Izolacja i Mianowanie Bakteriofagów

Ćwiczenie 4 i 5

BAKTERIOFAGI

1. TYPOWANIE BAKTERII FAGAMI

WYKONANIE ĆWICZENIA

Typowanie fagami polega na określeniu wrażliwości/oporności danego szczepu bakterii na poszczególne fagi; celem ćwiczenia jest typowanie fagami szczepów:

a) Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 24 (podłoże 79CA)

b) Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 3 (podłoże 79CA)

c) Escherichia coli HB101 (podłoże LB)

e) Salmonella typhimurium (podłoże LB)

f) Salmonella SL 869 (podłoże LB)

Dla każdego szczepu wylać 1 płytkę z odpowiednim podłożem stałym. Wysiać 100 μl hodowli bakteryjnej (płynnej) i rozprowadzić głaszczką, po czym nakroplić supernatanty zawierające cząstki fagowe (5-10 μl) (fagi T4, C21, 3H, 412). Po 24 godz. inkubacji w odpowiedniej temperaturze (28ºC dla Rhizobium i 37ºC dla E.coli i Salmonella) sprawdzić obecność lub brak łysinek fagowych w miejscu nakroplenia supernatantu i określić wrażliwość badanych szczepów na poszczególne fagi.

OPRACOWANIE WYNIKÓW

Cechę wrażliwości/oporności danego szczepu na poszczególne fagi zapisać w tabeli; znak „+” oznacza zdolność do zakażania, znak „-„ oporność

	T4	C21	3H	412
Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 24
Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 3
Escherichia coli HB101
Salmonella typhimurium
Salmonella SL 869

2. OZNACZANIE MIANA FAGÓW

1. Hodowle płynne:

Escherichia coli 101 HB

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii

1. Bakteriofagi: T4, 412

2. Płyn fizjologiczny

3. 6 Płytek Petriego z podłożem LB oraz 6 płytek 79CA

4. 6 sztuk 0,7% agar odżywczy tzw. agar miękki LB i 6 szt. 79CA

5. Probówki

6. Pipety, końcówki do pipet

Wykonanie ćwiczenia:

1. Rozpuścić agar miękki (3ml w probówce), następnie wstawić probówki do łaźni wodnej o temperaturze 46°C.

2. Wykonać kolejne 100-krotne rozcieńczenia (od 10^-1 do 10^-8) fagów w płynie fizjologicznym.

3. Do probówki z agarem miękkim wsiać 200µl odpowiedniej hodowli bakteryjnej oraz 100µl konkretnego rozcieńczenia (10^-6, 10^-7, 10^-8) odpowiedniego faga: dla E.coli 101HB fag T4; dla E.coli ROW fag λ; dla R. leguminosarum bv. trifolii fag 411 lub 412. Zawartość probówki dokładnie wymieszać i wylać na płytkę z podłożem hodowlanym. Płytki z E. coli inkubować w temperaturze 37°, a z R. leguminosarum bv. trifolii w temperaturze 28°C.

UWAGA! Dla szczepów E. coli używać agar miękki LB i płytki z podłożem LB, natomiast dla R. leguminosarum bv. trifolii agar miękki 79CA oraz płytki z podłożem 79CA.

3. RECEPTORY FAGOWE

Działanie czynnikami enzymatycznymi lub chemicznymi na bakterie może wybiórczo niszczyć pewne grupy związków obecnych na ścianie komórkowej bakterii (białka, polisacharydy), mogących pełnić rolę receptorów dla bakteriofagów. Ponieważ adsorpcja jest warunkiem koniecznym do przeprowadzenia przez fagi infekcji komórek bakteryjnych, więc zniszczenie receptorów uniemożliwiające adsorpcję fagów na powierzchni bakterii uniemożliwia zakażenie bakterii przez bakteriofagi.

WYKORZYSTYWANE SZCZEPY BAKTERII I FAGÓW

szczep Escherichia coli HB 101 + fag T4

szczep Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 24 + fag 412

WYKONANIE ĆWICZENIA

1. Pobrać po 0.5 ml hodowli bakterii do 5 probówek Eppendorfa, zwirować, zlać supernatant, bakterie zawiesić w płynie fizjologicznym (1 ml)

2. poddać działaniu czynników niszczących receptory fagowe:

czynnik	działa na :	sposób wykonania
1% roztw. nadjodanu sodu w 50 mM kw. siarkowym	polisacharydy	do próbki dodać 0,5 ml roztw. nadjodanu, inkubować 30 min. w 37ºC
enz. proteolityczny	białka	do próbki dodać 100μl, inkubować 30 min w 37ºC
wysoka temperatura	białka	próbkę inkubować 30 min w 37ºC

3. Przygotować kontrole: 2 osady bakteryjne.

4. Po okresie inkubacji próbki odwirować i zawiesić w 0,5 ml pożywki (LB dla E.coli lub79CA dla Rhizobium) (2 razy)

5. Do 3 próbek poddawanych niszczeniu receptorów oraz do 1 kontroli dodać po 100 μl supernatantu z cząstkami fagowymi; do drugiej kontroli dodać płynu. fizjologicznego lub wody, zgodnie z tabelą:

próbka	zawiesina faga	woda	opis
bakterie po nadjodanie	dodać	nie	badanie wielkości adsorpcji faga
bakterie po enz. proteolitycznym	dodać	nie	badanie wielkości adsorpcji faga
bakterie po inkubacji w wysokiej temp.	dodać	nie	badanie wielkości adsorpcji faga
bakterie	dodać	nie	kontrola pozytywna – prawidłowa adsorpcja
bakterie	nie	dodać	kontrola negatywna – kontrola czystości szczepu

6. Inkubować 20 min w 37C (adsorpcja faga)

7. Odwirować bakterie z zaadsorbowanymi fagami – nadmiar cząstek fagowych (nie adsorbujących się z powodu braku odpowiedniej ilości receptorów) pozostaje w supernatancie i będzie służył jako miernik ilości aktywnych receptorów.

8. Pobrać po 100 μl supernatantu z niezaadsorbowanymi fagami, wykonać szereg rozcieńczeń w celu zmianowania ilości fagów, wymieszać ze 100μl szczepu wskaźnikowego (ten sam szczep bakterii co użyty do adsorpcji) i zalać 0,7% agarem (płytki dwuwarstwowe).

Inkubować 24 godz na płytkach. Odczytać wynik - zwiększenie ilości niezaadsorbowanych fagów (zwiększenie ilości łysinek na płytach w porównaniu z kontrolą pozytywną) po potraktowaniu próbki danym czynnikiem świadczy o zniszczeniu receptorów rozpoznawanych przez faga, zgodnie z zasadą:

1. receptor nie poddawany działaniu czynnika uszkadzającego = duża ilość receptorów na powierzchni bakterii = duża ilość zaadsorbowanych fagów = niewielka ilość fagów pozostających w supernatancie po adsorpcji = niewielka ilość łysinek tworzonych na płytkach

2. receptor poddawany działaniu czynnika uszkadzającego = zniszczenie receptora = mała ilość receptorów na powierzchni bakterii = mała ilość zaadsorbowanych fagów = duża ilość fagów pozostających w supernatancie po adsorpcji = duża ilość łysinek tworzonych na płytkach

W oparciu o ilość łysinek fagowych na płytkach ze szczepem kontrolnym podać, jaka jest chemiczna charakterystyka receptorów dla fagów T4 oraz 412.