion wołowy WINIARY	0,219	0,159	0,97	1,40
Rosół wołowy KUCHAREK	0,254	0,246	1,13	2,15
Kostka mięsna CULINEO	0,312	0,325	1,39	2,84
Kostka drobiowa WINIARY	0,232	0,209	1,03	1,83

Przykładowe obliczenia:

A. zawartość adeniny

Obliczenie stężenia adeniny w roztworze na podstawie absorbancji roztworu wzorcowego
i absorbancji badanego roztworu:

0,900 - 10 μg adeniny/ml roztworu

0,246 - x

x= 2,733 μg adeniny/1 ml rozcieńczonego roztworu

Obliczenie zawartości adeniny w 100 ml roztworu:

2,733*100=273,333 μg adeniny/100ml roztworu

Obliczenie zawartości adeniny w roztworze nierozcieńczonym, poprzez pomnożenie przez wartość wielokrotności rozcieńczenia (20):

273,333*20=5466,666 μg adeniny/100 ml roztworu w 5 g

Obliczenie zawartości adeniny w 1 g kostki bulionowej:

5 g kostki bulionowej – 5466,666 µg adeniny

1 g kostki bulionowej - x

x = 1093,333 μg adeniny/1 g kostki bulionowej = 1,09 mg adeniny/1 g kostki bulionowej

B. zawartość guaniny

Obliczenie stężenia guaniny w roztworze na podstawie absorbancji roztworu wzorcowego
i absorbancji badanego roztworu:

0,457 - 10 μg guaniny/ml roztworu

0,165 - x

x= 3,611 μg guaniny/1 ml rozcieńczonego roztworu

Obliczenie zawartości guaniny w 100 ml roztworu:

3,611*100=361,1 μg guaniny/100ml roztworu

Obliczenie zawartości guaniny w roztworze nierozcieńczonym, poprzez pomnożenie przez wartość wielokrotności rozcieńczenia (20):

261,1*20=7222 μg guaniny/100 ml roztworu w 5 g

Obliczenie zawartości guaniny w 1 g kostki bulionowej:

5 g kostki bulionowej -7222 µg guaniny

1 g kostki bulionowej - x

x = 1444,4 μg guaniny /1 g kostki bulionowej = 1,44 mg guaniny/1 g kostki bulionowej

6. Oznaczenie zawartości DNA metodą z difenyloaminą.

Sposób wykonania doświadczenia:

Przygotowano 10 g wątroby i zhomogenizowano z 50 ml zimnego 10% kwasu trójchlorooctowego. Gotowy homogenat odwirowano. Ciecz nadosadową usunięto, a do osadu dodano 30 ml 0,6M roztworu kwasu nadchlorowego i ogrzewano mieszaninę przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 90^oC stale mieszając. Po ostudzeniu odwirowano osad zawierający białko, supernatant przeniesiono ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Zawartość kolby uzupełniono kwasem nadchlorowym do kreski i dokładnie wymieszano.

Równolegle przeprowadzono doświadczenie, w którym użyto 1 g mleczu ze śledzia zamiast wątroby.

Następnie przygotowano: dwie próby badane zawierające po 1 ml ekstraktu (0,5 ml dla mleczu) i 1 ml wody destylowanej (1,5 ml dla mleczu), jedna próbę wzorcową zawierającą 1 ml wzorcowego DNA (o stężeniu 200ug/ml) i 1 ml wody. Do każdej próby dodano 4 ml odczynnika difenyloaminowego i wstawiono jednocześnie do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Po tym czasie próby schłodzono i zmierzono absorbancję prób badanych i wzorcowych na spektrokolorymetrze przy długości fali 600 nm.

Tabela. Wyniki pomiarów absorbancji badanych prób.

	I	II
Próba wzorcowa	0,232	-
	0,140	-
Średnia	0,186	-
Próba badana (wątroba)	0,500	0,369
	0,536	0,333
Średnia	0,5315	0,352
Próba badana (mlecz ze śledzia)	0,554	0,601
	0,592	0,694
Średnia	0,573	0,6475

Przykładowe obliczenia:

Zawartość DNA w 1 ml ekstraktu:

Dla próby wzorcowej o stężeniu DNA 200 µg/ml absorbancja wyniosła 0,186, dla próby badanej absorbancja wyniosła odpowiednio w każdej próbie. Aby obliczyć stężenie DNA w 1 ml badanej próby można zastosować proporcję:

Dla wątroby I

200 µg/ml – 0,186

x – 0,5315 x = 571,5 µg/ml = 0,57 mg/ml

Dla wątroby II

200 µg/ml – 0,186

x – 0,352 x = 378,5 µg/ml = 0,38 mg/ml

Dla mleczu ze śledzia I

200 µg/ml – 0,186

x – 0,573 x = 616,1 µg/ml = 0,62 mg/ml

Dla mleczu ze śledzia II

200 µg/ml – 0,186

x – 0,6475 x = 696,2 µg/ml = 0,70 mg/ml

Zawartość DNA w 100 g wyjściowego surowca:

Dla wątroby I

Zawartość DNA w 1 ml ekstraktu mnożę przez 50 ml, gdyż taka była pojemność kolby miarowej, w której znajdował się ekstrakt.

0,57 mg/ml · 50 ml = 28,5 mg

Stężenie DNA w próbie o masie 10 g wynosi 28,5 mg, dlatego można zapisać proporcję:

28,5 mg DNA – 10 g wątroby

x – 100g x = 285 mg DNA/100 g wątroby = 0,285 g DNA / 100 g wątroby

Dla wątroby II

0,38 mg/ml · 50 ml = 19 mg

19 mg – 10 g

x -100g x = 190 mg DNA/100 g wątroby = 0,19 g DNA / 100 g wątroby

Średnia wyników: (0,285+0,19):2 = 0,24 g DNA / 100 g wątroby

Dla mleczu ze śledzia I

Dla mleczu śledziowego wyliczoną z proporcji wartość w mg mnożę przez 50 ml, ponieważ taka była pojemność kolby miarowej, w której znajdował się ekstrakt.

0,62 mg/ml · 50 ml = 31 mg

31 mg DNA – 1 g mleczu ze śledzia

x – 100 g x = 3100 mg = 3,1 g DNA/100g mleczu ze śledzia

Dla mleczu ze śledzia II

0,7 mg/ml · 50 ml = 70 mg

35 mg – 1 g

x – 100g x = 3500 mg = 3,5 g DNA/100g mleczu ze śledzia

Średnia wyników: (3,1+3,5):2= 3,3 g DNA / 100 g mleczu śledzia

7. WNIOSKI.

1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych.

Po dodaniu do probówek z DNA i RNA kwasu solnego wytrącił się osad, który świadczy o bardzo niskiej rozpuszczalności kwasów nukleinowych w środowisku kwaśnym. Może to również świadczyć o odczynie kwaśnym kwasów nukleinowym.

Rozpuszczenie osadu po dodaniu do probówek wodorotlenku sodu wskazuje na to, że kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczają się w środowisku alkalicznym.

2.1. Reakcja orcynolowa.

Zawarte w nukleozydach pentozy ogrzewane w środowisku kwaśnym ulegają odwodnieniu przechodząc w furfural, który w wyniku kondensacji z orcyną i jonami żelaza (III) tworzy zielone kompleksy.

2.2. Reakcja Dischego.

W reakcji z odczynnikiem difenylowym, wolna i związana deoksyryboza ulega odwodnieniu pod wpływem działania kwasu octowego zawartego w odczynniku dając aldehyd
ω-hydroksylewulinowy, a następnie tworząc barwny kompleks z difenyloaminą.

3. Wykrywanie kwasu fosforowego.

Wytrącenie osadu świadczy o utworzeniu trudno rozpuszczalnej soli fosfomolibdenianiu amonowego oraz o obecności reszt kwasu fosforowego w kwasach nukleinowych.

4. Wykrywanie zasad purynowych.

Wytrącanie osadu świadczy o utworzeniu trudno rozpuszczalnej soli srebrowej puryn. Zasady purynowe zawarte w kwasach nukleinowych tworzą sole z jonami metali.

5. Oznaczenie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną.

Bulion cielęcy z firmy WINIARY jest najlepszym z badanych produktów, ponieważ zawiera najmniejszą ilość Adeniny (0,62 mg/g) i Guaniny (0,91 mg/g). Najgorszą kostką z badanych okazał bulion warzywny z firmy WINIARY, który zawiera 1,79 mg/g Adeniny i 3,1 mg/g Guaniny.

Wszystkie z badanych kostek zawierały większą ilość Guaniny niż Adeniny.

Adenina i Guanina są niezdrowe dla naszego organizmu ponieważ podczas pochłaniania tlenu nasze ciało w reakcji pośredniej produkuje szkodliwe utleniacze. Są to tzw. wolne rodniki, cząsteczki, które w łatwy sposób wchodzą w reakcje z innymi cząstkami dzięki, co najmniej jednemu niesparowanemu elektronowi. Wolne rodniki łączą się z guaniną bazowego DNA przez co mogą zachwiać procesem replikacji DNA. Utleniony towarzysz guaniny, którym jest normalnie cytozyna, może być błędnie rozpoznawany i skopiowany przez mechanizm replikacyjny jako adenina. Nasilenie takich mutacji przez dłuższy czas może prowadzić do powstawania komórek rakowych. Dlatego też, tak ważne jest, aby unikać spożywania produktów z dużą zawartością guaniny i adeniny.

6. Oznaczenie zawartości DNA metodą z difenyloaminą.

Doświadczenie pokazuje, że stężenie DNA w 100 g mleczu ze śledzia jest znacznie wyższe niż stężenie DNA w 100 g wątroby.