Laboratorium z inżynierii genetycznej Wtorek , grupa II

Sylwia Mioduszewska 162684

Adriana Maryjowska 168615

Ligacja wektora pGEX-2T zlinearyzowanego enzymem BamH1i defosforylacja (pGEX-2T/BamH1) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA receptora ekdysteroidowego (EcRDBD/BamH1) przy użyciu ligazy T4.

Transforamacja komórek kompetentnych (Maniatis i wsp. 1989).

Wstęp:

Ligaza DNA katalizuje tworzenie wiązań fosfodiestrowych w miejscach gdzie łańcuch DNA został przerwany. Do działania ligaza ta wymaga wolnej grupy 3’OH, ufosforylowanej grupy 5’ oraz by łączone odcinki DNA znajdowały się w obrębie dwuniciowego DNA. Wymagana także jest energia pochodząca z ATP lub też NAD+.^[1]

Ligaza T4 jest najczęściej stosowana w procesie ligacji. Enzym ten bierze udział w replikacji fagowego DNA.^[2]

Łączy fragmenty dwuniciowego DNA, które posiadają przede wszystkim lepkie ale i tępe końce .^[3]Jednakże ligaza nie ma zdolności przybliżania ani trzymania końców nici DNA. Połączenia powstają na zasadzie dyfuzji losowej dzięki komplementarnym końcom, które łączą się niestabilnie ze sobą w mieszaninie ligacyjnej. Jednakże takie połączenia pozwala ligazie na przyczepienie się i zsyntezowanie dwóch wiązań fosfodiestrowych, które trwale „skleja” DNA.^[4]

Białka EcR i Usp funkcyjny receptor ekdysteroidowy wiążący 20-hydroksyektydyzon należą do receptorów jądrowych owadów. Kompleks EcR i Usp odpowiedzialny jest za dojrzewanie i metamorfozy owadów^[5]_.

Pobieranie DNA z podłoża jest właściwością nielicznych rodzajów bakterii- dlatego na komórki działa się specjalnymi odczynnikami chemicznymi lub zmianą warunków fizycznych. W ten sposób następuje destabilizacja błony komórkowej. Uzyskuje się w ten sposób komórki kompetentne, zdolne do dalszych modyfikacji. Proces transformacji wykorzystuje się często do badań sprzężeń między genami. Komórki pobierają DNA niezależnie od jego formy. Destabilizowana błona np. przez inkubację w niskiej temp. w obecności CaCl₂ daje możliwość wniknięcia DNA lecz musi ono połączyć się z wektorem aby w pełni zaszła transformacja.^[6]

Przebieg ćwiczenia :

Plazmidowe DNA (pGEX-2T/BamH1, ok 10ng) zlinearyzowane enzymem BamH1 oraz insert (EcRDBD/BamH1, ok. 2,5ng), trawiony tym samym enzymem restrykcyjnym zmieszano w sterylnej probówce Eppendorfa (stosunek molowy 1:4). Reakcje ligacji prowadzono w temperaturze ~22°C przez 1h i 15 min, w 1xbuforze do ligacji, w końcowej objętości 30 µl, przy użyciu ligazy T4(1U).

Skontrolowano regulację wektora przez przygotowanie próbki kontrolnej, zawierającej analogiczne składniki jak mieszanina ligacyjna, lecz niezawierającej insertu.

1. Przygotowanie próbek do reakcji ligacji.

Wektor:

Stężenia preparatu pGEX-2T/BamH1 wynosi ok. 17-18 ng/µl.

Do reakcji ligacji użyto10 ng wektora

MW_{(pGEX-2T/BamH1)}=4948pz x 640 g/mol pz= 3166729 g/mol

1 mol pGEX_--2T/BamH1 -- 3166729[g]

a pGEX_--2T/BamH1 -- 10x10^-9 [g]

a = 3,16x10^-15[mola]

Insert został dodany do zlinearyzowanego wektora w stosunku molowym 4:1. Zatem ilość moli insertu, którą należy dodać do przeprowadzenia ligacji wynosi:

3,16x10^-15 x 4 =1,26x 10^-14[mola]

Insert:

MW_{(EcRDBD/BamH1)}=306 pz x 640 g/mol pz= 195840 g/mol

1 mol insertu -- 195840g

1,26x 10-14mola -- b

b=2,48 x10^-9[g] = 2,5 ng

1. Reakcja ligacji ( na 1 próbke): Kontrola samoligacji:

11,9 µl pGEX-2T/BamH1 (wektor) 11,9 µl pGEX-2T/BamH1

2,8 µl EcRDBD/BamH1 preparat o stężeniu 0,9 ng/µl(insert) ___________

1 µl ligaza T4 (1U) (MBI Fermentas) 1 µl ligaza T4 (1U) (MBI Fermentas)

3 µl 10 xbufor do ligazy T4 (Fermentas) 3 µl 10 xbufor do ligazy T4 (Ferm.)

11,3 µl H₂O _miliQauto 11,3+2,8 µl H₂O _miliQauto

30 µl 30 µl

Ligacja trwała 1h i 15 minut.

1. 80µl zawiesiny komórek kompetentnych (XL1-Blue) rozmrożono na lodzie i przeniesiono natychmiast do schłodzonej probówki Eppendorfa, zawierającej mieszaninę po ligacji. Całość delikatnie wymieszano i inkubowano na lodzie przez 20 minut a następnie przez 5 min w temperaturze 37°C. Dodano po 80 µl pożywki płynnej LB i ponownie inkubowano w temp. 37°C przez 20 minut. Następnie na szalkę Petriego z podłożem LB-agar zawierającym karbenicylinę w stężeniu końcowym 100µl/mg, wysiano 200 µl zawiesiny transformowanych komórek.

Przeprowadzono inkubację w temp. 37°C przez ok. 12 h. Liczba kolonii transformantów na płytce ligacyjnej wyniosła 163 kolonie. Na płytce kontrolnej nie wyrosła ani jedna kolonia.

Zatem stopień religacji wektora wyniósł 0. ^[7]

Wnioski:

Komórki kompetentne, które zostały utworzone podczas wcześniejszych doświadczeń pobrały plazmid. Uzyskaliśmy transformowane komórki, zwierające fragment DNA kodujący domenę wiążąca DNA receptora ekdysteroidowego. Pokazuje to, iż wszystkie czynności były wykonane poprawie. Ligacja przebiegła bez zakłóceń. Enzym na żadnym z etapów nie został zdezaktywowany. Próbki nie zostały zanieczyszczone obcym DNA. Miejsca restrykcyjne były dobrze wbudowane. Startery do reakcji dobrze zaprojektowane. A warunki oraz odczynniki dobrane bardzo dokładnie.

Literatura:

1. Berg,J.M., Tymoczko,J.T., Stryer.L :2007 rok, PWN, Biochemia, str. 152

2. Brown.T.A.:2009 rok, PWN, Genomy, str. 42

3. Berg,J.M., Tymoczko,J.T., Stryer.L :2007 rok, PWN, Biochemia, str153

4. Brown.T.A.:2009 rok,PWN,Genomy, str. 42

5. Kręcisz.K, http://www.kns.b2me.pl/art-modelowanie-molekularne-homodimeru-bialka-ecr,95,0.html

6. Węgleński.P.:2006 rok, PWN, Genetyka molekularna, str 16,130

7. Instrukcja Inźynieria genetyczna –Laboratorium, nr 5, 2010-2011rok, PWR