ROZDZIAŁ V I VI ZE SKRYPTU:

Pożywki – są mieszaniną (stałą lub płynną) odpowiednio dobranych składników odżywczych i wzrostowych. Aby umożliwić właściwy wzrost drobnoustrojom należy tak dobrać te składniki, aby pożywka miała: odpowiednią wart odżywczą, dostateczną ilość wody, odpowiednie natlenienie, optymalny odczyn pH, właściwe ciśnienie osmotyczne. Autotrofy – samożywne(podłoże związki nieorganiczne), heterotrofy – cudzożywne (podłoże związki organiczne) Źródło C – w pożywkach – cukrowce, głównie glukoza (źródło C i energii), dodaje się również laktozę, maltozę, skrobi, glicerol… Cukrowców do podłoży dodaje się 0,5-2%. Źródła N – hydrolizat kateinowy, hydrolizat białka zwierzęcego, ekstrakty mięsne, czyste białka, białko rodzime, czyste aminokwasy, dodaje się je wszystkie 0,5-2%. Sole mineralne – Na K P Mg Fe podawane do podłoża w postaci soli nieorg: NaCl 3-8 g/l, fosforany Na i K 1-5 g/l, sole Fe i Mg jako chlorki i siarczany 5-50 mg/l, woda wodociągowa – zaspokaja wszystkie potrzebne sole mineralne. Cz wzrostowe – jako ekstrakt drożdżowy, wyciąg z mięsa, wyciąg z roślin, hormony, roztwory syntetycznych witamin. Czynniki ustalające pH pożywki: za pomocą 1-5 N roztworowo NaOH i HCl lub buforów. Dodatki specjalne: W celu odtlenienie, natlenienia środowiska, eliminacji niepożądanej mikroflory: s eliminujące (barwniki – fuksyna, fiolet krystaliczny, związki chemiczne – związki selenu, sole kwasów żółciowych), s różnicujące – wskaźniki, chem zw utleniające NaNO3 wzbogacają pożywkę w tlen, chem zw redukujące – odtleniają środowisko, stwarzając war beztlenowe. Subst zestalające podłoża: Agar-agar – polisacharyd otrzymany z glonów morskich zawier m.in. galaktozę, jony Mg i Ca. Właściwości żelujące. Pęcznieje w wodzie, rozp się w 95-100stC, krzepnie w 40stC, nie jest rozkładany przez większość drobnoustr, nie stanowi skł odżywczego w pożywce. Żelatyna – otrzymywana przez wodną ekstrakcję niektórych odpadów mięsnych bogatych w kolagen np. chrząstek. Do podłoża + 15%. Krzepnie 15-20stC, rozpuszcza się 25-27stC, czynnik zestalający i diagnozujący. Cel posiewów: w celu wyodrębnienia czystych kultur drobnoustrojów, odnowienia hodowli, stwierdzenia jakości mikrobiologicznej badanego materiału. Skos – aby go otrzymać, probówkę z wysterylizowaną i upłynnioną pożywką układa się w pozycji ukośnej do zestalania, tak, by pow skosu była możliwie duża, ale nie dotykała korka. Słupki – prze pozostawienie probówek z wyjałowionym podłożem w pozycji pionowej. Pobieranie materiału – małe pow (jałowy wacik umieszczony na metalowym drucie), duże pow (wilgotny tampon ujęty pincetą, przetrzeć i umieścić na płytce Petriego), płyny – jałowa pipeta lub strzykawka, sub stałe – skalpel i wycinki na płytkę Petriego, próby rozdrobnić, rozcieńczyć płynem Ringera, pasty – jałowa specjalna pipeta o poj 10 cm3, przenieśc do wysteryliz homogenizatora, po roztarciu należy dodać płyn Ringera w stosunku 1:10.

Podział podłoży: Konsystencja podłoża: płynne (bez dodatku czynników zestalających), półpłynne (do płynnej + 0,1-0,8% agaru), stałe (galareta, gładka pow, do płynnych + żelatyna lub agar) Pochodzenie składników podłoża: naturalne (tylko z nat skł) półsyntetyczne (przyd z podłoży syntetycznych + ekstrakty naturalne) syntetyczne (skł się z odp dobranych i ściśle określonych zw chem) Zastosowanie pożywek: ogólne (rozwija się na nich szeroka gr różnych drobnoustr), wybiórcze (umożliwiają rozwój tylko określonej gr mikroflory, efekt ten osiąga się przez dodanie do podłoża czynników eliminujących lub przez takie zestawienie skład pożywki, że brakuje w niej skł potrzebnego do życia niepożądanej gr drobnoustr) Funkcje jakie ma pełnić pożywka: namnażające (bogate w liczne skł odzywcze i stos w celu namnożenia wyst w badanym srod drobnoustrojów), namn-wybiórcze (do wyodrębni i namnoż tylko jednego interesuj nas rodz mikroflory i zahamowaniu wzrostu flory towarzyszącej, ident (zawier poza skł odż substancję diagnostyczną, która może być np. rozlożona enzymatycznie tylko przez określone gatunki mikroflory). Podział drobnou: psychrofile (-10 – 30), mezofile (10-50), termofile (24-95) Warunki beztlenowe otrzymuje się w an aerostacie, prowadząc hodowlę w atmosferze gazu obojętnego. Hodowlę beztlenowców można prowadzić w probówkach na podłożu płynnym, gdzie tlen jest absorbowany przez umieszczony w podłożu sterylny wacik (m wróblewskiego) lub kawałek tkanki zwierzęc (m Wrzoska). Hodowlę od dostępu tlenu atm oddziela warstwa płynnej parafiny. Sposoby zrobienia war beztlenowych: zagotowanie pożywek przed posiewem, dodanie do pożywki substancji szybko zużywających tlen (przez umieszcz w śr hodowli saszetki z mieszaniną odtleniającą no ziemia okrzemkowa, K2CO3 i pirogalol), jednoczesna hodowla bakt tlen i beztlen przy równoczesnym odcięciu dopływu tlenu. Hodowla/kultura – pożywka wraz z rozwijającymi się na niej drobnoustrojami. Kolonia – widoczne gołym okiem skupisko komórek na podłożu stałym. Jedna kolonia odpowiada jednej komórce bakteryjnej lub grzybowej. Cechy diagnostyczne: kształt kolonii, wielkość, brzeg kolonii, pow, struk, wzrost ponad pow, barwa, przejrz, konsystencja, zapach, zawieszalność, zdolność barwienia podłoża. Drobnoustroje przy posiewie rysowym (na skosach) nie tworzą kolonii. W tym przyp określa się intensywność wzrostu oraz jego charakter. Określa się również barwę powierzchni i strukturę ozy.

Hodowle na pożywkach płynnych: BEZWZGLĘDNE TLENOWCE – rosną na pow pożywki w postaci błonki, kożuszka, pierścienia kom. W zal od gat bakterii kożuch może być biały barwny, gładki pomarszczony, suchy śluzowaty. WZGLĘDNE BEZTLENOWCE –rosną w postaci jednolitej zawiesiny na całej wysokości pożywki , BEZWZGL BEZTLENOWCE – rosną zawsze w postaci osadu na dnie probówki. 2 typy hodowli : OKRESOWE – w których drobnoustroje namnażają się aż do momentu całkowitego wyczerpania skł odż lub zatrucia się wytworzonymi szkodliwymi metabolitami. CIĄGŁE – w których po wstępnym namnożeniu drobnoustr następuje stały dopływ świeżej pożywki przy jednoczesnym usuwaniu, takiej samej objętości zużytego podłoża wraz z wydzielonymi metabolitami. Krzywa wzrostu – przedstawia wzrost drobnoustrojów w hodowli okresowej, 6 faz: spoczynkowa (wstępna), przyspieszenia , wykładnicza (logarytmiczna), opóźnienia, równowagi (stacjonarna), zamierania (spadkowa). Spoczynkowa (wstępna) – rozpoczyna się w mom wprowadzenia drob do podłoża, a konczy w mom rozp podzialu kom, okres wzmożonego metabolizmu, kom powieksz się, lecz ich liczba jest stała Przyspieszenia – wzrasta tempo namnażania nowych kom, zwiększa się intens procesów przemiany materii. Wykładnicza (log) – tempo namnaż nowych kom jest b duże, czas generacji minimalnej i dla bakterii wynosi 10-60 min, również czas podwojenia biomasy jest min. Opóźnienia – następuje zwolnienie tempa przyrostu biomasy, zmniejsza się stężenie substratu, a rośnie ilość metabolitów Równowagi (stacjonarna) – taka sama ilość kom przyrasta co obumiera, wzrost populacji ulega zahamowaniu, stężenie biomasy osiąga w tej fazie max wart. Zamierania (spadkowa) – większa il kom obumiera niż powstaje nowych, w podłożu brakuje skł odż i wzrasta il szkodliwych metabolitów.

ROZDZIAŁ III ZE SKRYPTU:

Sterylizacja na sucho – w suszarkach elektrycznych Sterylizacja w atmosferze pary wodnej – w aparacie Kocha, Tyndalizacja – polega na trzykrotnym 10-min ogrzewaniu w atmosferze pary bieżącej w 100 stC w odstępach 24h. Podczas 1 ogrzewania giną wszystkie formy wegetatywne oraz zostają pobudzone do kiełkowania przetrwalniki, które giną podczas 2 ogrzewania. 3 ogrzewanie wyklucza istnienie żywych organizmów w sterylizowanym materiale Sterylizacja w atmosferze pary wodnej pod ciśnieniem – w autoklawie Ster przez suszenie – stosuje się do jałowienia podłoży, czy też roztworów zawierających składniki nieodporne na temp np. witaminy. Sterylizacja promieniami UV – promieniowanie niszczy lub zmienia DNA komórki, co w konsekwencji prowadzi do jej śmierci bez żadnych innych zmian w sterylizowanym materiale. Promieniowanie to wykorzystywane jest do jałowienia pomieszczeń, stołów, powietrza. Wyjałowienie polega na naświetlaniu prze okres 3-5 min. Bakterie zabijane są szybko lecz zarodniki grzybów giną znacznie wolniej. Metody kontroli jałowości: w celu sprawdzenia prawidłowości przebiegu procesu sterylizacji przeprowadza się kontrolę tego procesu jedną z opisanych metod: M. termostatowa – p.n umieszczeniu wyjałowionego materiału w cieplarce w 37stC na 1-10 dni, brak wzrostu mikroflory w tym czasie świadczy o prawidłowo przeprowadzonej sterylizacji. M. posiewu – p.n posianiu wysterylizowanego materiału na podłoża odżywcze i prowadzeniu hodowli w cieplarce w warunkach tlenowych i beztlenowych. Obser wzrostu drobnoustr prowadzi się przez 1-14 dni. M. sporotestowa – p.n. umieszczeniu pomiędzy jałowionym materiałem sporo testu (zamkniętej szklanej ampułki z pożywką zaszczepioną tlenowymi laseczkami przetrwalnikującymi Bacillus stearothermopfilus wraz ze wskaźnikiem). Po zakończeniu sterylizacji umieszcza się w cieplarce i inkubuje w 55stC przez 48h. Zmiana zabarwienia wskaźnika i zmętnienie pożywki świadczą o nieprawidłowym przebiegu procesu sterylizacji.

MATERIAŁ WYKŁADOWY – ALE TO JEST RACZEJ ZBĘDNE!

Drobnoustroje – inaczej mikroorganizmy są jednokomórkowymi lub tworzącymi tak zwane komórczaki organizmami o mikroskopijnych rozmiarach. Mikroorganizmy zamieszkują każde miejsce na Ziemi, gdzie występują większe żywe organizmy. Zasiedlają również te obszary, gdzie żadne inne organizmy nie mogą dłużej przetrwać. Gdziekolwiek istnieje życie, tam są drobnoustroje i odwrotnie, ekstremalne warunki tolerowane przez mikroorganizmy zakreślają granice życia na Ziemi w znanej nam formie. Mikroorganizm – organizm niewidoczny gołym okiem, widoczny pod mikroskopem: wirusy, bakterie, grzyby (drożdże i grzyby strzępkowe), glony oraz pierwiastki. Systematyka drobnoustrojów – znaczenie w przyrodzie: Pod względem liczebności i znaczenia stanowią dominującą grupę na Ziemi, Stanowią zasadnicze ogniwo w ekosystemach (woda, gleba, powietrze), Wykazują interakcje z innymi organizmami w środowisku, zyją na zewnątrz i wewnątrz organizmów żywych. Mikroorganizmy znajdują zastosowanie w przemyśle, medycynie, rolnictwie i ochronie środowiska. Oddziaływanie drobnoustrojów może mieć charakter korzystny (np. produkcja żywności) lub negatywny (choroby, psucie produktów) Podział mikroorganizmów: Podział tradycyjny: wirusy, bakterie, grzyby (mikroskopowe), glony jednokomorkowe i kolonijne, pierwotniaki Podział uwzględniający różnice cytologiczne, fizjologiczne i prawdopodobne stosunki filogenetyczne: virales – wirusy, procaryota (bakterie i organizmy bakterio podobne), eucaryota (wyższe organizmy z wykształconą błoną jądrową) Taksonomia – system stosowany przez naukowców do klasyfikowania organizmów żywych w grupy monofiletyczne czyli pochodzące od jednego przodka. Działy taksonomii: Klasyfikacja – porządkuje organizmy w grupy czyli taksony Nomenklatura – zajmuje się nazewnictwem taksonów Identyfikacja – ustala przynależność danego mikroorganizmu do określonego taksonu Procaryota: bakterie, archeony Eucaryota Domena: Eucaryna, królestwo protista, królestwo fungi (grzyby), królestwo zwierzęta, królestwo rośliny Charakterystyka morfologiczna drobnoustrojów – bakterie Organizmy jednokomórkowe, kształty: kulisty – coccus, cylindryczny: pałeczki – stosunek dług do szer 2:1, laseczki – stosunek dług do szer > 2:1, spiralny: przecinkowce, krętki, śrubowce Wielkość: większość bakterii – od 1 do kilku mikrometrów, średnica form kulistych – o,5 – 1 mikrometrów, średnica form pałeczkowatych – zwykle nie przekracza 1 mikrometrów, długosć – 10 mikrometrów, komórki nitkowate osiągają długość 20 mikrometrów (z rodzaju Spirillum nawet 40 mikrometrów) Organelle zewnętrzne – otoczka Zewnętrzna osłonka komórki – może mieć charakter śluz Skład otoczki zależy od rodzaju, gatunku, a nawet szczepu bakterii: głównie polisacharydy zawierające glukozę, ramnozę, amino sacharydy, kwasy uronowe, polipeptydy, struktura złożona – białkowo-sacharydowa lub sacharydowo-lipidowa. Funkcje otoczki: ochrona przed wysuszeniem, ochrona przed antybiotykami, bakteriofagami, metalami ciężkimi, regulacja wnikania niektórych cząsteczek, adhezja (przywieranie) bakterii do powierzchni, czynnik zjadliwości u bakterii chorobotwórczych. Mogą być różnej grubości, nie występują u wszystkich rodzajów bakterii. Organelle zewnętrzne – rzęska i ruch bakterii Organelle ruchu bakterii, zbudowane ze zwiniętych łańcuchów białka – flageliny, komórka może mieć od 1-100 rzęsek, występowanie, liczba i sposób ułożenia rzęsek jest dla bakterii cechą charakterystyczną i ma znaczenie taksonomiczne (bezrzęsne, jednorzędne, wielorzęsne jednobiegunowe, dwurzęsne dwubiegunowe, okołorzęsne) Ruch bakterii: Podział na bakterie ruchliwe i nieruchliwe - ważna cecha w diagnostyce, zwykle ruchliwe są formy cylindryczne i spiralne, ruch związany zwykle z obecnością rzęsek, ale nie zawsze, formy kuliste zwykle nieruchliwe (bezrzęsne), r uchy Browna – drgania pod wpływem drgań cząsteczek płynnego środowiska, ruchy bezwładne, taksje – ruch ukierunkowany związany z czynnikami środowiskowymi Organelle zewnętrzne – fimbrie i pilusy Białkowe wyrostki zbudowane z białka piliny, budowa rurkowata, fimbrie (zwykłe) : występują u bakterii urzęsionych i nieurzęsionych, rola fimbrii: uczestniczą w procesie adhezji do komórek nabłonka, Komorek roślin, minerałów, umożliwiają agregację i tworzenie biofilmów Pilusy (fibrie płciowe) – biorą udziale koniugacji – procesie przekazywania materiału genetycznego między komórkami tego samego rodzaju bakterii osobniki + i -) Organelle wewnętrzne – ściana komórkowa Zewnętrzna osłonka komórki, występuje u wszystkich bakterii za wyjątkiem mykoplazm, budowa ściany komórkowej różni się znacznie u bakterii gram dodatnich i gram ujemnych. Funkcje: Nadaje kształt komórce, chroni przed czynnikami fizycznymi i chemicznymi oraz przed mikroorganizmami, chroni komórkę przed skutkami zmian ciśnienia osmotycznego, uszkodzeniami mechanicznymi, działaniem detergentów, w pełni przepuszczalna dla soli i związków drobnocząsteczkowych (sito molekularne) Peptydoglikan (mureina) – podstawowy składnik ściany komórkowej Składa się z: N – acetyloglukozoaminy, kwasu N – acetylomuraminowego, te dwie jednostki są połączone i tworzą długie łańcuchy polisacharydowe. Do reszt kwasu muraminowego dołączone sa krótkie peptydy wiążące łańcuchy polisacharydowe – tworzy się struktura sieci. Organelle wewnętrzne – błona cytoplazmatyczna Otacza cytoplazmę i odgradza wnętrze komórki od ściany komórkowej, skąłd: 50 – 70 % substancji białkowych, 20 – 35 % lipidów obojętnych i fosfolipidów, grubość 8-15 nm, budowa trójwarstwowa – białko -> lipid <->lipid <- białko Funkcje: Błona półprzepuszczalna – odpowiada za wymianę substancji między komórką a środowiskiem (tzw selektywna), transport substancji odżywczych, pierwiastków i produktów metabolizmu, w błonie rozmieszczone są enzymy i przenośniki m.in. elektronów. Organelle wewnętrzne – cytoplazma Wodny, koloidalny, roztór różnych związków organicznych niezbędnych do życia komórki oraz metabolitów, zawieszone sa w niej struktury komórkowe: nukleid, plazmidy, mezosomy, rybosomy, gromadzony jest w niej materiął zapasowy Organelle wewnętrzne – nukleoid i plazmidy Nukleoid – podwójna nić DNA w postaci spiralnie skręconej, ściśle upakowanej struktury niczym nie osłoniętej, zawiera informację genetyczną komórki, nei ma stałego położenia w komórce, wielkość 100 – 200 nm Plazmid Kolista cząsteczka DNA pozachromosomowego, różnią się wielkością i liczbą kopii (1 do kilkuset na komórkę), mogą się replikować samodzielnie (powielać) Funkcje: odporność bakterii na antybiotyki i inne czynniki antybakteryjne, wytwarzanie bakteriocyn (substancje antydrobnoustrojowe), kodują zespoły enzymów odpowiedzialnych za degradację różnych związków toksycznych. Organelle cytoplazmatyczne – rybosomy, mezosomy i inne Rybosomy - centra syntezy zbudowane z RNA i białek, występują pojedynczo lub w zespołach Mezosomy – powstają przez wpuklenie błony cytoplazmatycznej do wnętrza komorki i pełnią ważne funkcje w procesie oddechowym i biosyntezie kwasów tłuszczowych. Chromatofory – organelle występujące u bakterii fotosyntezujących i zawierają barwniki np. chlorofil, karotenoidy Formy przetrwalne bakterii – endospory

Wytwarzane przez bakterie cylindryczne – lasezki, tworzą się w wyniku wyczerpania substratów środowiskowych lub starzenia komórki, ułożenie w komórce – różne (centralnie, biegunowo), komórka może zachoważ swój kształt lub ulega rozdęciu i jest to xecha diagnostyczna. Cechy przetrwalników: ciepłoodporność, odporność na promieniowanie, odpornośc na brak wody i substancji odżywczych, odporność na działanie antybiotyków i środkó dezynfekcyjnych, odporność na przenikanie barwników Podział bakterii: Podział bakterii dotyczący różnej barwliwości komórek podczas barwienia metodą Gram, wynikający z różnic w budowie ściany komórkowej – cecha diagnostyczna :

Cecha	Bakterie G (+)	Bakterie (-)
Ściana komórkowa Grubość Prptydoglikan Lipidy Aminocukry Rodzaje aminokwasów Kwasy tejchowe i tejchuronowe	20 – 80 nm 50 – 80 % ściany 0 – 3 % 10 – 22 % Kilka występują	10 nm 10% ściany 10 – 30 % 2 – 8 % Dużo brak
Przepuszczalność komórek dla barwników	większa	Mniejsza
Wytwarzanie przetrwalników	Wiele gatunków	Nie wykryto
Wrażliwość Detergenty Penicylinę lizozym	Bardzo duża Wrażliwe Ściana ulega łatwo rozpuszczeniu	Mniejsza Niewrażliwe Ściana odporna na działanie